CN110423771A

CN110423771A - 双质粒系统及其应用

Info

Publication number: CN110423771A
Application number: CN201910644324.1A
Authority: CN
Inventors: 季泉江; 王宇
Original assignee: ShanghaiTech University
Current assignee: ShanghaiTech University
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2039-07-17
Also published as: CN110423771B

Abstract

本发明提供了一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒命名为pCasAb，序列为SEQ ID NO：1；所述第二质粒命名为pSGAb，序列为SEQ ID NO：2。本发明能够高效、快速并且无痕地编辑鲍曼不动杆菌菌株的基因组DNA，包括基因插入、基因敲除和单碱基突变。所述的技术对于鲍曼不动杆菌的基因功能研究、耐药机制解析、新药物靶点筛选、新治疗方法开发等方面具有广阔的应用前景。

Description

双质粒系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于鲍曼不动杆菌基因组编辑的双质粒系统及其应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌是一种危害性极大的革兰氏阴性人类病原细菌，能够引起一系列严重的医院获得性感染，如败血症、肺炎、心内膜炎和继发性脑膜炎等严重感染性疾病，且极易在患者、医护人员之间进行传播。鲍曼不动杆菌强大的致病和传播能力主要归因于两个方面。一方面，鲍曼不动杆菌具有耐受干燥和多种消毒剂的能力，使其能够在临床医疗材料表面长时间存活，难以被完全杀灭；另一方面，鲍曼不动杆菌能够摄取外源耐药基因，获得对包括碳青霉烯和多粘菌素类抗生素在内的多种抗生素的抵抗能力，其感染人体后很难找到有效的抗生素药物。近几十年来，随着抗生素的广泛使用，由多重耐药性甚至全耐药性鲍曼不动杆菌造成的临床感染病例正快速增加，进一步增加了治疗难度。在世界卫生组织(WHO)公布的抗生素耐药“重点病原体”清单中，碳青霉烯类耐药性鲍曼不动杆菌位列第一名，强调了新型药物靶点筛选和新型治疗方法开发的重要性和迫切性。

新型药物靶点的筛选离不开基因组层面的基因组编辑操作和后续的基因功能研究。用于鲍曼不动杆菌基因组编辑操作的现有技术主要有非复制许可质粒法和外源重组酶法。这两种方法的操作较为复杂，基因敲除效率较低，需要耗费大量的人力物力，且难以实现精确的无痕基因组编辑，极大地阻碍了鲍曼不动杆菌的基因功能研究，因此迫切需要开发一种适用于鲍曼不动杆菌的高效率基因组编辑系统。

CRISPR-Cas9系统是一种近年来开发的新型基因组编辑工具，具有强大的DNA定点切割能力。该系统源自原核生物的获得性免疫系统，是原核生物进化出来的一种用于抵抗外源核酸入侵和噬菌体感染的主动免疫系统。目前使用最为广泛的CRISPR-Cas9系统由来自化脓链球菌的Cas9核酸酶和人工嵌合单向导RNA(sgRNA)两部分组成。sgRNA能够与Cas9蛋白结合形成复合物，识别PAM位点上游能够与sgRNA的5’端的20bp spacer序列互补配对的靶标位点，并对其进行切割，造成DNA双链断裂。

CRISPR-Cas9系统切割细菌基因组DNA产生双链断裂后，细菌只有通过同源重组修复DNA双链断裂才能存活。此时通过导入人工设计的同源修复模板，便可以通过同源重组修复，实现靶基因的精确定向编辑。然而，现行的CRISPR-Cas9系统还具有很大的局限性，不能直接用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑，需要进一步探索和开发，才能实现鲍曼不动杆菌的高效率基因组编辑。

发明内容

鉴于现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于鲍曼不动杆菌基因组编辑的双质粒系统，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒能够表达Cas9蛋白和RecAb重组酶，所述第二质粒能够表达sgRNA。

优选地，所述第一质粒包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重组酶系统基因片段、tacpromoter启动子片段，tac promoter启动子调控RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因的表达。

更优选地，所述RecAb重组酶系统包含beta和exo基因片段。

优选地，所述第一质粒包含aprR阿布拉霉素抗性基因片段。

优选地，所述第一质粒包含sacB蔗糖筛选基因片段。

一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒命名为pCasAb，序列为SEQ ID NO：1；所述第二质粒命名为pSGAb，序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供了上述的双质粒系统在鲍曼不动杆菌株的基因编辑中的应用。

优选地，所述的鲍曼不动杆菌株为鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株。

优选地，所述的基因编辑为基因插入、基因敲除或单碱基突变中的一种。

更优选地，所述的基因敲除中的敲除基因为oxyR基因。

更优选地，所述的基因插入是以iscA基因与hscB基因的间隙作为插入位点，以表达紫色色素蛋白的amilCP基因作为插入基因。

更优选地，所述的单碱基突变为oxyR基因中第605位的鸟嘌呤碱基(G)突变为胞嘧啶碱基(C)。

本发明还提供了含有上述的pCasAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCC M 2019464。

本发明还提供了含有上述的pSGAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCC M 2019465。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明涉及在鲍曼不动杆菌中基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术形成的pCasAb/pSGAb双质粒系统以及相关应用。本发明的pCasAb/pSGAb双质粒系统能够高效、省时并且无痕地实现对鲍曼不动杆菌的基因组编辑，其中包括基因敲除、基因插入和单碱基突变。

含有pCasAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2019.06.19，保藏号为：CCTCC M 2019464。

含有pSGAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2019.06.19，保藏号为：CCTCC M 2019465。

附图说明

图1：pCasAb/pSGAb双质粒系统结构说明；

图A.pCasAb质粒图谱；lacI基因：表达半乳糖诱导型启动子的阻遏蛋白；tacpromoter：RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因表达的半乳糖诱导型启动子；beta和exo基因：共同组成RecAb重组酶系统；rrnBT1T2：RecAb重组酶系统的终止子；sacB基因：用于后续质粒消除的蔗糖敏感基因；aprR：大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中阿布拉霉素抗性基因片段；oriV、mobC、oriT、mobB、mobA、repB、repA、repC：共同组成革兰氏阴性菌广宿主复制子RSF1010；

图B.pSGAb质粒谱图；J23119：表达sgRNA的启动子；spacer：用于插入约20bp的靶点序列；rep(pMB1)：大肠杆菌中的质粒复制子；WH1266：鲍曼不动杆菌中的质粒复制子；kmR：大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中卡那霉素抗性基因片段；sacB基因：用于后续质粒消除的蔗糖敏感基因；

附图2：pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中实现高效基因组编辑；

图A.采用pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行基因组编辑的步骤原理图；

图B.采用pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行基因敲除的PCR验证、DNA测序和双氧水敏感实验结果；

图C.采用pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行基因插入的转化平板图、PCR验证和DNA测序结果；

图D.采用pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行单碱基突变的原理图和DNA测序结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

各实施例中使用的生物材料来源如下：

pCasKP-apr质粒(购自美国addgene公司，货号：117231)；

pSGKP-km质粒(购自美国addgene公司，货号：117233)；

pMMB67EH质粒(购自美国ATCC公司，货号：ATCC37622)；

pWH1266质粒(购自美国ATCC公司，货号：ATCC77092)；

pUC57-amilCP质粒(购自金唯智生物科技有限公司，全基因合成)

鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株(购自美国ATCC公司，货号：ATCC17978)；

大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司，货号：DL1001)；

各实施例中使用的LB液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507002-0250；LB固体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507003-0250；阿布拉霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600090-0001；卡那霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：K103024-5g。

实施例一：pCasAb质粒构建

pCasAb质粒的组成如附图1A所示，其序列为SEQ ID NO：1，其具体构建方法如下：

(1)通过聚合酶链式反应(PCR)从pCasKP-apr质粒中扩增得到aprR阿布拉霉素抗性基因片段。用于PCR扩增的引物序列为：

aprR-F：5’-GCGTCAATTCACGGATCCGGTTCATGTGCAGCTCCATCAGC-3’(SEQ ID NO：3)

aprR-R：5’-AAACTTGGTCTGACAGTCAGCCAATCGACTGGCGA-3’(SEQ ID NO：4)

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述DNA片段进行扩增，反应体系为：32μL ddH₂O，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，10μL5×Primestar Buffer，1.5μL aprR-F(10μM)，1.5μL aprR-R(10μM)，0.5μL pCasKP-apr质粒模板(1ng/μL)，0.5μLPrimerSTAR HS DNA Polymerase。

体系配置完成后进行PCR扩增，扩增参数：98℃预变性30s；之后98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，共28个循环；接着72℃完全延伸5min；最后16℃保温。

PCR扩增完成后，使用TAKARA公司的DpnI限制性内切酶消除PCR反应体系中的pCasKP-apr质粒模板，具体操作为：在完成扩增的上一步PCR反应液中加入1μL DpnI酶，使用移液枪吹吸混匀后置于37℃恒温培养箱中温育1h。然后，使用康宁生物科学(吴江)有限公司产生的AxyPrep PCR清洁试剂盒对上述PCR产物进行纯化回收。PCR产物纯化的操作步骤按照试剂盒提供的操作说明书进行。

(2)利用限制性内切酶对pMMB67EH质粒进行单酶切，将其由环状DNA转变为线性DNA片段。

使用NEB公司的BamHI-HF限制性内切酶对pMMB67EH质粒执行单酶切反应，反应体系为：24μL ddH₂O，20μL pMMB67EH质粒(50ng/μL)，1μL BamHI-HF，5μL 10×CutsmartBuffer。体系配制完成后进行酶切反应，反应条件为：37℃温育4h。

单酶切反应完成后，使用康宁生物科学(吴江)有限公司产生的AxyPrep PCR清洁试剂盒对酶切产物进行纯化回收，操作步骤按照试剂盒提供的操作说明书进行。

(3)通过In-Fusion克隆方法将步骤(1)和步骤(2)获得的DNA片段组装成一个环状质粒，命名为pAT04-apr质粒。

使用TAKARA公司的In-Fusion HD Cloning Kit试剂盒进行上述片段的组装，反应体系为：2μL aprR基因片段(60ng/μL)，3μL线性化的pMMB67EH质粒片段(30ng/μL)，3μLddH₂O，2μL In-Fusion HD enzyme premix。体系配制完成后进行In-Fusion克隆反应，反应条件为：50℃温育15min，然后冰浴至少2min。

将上述的10μL反应产物转化到100μL大肠杆菌DH5apha感受态细胞中(上海唯地生物技术有限公司)，转化方法参照附带的说明书进行。接着，取100μL复苏液涂布在含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板上，待复苏液被固体培养基完全吸收后，将固体培养基平板倒置于37℃恒温培养箱培养约16h直至细菌转化子长出。随机挑取几个长出的细菌转化子，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒抽提质粒，抽提步骤参照试剂盒提供的操作手册进行。提取的pAT04-apr质粒送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，测序正确的pAT04-apr质粒用于下一步质粒构建实验。

(4)从pCasKP-apr质粒中PCR扩增得到Cas9基因片段；从pSGKP-km质粒中PCR扩增得到sacB蔗糖筛选基因片段。

用于扩增Cas9基因片段的引物序列为：

Cas9-F：5’-AGGAAACAGAATTCATGGATAAGAAATACTCAATA-3’(SEQ ID NO：5)

Cas9-R：5’-TACGCCAACCAGCCATCAGTCACCTCCTAGCTGACT-3’(SEQ ID NO：6)

用于扩增sacB基因片段的引物序列为：

sacB-F：5’-TACTGTTGTGGTAAATACCAAGCTTGCAACTTTATGCCCATGCAA C-3’(SEQ IDNO：7)

sacB-R：5’-GTCGACGGTATCGATACGGCATCAGAGCAGATTGTAC-3’(SEQ ID NO：8)

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述两条DNA片段分别进行扩增，反应体系为：32μL ddH₂O，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，10μL 5×PrimestarBuffer，1.5μL正义链引物(10μM)，1.5μL反义链引物(10μM)，0.5μL质粒DNA模板(1ng/μL)，0.5μL PrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后进行PCR，循环如下：98℃预变性30s；之后98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸3min或1.5min，共28个循环；接着72℃完全延伸5min；最后16℃保温。其中扩增Cas9基因片段的延伸时间为3min；扩增sacB基因片段的延伸时间为1.5min。

PCR扩增完成后，使用TAKARA公司的DpnI限制性内切酶消除扩增Cas9基因片段的PCR反应体系中的pCasKP-apr质粒模板，具体操作为：在完成扩增的Cas9基因片段PCR反应液中加入1μL DpnI酶，使用移液枪吹吸混匀后置于37℃恒温培养箱中温育1h。然后，使用康宁生物科学(吴江)有限公司产生的AxyPrep PCR清洁试剂盒对上述两管PCR产物分别进行纯化回收。PCR产物纯化的操作步骤按照试剂盒提供的操作说明书进行。

(5)利用限制性内切酶对pAT04-apr质粒进行单酶切，将其由环状DNA转变为线性DNA片段。

使用NEB公司的BamHI-HF限制性内切酶对pAT04-apr质粒进行单酶切反应，反应体系为：24μL ddH₂O，20μL pAT04-apr质粒(50ng/μL)，1μL BamHI-HF，5μL 10×CutsmartBuffer。体系配制完成后进行酶切反应，反应条件为：37℃温育4h。

(6)通过In-Fusion克隆方法将步骤(4)和步骤(5)获得的DNA片段组装成一个环状质粒，命名为pCasAb质粒。

使用TAKARA公司的In-Fusion HD Cloning Kit试剂盒进行上述三个DNA片段的组装，反应体系为：2μL Cas9基因片段(80ng/μL)，1μL sacB基因片段(100ng/μL)，3μL线性化质粒片段(30ng/μL)，2μL ddH₂O，2μL In-Fusion HD enzyme premix。体系配制完成后进行In-Fusion克隆反应，反应条件为：50℃温育15min，然后冰浴至少2min。

将上述的10μL反应产物转化到100μL大肠杆菌DH5apha感受态细胞中(上海唯地生物技术有限公司)，转化方法参照附带的说明书进行。接着，取100μL复苏液涂布在含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板上，待复苏液被固体培养基完全吸收后，将固体培养基平板倒置于37℃恒温培养箱培养约16h直至细菌转化子长出。随机挑取几个长出的细菌转化子转接保存，并使用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒抽提质粒，抽提步骤参照试剂盒提供的操作手册进行。提取的pCasAb质粒送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，测序正确的pCasAb质粒用于下一步质粒构建实验。含有正确pCasAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M 2019464。

该pCasAb质粒的特征在于是一种革兰氏阴性菌广宿主质粒，能够在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中复制传代；该质粒具有阿布拉霉素抗性基因，能够用于大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的筛选；该质粒能够在鲍曼不动杆菌中经半乳糖及其类似物(如：IPTG)诱导后表达RecAb重组酶系统和Cas9核酸酶，用于基因组编辑；该质粒拥有蔗糖敏感基因sacB，能够在鲍曼不动杆菌株中实现质粒消除。

实施例二：pSGAb质粒构建

pSGAb质粒的组成如附图1B所示，其序列为SEQ ID NO：2，其具体构建方法如下：

(1)通过聚合酶链式反应(PCR)从pWH1266质粒中扩增得到WH1266质粒复制子DNA片段。用于PCR扩增的引物序列为：

WH1266-ori-F：5’-TGAGAGTGCACCATAGGATTTTAACATTTTGCGTTGTTC-3’(SEQ ID NO：9)

WH1266-ori-R：5’-ATTTCACACCGCATAGCCAAGATCGTAGAAATATCTATGA-3’(SEQ IDNO：10)

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述DNA片段进行扩增，PCR反应体系为：32μL ddH₂O，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，10μL 5×Primestar Buffer，1.5μL WH1266-ori-F(10μM)，1.5μL WH1266-ori-R(10μM)，0.5μL pWH1266质粒模板(1ng/μL)，0.5μL PrimerSTAR HS DNA Polymerase。

体系配置完成后进行PCR扩增，扩增参数为：98℃预变性30s；之后98℃变性10s，54℃退火15s，72℃延伸1min，共28个循环；接着72℃完全延伸5min；最后16℃保温。

使用康宁生物科学(吴江)有限公司产生的AxyPrep PCR清洁试剂盒对上述PCR产物进行纯化回收。PCR产物纯化的操作步骤按照试剂盒提供的操作说明书进行。

(2)利用限制性内切酶对pSGKP-km质粒进行单酶切，将其由环状DNA转变为线性DNA片段。

使用NEB公司的NdeI-HF限制性内切酶对pSGKP-km质粒进行单酶切反应，反应体系为：39μL ddH₂O，5μL pSGKP-km质粒(200ng/μL)，1μL BamHI-HF，5μL 10×CutsmartBuffer。体系配制完成后进行酶切反应，反应条件为：37^℃温育4h。

(3)通过In-Fusion克隆方法将步骤(1)和步骤(2)获得的DNA片段组装成一个环状质粒，命名为pSGAb质粒。

使用TAKARA公司的In-Fusion HD Cloning Kit试剂盒进行上述两个DNA片段的组装，反应体系为：1μL WH1266质粒复制子DNA片段(100ng/μL)，3μL线性化质粒片段(30ng/μL)，4μL ddH₂O，2μL In-Fusion HD enzyme premix。体系配制完成后进行In-Fusion克隆反应，反应条件为：50℃温育15min，然后冰浴至少2min。

将上述的10μL反应产物转化到100μL大肠杆菌DH5apha感受态细胞中(上海唯地生物技术有限公司)，转化方法参照附带的说明书进行。接着，取100μL复苏液涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上，带复苏液被固体培养基完全吸收后，将固体培养基平板倒置于37℃恒温培养箱培养约16h直至细菌转化子长出。随机挑取几个长出的细菌转化子转接保存，并使用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒抽提质粒，抽提步骤参照试剂盒提供的操作手册进行。提取的pSGAb质粒送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，测序正确的pSGAb质粒用下游实验。含有正确pSGAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M 2019465。

该pSGAb质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中复制传代；该质粒在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中都具有卡那霉素抗性，能够用于菌株筛选；该质粒能在鲍曼不动杆菌中表达sgRNA，用于基因组DNA靶点的定位，引导Cas9核酸酶至靶点位置；含有两个BsaI酶切位点，能够通过golden gate反应无缝插入spacer片段；拥有蔗糖敏感基因sacB，能够在鲍曼不动杆菌株中实现质粒消除。

实施例三：将spacer片段插入pSGAb质粒

为了使sgRNA和Cas9核酸酶复合物能够定位到鲍曼不动杆菌基因组DNA的特定靶点处进行切割，需要将靶点的spacer序列插入到sgRNA表达基因中，其插入方法如下：

(1)首先在目标基因上选定某一NGG(N代表A/T/G/C任意碱基)序列前的20个碱基序列(这20个碱基序列称为spacer，NGG不包含在其中，spacer序列的GC比例控制在20～80％)。本步骤的特征在于：为使spacer片段能插入pSGAb质粒，需要在spacer序列正义链5’端加上tagt接头，同时在spacer序列反义链5’端加上aaac接头，其具体的引物设计模板如下：

正义链引物：5’-tagtNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

反义链引物：3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNcaaa-5’

按上述模板设计好spacer的正义链引物和反义链引物送至金唯智生物科技有限公司进行引物合成。

(2)将上述两条合成的spacer引物进行磷酸化并以碱基互补配对方式退火成双链DNA，具体反应体系如下：1μL spacer正义链引物(100μM)，1μL spacer反义链引物(100μM),1μL T4PNK polynucleotide kinase(TAKARA公司)，5μL 10×T4 DNA ligase Buffer，42μLddH₂O。应注意，磷酸化反应体系中添加的是含有10mM ATP的T4 DNA ligase Buffer。反应条件为：37℃温育0.5～1h。然后向反应产物中加入0.5μL 5M NaCl溶液，混合均匀后进行退火处理，退火参数条件为：95℃温育5min，再以每10s降温1℃的速度缓慢降温到25℃。该反应过程在PCR仪中进行。完成退火反应后，使用ddH₂O对反应产物进行十倍稀释，用于后续实验。

(3)将上述得到的双链DNA插入pSGAb质粒的BsaI位点处，反应体系为：1μL上述十倍稀释的退火双链DNA，1μL pSGAb质粒(50ng/μL)，1μL 10×T4 DNA ligase Buffer，0.5μLT4 DNA ligase(NEB公司)，0.5μL BsaI-HF(NEB公司)，6μL ddH₂O，总体积共10μL。反应条件为：37℃温育3min，16℃温育4min，共25个循环；然后50℃温育5min，80℃温育15min。该反应过程在PCR仪中进行。

(4)将上一步反应产物转化至大肠杆菌DH5alpha感受态细胞中(上海唯地生物技术有限公司)，转化步骤参照附带说明书进行，大致为：将10μL反应产物与刚刚融化的100μL大肠杆菌DH5alpha感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min，然后42℃热激1min，继续冰浴2min后加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，置于37℃摇床中复苏40-60min，最后取适量复苏菌液涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，倒置于37℃恒温培养箱培养过夜，直至转化子长出。随机挑取一些转化子，经LB液体扩增后使用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，并取部分质粒溶液送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，以验证插入spacer片段的正确性。

实施例四：制备野生型鲍曼不动杆菌电转感受态细胞

用无菌接种环沾取甘油管保藏的野生型鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株，在LB固体培养基平板上进行划线，倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜直至菌体长出。在平板上挑取一个单克隆菌落，接种到5mL不含抗生素的LB液体试管中，在37℃摇床中振荡培养过夜。取1mL新鲜的过夜培养菌液接种至100mL不含抗生素的LB液体培养基中，在37℃摇床中继续振荡培养。当菌液的OD₆₀₀值达到0.5左右时，将菌液冰浴20min，然后在预冷的4℃离心机以3200g离心力离心5min，弃去上清培养液并收集菌体。使用40mL 4℃预冷的10％无菌甘油重悬菌体沉淀，并以相同的离心参数再次离心，重新获得菌体沉淀；重复该甘油洗涤步骤一次。将获得的菌体沉淀用1mL 4℃预冷的10％无菌甘油重悬，即为制备完成的野生型鲍曼不动杆菌电转感受态细胞。该感受态细胞以50μL等份分装到无菌EP管中，液氮速冻后放入-80℃冰箱保存。

本实施例的特征在于，可以制备任意品种的野生型鲍曼不动杆菌电转感受态细胞，此处仅以鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株为例。

实施例五：将质粒电转入鲍曼不动杆菌电转感受态细胞

取一管实施例四中制备的鲍曼不动杆菌电转感受态细胞，冰浴几分钟至冰冻细胞刚刚融化，然后加入约200ng质粒(体积不超过5μL)并轻轻混匀。此处以pCasAb质粒为例，将上述电转感受态细胞与pCasAb质粒的混合物转移至提前预冷的2mm电转杯(Bio-Rad公司)，使用GenePulser Xcell电穿孔仪(Bio-Rad公司)进行电转化。电转化参数为：2.5kV，200Ω，25μF，正常的电击时间为4.8-5.3ms之间。电击后立即加入1mL不含抗生素的LB培养液洗出电击后的细胞，转入无菌的EP管中，在37℃摇床中复苏培养1.5h。取100μL复苏液涂布在含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板上，待菌液被吸收后，于37℃培养箱中倒置培养过夜，只有成功转入pCasAb质粒的鲍曼不动杆菌才能生长。

实施例六：制备含pCasAb质粒的鲍曼不动杆菌电转感受态细胞

挑取一个实施例五中获得的含pCasAb质粒的鲍曼不动杆菌转化子单菌落，接种至5mL含有100μg/mL阿布拉霉素的LB液体试管中，在37℃摇床中振荡培养过夜。取1mL新鲜的过夜培养菌液接种至100mL含100μg/mL阿布拉霉素的LB液体培养基中，在37℃摇床中继续振荡培养。当菌液的OD₆₀₀值达到0.1～0.2时，添加100μL1M IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)溶液以诱导RecAb重组酶和Cas9核酸酶表达。继续诱导培养2h后，将菌液置于冰上冰浴20min，然后在预冷的4℃离心机以3200g离心力离心5min收集菌体，弃去上清培养液并收集菌体。使用40mL 4℃预冷的10％无菌甘油重悬菌体沉淀，并以相同的离心参数再次离心，重新获得菌体沉淀；重复该甘油洗涤步骤一次。将获得的菌体沉淀用1mL 4℃预冷的10％无菌甘油重悬，即为制备完成的含pCasAb质粒的鲍曼不动杆菌电转感受态细胞。应注意的是，该感受态细胞中含有已表达的RecAb重组酶和Cas9核酸酶蛋白，因此制备完成后应立即使用，而不要冻存。

实施例七：pCasAb/pSGAb双质粒系统实现鲍曼不动杆菌高效基因敲除

使用pCasAb/pSGAb双质粒系统可以在鲍曼不动杆菌中实现对不同基因的高效敲除。实验中选取oxyR基因为例，在鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株中进行基因敲除实验。附图2A为使用pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行基因组编辑的原理图，附图2B显示的是oxyR基因敲除的PCR验证、DNA测序和H₂O₂敏感实验结果。

鲍曼不动杆菌中基因敲除的步骤如下：

(1)本实验选定的oxyR基因的spacer序列为：5’-ATTGTAGAGCGCCTAGAACA-3’(SEQID NO：11)，具体设计的引物序列如下：

oxyR-spacer-F：tagtATTGTAGAGCGCCTAGAACA(SEQ ID NO：12)

oxyR-spacer-R：aaacTGTTCTAGGCGCTCTACAAT(SEQ ID NO：13)

在金唯智生物科技有限公司合成上述两条引物，并按照实施例三中的步骤将oxyR_spacer插入到实施例二构建的pSGAb质粒中，得到pSGAb-oxyR质粒。得到的pSGAb-oxyR质粒送到金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，测序正确的质粒用于后续的oxyR基因敲除实验。

(2)在oxyR_spacer序列的上下游各挑选40nt的DNA序列用作同源修复模板的上下游序列，同源修复模板的上下游序列之间的距离视所需敲除的DNA片段长度而定。本oxyR敲除实验所选择的oxyR修复模板上游序列为：5’-TTGATGAAGTGCATCAACAATTACCGAAGATTCAGTTGCA-3’(SEQ ID NO：14)；下游序列为：5’-ATGATCTCGATTTATCACGTCTCATTTTGCTTGAAGAAGG-3’(SEQ ID NO：15)；将上下游序列拼接为一个完整的80nt同源修复模板序列oxyR-ssDNA，其序列为5’-TTGATGAAGTGCATCAACAATTACCGAAGATTCAGTTGCAATGATCTCGATTTATCACGTCTCATTTTGCTTGAAGAAGG-3’(SEQ ID NO：16)。在金唯智生物科技有限公司合成该80nt序列的单链DNA片段，用作oxyR基因敲除的同源修复模板。

(3)取约200ng的pSGAb-oxyR质粒和3μL oxyR-ssDNA(100μM)(总体积不超过5μL)，混匀后加入到实施例六制备的含pCasAb质粒的鲍曼不动杆菌电转感受态细胞中，接着按照实施例五的步骤将质粒与ssDNA混合物电转化进鲍曼不动杆菌中。在复苏1.5h后，取适量复苏菌液涂布同时含有100μg/mL阿布拉霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，然后倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜直至转化子长出。

(4)随机挑取一些上一步得到的鲍曼不动杆菌的转化子单菌落，通过菌落PCR初步验证其oxyR基因是否敲除成功。菌落PCR的反应体系为：10μL 2×Estaq Mastermix(康为世纪公司)，0.5μL oxyR-seq-F(10μM)，0.5μL oxyR-seq-R(10μM)，9μL ddH₂O，然后用无菌牙签沾取少量鲍曼不动杆菌转化子菌体至反应体系中作为扩增模板。本oxyR基因敲除验证实验的菌落PCR扩增条件参数为：95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环；然后72℃完全延伸5min，最后进行16℃保温。待菌落PCR反应结束后，每管PCR反应溶液中吸取1μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以对其扩增产物进行分析。本实验所使用的琼脂糖凝胶浓度为1％，电泳缓冲液体系为1×TAE。电泳结束后，取出琼脂糖凝胶在凝胶成像仪(Bio-Rad公司)中进行拍照，观察PCR扩增产物DNA条带的位置和大小。与野生型对照条带相比，oxyR成功敲除的鲍曼不动杆菌细胞的PCR扩增产物会小一些，从而初步判断oxyR是否被敲除。这些PCR产物可送至生物公司进行DNA测序，根据DNA测序结果进一步判断oxyR基因是否按照预期被敲除。

本步骤的特征在于进行菌落PCR验证的引物分别位于oxyR同源修复模板外侧的上下游序列中，此时无论oxyR基因是否被敲除，都可以扩增出一定长度的DNA片段，排除可能存在的实验误差。由于oxyR基因被敲除后，扩增得到的DNA片段长度会缩短，此时可根据扩增产物的长度对oxyR是否敲除成功进行初步判断。本实验使用的oxyR基因敲除验证引物序列分别为：

oxyR-seq-F：5’-ACTTTATCGGGCGGCATTAT-3’(SEQ ID NO：17)；

oxyR-seq-R：5’-GTACGGCTAGGTGCGTCTTC-3’(SEQ ID NO：18)。

若鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株中的oxyR基因未被敲除，则可获得长度为710bp的PCR扩增产物；若oxyR敲除成功，则可获得长度为498bp的PCR扩增产物。从图2B的电泳图中可以看出，本实验随机挑取的15个鲍曼不动杆菌的转化子单菌落中，14个都成功进行了oxyR基因敲除。

(5)将上一步获得的PCR产物送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，测序结果进一步证实了14/15的oxyR基因敲除结果。本实验使用的DNA测序引物为上一步骤实验中使用的oxyR-seq-F引物。

(6)本实验所敲除的oxyR基因为鲍曼不动杆菌耐受H₂O₂的重要基因，oxyR基因的敲除可导致鲍曼不动杆菌对H₂O₂敏感性的增加。为从表型确认oxyR基因已被成功敲除，本实验按照实施例十提供的步骤执行H₂O₂敏感实验。从附图2B的实验结果可以看出，除10号转化子外，其余鲍曼不动杆菌的转化子单菌落均对H₂O₂的敏感性增加，与菌落PCR验证结果一致。

(7)对于已确认oxyR基因成功敲除的鲍曼不动杆菌转化子单菌落，按照实施例十一提供的步骤执行pCasAb和pSGAb-oxyR质粒的同时消除。质粒成功消除的oxyR基因敲除菌株，可使用甘油管进行保藏，或用于其他相关实验。

实施例八：pCasAb/pSGAb双质粒系统实现鲍曼不动杆菌高效基因插入

使用pCasAb/pSGAb双质粒系统可以在鲍曼不动杆菌中实现对不同基因的高效插入。实验中选取iscA基因与hscB基因的间隙作为插入位点，以可表达紫色色素蛋白的amilCP基因作为插入基因，在鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株中进行基因插入实验。附图2C显示的是amilCP基因插入实验的鲍曼不动杆菌转化子平板照片以及PCR验证和DNA测序结果。

鲍曼不动杆菌中基因插入的步骤如下：

(1)本实验选定的amilCP基因插入位点的spacer序列为：5’-AATGAGAAAAAGGAAAGGAG-3’(SEQ ID NO：19)，具体设计的引物序列如下：

amilCP-spacer-F：5’-tagtAATGAGAAAAAGGAAAGGAG-3’(SEQ ID NO：20)

amilCP-spacer-R：5’-aaacCTCCTTTCCTTTTTCTCATT-3’(SEQ ID NO：21)

在金唯智生物科技有限公司合成上述两条引物，并按照实施例三中的步骤将amilCP_spacer插入到实施例二得到的pSGAb质粒中，得到pSGAb-amilCP质粒。得到的pSGAb-amilCP质粒送到金唯智生物科技有限公司测序，测序确认正确的pSGAb-amilCP质粒用于后续的amilCP基因插入实验。

(2)在amilCP插入位点两侧各扩增200-300bp的DNA片段用作同源重组模板，同时扩增amilCP紫色色素蛋白表达基因。用于扩增上游同源臂的引物序列为：

iscA-UP-F：5’-GTAGATGATATCGATGAACATGAT-3’(SEQ ID NO：22)

iscA-UP-R：5’-GAGAGGATTAAACAGTGA-3’(SEQ ID NO：23)

用于扩增下游同源臂的引物序列为：

hscB-DOWN-F：5’-CTTTCCTTTTTCTCATTAAAACAG-3’(SEQ ID NO：24)

hscB-DOWN-R：5’-GATTGATCAAGATGATGATCTTG-3’(SEQ ID NO：25)

用于扩增amilCP基因的引物序列为：

amilCP-F：5’-TCACTGTTTAATCCTCTCTTGACGGCTAGCTCAGTCC-3’(SEQ ID NO：26)

amilCP-R：5’-TAATGAGAAAAAGGAAAGTTAGGCGACCACAGGTTTGC-3’(SEQ ID NO：27)

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述三个DNA片段分别进行扩增，反应体系为：32μL ddH₂O，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，10μL 5×PrimestarBuffer，1.5μL正义链引物(10μM)，1.5μL反义链引物(10μM)，0.5μL模板DNA，0.5μLPrimerSTAR HS DNA Polymerase。其中用于扩增上下游同源臂DNA片段所用的模板DNA为鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株的基因组DNA，浓度为80ng/μL；用于扩增amilCP基因DNA片段所用的模板DNA为pUC57-amilCP质粒DNA，浓度为1ng/μL。本实验使用的pUC57-amilCP质粒中的amilCP基因是在金唯智生物科技有限公司通过全基因合成获得，具体序列为：

5’-TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCTACTAGAGCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGAGTGTGATCGCTAAACAAATGACCTACAAGGTTTATATGTCAGGCACGGTCAATGGACACTACTTTGAGGTCGAAGGCGATGGAAAAGGTAAGCCCTACGAGGGGGAGCAGACGGTAAAGCTCACTGTCACCAAGGGCGGACCTCTGCCATTTGCTTGGGATATTTTATCACCACAGTGTCAGTACGGAAGCATACCATTCACCAAGTACCCTGAAGACATCCCTGACTATGTAAAGCAGTCATTCCCGGAGGGCTATACATGGGAGAGGATCATGAACTTTGAAGATGGTGCAGTGTGTACTGTCAGCAATGATTCCAGCATCCAAGGCAACTGTTTCATCTACCATGTCAAGTTCTCTGGTTTGAACTTTCCTCCCAATGGACCTGTCATGCAGAAGAAGACACAGGGCTGGGAACCCAACACTGAGCGTCTCTTTGCACGAGATGGAATGCTGCTAGGAAACAACTTTATGGCTCTGAAGTTAGAAGGAGGCGGTCACTATTTGTGTGAATTTAAAACTACTTACAAGGCAAAGAAGCCTGTGAAGATGCCAGGGTATCACTATGTTGACCGCAAACTGGATGTAACCAATCACAACAAGGATTACACTTCGGTTGAGCAGTGTGAAATTTCCATTGCACGCAAACCTGTGGTCGCCTAATAATACTAGTAGCGGCCGCTGCAGTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGA-3’(SEQ IDNO：28)

PCR体系配置完成后执行PCR扩增，增条件参数为：98℃预变性30s；之后98℃变性10s，54℃退火15s，72℃延伸30s，共28个循环；接着72℃完全延伸5min；最后16℃保温。

PCR扩增完成后，使用康宁生物科学(吴江)有限公司生产的AxyPrep PCR清洁试剂盒对上述PCR产物进行纯化回收。PCR产物纯化的操作步骤按照试剂盒提供的操作说明书进行。

(3)通过overlap PCR将上一步获得的三个DNA片段依次拼接，成为一个完整的DNA片段。overlap PCR反应体系为：31μL ddH₂O，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，10μL 5×Primestar Buffer，0.5μL上游同源臂片段(50ng/μL)，0.5μL amilCP基因片段(50ng/μL)，0.5μL下游同源臂片段(50ng/μL)，0.5μL PrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后先进行少量的循环反应，用于各片段之间依次搭桥连接，具体参数为：98℃预变性30s；之后98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，共5个循环；接着72℃完全延伸5min。接着再向overlap PCR体系中加入1.5μL iscA-UP-F(10μM)引物和1.5μL hscB-DOWN-R(10μM)引物，再进行PCR扩增反应，具体参数为：98℃预变性30s；之后98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，共26个循环；接着72℃完全延伸5min；最后16℃保温。

overlap PCR反应完成后，使用康宁生物科学(吴江)有限公司产生的AxyPrep PCR清洁试剂盒对上述PCR产物进行纯化回收。PCR产物纯化的操作步骤按照试剂盒提供的操作说明书进行。

(4)取约200ng pSGAb-amilCP质粒和约500ng纯化后的overlap PCR产物(总体积不超过5μL)，混匀后加入到实施例六制备的含pCasAb质粒的鲍曼不动杆菌电转感受态细胞中，接着按照实施例五的步骤将质粒和DNA片段电转进鲍曼不动杆菌中。在复苏1.5h后，取适量复苏菌液涂布同时含有100μg/mL阿布拉霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，然后倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜直至转化子长出。

(5)从附图2C可以看出，LB固体培养基平板上长出了大量紫色或白色的转化子单菌落，经计数，分别有1337个紫色单菌落和412个白色单菌落。这些紫色菌落表明amilCP基因已成功表达。

(6)随机挑取6个紫色的鲍曼不动杆菌的转化子单菌落，通过菌落PCR初步验证amilCP基因是否成功插入基因组DNA的预期位点。菌落PCR的反应体系为：10μL 2×EstaqMastermix(康为世纪公司)，0.5μL iscA-seq-F(10μM)，0.5μL hscB-seq-R(10μM)，9μLddH₂O，然后用无菌牙签沾取少量紫色的鲍曼不动杆菌转化子菌体至反应体系中作为扩增模板。本amilCP基因插入实验的菌落PCR扩增条件参数为：95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共28个循环；然后72℃完全延伸5min，最后进行16℃保温。待菌落PCR反应结束后，每管PCR反应溶液中吸取1μL扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液体系为1×TAE。电泳结束后，取出琼脂糖凝胶在凝胶成像仪(Bio-Rad公司)中进行拍照，观察PCR扩增产物DNA条带的位置和大小。与野生型对照条带相比，amilCP基因插入成功的鲍曼不动杆菌转化子的PCR扩增产物条带会大一些，从而初步判断amilCP基因是否插入。然后这些PCR产物可送至生物公司进行DNA双向测序，根据DNA测序结果进一步判断amilCP基因是否按照预期成功插入。

本步骤的特征在于进行菌落PCR验证的引物分别位于同源重组模板片段外侧的上下游，此时无论amilCP基因是否成功插入，都可以扩增出一定长度的DNA扩增产物，排除可能存在的实验误差。若amilCP基因插入成功，扩增得到的DNA片段长度将长于野生型对照组，可对amilCP基因是否插入成功做出初步判断。本实验使用的amilCP基因插入验证引物序列分别为：

iscA-seq-F：5’-TGGGTTGGCTTATGTTCTCG-3’(SEQ ID NO：29)

hscB-seq-R：5’-GTACGGTATCGCGTGCTTCT-3’(SEQ ID NO：30)

若amilCP基因成功插入到鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株的iscA基因与hscB基因之间，则可扩增出长度为1535bp的PCR产物；若amilCP基因未插入到基因组的预期位置，则扩增产物的长度为720bp。从附图2C的电泳图可以看出，本实验随机挑取的6个鲍曼不动杆菌的紫色转化子单菌落中，除4号转化子扩增产物不纯外，其余5个转化子都扩增得到了长于野生型对照组的扩增产物条带。

(7)将上一步获得的PCR产物送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，测序结果进一步证实了5/6的amilCP基因插入结果。由于本实验需测序的DNA片段较长(1535bp)，因此使用实验上一步实验中的iscA-seq-F引物和hscB-seq-R引物进行双向DNA测序。

(8)对于已确认amilCP基因插入成功的鲍曼不动杆菌转化子单菌落，按照实施例十一提供的步骤执行pCasAb和pSGAb-amilCP质粒的同时消除。质粒消除成功的amilCP基因插入菌株，可使用甘油管进行保藏，或用于其他相关实验。

实施例九：pCasAb/pSGAb双质粒系统实现鲍曼不动杆菌高效单碱基突变

使用pCasAb/pSGAb双质粒系统可以在鲍曼不动杆菌中实现对不同基因的高效单碱基突变。实验中选取oxyR基因为例，在鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株中进行单碱基突变实验。附图2D显示的是pCasAb/pSGAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌进行单碱基突变的示意图和DNA测序结果。

鲍曼不动杆菌中单碱基突变的步骤如下：

(1)本实验选定的spacer序列为：5’-CGTCTCATTTTGCTTGAAGA-3’(SEQ ID NO：31)，具体设计的引物序列如下：

oxyR1-spacer-F：5’-tagtCGTCTCATTTTGCTTGAAGA-3’(SEQ ID NO：32)

oxyR1-spacer-R：5’-aaacTCTTCAAGCAAAATGAGACG-3’(SEQ ID NO：33)

在金唯智生物科技有限公司合成上述两条引物，并按照实施例三中的步骤将oxyR1_spacer插入到实施例二得到的pSGAb质粒中，得到pSGAb-oxyR1质粒。得到的pSGAb-oxyR1质粒送到金唯智生物科技有限公司测序，测序确认正确的pSGAb-oxyR1质粒用于后续实验。

(2)在oxyR1_spacer序列两侧各挑选40nt的DNA，并在其中添加一个20nt的外源spacer序列，将其拼接为一个完整的100nt ssDNA序列，并在金唯智生物科技有限公司进行合成，用作同源修复模板。本实验选取的外源spacer序列来自绿色荧光蛋白GFP基因，具体序列为：5’-GCTGAAGGGCATCGACTTCA-3’(SEQ ID NO：34)。本实验合成的100nt ssDNA同源修复模板序列为：5’-TGCACTTCAAGCAAATTCACTTGATGATCTCGATTTATCAGCTGAAGGGC ATCGACTTCAAGGCCACTGCTTACGTGATCATGTATTAAGTGCCTGTCCA-3’(SEQ ID NO：35)。

(3)取约200ng pSGAb-oxyR1质粒和2μL上一步合成的100nt ssDNA(100μM)修复模板(总体积不超过5μL)，混匀后加入到实施例六制备的含pCasAb质粒的鲍曼不动杆菌电转感受态细胞中，接着按照实施例五的步骤将质粒与ssDNA混合物电转化进鲍曼不动杆菌中。在复苏1.5h后，取适量复苏菌液涂布同时含有100μg/mL阿布拉霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，然后倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜直至转化子长出。

(4)随机挑取一些鲍曼不动杆菌的转化子单菌落，使用实施例七步骤(4)和步骤(5)提供的步骤和引物，扩增含有spacer区域的DNA片段并进行测序，选取oxyR1_spacer序列被成功替换为来自GFP基因的外源spacer序列的转化子，按照实施例十一提供的步骤执行pCasAb和pSGAb-oxyR1质粒的同时消除。质粒消除成功的oxyR1_spacer替换菌株用于下一步实验。

(5)设计并合成针对GFP_spacer的引物，其具体序列为：

GFP-spacer-F：5’-tagtGCTGAAGGGCATCGACTTCA-3’(SEQ ID NO：36)

GFP-spacer-R：5’-aaacTGAAGTCGATGCCCTTCAGC-3’(SEQ ID NO：37)

按照实施例三中的步骤将GFP_spacer插入到实施例二得到的pSGAb质粒中，得到pSGAb-GFP质粒。得到的pSGAb-GFP质粒送到金唯智生物科技有限公司测序，测序确认正确的pSGAb-GFP质粒用于后续实验。

(6)设计oxyR基因单碱基突变位点上下游各约1000bp的扩增产物的引物，同时在设计引物时引入突变后的位点序列。

本实验设计扩增oxyR基因单碱基突变位点上游片段的引物具体序列为：

oxyR-C202S-upF:5’-CTTGATTGGCAAGCCAGAA-3’(SEQ ID NO：38)

oxyR-C202S-upR：5’-ggaGTGGCCTTCTTCAAGCAAAATGA-3’(SEQ ID NO：39)

oxyR-C202S-downF：5’-tccTTACGTGATCATGTATTAAGTGCCTG-3’(SEQ ID NO：40)

oxyR-C202S-downR：5’-TGCGGATCAGAAGTGCTATG-3’(SEQ ID NO：41)

(7)以鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株基因组DNA为模板，使用实施例八中步骤(2)提供的方法分别扩增出上述两个DNA片段，并通过实施例八中步骤(3)提供的overlap PCR方法将上述两个DNA片段拼接为一个完整的DNA片段。

(8)取用步骤(4)中已成功消除质粒的鲍曼不动杆菌株，首先通过实施例四的方法制备为电转感受态细胞，接着通过实施例五的方法电转化pCasAb质粒，再通过实施例六的方法再次制备为电转感受态细胞，并在其中加入约200ng步骤(5)构建的pSGAb-GFP质粒和约500ng纯化后的上一步overlap PCR产物(总体积不超过5μL)，轻轻混匀后参照实施例五的方法执行电转化操作，并涂布同时含有100μg/mL阿布拉霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，然后倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜直至转化子长出。

(9)随机挑取一些转化子，按照实施例七步骤(4)的方法执行菌落PCR扩增，并将PCR扩增产物送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，验证单碱基突变是否成功。本实验使用的PCR扩增引物分别为：

oxyR-LF：5’-TGCTTCTCGACCGTTTAGGA-3’(SEQ ID NO：42)

oxyR-LR：5’-GGTTAATGCCAGTGACTGCTT-3’(SEQ ID NO：43)

进行DNA测序的引物序列为：

oxyR-seq-F：5’-ACTTTATCGGGCGGCATTAT-3’(SEQ ID NO：17)。

测序结果显示,在选取的10个转化子单菌落中，8个单碱基突变成功。

实施例十：鲍曼不动杆菌的H₂O₂敏感实验

挑取不同的鲍曼不动杆菌菌株接种到LB液体培养基中，置于37℃摇床中振荡培养过夜。取少量新鲜的菌液，通过3200g离心5min去除培养液上清后，使用无菌生理盐水将菌体沉淀重悬至0.5麦氏浊度，再进行十倍稀释。取2μL稀释后的菌液滴在含有0.25mM H₂O₂的LB固体培养基平板上，静置几分钟直至菌液被固体培养基吸收，然后将平板倒置于37℃恒温培养箱培养过夜。第二天取出平板，观察各菌株在平板上的生长状况，并拍照记录。

实施例十一：鲍曼不动杆菌中pCasAb质粒和pSGAb质粒的消除

将含有pCasAb质粒和插入了spacer的pSGAb质粒的鲍曼不动杆菌接种至不含抗生素的5mL LB液体培养基试管中，置于37℃摇床振荡培养过夜。第二天，用无菌接种环沾取过夜培养的菌液，在含有5％蔗糖的LB固体培养基平板上进行划线，并倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。由于pCasAb质粒和pSGAb质粒中都含有蔗糖敏感基因sacB，它表达的分泌型蔗糖果聚糖酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成有毒的高分子量的果聚糖，造成细菌死亡。因此，携带有质粒的鲍曼不动杆菌不能在含有蔗糖的培养基中生长，只有pCasAb质粒和pSGAb质粒都被消除了的鲍曼不动杆菌才能生长出来。

为进一步确认质粒的消除，从含有5％蔗糖的LB固体培养基平板上挑取长出的单菌落，依次在分别含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板、50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板和不含抗生素的LB固体培养基平板划线，并置于倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。若仅在不含抗生素的LB固体培养基平板上可以生长，而在含抗生素的另外两种平板上不能生长，则确认pCasAb质粒和pSGAb质粒均已消除成功，可对其进行保藏或用于其他实验。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海科技大学

<120> 双质粒系统及其应用

<130> PCN1191764

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16599

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCasAb/pSGAb双质粒系统

<400> 1

agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac 60

gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg 120

accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc 180

atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg 240

gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg 300

ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca 360

taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt 420

ctacaaactc ttttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 480

ataaccctgg atccgggctt atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag 540

ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc 600

aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa 660

tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag 720

cggataacaa tttcacacag gaaacagaat tcatggataa gaaatactca ataggcttag 780

atatcggcac aaatagcgtc ggatgggcgg tgatcactga tgaatataag gttccgtcta 840

aaaagttcaa ggttctggga aatacagacc gccacagtat caaaaaaaat cttatagggg 900

ctcttttatt tgacagtgga gagacagcgg aagcgactcg tctcaaacgg acagctcgta 960

gaaggtatac acgtcggaag aatcgtattt gttatctaca ggagattttt tcaaatgaga 1020

tggcgaaagt agatgatagt ttctttcatc gacttgaaga gtcttttttg gtggaagaag 1080

acaagaagca tgaacgtcat cctatttttg gaaatatagt agatgaagtt gcttatcatg 1140

agaaatatcc aactatctat catctgcgaa aaaaattggt agattctact gataaagcgg 1200

atttgcgctt aatctatttg gccttagcgc atatgattaa gtttcgtggt cattttttga 1260

ttgagggaga tttaaatcct gataatagtg atgtggacaa actatttatc cagttggtac 1320

aaacctacaa tcaattattt gaagaaaacc ctattaacgc aagtggagta gatgctaaag 1380

cgattctttc tgcacgattg agtaaatcaa gacgattaga aaatctcatt gctcagctcc 1440

ccggtgagaa gaaaaatggc ttatttggga atctcattgc tttgtcattg ggtttgaccc 1500

ctaattttaa atcaaatttt gatttggcag aagatgctaa attacagctt tcaaaagata 1560

cttacgatga tgatttagat aatttattgg cgcaaattgg agatcaatat gctgatttgt 1620

ttttggcagc taagaattta tcagatgcta ttttactttc agatatccta agagtaaata 1680

ctgaaataac taaggctccc ctatcagctt caatgattaa acgctacgat gaacatcatc 1740

aagacttgac tcttttaaaa gctttagttc gacaacaact tccagaaaag tataaagaaa 1800

tcttttttga tcaatcaaaa aacggatatg caggttatat tgatggggga gctagccaag 1860

aagaatttta taaatttatc aaaccaattt tagaaaaaat ggatggtact gaggaattat 1920

tggtgaaact aaatcgtgaa gatttgctgc gcaagcaacg gacctttgac aacggctcta 1980

ttccccatca aattcacttg ggtgagctgc atgctatttt gagaagacaa gaagactttt 2040

atccattttt aaaagacaat cgtgagaaga ttgaaaaaat cttgactttt cgaattcctt 2100

attatgttgg tccattggcg cgtggcaata gtcgttttgc atggatgact cggaagtctg 2160

aagaaacaat taccccatgg aattttgaag aagttgtcga taaaggtgct tcagctcaat 2220

catttattga acgcatgaca aactttgata aaaatcttcc aaatgaaaaa gtactaccaa 2280

aacatagttt gctttatgag tattttacgg tttataacga attgacaaag gtcaaatatg 2340

ttactgaagg aatgcgaaaa ccagcatttc tttcaggtga acagaagaaa gccattgttg 2400

atttactctt caaaacaaat cgaaaagtaa ccgttaagca attaaaagaa gattatttca 2460

aaaaaataga atgttttgat agtgttgaaa tttcaggagt tgaagataga tttaatgctt 2520

cattaggtac ctaccatgat ttgctaaaaa ttattaaaga taaagatttt ttggataatg 2580

aagaaaatga agatatctta gaggatattg ttttaacatt gaccttattt gaagataggg 2640

agatgattga ggaaagactt aaaacatatg ctcacctctt tgatgataag gtgatgaaac 2700

agcttaaacg tcgccgttat actggttggg gacgtttgtc tcgaaaattg attaatggta 2760

ttagggataa gcaatctggc aaaacaatat tagatttttt gaaatcagat ggttttgcca 2820

atcgcaattt tatgcagctg atccatgatg atagtttgac atttaaagaa gacattcaaa 2880

aagcacaagt gtctggacaa ggcgatagtt tacatgaaca tattgcaaat ttagctggta 2940

gccctgctat taaaaaaggt attttacaga ctgtaaaagt tgttgatgaa ttggtcaaag 3000

taatggggcg gcataagcca gaaaatatcg ttattgaaat ggcacgtgaa aatcagacaa 3060

ctcaaaaggg ccagaaaaat tcgcgagagc gtatgaaacg aatcgaagaa ggtatcaaag 3120

aattaggaag tcagattctt aaagagcatc ctgttgaaaa tactcaattg caaaatgaaa 3180

agctctatct ctattatctc caaaatggaa gagacatgta tgtggaccaa gaattagata 3240

ttaatcgttt aagtgattat gatgtcgatc acattgttcc acaaagtttc cttaaagacg 3300

attcaataga caataaggtc ttaacgcgtt ctgataaaaa tcgtggtaaa tcggataacg 3360

ttccaagtga agaagtagtc aaaaagatga aaaactattg gagacaactt ctaaacgcca 3420

agttaatcac tcaacgtaag tttgataatt taacgaaagc tgaacgtgga ggtttgagtg 3480

aacttgataa agctggtttt atcaaacgcc aattggttga aactcgccaa atcactaagc 3540

atgtggcaca aattttggat agtcgcatga atactaaata cgatgaaaat gataaactta 3600

ttcgagaggt taaagtgatt accttaaaat ctaaattagt ttctgacttc cgaaaagatt 3660

tccaattcta taaagtacgt gagattaaca attaccatca tgcccatgat gcgtatctaa 3720

atgccgtcgt tggaactgct ttgattaaga aatatccaaa acttgaatcg gagtttgtct 3780

atggtgatta taaagtttat gatgttcgta aaatgattgc taagtctgag caagaaatag 3840

gcaaagcaac cgcaaaatat ttcttttact ctaatatcat gaacttcttc aaaacagaaa 3900

ttacacttgc aaatggagag attcgcaaac gccctctaat cgaaactaat ggggaaactg 3960

gagaaattgt ctgggataaa gggcgagatt ttgccacagt gcgcaaagta ttgtccatgc 4020

cccaagtcaa tattgtcaag aaaacagaag tacagacagg cggattctcc aaggagtcaa 4080

ttttaccaaa aagaaattcg gacaagctta ttgctcgtaa aaaagactgg gatccaaaaa 4140

aatatggtgg ttttgatagt ccaacggtag cttattcagt cctagtggtt gctaaggtgg 4200

aaaaagggaa atcgaagaag ttaaaatccg ttaaagagtt actagggatc acaattatgg 4260

aaagaagttc ctttgaaaaa aatccgattg actttttaga agctaaagga tataaggaag 4320

ttaaaaaaga cttaatcatt aaactaccta aatatagtct ttttgagtta gaaaacggtc 4380

gtaaacggat gctggctagt gccggagaat tacaaaaagg aaatgagctg gctctgccaa 4440

gcaaatatgt gaatttttta tatttagcta gtcattatga aaagttgaag ggtagtccag 4500

aagataacga acaaaaacaa ttgtttgtgg agcagcataa gcattattta gatgagatta 4560

ttgagcaaat cagtgaattt tctaagcgtg ttattttagc agatgccaat ttagataaag 4620

ttcttagtgc atataacaaa catagagaca aaccaatacg tgaacaagca gaaaatatta 4680

ttcatttatt tacgttgacg aatcttggag ctcccgctgc ttttaaatat tttgatacaa 4740

caattgatcg taaacgatat acgtctacaa aagaagtttt agatgccact cttatccatc 4800

aatccatcac tggtctttat gaaacacgca ttgatttgag tcagctagga ggtgactgat 4860

ggctggttgg cgtactgttg tggtaaatac caagcttgca actttatgcc catgcaacag 4920

aaactataaa aaatacagag aatgaaaaga aacagataga ttttttagtt ctttaggccc 4980

gtagtctgca aatcctttta tgattttcta tcaaacaaaa gaggaaaata gaccagttgc 5040

aatccaaacg agagtctaat agaatgaggt cgaaaagtaa atcgcgcggg tttgttactg 5100

ataaagcagg caagacctaa aatgtgtaaa gggcaaagtg tatactttgg cgtcacccct 5160

tacatatttt aggtcttttt ttattgtgcg taactaactt gccatcttca aacaggaggg 5220

ctggaagaag cagaccgcta acacagtaca taaaaaagga gacatgaacg atgaacatca 5280

aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg gcaggaggcg 5340

caactcaagc gtttgcgaaa gaaacgaacc aaaagccata taaggaaaca tacggcattt 5400

cccatattac acgccatgat atgctgcaaa tccctgaaca gcaaaaaaat gaaaaatatc 5460

aagttcctga gttcgattcg tccacaatta aaaatatctc ttctgcaaaa ggcctggacg 5520

tttgggacag ctggccatta caaaacgctg acggcactgt cgcaaactat cacggctacc 5580

acatcgtctt tgcattagcc ggagatccta aaaatgcgga tgacacatcg atttacatgt 5640

tctatcaaaa agtcggcgaa acttctattg acagctggaa aaacgctggc cgcgtcttta 5700

aagacagcga caaattcgat gcaaatgatt ctatcctaaa agaccaaaca caagaatggt 5760

caggttcagc cacatttaca tctgacggaa aaatccgttt attctacact gatttctccg 5820

gtaaacatta cggcaaacaa acactgacaa ctgcacaagt taacgtatca gcatcagaca 5880

gctctttgaa catcaacggt gtagaggatt ataaatcaat ctttgacggt gacggaaaaa 5940

cgtatcaaaa tgtacagcag ttcatcgatg aaggcaacta cagctcaggc gacaaccata 6000

cgctgagaga tcctcactac gtagaagata aaggccacaa atacttagta tttgaagcaa 6060

acactggaac tgaagatggc taccaaggcg aagaatcttt atttaacaaa gcatactatg 6120

gcaaaagcac atcattcttc cgtcaagaaa gtcaaaaact tctgcaaagc gataaaaaac 6180

gcacggctga gttagcaaac ggcgctctcg gtatgattga gctaaacgat gattacacac 6240

tgaaaaaagt gatgaaaccg ctgattgcat ctaacacagt aacagatgaa attgaacgcg 6300

cgaacgtctt taaaatgaac ggcaaatggt atctgttcac tgactcccgc ggatcaaaaa 6360

tgacgattga cggcattacg tctaacgata tttacatgct tggttatgtt tctaattctt 6420

taactggccc atacaagccg ctgaacaaaa ctggccttgt gttaaaaatg gatcttgatc 6480

ctaacgatgt aacctttact tactcacact tcgctgtacc tcaagcgaaa ggaaacaatg 6540

tcgtgattac aagctatatg acaaacagag gattctacgc agacaaacaa tcaacgtttg 6600

cgcctagctt cctgctgaac atcaaaggca agaaaacatc tgttgtcaaa gacagcatcc 6660

ttgaacaagg acaattaaca gttaacaaat aaaaacgcaa aagaaaatgc cgattatggt 6720

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg tatcgatacc gtcgacctcg agggggggcc 6780

cggtaccatc ccaatacgcg tcaattcacg gatccggttc atgtgcagct ccatcagcaa 6840

aaggggatga taagtttatc accaccgact atttgcaaca gtgccgttga tcgtgctatg 6900

atcgactgat gtcatcagcg gtggagtgca atgtcgtgca atacgaatgg cgaaaagccg 6960

agctcatcgg tcagcttctc aaccttgggg ttacccccgg cggtgtgctg ctggtccaca 7020

gctccttccg tagcgtccgg cccctcgaag atgggccact tggactgatc gaggccctgc 7080

gtgctgcgct gggtccggga gggacgctcg tcatgccctc gtggtcaggt ctggacgacg 7140

agccgttcga tcctgccacg tcgcccgtta caccggacct tggagttgtc tctgacacat 7200

tctggcgcct gccaaatgta aagcgcagcg cccatccatt tgcctttgcg gcagcggggc 7260

cacaggcaga gcagatcatc tctgatccat tgcccctgcc acctcactcg cctgcaagcc 7320

cggtcgcccg tgtccatgaa ctcgatgggc aggtacttct cctcggcgtg ggacacgatg 7380

ccaacacgac gctgcatctt gccgagttga tggcaaaggt tccctatggg gtgccgagac 7440

actgcaccat tcttcaggat ggcaagttgg tacgcgtcga ttatctcgag aatgaccact 7500

gctgtgagcg ctttgccttg gcggacaggt ggctcaagga gaagagcctt cagaaggaag 7560

gtccagtcgg tcatgccttt gctcggttga tccgctcccg cgacattgtg gcgacagccc 7620

tgggtcaact gggccgagat ccgttgatct tcctgcatcc gccagaggcg ggatgcgaag 7680

aatgcgatgc cgctcgccag tcgattggct gactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 7740

tttagattga tttctgaaag cgaccaggtg ctcggcgtgg caagactcgc agcgaacccg 7800

tagaaagcca tgctccagcc gcccgcattg gagaaattct tcaaattccc gttgcacata 7860

gcccggcaat tcctttccct gctctgccat aagcgcagcg aatgccgggt aatactcgtc 7920

aacgatctga tagagaaggg tttgctcggg tcggtggctc tggtaacgac cagtatcccg 7980

atcccggctg gccgtcctgg ccgccacatg aggcatgttc cgcgtccttg caatactgtg 8040

tttacataca gtctatcgct tagcggaaag ttcttttacc ctcagccgaa atgcctgccg 8100

ttgctagaca ttgccagcca gtgcccgtca ctcccgtact aactgtcacg aacccctgca 8160

ataactgtca cgcccccctg caataactgt cacgaacccc tgcaataact gtcacgcccc 8220

caaacctgca aacccagcag gggcgggggc tggcggggtg ttggaaaaat ccatccatga 8280

ttatctaaga ataatccact aggcgcggtt atcagcgccc ttgtggggcg ctgctgccct 8340

tgcccaatat gcccggccag aggccggata gctggtctat tcgctgcgct aggctacaca 8400

ccgccccacc gctgcgcggc agggggaaag gcgggcaaag cccgctaaac cccacaccaa 8460

accccgcaga aatacgctgg agcgctttta gccgctttag cggcctttcc ccctacccga 8520

agggtggggg cgcgtgtgca gccccgcagg gcctgtctcg gtcgatcatt cagcccggct 8580

catccttctg gcgtggcggc agaccgaaca aggcgcggtc gtggtcgcgt tcaaggtacg 8640

catccattgc cgccatgagc cgatcctccg gccactcgct gctgttcacc ttggccaaaa 8700

tcatggcccc caccagcacc ttgcgccttg tttcgttctt gcgctcttgc tgctgttccc 8760

ttgcccgctc ccgctgaatt tcggcattga ttcgcgctcg ttgttcttcg agcttggcca 8820

gccgatccgc cgccttgttg ctccccttaa ccatcttgac accccattgt taatgtgctg 8880

tctcgtaggc tatcatggag gcacagcggc ggcaatcccg accctacttt gtaggggagg 8940

gcgcacttac cggtttctct tcgagaaact ggcctaacgg ccacccttcg ggcggtgcgc 9000

tctccgaggg ccattgcatg gagccgaaaa gcaaaagcaa cagcgaggca gcatggcgat 9060

ttatcacctt acggcgaaaa ccggcagcag gtcgggcggc caatcggcca gggccaaggc 9120

cgactacatc cagcgcgaag gcaagtatgc ccgcgacatg gatgaagtct tgcacgccga 9180

atccgggcac atgccggagt tcgtcgagcg gcccgccgac tactgggatg ctgccgacct 9240

gtatgaacgc gccaatgggc ggctgttcaa ggaggtcgaa tttgccctgc cggtcgagct 9300

gaccctcgac cagcagaagg cgctggcgtc cgagttcgcc cagcacctga ccggtgccga 9360

gcgcctgccg tatacgctgg ccatccatgc cggtggcggc gagaacccgc actgccacct 9420

gatgatctcc gagcggatca atgacggcat cgagcggccc gccgctcagt ggttcaagcg 9480

gtacaacggc aagaccccgg agaagggcgg ggcacagaag accgaagcgc tcaagcccaa 9540

ggcatggctt gagcagaccc gcgaggcatg ggccgaccat gccaaccggg cattagagcg 9600

ggctggccac gacgcccgca ttgaccacag aacacttgag gcgcagggca tcgagcgcct 9660

gcccggtgtt cacctggggc cgaacgtggt ggagatggaa ggccggggca tccgcaccga 9720

ccgggcagac gtggccctga acatcgacac cgccaacgcc cagatcatcg acttacagga 9780

ataccgggag gcaatagacc atgaacgcaa tcgacagagt gaagaaatcc agaggcatca 9840

acgagttagc ggagcagatc gaaccgctgg cccagagcat ggcgacactg gccgacgaag 9900

cccggcaggt catgagccag accaagcagg ccagcgaggc gcaggcggcg gagtggctga 9960

aagcccagcg ccagacaggg gcggcatggg tggagctggc caaagagttg cgggaggtag 10020

ccgccgaggt gagcagcgcc gcgcagagcg cccggagcgc gtcgcggggg tggcactgga 10080

agctatggct aaccgtgatg ctggcttcca tgatgcctac ggtggtgctg ctgatcgcat 10140

cgttgctctt gctcgacctg acgccactga caaccgagga cggctcgatc tggctgcgct 10200

tggtggcccg atgaagaacg acaggacttt gcaggccata ggccgacagc tcaaggccat 10260

gggctgtgag cgcttcgata tcggcgtcag ggacgcaccc accggccaga tgatgaaccg 10320

ggaatggtca gccgccgaag tgctccagaa cacgccatgg ctcaagcgga tgaatgccca 10380

gggcaatgac gtgtatatca ggcccgccga gcaggagcgg catggtctgg tgctggtgga 10440

cgacctcagc gagtttgacc tggatgacat gaaagccgag ggccgggagc ctgccctggt 10500

agtggaaacc agcccgaaga actatcaggc atgggtcaag gtggccgacg ccgcaggcgg 10560

tgaacttcgg gggcagattg cccggacgct ggccagcgag tacgacgccg acccggccag 10620

cgccgacagc cgccactatg gccgcttggc gggcttcacc aaccgcaagg acaagcacac 10680

cacccgcgcc ggttatcagc cgtgggtgct gctgcgtgaa tccaagggca agaccgccac 10740

cgctggcccg gcgctggtgc agcaggctgg ccagcagatc gagcaggccc agcggcagca 10800

ggagaaggcc cgcaggctgg ccagcctcga actgcccgag cggcagctta gccgccaccg 10860

gcgcacggcg ctggacgagt accgcagcga gatggccggg ctggtcaagc gcttcggtca 10920

tgacctcagc aagtgcgact ttatcgccgc gcagaagctg gccagccggg gccgcagtgc 10980

cgaggaaatc ggcaaggcca tggccgaggc cagcccagcg ctggcagagc gcaagcccgg 11040

ccacgaagcg gattacatcg agcgcaccgt cagcaaggtc atgggtctgc ccagcgtcca 11100

gcttgcgcgg gccgagctgg cacgggcacc ggcaccccgc cagcgaggca tggacagggg 11160

cgggccagat ttcagcatgt agtgcttgcg ttggtactca cgcctgttat actatgagta 11220

ctcacgcaca gaagggggtt ttatggaata cgaaaaaagc gcttcagggt cggtctacct 11280

gatcaaaagt gacaagggct attggttgcc cggtggcttt ggttatacgt caaacaaggc 11340

cgaggctggc cgcttttcag tcgctgatat ggccagcctt aaccttgacg gctgcacctt 11400

gtccttgttc cgcgaagaca agcctttcgg ccccggcaag tttctcggtg actgatatga 11460

aagaccaaaa ggacaagcag accggcgacc tgctggccag ccctgacgct gtacgccaag 11520

cgcgatatgc cgagcgcatg aaggccaaag ggatgcgtca gcgcaagttc tggctgaccg 11580

acgacgaata cgaggcgctg cgcgagtgcc tggaagaact cagagcggcg cagggcgggg 11640

gtagtgaccc cgccagcgcc taaccaccaa ctgcctgcaa aggaggcaat caatggctac 11700

ccataagcct atcaatattc tggaggcgtt cgcagcagcg ccgccaccgc tggactacgt 11760

tttgcccaac atggtggccg gtacggtcgg ggcgctggtg tcgcccggtg gtgccggtaa 11820

atccatgctg gccctgcaac tggccgcaca gattgcaggc gggccggatc tgctggaggt 11880

gggcgaactg cccaccggcc cggtgatcta cctgcccgcc gaagacccgc ccaccgccat 11940

tcatcaccgc ctgcacgccc ttggggcgca cctcagcgcc gaggaacggc aagccgtggc 12000

tgacggcctg ctgatccagc cgctgatcgg cagcctgccc aacatcatgg ccccggagtg 12060

gttcgacggc ctcaagcgcg ccgccgaggg ccgccgcctg atggtgctgg acacgctgcg 12120

ccggttccac atcgaggaag aaaacgccag cggccccatg gcccaggtca tcggtcgcat 12180

ggaggccatc gccgccgata ccgggtgctc tatcgtgttc ctgcaccatg ccagcaaggg 12240

cgcggccatg atgggcgcag gcgaccagca gcaggccagc cggggcagct cggtactggt 12300

cgataacatc cgctggcagt cctacctgtc gagcatgacc agcgccgagg ccgaggaatg 12360

gggtgtggac gacgaccagc gccggttctt cgtccgcttc ggtgtgagca aggccaacta 12420

tggcgcaccg ttcgctgatc ggtggttcag gcggcatgac ggcggggtgc tcaagcccgc 12480

cgtgctggag aggcagcgca agagcaaggg ggtgccccgt ggtgaagcct aagaacaagc 12540

acagcctcag ccacgtccgg cacgacccgg cgcactgtct ggcccccggc ctgttccgtg 12600

ccctcaagcg gggcgagcgc aagcgcagca agctggacgt gacgtatgac tacggcgacg 12660

gcaagcggat cgagttcagc ggcccggagc cgctgggcgc tgatgatctg cgcatcctgc 12720

aagggctggt ggccatggct gggcctaatg gcctagtgct tggcccggaa cccaagaccg 12780

aaggcggacg gcagctccgg ctgttcctgg aacccaagtg ggaggccgtc accgctgaat 12840

gccatgtggt caaaggtagc tatcgggcgc tggcaaagga aatcggggca gaggtcgata 12900

gtggtggggc gctcaagcac atacaggact gcatcgagcg cctttggaag gtatccatca 12960

tcgcccagaa tggccgcaag cggcaggggt ttcggctgct gtcggagtac gccagcgacg 13020

aggcggacgg gcgcctgtac gtggccctga accccttgat cgcgcaggcc gtcatgggtg 13080

gcggccagca tgtgcgcatc agcatggacg aggtgcgggc gctggacagc gaaaccgccc 13140

gcctgctgca ccagcggctg tgtggctgga tcgaccccgg caaaaccggc aaggcttcca 13200

tagatacctt gtgcggctat gtctggccgt cagaggccag tggttcgacc atgcgcaagc 13260

gccgcaagcg ggtgcgcgag gcgttgccgg agctggtcgc gctgggctgg acggtaaccg 13320

agttcgcggc gggcaagtac gacatcaccc ggcccaaggc ggcaggctga ccccccccac 13380

tctattgtaa acaagacatt tttatctttt atattcaatg gcttattttc ctgctaattg 13440

gtaataccat gaaaaatacc atgctcagaa aaggcttaac aatattttga aaaattgcct 13500

actgagcgct gccgcacagc tccataggcc gctttcctgg ctttgcttcc agatgtatgc 13560

tcttctgctc ccgaacgcca gcaagacgta gcccagcgcg tcggccagct tgcaattcgc 13620

gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 13680

gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc 13740

agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg 13800

ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt 13860

tgatggtggt taacggcggg atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta 13920

ccgagatatc cgcaccaacg cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg 13980

ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca 14040

tggtttgttg aaaaccggac atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa 14100

tttgattgcg agtgagatat ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac 14160

ttaatgggcc cgctaacagc gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc 14220

ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga 14280

catcaagaaa taacgccgga acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt 14340

catccagcgg atagttaatg atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg 14400

ccgctttaca ggcttcgacg ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca 14460

gttgatcggc gcgagattta atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac 14520

tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt 14580

tgggaatgta attcagctcc gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa 14640

cgtggctggc ctggttcacc acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg 14700

cgacatcgta taacgttact ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc 14760

gctatcatgc cataccgcga aaggttttgc accattcgat ggtgtcaacg taaatgccgc 14820

ttcgccttcg cgcgcgaatt gcaagctgat ccgggcttat cgactgcacg gtgcaccaat 14880

gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact 14940

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<220>

<223> pCasAb/pSGAb双质粒系统

<400> 37

aaactgaagt cgatgccctt cagc 24

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCasAb/pSGAb双质粒系统

<400> 38

cttgattggc aagccagaa 19

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCasAb/pSGAb双质粒系统

<400> 39

ggagtggcct tcttcaagca aaatga 26

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCasAb/pSGAb双质粒系统

<400> 40

tccttacgtg atcatgtatt aagtgcctg 29

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCasAb/pSGAb双质粒系统

<400> 41

tgcggatcag aagtgctatg 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCasAb/pSGAb双质粒系统

<400> 42

tgcttctcga ccgtttagga 20

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCasAb/pSGAb双质粒系统

<400> 43

ggttaatgcc agtgactgct t 21

Claims

1.一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒能够表达Cas9蛋白和RecAb重组酶，所述第二质粒能够表达sgRNA。

2.如权利要求1的所述的双质粒系统，其特征在于，所述第一质粒包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重组酶系统基因片段、tac promoter启动子片段，tac promoter启动子调控RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因的表达。

3.如权利要求1的所述的双质粒系统，其特征在于，所述第一质粒包含aprR阿布拉霉素抗性基因片段与sacB蔗糖筛选基因片段。

4.一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒和第二质粒，所述第一质粒命名为pCasAb，序列为SEQ ID NO：1；所述第二质粒命名为pSGAb，序列为SEQ ID NO：2。

5.权利要求1～4中任一项所述的双质粒系统在鲍曼不动杆菌株的基因编辑中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的基因编辑为基因插入、基因敲除或单碱基突变中的一种。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的基因敲除中的敲除基因为oxyR基因。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的基因插入是以iscA基因与hscB基因的间隙作为插入位点，以表达紫色色素蛋白的amilCP基因作为插入基因。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的单碱基突变为oxyR基因中第605位的鸟嘌呤碱基突变为胞嘧啶碱基。

10.含有pCasAb质粒和pSGAb质粒中的至少一种的菌株。