CN109136251A - 一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，包含pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种，所述的pCasPA质粒能够表达Cas9蛋白和λ‑Red重组系统，所述的pACRISPR质粒能够表达sgRNA。本发明能够(1)高效并且快速地敲除铜绿假单胞各种菌株的基因；(2)高效并且快速地在铜绿假单胞各种菌株的基因组上进行基因插入。所述技术在铜绿假单胞菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、铜绿假单胞菌生理研究方面具有广阔地应用前景。

Description

一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用

技术领域

本发明涉及一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用。

背景技术

铜绿假单胞菌是一种常见的革兰氏阴性菌，它广泛存在于环境中，例如泥土、水、植物和人体中，会引起糖尿病、严重创伤、囊肿纤维化、癌症和艾滋病等患者的感染，是一种常见的临床病原菌。绿脓杆菌的感染很难治疗，这很大程度上是由于其低渗透外膜屏障与耐药结节细胞分化(resistance-nodulation-cell division，RND)家族多药耐药外排泵的协同作用，使得铜绿假单胞菌具有较强的多重耐药性。近年来，铜绿假单胞菌的感染情况日益严重，因此迫切需要寻找新型药物靶标和开发新型药物。基因组编辑和基因筛选技术是研究细菌致病性和抗药性的重要手段，对发现新的药物靶标具有重要意义。目前使用的传统铜绿假单胞菌基因组编辑技术主要基于同源重组双交换的方法。但是该方法操作过程复杂，效率低下，是一件非常费时费力的工作，大大限制了基因的研究工作。

近年来最新开发的CRISRP/Cas9系统是一种新型基因组编辑技术，极具革新生命体中基因组修饰与突变技术的潜力。该系统源于细菌自身的免疫系统，用来抵御病毒等外源DNA的侵袭。它主要是由一种核酸内切酶Cas9和一种介导RNA(sgRNA)特异性结合形成复合物，通过sgRNA与基因组DNA碱基互补配对实现靶向识别并精确定位到基因组特定位点。然后Cas9蛋白切割基因组DNA造成双链断裂。结合基因重组酶，通过人为提供外源DNA修复模板进行同源重组修复，就可以快速准确地在基因组的任何位置实现包括基因敲除以及基因插入在内的靶向编辑。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术已经在哺乳动物细胞以及一些模式生物中，例如斑马鱼、酵母、大肠杆菌等，成功实现了高效的基因组编辑。但到目前为止，还没有在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑的报道。因此通过对CRISPR/Cas9体系的工程化和改造，使其能够应用于铜绿假单胞菌中的基因组编辑，将极大简化铜绿假单胞菌的遗传学操作，为后续基因生物学功能研究，药物靶标发现，新型药物设计以及基因治疗提供有力的工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，包含pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种。

优选地，所述的pCasPA质粒能够表达Cas9蛋白和λ-Red重组系统，所述的pACRISPR质粒能够表达sgRNA。

优选地，所述的pCasPA质粒包含包含λ-Red重组系统基因片段、Cas9蛋白基因片段以及P_araB启动子DNA片段，Cas9蛋白和λ-Red重组系统都受到阿拉伯糖启动子P_araB的调控。

优选地，所述的pCasPA质粒包含sacB基因片段。

优选地，所述的pACRISPR质粒包含XbaI和XhoI酶切位点，用来插入修复模板。

优选地，所述的pACRISPR质粒包含两个BsaI位点，用来插入spacer片段。

优选地，所述的pACRISPR质粒包含sacB反向筛选基因片段。

优选地，所述的pACRISPR质粒包含sgRNA序列。

优选地，所述的pCasPA质粒的序列为SEQ ID NO：1。

优选地，所述的pACRISPR质粒的序列为SEQ ID NO：2。

优选地，所述的pCasPA质粒和pACRISPR质粒配合使用，能够在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑，实现基因敲除或基因插入。

本发明还提供了含有上述的pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种的菌株。

本发明还提供了含有上述的pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种的细胞。

本发明还提供了上述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统在基因编辑中的作用。

优选地，所述的基因编辑为基因插入或基因敲除。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明能够(1)高效并且快速地敲除铜绿假单胞各种菌株的基因；(2)高效并且快速地在铜绿假单胞各种菌株的基因组上进行基因插入。所述技术在铜绿假单胞菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、铜绿假单胞菌生理研究方面具有广阔地应用前景。

本发明还提供了含有上述pCasPA质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：CCTCC M2018450。

本发明还提供了含有上述pACRISPR质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：CCTCC M2018449。

附图说明

附图1：编辑质粒pCasPA和pACRISPR图谱；图A.编辑质粒pCasPA图谱。Cas9蛋白和λ-Red重组系统都受到阿拉伯糖启动子P_araB的调控；sacB：反向筛选基因，用于编辑后质粒消除。图B.编辑质粒pACRISPR图谱。BsaI位点：用于Golden Gate Assembly技术插入spacer片段；XbaI和XhoI位点：用于GibsonAssembly技术插入目标基因的修复模板；trcpromoter：sgRNA表达的启动子；sacB：反向筛选基因，用于编辑后质粒消除。

附图2：pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑的过程示意图。

附图3：pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌各种菌株中实现高效基因组编辑；

图A.pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因敲除的示意图，和在PAO1菌株中进行rhlR基因敲除的PCR验证，色素实验以及DNA测序结果。图B.pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因插入的示意图，和在PAO1菌株中进行rpsL启动子插入的PCR验证和DNA测序结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。

各实施例中使用的生物材料来源如下：

pKD46质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：P0098)；

pCasSA质粒(购自美国Addgene公司，货号：98211)；

pDN19质粒(购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pDN19)；

pEX18Ap质粒(购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pEX18Ap)；

pAK1900质粒(购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pAK1900)；

铜绿假单胞菌PAO1菌株(购自美国ATCC公司，货号：ATCC15692)

感受态大肠杆菌DH5α菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：P1435)。

含有pCasPA质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：CCTCC M 2018450。

含有pACRISPR质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：CCTCC M 2018449。

各实施例中使用的LB液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507002-0250；LB固体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507003-0250；盐酸四环素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A100422-0010；羧苄青霉素二钠购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600469-0005；蔗糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A100335-0250；甘油购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A100854-0500。

实施例一：pCasPA质粒构建：

pCasPA质粒的组成如附图1A所示，其序列为SEQ ID NO：1。pCasPA质粒的具体构建方法如下：

(1)以pKD46质粒为模板，分别PCR扩增得到λ-Red重组系统的DNA片段和阿拉伯糖诱导的P_araB启动子的DNA片段；从pCasSA质粒中通过PCR扩增得到含有Cas9蛋白的基因片段。

用于PCR扩增的引物序列为：

扩增λ-Red重组系统5’引物序列(SEQ ID NO：3)：

5’-AACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCctttcctgcgttGTCGAC

tgtatttagaaaaataaacaaataggggttcc-3’

扩增λ-Red重组系统3’引物序列(SEQ ID NO：4)：

5’-gtatgaaaagtCTCGAGCATTCTAGAtccacaGCGGCCGCcatggattcttcgtctgtttctactg-3’

扩增P_araB启动子5’引物序列(SEQ ID NO：5)：

5’-CGGCCGCtgtggaTCTAGAATGCTCGAGacttttcatactcccgccatt c-3’

扩增P_araB启动子3’引物序列(SEQ ID NO：6)：

5’-GCCTATTGAGTATTTCTTATCCATtttttataacctccttagagctcgaattc-3’

扩增Cas9蛋白基因5’引物序列(SEQ ID NO：7)：

5’-cgagctctaaggaggttataaaaaATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGAT-3’

扩增Cas9蛋白基因3’引物序列(SEQ ID NO：8)：

5’-GCTCTAATACGACTCACTATAGGGAAAGCTTctgtccatacccatgGGTATTTACCAC-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase分别扩增上述三个DNA片段，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimestarBuffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。

上述PCR反应体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 5min，共30个循环；最后72℃ 10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物分别进行回收。PCR产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(2)使用KpnI和HindIII-HF对pDN19质粒进行酶切，其反应体系如下：5μl 10×CutSmart Buffer，2μg pDN19质粒，2μl KpnI(10units/μl)，2μl HindIII-HF(20units/μl)，最后加入适量ddH₂O至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。将反应体系在37℃下反应2～3小时后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(3)将步骤(1)中得到的三个DNA片段和步骤(2)中得到的pDN19质粒酶切产物组装成一个质粒。具体的反应体系为：10μl NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB公司)，20fmol λ-Red重组系统DNA片段，20fmol P_araB启动子DNA片段，20fmol Cas9蛋白基因片段，20fmol酶切后的pDN19质粒，加入适量ddH₂O至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有15μg/ml四环素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。

(4)使用XbaI和XhoI对步骤(3)得到的质粒进行酶切，其反应体系如下：5μl 10×CutSmart Buffer，2μg步骤(3)得到的质粒，2μl XbaI(20units/μl)，2μl XhoI(20units/μl)，最后加入适量ddH₂O至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。将反应体系在37℃下反应2～3小时后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(5)以pEX18Ap质粒为模板，PCR扩增得到反向筛选基因sacB的DNA片段。

扩增sacB基因5’引物序列(SEQ ID NO：9)：

5’aagaatccatgGCGGCCGCtgtggaTCTAGAcggcatcagagcagattgta-3’

扩增sacB基因3’引物序列(SEQ ID NO：10)：

5’tctgaatggcgggagtatgaaaagtCTCGAGgcaactttatgcccatgcaaca-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase扩增sacB基因DNA片段，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×Primestar Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。

PCR反应体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃10s，55℃ 30s，72℃ 2min30s，共30个循环；最后72℃ 10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物分别进行回收。PCR产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(6)将步骤(4)中得到的质粒酶切产物和步骤(5)中得到的sacB基因片段组装成一个质粒。具体的反应体系为：10μl NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB公司)，20fmol步骤(4)得到的质粒酶切产物，20fmol sacB基因片段，加入适量ddH₂O至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有15μg/ml四环素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。最终得到的质粒命名为pCasPA质粒。含有正确pCasPA质粒的大肠杆菌DH5α菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M 2018450。

该pCasPA质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中复制传代；在于该质粒在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中均为四环素抗性，大肠杆菌中的筛选浓度为15μg/ml，在铜绿假单胞菌中的筛选浓度为100μg/ml；在于该质粒能在铜绿假单胞菌中在阿拉伯糖诱导下表达Cas9蛋白和λ-Red重组系统；在于该质粒与pACRISPR质粒配合使用，能够在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑，实现基因敲除、基因插入等功能；在于具有sacB反向筛选基因，通过在蔗糖条件下培养能够实现菌株中的质粒消除。

实施例二：pACRISPR质粒构建：

pACRISPR质粒的组成如附图1B所示，其序列为SEQ ID NO：2。pACRISPR质粒的具体构建方法如下：

(1)使用BamHI-HF和HindIII-HF对pAK1900质粒进行酶切，其反应体系如下：5μl10×CutSmart Buffer，2μg pAK1900质粒，2μl BamHI-HF(20units/μl)，2μl HindIII-HF(20units/μl)，最后加入适量ddH₂O至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。将反应体系在37℃下反应2～3小时后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(2)以pEX18Ap质粒为模板，PCR扩增得到反向筛选基因sacB的DNA片段。

扩增sacB基因5’引物序列(SEQ ID NO：11)：

5’-GGGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCcggcatcagagcagattgta-3’

扩增sacB基因3’引物序列(SEQ ID NO：12)：

5’-aacctgattccaatttgagcaaggcGTCGACgcaactttatgcccatgcaaca-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase扩增sacB基因DNA片段，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×Primestar Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。

PCR反应体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃10s，55℃ 30s，72℃ 2min30s，共30个循环；最后72℃ 10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物分别进行回收。PCR产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(3)在金唯智生物科技有限公司采用常规方法化学合成含有trc启动子和sgRNA序列的DNA片段，其序列如下(SEQ ID NO：13)：

其中加粗的大写部分为trc启动子序列；小写部分为sgRNA序列；下划线的大写部分别为两个BsaI酶切位点。

(4)将步骤(1)中得到的pAK1900质粒酶切产物，步骤(2)中得到的sacB基因片段以及步骤(3)全合成的DNA片段组装成一个质粒。具体的反应体系为：10μl NEBuilder HiFiDNA Assembly Master Mix(NEB公司)，20fmol步骤(1)pAK1900质粒酶切产物，20fmol步骤(2)sacB基因片段，20fmol步骤(3)全基因合成DNA片段，加入适量ddH₂O至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml羧苄青霉素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。最终得到的质粒命名为pACRISPR质粒。含有正确pACRISPR质粒的大肠杆菌DH5α菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M 2018449。

该pACRISPR质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中复制传代；在于该质粒在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中均为羧苄青霉素抗性，在大肠杆菌中的筛选浓度为50μg/ml，在铜绿假单胞菌中的筛选浓度为150μg/ml；在于该质粒能在铜绿假单胞菌中稳定表达sgRNA；在于该质粒与pCasPA质粒配合使用，能够在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑，实现基因敲除、基因插入等功能；在于具有sacB反向筛选基因，通过在蔗糖条件下培养能够实现菌株中的质粒消除；在于含有两个BsaI位点，能够用来插入spacer片段；在于含有XbaI和XhoI酶切位点，能够用来插入修复模板。

实施例三：pCasPA/pACRISPR双质粒系统实现铜绿假单胞菌株中高效基因敲除：

使用pCasPA/pACRISPR双质粒系统可以在铜绿假单胞菌各种菌株中实现对不同基因的高效敲除，其过程如附图2所示。实验中选取rhlR基因为例，在铜绿假单胞菌PAO1菌株中进行基因敲除实验。附图3A为采用pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因敲除的示意图，和在PAO1菌株中进行rhlR基因敲除的PCR验证，色素实验以及DNA测序结果。

(1)先在PAO1菌株目标基因上选定某一NGG(N为任意碱基)序列前面20个碱基的DNA片段(这20个碱基被称为spacer，NGG不包含在其中)。本步骤的特征在于：为使spacer片段能插入到pACRISPR质粒中，需在该单链DNA序列的5’端加上GTGG。同时需合成spacer的反补序列，并在反补序列5’端加上AAAC。例如实验选定的rhlR基因spacer的DNA序列(SEQ IDNO：14)为：5’-tcttctggatgttcttgtgg-3’，则具体序列设计如下：

5’-GTGGtcttctggatgttcttgtgg-3’(SEQ ID NO：15)

3’-ccacaagaacatccagaagaCAAA-5’(SEQ ID NO：16)

在生工生物工程(上海)股份有限公司常规方法合成上述两条引物，并按实施例六的步骤将spacer插入到实施例二中得到的pACRISPR质粒中，得到pACRISPR-rhlR_spacer质粒。

(2)使用XbaI和XhoI对pACRISPR-rhlR_spacer质粒进行酶切反应。其反应体系如下：5μl 10×CutSmart Buffer，2μg pACRISPR-rhlR_spacer质粒，2μl XbaI(20units/μl)，2μl XhoI(20units/μl)，最后加入适量ddH₂O至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。在37℃下反应2～3小时后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对双酶切质粒产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(3)扩增要敲除的目标基因上下游各～500bp的DNA片段。本步骤的特征在于：在目标基因上游的5’引物上需添加5’-ttttgagatctgtccatacccatggTCTAGA-3’序列(SEQ IDNO：17)，而在目标基因下游的3’引物上需添加5’-tctgaatggcgggagtatgaaaagtCTCGAG-3’序列(SEQ ID NO：18)；同时扩增目标基因上游的3’引物与扩增下游的5’引物之间有20～50个碱基的重叠互补区域。以rhlR基因为例，扩增其上下游片段所需的引物分别为：

rhlR基因上游5’引物序列：5’-agctcccagaccgacggatcgct-3’(SEQ ID NO：19)

rhlR基因上游3’引物序列：5’-ctgggtctcatctgaagcgca-3’(SEQ ID NO：20)

rhlR基因下游5’引物序列：5’-tgcagtaagccctgatcgataaaatg-3’(SEQ ID NO：21)

rhlR基因下游3’引物序列：5’-ggagccttgctgccatcgtg-3’(SEQ ID NO：22)

那么在实验中具体设计时，引物的实际序列为：

rhlR基因上游5’引物序列(SEQ ID NO：23)：

5’-ttttgagatctgtccatacccatggTCTAGAagctcccagaccgacggatcgct-3’

rhlR基因上游3’引物序列(SEQ ID NO：24)：

5’-cattttatcgatcagggcttactgcactgggtctcatctgaagcgca-3’

rhlR基因下游5’引物序列(SEQ ID NO：25)：

5’-tgcgcttcagatgagacccagtgcagtaagccctgatcgataaaatg-3’

rhlR基因下游3’引物序列(SEQ ID NO：26)：

5’-tctgaatggcgggagtatgaaaagtCTCGAGggagccttgctgccatcgtg-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对rhlR基因上下游片段分别进行扩增，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提铜绿假单胞菌PAO1菌株的基因组，作为PCR模板，具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 40s，共30个循环；最后72℃ 10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物分别进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(4)将上述步骤(3)得到的rhlR基因上下游片段插入到步骤(2)酶切后的pACRISPR-rhlR_spacer质粒的XbaI/XhoI位点中，得到pACRISPR-rhlR质粒。具体的反应体系为：10μl NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB公司)，20fmol rhlR基因上游片段，20fmol rhlR基因下游片段，20fmol酶切后的pACRISPR-rhlR_spacer质粒，加入适量ddH₂O至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml羧苄青霉素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养基吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提pACRISPR-rhlR质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。

(5)将构建的pACRISPR-rhlR质粒转入实施例七制备的含有pCasPA质粒的PAO1菌株电转感受态中。具体操作如下：取一管实施例七中制备的含有pCasPA质粒的PAO1菌株电转感受态细菌，在冰上放置5～10分钟后，加入1～2μg质粒。混合均匀后转入1mm电转杯(Bio-Rad公司)，室温下在GenePulser Xcell电击仪(Bio-Rad公司)中进行电击。电击参数为：2100V，200Ω，25μF。电击后立即加入1ml LB培养液，混合均匀后转入干净的EP管中，在37℃摇床中振摇1～2个小时。将EP管以6000rpm转速在室温下离心1.5分钟，弃去～900μl上清，将剩余的菌液(～150μl)混合均匀后平铺在含有150μg/ml羧苄青霉素和100μg/ml四环素的LB固体培养平板上。待菌液被固体培养基吸收后，于37℃培养箱倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌能在培养基上生长。

(6)挑取单克隆菌落到10μl ddH₂O中，在95℃下加热10min使细菌裂解，作为PCR模板扩增rhlR基因部分。反应体系为34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl PCR模板，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。成功进行基因敲除的菌株单克隆，其PCR产物会比正常菌株的PCR产物长度短，因此可以通过琼脂糖凝胶上DNA片段的大小来判断基因敲除是否成功。

本步骤的特征在于进行PCR验证的引物位于rhlR基因上下游的外侧，不在pACRISPR-rhlR质粒中，这样就避免了pACRISPR-rhlR质粒对PCR结果的干扰。

rhlR基因敲除的PCR验证引物序列为：

5’Primer：5’-gcaggctggaccagaatatc-3’(SEQ ID NO：27)

3’Primer：5’-aactgcaacgctttctcgat-3’(SEQ ID NO：28)

将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，测序引物为：5’-ccttccagcgattcagagag-3’(SEQ ID NO：29)。

实验结果发现，在选取的12个菌落中，所有12个都基因敲除成功。

(7)铜绿假单胞菌PAO1菌株中的rhlR基因与细菌的色素生产相关。当rhlR基因失去功能时，会使菌株失去色素生产能力。将步骤(6)中选取的12个单克隆菌落，在3ml PPB液体培养基中于37℃摇床振摇培养过夜(PPB液体培养基配方：1升PPB液体培养基中含有20g蛋白胨，1.4g MgCl₂，10g K₂SO₄，20ml甘油；pH 7.0)。同时选取一个野生型PAO1菌落在相同的条件下培养作为对照。第二天，野生型菌株的PPB菌液显示为绿色，而rhlR基因敲除成功的12个菌落则显示为黄色。

(8)对已经确认基因敲除成功的铜绿假单胞菌各菌株，按实施例五的操作过程消除菌株中的质粒。

实施例四：pCasPA/pACRISPR双质粒系统实现铜绿假单胞菌株中高效基因插入：

使用pCasPA/pACRISPR双质粒系统可以在铜绿假单胞菌各种菌株中实现对不同基因的高效插入，其过程如附图2所示。实验中选取rhlA基因启动子作为插入位点，以rpsL启动子作为插入基因，在铜绿假单胞菌PAO1菌株中进行基因插入实验。附图3B为采用pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因插入的示意图，和在PAO1菌株中将rpsL启动子插入rhlA基因启动子位点的PCR验证和DNA测序结果。

(1)设计用于rpsL启动子插入的spacer片段序列，选定的spacer DNA序列(SEQ IDNO：30)为：5’-acggcagacaagtaactcag-3’，则具体序列设计如下：

5’-GTGGacggcagacaagtaactcag-3’(SEQ ID NO：31)

3’-ctgagttacttgtctgccgtCAAA-5’(SEQ ID NO：32)

在生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述两条引物，并按实施例六的步骤将spacer插入到实施例二中得到的pACRISPR质粒中，得到pACRISPR-rpsL_spacer质粒。

(2)使用XbaI和XhoI对pACRISPR-rpsL_spacer质粒进行酶切反应，并纯化酶切产物。其步骤与实施例三步骤(2)相同。

(3)扩增要插入的目标位点上下游各～500bp的DNA片段，并扩增rpsL启动子。与实施例三步骤(3)相比，本步骤的特征在于：增加了rpsL启动子片段，而且扩增rpsL启动子的5’引物和3’引物分别与扩增目标位点上游的3’引物和扩增目标位点下游的5’引物之间有30～40个碱基的重叠互补区域。以rpsL启动子为例，在实验设计时，引物的具体序列为：

rpsL启动子插入位点上游5’引物序列(SEQ ID NO：33)：

5’-ttttgagatctgtccatacccatggTCTAGActtcgacgagaaaagcttcgtc-3’

rpsL启动子插入位点上游3’引物序列(SEQ ID NO：34)：

5’-CGGGGCTTGTCGTTGATGCgattggcgtccgtgttcacg-3’

rpsL启动子5’引物序列(SEQ ID NO：35)：

5’-cgtgaacacggacgccaatcGCATCAACGACAAGCCCCG-3’

rpsL启动子3’引物序列(SEQ ID NO：36)：

5’-aacagactttcgcgccgcatCTATAGCTCCACTGATTGTCTTACG-3’

rpsL启动子插入位点下游5’引物序列(SEQ ID NO：37)：

5’-CGTAAGACAATCAGTGGAGCTATAGatgcggcgcgaaagtctgtt-3’

rpsL启动子插入位点下游3’引物序列(SEQ ID NO：38)：

5’-tctgaatggcgggagtatgaaaagtCTCGAGcatgtgctgatggttgctgg-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对rpsL启动子插入位点上下游片段以及rpsL启动子分别进行扩增，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase。

其中扩增rpsL启动子插入位点上下游片段以及rpsL启动子的模板DNA为铜绿假单胞菌PAO1菌株的基因组DNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司生产Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒从PAO1菌株中抽提得到。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s，55℃ 30s，72℃40s，共30个循环；最后72℃ 10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物分别进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(4)将上述纯化得到的rpsL启动子插入位点上下游片段以及rpsL启动子插入到步骤(2)酶切后的pACRISPR-rpsL_spacer质粒的XbaI/XhoI位点中，得到pACRISPR-rpsL质粒。具体的反应体系为：10μl NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB公司)，20fmolrpsL启动子插入位点上游片段，20fmol rpsL启动子插入位点下游片段，20fmol rpsL启动子片段，20fmol酶切后的pACRISPR-rpsL_spacer质粒，加入适量ddH₂O至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml羧苄青霉素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养基吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提pACRISPR-rpsL质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。

(5)将构建的pACRISPR-rpsL质粒按实施例三步骤(5)的操作步骤转入铜绿假单胞菌PAO1菌株中。

(6)挑取单克隆菌落到10μl ddH₂O中，在95℃下加热10min使细菌裂解，作为PCR模板扩增rpsL启动子插入位点。反应体系为34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。与实施例三步骤(6)相比，本步骤的特征之处在于使用了不同的验证引物，其中5’引物位于rpsL启动子上，而3’引物则位于rpsL启动子插入位点下游的外侧。这样成功进行基因插入的菌株能够得到PCR扩增条带，而没有发生基因插入的菌株则不能得到PCR扩增条带。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。可以通过琼脂糖凝胶上是否具有明显DNA条带来判断基因插入是否成功。该引物设计同时也避免了pACRISPR-rpsL质粒对PCR结果的干扰。

rpsL启动子插入的PCR验证引物序列为：

5’Primer：5’-TTTTGTACCCCGAAAATTGG-3’(SEQ ID NO：39)

3’Primer：5’-agctgccgttgatgaaatgc-3’(SEQ ID NO：40)

此外，扩增rpsL启动子插入位点的DNA片段。反应体系为34.4μl ddH₂O，4μl dNTPMixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase。将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

rpsL启动子插入位点的PCR扩增引物序列为：

5’Primer：5’-gtgatttcctacggggtgtc-3’(SEQ ID NO：41)

3’Primer：5’-agctgccgttgatgaaatgc-3’(SEQ ID NO：40)

测序引物为：5’-gcgtttcgacaccggaaacc-3’(SEQ ID NO：42)

实验结果发现，在选取的12个菌落中，有11个基因插入成功。

(7)对已经确认基因敲除成功的铜绿假单胞菌各菌株，按实施例五的操作过程消除菌株中的质粒。

实施例五：金黄色葡萄球菌中pCasPA质粒和pACRISPR质粒的消除：

从基因编辑成功的含有pCasPA和pACRISPR质粒的铜绿假单胞菌中挑取一个单克隆，接种到3ml含有150μg/ml羧苄青霉素和含有100μg/ml四环素的LB液体培养基中，在37℃下振摇过夜。第二天，取3μl菌液，以1∶1000比例稀释到3ml新鲜的LB液体培养基中，在37℃下振摇培养至菌液浑浊。用新鲜的LB液体培养基将菌液稀释10000倍，取100μl稀释后的菌液平铺在含有5％w/v蔗糖的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。由于pCasPA质粒和pACRISPR质粒中含有sacB基因，使得质粒在蔗糖条件下会产生对细菌有害物质，造成细菌死亡，从而在培养平板上长出来的菌落都是不含质粒的。从含有5％w/v蔗糖的LB固体培养平板上挑取单克隆菌落，接种在10μl LB液体培养基中，分别在LB固体培养平板、含有100μg/ml四环素的LB固体培养平板以及含有150μg/ml羧苄青霉素的LB固体培养平板上划线。能在LB固体培养基生长，但是不能在含有100μg/ml四环素的LB固体培养平板和含有150μg/ml羧苄青霉素的LB固体培养平板上生长的菌落，即为消除了pCasPA质粒和pACRISPR的菌落，对其进行培养与保种。

实施例六：将spacer片段插入pACRISPR质粒：

首先将设计合成的两个spacer引物进行磷酸化，具体反应体系如下：5μl 10×T4DNAligase Buffer(NEB公司)，2μl spacer 5’primer(50μM)，2μl spacer 3’primer(50μM)，1μl T4 polynucleotide kinase(Takara公司)，40μl ddH₂O。在37℃下反应1小时。向反应产物中加入2.5μl 1M NaCl，在95℃加热5min，然后在1～2小时内缓慢地降低到室温，使磷酸化的两条单链引物通过碱基配对形成双链DNA。然后用ddH₂O将得到的产物稀释20倍。

将上述得到的双链DNA插入pACRISPR质粒的BsaI位点，具体反应体系为：1μl 10×T4DNA ligase Buffer，1μl上述20倍稀释的磷酸化双链DNA，20fmol实施例二中得到的pACRISPR质粒，0.5μl T4 DNA ligase(400units/μl)，0.5μl BsaI-HF(20units/μl)，最后加入适量ddH₂O至总体积为10μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。在PCR仪中进行反应，循环如下：37℃ 2min；16℃ 5min，共25个循环；然后50℃ 5min，80℃ 15min。

将该10μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml羧苄青霉素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，同时抽提质粒并送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

实施例七：制备含有pCasPA质粒的铜绿假单胞菌电转感受态

(1)将实验室保种的铜绿假单胞菌PAO1菌株在LB固体培养平板上划线，于37℃培养箱倒置培养过夜。挑取培养平板上长出的一个单克隆菌落，接种到3ml LB液体培养基中，在37℃摇床中以250rpm转速振摇过夜。第二天取1ml菌液接种到100ml新鲜的LB培养基中，在37℃摇床中继续振摇。当菌液的OD₆₀₀达到1.0～1.5时，将菌液放在冰上冷却十分钟。在4℃离心机中以6000rpm转速离心5分钟收菌，弃去培养基上清，将底部的细菌沉淀用20ml10％v/v甘油(高压灭菌，并在冰上预冷)重悬。以同样的转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀再次用20ml 10％v/v甘油重悬。以同样的转速再一次离心，弃去上清后用1ml 10％v/v甘油重悬底部的细菌沉淀。将得到的细菌电转感受态分装到EP管中，每管50μl菌液。将分装的菌液先在液氮中快速冷冻，然后放入-80℃冰箱中保存。需要注意的是，在重悬时动作要轻柔，可以使用移液枪轻轻吹打的方式使细菌重悬。

(2)取一管步骤(1)中制备的铜绿假单胞菌PAO1菌株电转感受态，在冰上放置5～10分钟后，加入1～2μg实施例一中制备的pCasPA质粒。混合均匀后转入1mm电转杯(Bio-Rad公司)，室温下在GenePulser Xcell电击仪(Bio-Rad公司)中进行电击。电击参数为：2100V，200Ω，25μF。电击后立即加入1ml LB液体培养基，混合均匀后转入干净的EP管中，在37℃摇床中振摇1～2个小时。将EP管以6000rpm转速在室温下离心1.5分钟，弃去～900μl上清，将剩余的菌液(～150μl)混合均匀后平铺在含有100μg/ml四环素的LB固体培养平板上。待菌液被固体培养平板吸收后，于37℃培养箱倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌能在含有四环素的培养平板上生长。挑取一个单克隆菌落，在3ml含有100μg/ml四环素的LB液体培养基中于37℃摇床中以250rpm转速振摇过夜。第二天取650μl细菌菌液，与350μl 80％ v/v甘油(高压灭菌)混合均匀后，保存于-80℃冰箱中进行保种用于后续实验。

(3)将步骤(2)中保种的含有pCasPA质粒的铜绿假单胞菌PAO1菌株在含有100μg/ml四环素的LB固体培养平板上划线，于37℃培养箱倒置培养过夜。挑取培养平板上长出的一个单克隆菌落，接种到3ml含有100μg/ml四环素的LB液体培养基中，在37℃摇床中以250rpm转速振摇过夜。第二天取1ml菌液接种到100ml含有100μg/ml四环素的LB培养基中，在37℃摇床中继续振摇。当菌液的OD₆₀₀达到1.0～1.5时，加入1ml 20％w/v L-阿拉伯糖诱导λ-Red重组系统和Cas9蛋白的表达。在37℃摇床中继续振摇2小时后，将菌液放在冰上冷却十分钟。在4℃离心机中以6000rpm转速离心5分钟收菌，弃去培养基上清，将底部的细菌沉淀用20ml 10％v/v甘油(高压灭菌，并在冰上预冷)重悬。以同样的转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀再次用20ml 10％v/v甘油重悬。以同样的转速再一次离心，弃去上清后用1ml 10％v/v甘油重悬底部的细菌沉淀。将得到的细菌电转感受态分装到EP管中，每管50μl菌液，用于后续电转。需要注意的是，该电转感受态需要现配现用，在-80℃冰箱冻存会严重降低电转效率。

序列表

<110> 上海科技大学

<120> 一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17653

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gaccctttcc gacgctcacc gggctggttg ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg 60

gccctgcaaa cgcgccagaa acgccgtcga agccgtgtgc gagacaccgc ggccgccggc 120

gttgtggata cctcgcggaa aacttggccc tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca 180

cttgaggggc cgactcaccc ggcgcggcgt tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc 240

cggcgacgtg gagctggcca gcctcgcaaa tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt 300

tcccacagat gatgtggaca agcctgggga taagtgccct gcggtattga cacttgaggg 360

gcgcgactac tgacagatga ggggcgcgat ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca 420

gatgaggggc gcacctattg acatttgagg ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt 480

gcaagggttt ccgcccgttt ttcggccacc gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac 540

caatatttat aaaccttgtt tttaaccagg gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc 600

cgaagggggg tgccccccct tctcgaaccc tcccggcccg ctaacgcggg cctcccatcc 660

ccccaggggc tgcgcccctc ggccgcgaac ggcctcaccc caaaaatggc aggacaactg 720

gtgagtctgg atctgaagtt cattgttgtc atggatgatc tggaccgact ggagccatcc 780

caggtggcgg aagtgttcag gcttgtgagt gcagtagccg atctgccccg ctttacccat 840

attctctgtt atgacaggca gattatcact catgccgttg aacatgcgct gaatatcgaa 900

gatggcagcc gttatctcca gaaaatcatt cagcttagtt ttaaattacc ccgacctgaa 960

gcctttgatt tacgtaatga atttcgccag cgggctgagg ctctatatca gcaaattaat 1020

aatcaaccgc cagactctgg aatggtaagg gatctcatcg cggtgactga tacctatggt 1080

gccgcacttt cgacgccacg ggaaatccat caggccatta attccctgat ttttctttat 1140

ccggggatgc gggattttgt ttatttccct gatttgtgcc tgcttcagct tatacgggtg 1200

acaaacccgg ctctgtatga ctggacagag cattacctga cagaacggtc cgtgattgaa 1260

accggtcagg gtatgctttc tgacggagag aaagcagact tccgggaggg gcttatcaga 1320

tgtatgaaga cgttcagggc atcaaatgca gactcgtttc tgacacttgc agactggatc 1380

tatctcatct gcgcaaggca gaacgtgaag acggccgccc tggacctcgc ccgcgagcgc 1440

caggcgcacg aggccggcgc gcggacccgc gccacggccc acgagcggac gccgcagcag 1500

gagcgccaga aggccgccag agaggccgag cgcggccgtg aggcttggac gctagggcag 1560

ggcatgaaaa agcccgtagc gggctgctac gggcgtctga cgcggtggaa agggggaggg 1620

gatgttgtct acatggctct gctgtagtga gtgggttgcg ctccggcagc ggtcctgatc 1680

aatcgtcacc ctttctcggt ccttcaacgt tcctgacaac gagcctcctt ttcgccaatc 1740

catcgacaat caccgcgagt ccctgctcga acgctgcgtc cggaccggct tcgtcgaagg 1800

cgtctatcgc ggcccgcaac agcggcgaga gcggagcctg ttcaacggtg ccgccgcgct 1860

cgccggcatc gctgtcgccg gcctgctcct caagcacggc cccaacagtg aagtagctga 1920

ttgtcatcag cgcattgacg gcgtccccgg ccgaaaaacc cgcctcgcag aggaagcgaa 1980

gctgcgcgtc ggccgtttcc atctgcggtg cgcccggtcg cgtgccggca tggatgcgcg 2040

cgccatcgcg gtaggcgagc agcgcctgcc tgaagctgcg ggcattcccg atcagaaatg 2100

agcgccagtc gtcgtcggct ctcggcaccg aatgcgtatg attctccgcc agcatggctt 2160

cggccagtgc gtcgagcagc gcccgcttgt tcctgaagtg ccagtaaagc gcccgctcct 2220

ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat 2280

cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt 2340

gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg 2400

acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac 2460

cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta 2520

aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca 2580

atttccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 2640

cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 2700

cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag ctcggtaccc 2760

tttcctgcgt tgtcgactgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 2820

cccgaaaagt gccacctgca tcgatttatt atgacaactt gacggctaca tcattcactt 2880

tttcttcaca accggcacgg aactcgctcg ggctggcccc ggtgcatttt ttaaataccc 2940

gcgagaaata gagttgatcg tcaaaaccaa cattgcgacc gacggtggcg ataggcatcc 3000

gggtggtgct caaaagcagc ttcgcctggc tgatacgttg gtcctcgcgc cagcttaaga 3060

cgctaatccc taactgctgg cggaaaagat gtgacagacg cgacggcgac aagcaaacat 3120

gctgtgcgac gctggcgata tcaaaattgc tgtctgccag gtgatcgctg atgtactgac 3180

aagcctcgcg tacccgatta tccatcggtg gatggagcga ctcgttaatc gcttccatgc 3240

gccgcagtaa caattgctca agcagattta tcgccagcag ctccgaatag cgcccttccc 3300

cttgcccggc gttaatgatt tgcccaaaca ggtcgctgaa atgcggctgg tgcgcttcat 3360

ccgggcgaaa gaaccccgta ttggcaaata ttgacggcca gttaagccat tcatgccagt 3420

aggcgcgcgg acgaaagtaa acccactggt gataccattc gcgagcctcc ggatgacgac 3480

cgtagtgatg aatctctcct ggcgggaaca gcaaaatatc acccggtcgg caaacaaatt 3540

ctcgtccctg atttttcacc accccctgac cgcgaatggt gagattgaga atataacctt 3600

tcattcccag cggtcggtcg ataaaaaaat cgagataacc gttggcctca atcggcgtta 3660

aacccgccac cagatgggca ttaaacgagt atcccggcag caggggatca ttttgcgctt 3720

cagccatact tttcatactc ccgccattca gagaagaaac caattgtcca tattgcatca 3780

gacattgccg tcactgcgtc ttttactggc tcttctcgct aaccaaaccg gtaaccccgc 3840

ttattaaaag cattctgtaa caaagcggga ccaaagccat gacaaaaacg cgtaacaaaa 3900

gtgtctataa tcacggcaga aaagtccaca ttgattattt gcacggcgtc acactttgct 3960

atgccatagc atttttatcc ataagattag cggatcctac ctgacgcttt ttatcgcaac 4020

tctctactgt ttctccatac ccgttttttt gggaattcga gctctaagga ggttataaaa 4080

aatggatatt aatactgaaa ctgagatcaa gcaaaagcat tcactaaccc cctttcctgt 4140

tttcctaatc agcccggcat ttcgcgggcg atattttcac agctatttca ggagttcagc 4200

catgaacgct tattacattc aggatcgtct tgaggctcag agctgggcgc gtcactacca 4260

gcagctcgcc cgtgaagaga aagaggcaga actggcagac gacatggaaa aaggcctgcc 4320

ccagcacctg tttgaatcgc tatgcatcga tcatttgcaa cgccacgggg ccagcaaaaa 4380

atccattacc cgtgcgtttg atgacgatgt tgagtttcag gagcgcatgg cagaacacat 4440

ccggtacatg gttgaaacca ttgctcacca ccaggttgat attgattcag aggtataaaa 4500

cgaatgagta ctgcactcgc aacgctggct gggaagctgg ctgaacgtgt cggcatggat 4560

tctgtcgacc cacaggaact gatcaccact cttcgccaga cggcatttaa aggtgatgcc 4620

agcgatgcgc agttcatcgc attactgatc gttgccaacc agtacggcct taatccgtgg 4680

acgaaagaaa tttacgcctt tcctgataag cagaatggca tcgttccggt ggtgggcgtt 4740

gatggctggt cccgcatcat caatgaaaac cagcagtttg atggcatgga ctttgagcag 4800

gacaatgaat cctgtacatg ccggatttac cgcaaggacc gtaatcatcc gatctgcgtt 4860

accgaatgga tggatgaatg ccgccgcgaa ccattcaaaa ctcgcgaagg cagagaaatc 4920

acggggccgt ggcagtcgca tcccaaacgg atgttacgtc ataaagccat gattcagtgt 4980

gcccgtctgg ccttcggatt tgctggtatc tatgacaagg atgaagccga gcgcattgtc 5040

gaaaatactg catacactgc agaacgtcag ccggaacgcg acatcactcc ggttaacgat 5100

gaaaccatgc aggagattaa cactctgctg atcgccctgg ataaaacatg ggatgacgac 5160

ttattgccgc tctgttccca gatatttcgc cgcgacattc gtgcatcgtc agaactgaca 5220

caggccgaag cagtaaaagc tcttggattc ctgaaacaga aagccgcaga gcagaaggtg 5280

gcagcatgac accggacatt atcctgcagc gtaccgggat cgatgtgaga gctgtcgaac 5340

agggggatga tgcgtggcac aaattacggc tcggcgtcat caccgcttca gaagttcaca 5400

acgtgatagc aaaaccccgc tccggaaaga agtggcctga catgaaaatg tcctacttcc 5460

acaccctgct tgctgaggtt tgcaccggtg tggctccgga agttaacgct aaagcactgg 5520

cctggggaaa acagtacgag aacgacgcca gaaccctgtt tgaattcact tccggcgtga 5580

atgttactga atccccgatc atctatcgcg acgaaagtat gcgtaccgcc tgctctcccg 5640

atggtttatg cagtgacggc aacggccttg aactgaaatg cccgtttacc tcccgggatt 5700

tcatgaagtt ccggctcggt ggtttcgagg ccataaagtc agcttacatg gcccaggtgc 5760

agtacagcat gtgggtgacg cgaaaaaatg cctggtactt tgccaactat gacccgcgta 5820

tgaagcgtga aggcctgcat tatgtcgtga ttgagcggga tgaaaagtac atggcgagtt 5880

ttgacgagat cgtgccggag ttcatcgaaa aaatggacga ggcactggct gaaattggtt 5940

ttgtatttgg ggagcaatgg cgatgacgca tcctcacgat aatatccggg taggcgcaat 6000

cactttcgtc tactccgtta caaagcgagg ctgggtattt cccggccttt ctgttatccg 6060

aaatccactg aaagcacagc ggctggctga ggagataaat aataaacgag gggctgtatg 6120

cacaaagcat cttctgttga gttaagaacg agtatcgaga tggcacatag ccttgctcaa 6180

attggaatca ggtttgtgcc aataccagta gaaacagacg aagaatccat ggcggccgct 6240

gtggatctag acggcatcag agcagattgt actgagagtg caccataatc ggcattttct 6300

tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca aggatgctgt ctttgacaac 6360

agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag gaagctaggc gcaaacgttg attgtttgtc 6420

tgcgtagaat cctctgtttg tcatatagct tgtaatcacg acattgtttc ctttcgcttg 6480

aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta ggatcaagat ccatttttaa 6540

cacaaggcca gttttgttca gcggcttgta tgggccagtt aaagaattag aaacataacc 6600

aagcatgtaa atatcgttag acgtaatgcc gtcaatcgtc atttttgatc cgcgggagtc 6660

agtgaacaga taccatttgc cgttcatttt aaagacgttc gcgcgttcaa tttcatctgt 6720

tactgtgtta gatgcaatca gcggtttcat cacttttttc agtgtgtaat catcgtttag 6780

ctcaatcata ccgagagcgc cgtttgctaa ctcagccgtg cgttttttat cgctttgcag 6840

aagtttttga ctttcttgac ggaagaatga tgtgcttttg ccatagtatg ctttgttaaa 6900

taaagattct tcgccttggt agccatcttc agttccagtg tttgcttcaa atactaagta 6960

tttgtggcct ttatcttcta cgtagtgagg atctctcagc gtatggttgt cgcctgagct 7020

gtagttgcct tcatcgatga actgctgtac attttgatac gtttttccgt caccgtcaaa 7080

gattgattta taatcctcta caccgttgat gttcaaagag ctgtctgatg ctgatacgtt 7140

aacttgtgca gttgtcagtg tttgtttgcc gtaatgttta ccggagaaat cagtgtagaa 7200

taaacggatt tttccgtcag atgtaaatgt ggctgaacct gaccattctt gtgtttggtc 7260

ttttaggata gaatcatttg catcgaattt gtcgctgtct ttaaagacgc ggccagcgtt 7320

tttccagctg tcaatagaag tttcgccgac tttttgatag aacatgtaaa tcgatgtgtc 7380

atccgcattt ttaggatctc cggctaatgc aaagacgatg tggtagccgt gatagtttgc 7440

gacagtgccg tcagcgtttt gtaatggcca gctgtcccaa acgtccaggc cttttgcaga 7500

agagatattt ttaattgtgg acgaatcgaa ctcaggaact tgatattttt catttttttg 7560

ctgttcaggg atttgcagca tatcatggcg tgtaatatgg gaaatgccgt atgtttcctt 7620

atatggcttt tggttcgttt ctttcgcaaa cgcttgagtt gcgcctcctg ccagcagtgc 7680

ggtagtaaag gttaatactg ttgcttgttt tgcaaacttt ttgatgttca tcgttcatgt 7740

ctcctttttt atgtactgtg ttagcggtct gcttcttcca gccctcctgt ttgaagatgg 7800

caagttagtt acgcacaata aaaaaagacc taaaatatgt aaggggtgac gccaaagtat 7860

acactttgcc ctttacacat tttaggtctt gcctgcttta tcagtaacaa acccgcgcga 7920

tttacttttc gacctcattc tattagactc tcgtttggat tgcaactggt ctattttcct 7980

cttttgtttg atagaaaatc ataaaaggat ttgcagacta cgggcctaaa gaactaaaaa 8040

atctatctgt ttcttttcat tctctgtatt ttttatagtt tctgttgcat gggcataaag 8100

ttgcctcgag acttttcata ctcccgccat tcagagaaga aaccaattgt ccatattgca 8160

tcagacattg ccgtcactgc gtcttttact ggctcttctc gctaaccaaa ccggtaaccc 8220

cgcttattaa aagcattctg taacaaagcg ggaccaaagc catgacaaaa acgcgtaaca 8280

aaagtgtcta taatcacggc agaaaagtcc acattgatta tttgcacggc gtcacacttt 8340

gctatgccat agcattttta tccataagat tagcggatcc tacctgacgc tttttatcgc 8400

aactctctac tgtttctcca tacccgtttt tttgggaatt cgagctctaa ggaggttata 8460

aaaaatggat aagaaatact caataggctt agatatcggc acaaatagcg tcggatgggc 8520

ggtgatcact gatgaatata aggttccgtc taaaaagttc aaggttctgg gaaatacaga 8580

ccgccacagt atcaaaaaaa atcttatagg ggctctttta tttgacagtg gagagacagc 8640

ggaagcgact cgtctcaaac ggacagctcg tagaaggtat acacgtcgga agaatcgtat 8700

ttgttatcta caggagattt tttcaaatga gatggcgaaa gtagatgata gtttctttca 8760

tcgacttgaa gagtcttttt tggtggaaga agacaagaag catgaacgtc atcctatttt 8820

tggaaatata gtagatgaag ttgcttatca tgagaaatat ccaactatct atcatctgcg 8880

aaaaaaattg gtagattcta ctgataaagc ggatttgcgc ttaatctatt tggccttagc 8940

gcatatgatt aagtttcgtg gtcatttttt gattgaggga gatttaaatc ctgataatag 9000

tgatgtggac aaactattta tccagttggt acaaacctac aatcaattat ttgaagaaaa 9060

ccctattaac gcaagtggag tagatgctaa agcgattctt tctgcacgat tgagtaaatc 9120

aagacgatta gaaaatctca ttgctcagct ccccggtgag aagaaaaatg gcttatttgg 9180

gaatctcatt gctttgtcat tgggtttgac ccctaatttt aaatcaaatt ttgatttggc 9240

agaagatgct aaattacagc tttcaaaaga tacttacgat gatgatttag ataatttatt 9300

ggcgcaaatt ggagatcaat atgctgattt gtttttggca gctaagaatt tatcagatgc 9360

tattttactt tcagatatcc taagagtaaa tactgaaata actaaggctc ccctatcagc 9420

ttcaatgatt aaacgctacg atgaacatca tcaagacttg actcttttaa aagctttagt 9480

tcgacaacaa cttccagaaa agtataaaga aatctttttt gatcaatcaa aaaacggata 9540

tgcaggttat attgatgggg gagctagcca agaagaattt tataaattta tcaaaccaat 9600

tttagaaaaa atggatggta ctgaggaatt attggtgaaa ctaaatcgtg aagatttgct 9660

gcgcaagcaa cggacctttg acaacggctc tattccccat caaattcact tgggtgagct 9720

gcatgctatt ttgagaagac aagaagactt ttatccattt ttaaaagaca atcgtgagaa 9780

gattgaaaaa atcttgactt ttcgaattcc ttattatgtt ggtccattgg cgcgtggcaa 9840

tagtcgtttt gcatggatga ctcggaagtc tgaagaaaca attaccccat ggaattttga 9900

agaagttgtc gataaaggtg cttcagctca atcatttatt gaacgcatga caaactttga 9960

taaaaatctt ccaaatgaaa aagtactacc aaaacatagt ttgctttatg agtattttac 10020

ggtttataac gaattgacaa aggtcaaata tgttactgaa ggaatgcgaa aaccagcatt 10080

tctttcaggt gaacagaaga aagccattgt tgatttactc ttcaaaacaa atcgaaaagt 10140

aaccgttaag caattaaaag aagattattt caaaaaaata gaatgttttg atagtgttga 10200

aatttcagga gttgaagata gatttaatgc ttcattaggt acctaccatg atttgctaaa 10260

aattattaaa gataaagatt ttttggataa tgaagaaaat gaagatatct tagaggatat 10320

tgttttaaca ttgaccttat ttgaagatag ggagatgatt gaggaaagac ttaaaacata 10380

tgctcacctc tttgatgata aggtgatgaa acagcttaaa cgtcgccgtt atactggttg 10440

gggacgtttg tctcgaaaat tgattaatgg tattagggat aagcaatctg gcaaaacaat 10500

attagatttt ttgaaatcag atggttttgc caatcgcaat tttatgcagc tgatccatga 10560

tgatagtttg acatttaaag aagacattca aaaagcacaa gtgtctggac aaggcgatag 10620

tttacatgaa catattgcaa atttagctgg tagccctgct attaaaaaag gtattttaca 10680

gactgtaaaa gttgttgatg aattggtcaa agtaatgggg cggcataagc cagaaaatat 10740

cgttattgaa atggcacgtg aaaatcagac aactcaaaag ggccagaaaa attcgcgaga 10800

gcgtatgaaa cgaatcgaag aaggtatcaa agaattagga agtcagattc ttaaagagca 10860

tcctgttgaa aatactcaat tgcaaaatga aaagctctat ctctattatc tccaaaatgg 10920

aagagacatg tatgtggacc aagaattaga tattaatcgt ttaagtgatt atgatgtcga 10980

tcacattgtt ccacaaagtt tccttaaaga cgattcaata gacaataagg tcttaacgcg 11040

ttctgataaa aatcgtggta aatcggataa cgttccaagt gaagaagtag tcaaaaagat 11100

gaaaaactat tggagacaac ttctaaacgc caagttaatc actcaacgta agtttgataa 11160

tttaacgaaa gctgaacgtg gaggtttgag tgaacttgat aaagctggtt ttatcaaacg 11220

ccaattggtt gaaactcgcc aaatcactaa gcatgtggca caaattttgg atagtcgcat 11280

gaatactaaa tacgatgaaa atgataaact tattcgagag gttaaagtga ttaccttaaa 11340

atctaaatta gtttctgact tccgaaaaga tttccaattc tataaagtac gtgagattaa 11400

caattaccat catgcccatg atgcgtatct aaatgccgtc gttggaactg ctttgattaa 11460

gaaatatcca aaacttgaat cggagtttgt ctatggtgat tataaagttt atgatgttcg 11520

taaaatgatt gctaagtctg agcaagaaat aggcaaagca accgcaaaat atttctttta 11580

ctctaatatc atgaacttct tcaaaacaga aattacactt gcaaatggag agattcgcaa 11640

acgccctcta atcgaaacta atggggaaac tggagaaatt gtctgggata aagggcgaga 11700

ttttgccaca gtgcgcaaag tattgtccat gccccaagtc aatattgtca agaaaacaga 11760

agtacagaca ggcggattct ccaaggagtc aattttacca aaaagaaatt cggacaagct 11820

tattgctcgt aaaaaagact gggatccaaa aaaatatggt ggttttgata gtccaacggt 11880

agcttattca gtcctagtgg ttgctaaggt ggaaaaaggg aaatcgaaga agttaaaatc 11940

cgttaaagag ttactaggga tcacaattat ggaaagaagt tcctttgaaa aaaatccgat 12000

tgacttttta gaagctaaag gatataagga agttaaaaaa gacttaatca ttaaactacc 12060

taaatatagt ctttttgagt tagaaaacgg tcgtaaacgg atgctggcta gtgccggaga 12120

attacaaaaa ggaaatgagc tggctctgcc aagcaaatat gtgaattttt tatatttagc 12180

tagtcattat gaaaagttga agggtagtcc agaagataac gaacaaaaac aattgtttgt 12240

ggagcagcat aagcattatt tagatgagat tattgagcaa atcagtgaat tttctaagcg 12300

tgttatttta gcagatgcca atttagataa agttcttagt gcatataaca aacatagaga 12360

caaaccaata cgtgaacaag cagaaaatat tattcattta tttacgttga cgaatcttgg 12420

agctcccgct gcttttaaat attttgatac aacaattgat cgtaaacgat atacgtctac 12480

aaaagaagtt ttagatgcca ctcttatcca tcaatccatc actggtcttt atgaaacacg 12540

cattgatttg agtcagctag gaggtgactg atggctggtt ggcgtactgt tgtggtaaat 12600

acccatgggt atggacagaa gctttcccta tagtgagtcg tattagagct tggcgtaatc 12660

atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 12720

agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 12780

tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 12840

aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccggctgc tgaaccccca 12900

accgttccgc cagtttgcgt gtcgtcagac cgtctacgcc gacctcgttc aacaggtcca 12960

gggcggcacg gatcactgta ttcggctgca actttgtcat gattgacact ttatcactga 13020

taaacataat atgtccacca acttatcagt gataaagaat ccgcgcgttc aatcggacca 13080

gcggaggctg gtccggaggc cagacgtgaa acccaacata cccctgatcg taattctgag 13140

cactgtcgcg ctcgacgctg tcggcatcgg cctgattatg ccggtgctgc cgggcctcct 13200

gcgcgatctg gttcactcga acgacgtcac cgcccactat ggcattctgc tggcgctgta 13260

tgcgttggtg caatttgcct gcgcacctgt gctgggcgcg ctgtcggatc gtttcgggcg 13320

gcggccaatc ttgctcgtct cgctggccgg cgccactgtc gactacgcca tcatggcgac 13380

agcgcctttc ctttgggttc tctatatcgg gcggatcgtg gccggcatca ccggggcgac 13440

tggggcggta gccggcgctt atattgccga tatcactgat ggcgatgagc gcgcgcggca 13500

cttcggcttc atgagcgcct gtttcgggtt cgggatggtc gcgggacctg tgctcggtgg 13560

gctgatgggc ggtttctccc cccacgctcc gttcttcgcc gcggcagcct tgaacggcct 13620

caatttcctg acgggctgtt tccttttgcc ggagtcgcac aaaggcgaac gccggccgtt 13680

acgccgggag gctctcaacc cgctcgcttc gttccggtgg gcccggggca tgaccgtcgt 13740

cgccgccctg atggcggtct tcttcatcat gcaacttgtc ggacaggtgc cggccgcgct 13800

ttgggtcatt ttcggcgagg atcgctttca ctgggacgcg accacgatcg gcatttcgct 13860

tgccgcattt ggcattctgc attcactcgc ccaggcaatg atcaccggcc ctgtagccgc 13920

ccggctcggc gaaaggcggg cactcatgct cggaatgatt gccgacggca caggctacat 13980

cctgcttgcc ttcgcgacac ggggatggat ggcgttcccg atcatggtcc tgcttgcttc 14040

gggtggcatc ggaatgccgg cgctgcaagc aatgttgtcc aggcaggtgg atgaggaacg 14100

tcaggggcag ctgcaaggct cactggcggc gctcaccagc ctgacctcga tcgtcggacc 14160

cctcctcttc acggcgatct atgcggcttc tataacaacg tggaacgggt gggcatggat 14220

tgcaggcgct gccctctact tgctctgcct gccggcgctg cgtcgcgggc tttggagcgg 14280

cgcagggcaa cgagccgatc gctgatcgtg gaaacgatag gcctatgcca tgcgggtcaa 14340

ggcgacttcc ggcaagctat acgcgcccta ggagtgcggt tggaacgttg gcccagccag 14400

atactcccga tcacgagcag gacgccgatg atttgaagcg cactcagcgt ctgatccaag 14460

aacaaccatc ctagcaacac ggcggtcccc gggctgagaa agcccagtaa ggaaacaact 14520

gtaggttcga gtcgcgagat cccccggaac caaaggaagt aggttaaacc cgctccgatc 14580

aggccgagcc acgccaggcc gagaacattg gttcctgtag gcatcgggat tggcggatca 14640

aacactaaag ctactggaac gagcagaagt cctccggccg ccagttgcca ggccgtaaag 14700

gtgagcagag gcacgggagg ttgccacttg cgggtcagca cggttccgaa cgccatggaa 14760

accgcccccg ccaggcccgc tgcgacgccg acaggatcta gcgctgcgtt tggtgtcaac 14820

accaacagcg ccacgcccgc agttccgcaa atagccccca ggaccgccat caatcgtatc 14880

gggctaccta gcagagcggc agagatgaac acgaccatca gcggctgcac agcgcctacc 14940

gtcgccgcga ccccgcccgg caggcggtag accgaaataa acaacaagct ccagaatagc 15000

gaaatattaa gtgcgccgag gatgaagatg cgcatccacc agattcccgt tggaatctgt 15060

cggacgatca tcacgagcaa taaacccgcc ggcaacgccc gcagcagcat accggcgacc 15120

cctcggcctc gctgttcggg ctccacgaaa acgccggaca gatgcgcctt gtgagcgtcc 15180

ttggggccgt cctcctgttt gaagaccgac agcccaatga tctcgccgtc gatgtaggcg 15240

ccgaatgcca cggcatctcg caaccgttca gcgaacgcct ccatgggctt tttctcctcg 15300

tgctcgtaaa cggacccgaa catctctgga gctttcttca gggccgacaa tcggatctcg 15360

cggaaatcct gcacgtcggc cgctccaagc cgtcgaatct gagccttaat cacaattgtc 15420

aattttaatc ctctgtttat cggcagttcg tagagcgcgc cgtgcgtccc gagcgatact 15480

gagcgaagca agtgcgtcga gcagtgcccg cttgttcctg aaatgccagt aaagcgctgg 15540

ctgctgaacc cccagccgga actgacccca caaggcccta gcgtttgcaa tgcaccaggt 15600

catcattgac ccaggcgtgt tccaccaggc cgctgcctcg caactcttcg caggcttcgc 15660

cgacctgctc gcgccacttc ttcacgcggg tggaatccga tccgcacatg aggcggaagg 15720

tttccagctt gagcgggtac ggctcccggt gcgagctgaa atagtcgaac atccgtcggg 15780

ccgtcggcga cagcttgcgg tacttctccc atatgaattt cgtgtagtgg tcgccagcaa 15840

acagcacgac gatttcctcg tcgatcagga cctggcaacg ggacgttttc ttgccacggt 15900

ccaggacgcg gaagcggtgc agcagcgaca ccgattccag gtgcccaacg cggtcggacg 15960

tgaagcccat cgccgtcgcc tgtaggcgcg acaggcattc ctcggccttc gtgtaatacc 16020

ggccattgat cgaccagccc aggtcctggc aaagctcgta gaacgtgaag gtgatcggct 16080

cgccgatagg ggtgcgcttc gcgtactcca acacctgctg ccacaccagt tcgtcatcgt 16140

cggcccgcag ctcgacgccg gtgtaggtga tcttcacgtc cttgttgacg tggaaaatga 16200

ccttgttttg cagcgcctcg cgcgggattt tcttgttgcg cgtggtgaac agggcagagc 16260

gggccgtgtc gtttggcatc gctcgcatcg tgtccggcca cggcgcaata tcgaacaagg 16320

aaagctgcat ttccttgatc tgctgcttcg tgtgtttcag caacgcggcc tgcttggcct 16380

cgctgacctg ttttgccagg tcctcgccgg cggtttttcg cttcttggtc gtcatagttc 16440

ctcgcgtgtc gatggtcatc gacttcgcca aacctgccgc ctcctgttcg agacgacgcg 16500

aacgctccac ggcggccgat ggcgcgggca gggcaggggg agccagttgc acgctgtcgc 16560

gctcgatctt ggccgtagct tgctggacca tcgagccgac ggactggaag gtttcgcggg 16620

gcgcacgcat gacggtgcgg cttgcgatgg tttcggcatc ctcggcggaa aaccccgcgt 16680

cgatcagttc ttgcctgtat gccttccggt caaacgtccg attcattcac cctccttgcg 16740

ggattgcccc gactcacgcc ggggcaatgt gcccttattc ctgatttgac ccgcctggtg 16800

ccttggtgtc cagataatcc accttatcgg caatgaagtc ggtcccgtag accgtctggc 16860

cgtccttctc gtacttggta ttccgaatct tgccctgcac gaataccagc tccgcgaagt 16920

cgctcttctt gatggagcgc atggggacgt gcttggcaat cacgcgcacc ccccggccgt 16980

tttagcggct aaaaaagtca tggctctgcc ctcgggcgga ccacgcccat catgaccttg 17040

ccaagctcgt cctgcttctc ttcgatcttc gccagcaggg cgaggatcgt ggcatcaccg 17100

aaccgcgccg tgcgcgggtc gtcggtgagc cagagtttca gcaggccgcc caggcggccc 17160

aggtcgccat tgatgcgggc cagctcgcgg acgtgctcat agtccacgac gcccgtgatt 17220

ttgtagccct ggccgacggc cagcaggtag gccgacaggc tcatgccggc cgccgccgcc 17280

ttttcctcaa tcgctcttcg ttcgtctgga aggcagtaca ccttgatagg tgggctgccc 17340

ttcctggttg gcttggtttc atcagccatc cgcttgccct catctgttac gccggcggta 17400

gccggccagc ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg ccaggtgcga ataagggaca 17460

gtgaagaagg aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac ctatcctgcc cggctgacgc 17520

cgttggatac accaaggaaa gtctacacga accctttggc aaaatcctgt atatcgtgcg 17580

aaaaaggatg gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc cgaagcaggg ttatgcagcg 17640

gaaaagatcc gtc 17653

<210> 2

<211> 6936

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 60

gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 120

tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 180

cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 240

aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 300

cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtccattc gccattcagg ctgcgcaact 360

gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat 420

gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa 480

cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga attcgagctc ggtacccggg 540

gatcccggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat aatcggcatt ttcttttgcg 600

tttttatttg ttaactgtta attgtccttg ttcaaggatg ctgtctttga caacagatgt 660

tttcttgcct ttgatgttca gcaggaagct aggcgcaaac gttgattgtt tgtctgcgta 720

gaatcctctg tttgtcatat agcttgtaat cacgacattg tttcctttcg cttgaggtac 780

agcgaagtgt gagtaagtaa aggttacatc gttaggatca agatccattt ttaacacaag 840

gccagttttg ttcagcggct tgtatgggcc agttaaagaa ttagaaacat aaccaagcat 900

gtaaatatcg ttagacgtaa tgccgtcaat cgtcattttt gatccgcggg agtcagtgaa 960

cagataccat ttgccgttca ttttaaagac gttcgcgcgt tcaatttcat ctgttactgt 1020

gttagatgca atcagcggtt tcatcacttt tttcagtgtg taatcatcgt ttagctcaat 1080

cataccgaga gcgccgtttg ctaactcagc cgtgcgtttt ttatcgcttt gcagaagttt 1140

ttgactttct tgacggaaga atgatgtgct tttgccatag tatgctttgt taaataaaga 1200

ttcttcgcct tggtagccat cttcagttcc agtgtttgct tcaaatacta agtatttgtg 1260

gcctttatct tctacgtagt gaggatctct cagcgtatgg ttgtcgcctg agctgtagtt 1320

gccttcatcg atgaactgct gtacattttg atacgttttt ccgtcaccgt caaagattga 1380

tttataatcc tctacaccgt tgatgttcaa agagctgtct gatgctgata cgttaacttg 1440

tgcagttgtc agtgtttgtt tgccgtaatg tttaccggag aaatcagtgt agaataaacg 1500

gatttttccg tcagatgtaa atgtggctga acctgaccat tcttgtgttt ggtcttttag 1560

gatagaatca tttgcatcga atttgtcgct gtctttaaag acgcggccag cgtttttcca 1620

gctgtcaata gaagtttcgc cgactttttg atagaacatg taaatcgatg tgtcatccgc 1680

atttttagga tctccggcta atgcaaagac gatgtggtag ccgtgatagt ttgcgacagt 1740

gccgtcagcg ttttgtaatg gccagctgtc ccaaacgtcc aggccttttg cagaagagat 1800

atttttaatt gtggacgaat cgaactcagg aacttgatat ttttcatttt tttgctgttc 1860

agggatttgc agcatatcat ggcgtgtaat atgggaaatg ccgtatgttt ccttatatgg 1920

cttttggttc gtttctttcg caaacgcttg agttgcgcct cctgccagca gtgcggtagt 1980

aaaggttaat actgttgctt gttttgcaaa ctttttgatg ttcatcgttc atgtctcctt 2040

ttttatgtac tgtgttagcg gtctgcttct tccagccctc ctgtttgaag atggcaagtt 2100

agttacgcac aataaaaaaa gacctaaaat atgtaagggg tgacgccaaa gtatacactt 2160

tgccctttac acattttagg tcttgcctgc tttatcagta acaaacccgc gcgatttact 2220

tttcgacctc attctattag actctcgttt ggattgcaac tggtctattt tcctcttttg 2280

tttgatagaa aatcataaaa ggatttgcag actacgggcc taaagaacta aaaaatctat 2340

ctgtttcttt tcattctctg tattttttat agtttctgtt gcatgggcat aaagttgcgt 2400

cgacgccttg ctcaaattgg aatcaggttt gtgccaatac cagtagaaac agacgaagaa 2460

tccatggcgg ccgctgtcat gggcccttga caattaatca tccggctcgt ataatgtgtg 2520

gcgagaccat tggtctcagt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 2580

ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tgagatctgt ccatacccat 2640

ggtctagaat gctcgagact tttcatactc ccgccattca gaagcttgag tattctatag 2700

tgtcacctaa atagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgtgta 2760

tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 2820

ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 2880

aaacctgtcg tgccagaatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata 2940

ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 3000

gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 3060

acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 3120

tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 3180

agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 3240

cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 3300

aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg 3360

gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 3420

agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 3480

aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 3540

gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 3600

ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc 3660

aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 3720

aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 3780

tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt ggatctcgcg gtatcattgc 3840

agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 3900

ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 3960

ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 4020

ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 4080

acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccaattac acgccactgg ctgtgcttgc 4140

tggggtgacg gtggcaacgg tggcggcctt gctgggctat cgcgttggaa agaaacgagg 4200

gaaaggggac tgataaaccg gtcttagccc ctccccttgg tgtccaaccg ctctgtaggc 4260

ctctcaggcg ccgctggtgc cgctggttgg acgccaaggg tgaatccgcc tcgataccct 4320

gattactcgc ttcctgcgcc ctctcaggcg gcgatagggg actggtaaaa cggggattgc 4380

ccagacgcct cccccgcccc ttcaggggca caaatgcggc cccaacgggg ccacgtagtg 4440

gtgcgttttt tgcgtttcca cccttttctt ccttttccct tttaaacctt ttaggacgtc 4500

tacaggccac gtaatccgtg gcctgtagag tttaaaaagg gacggatttg ttgccattaa 4560

gggacggatt tgttgttaag aagggacgga tttgttgttg taaagggacg gatttgttgt 4620

attgtgggac gcagatacag tgtcccctta tacacaagga atgtcgaacg tggcctcacc 4680

cccaatggtt tacaaaagca atgccctggt cgaggccgcg tatcgcctca gtgttcagga 4740

acagcggatc gttctggcct gtattagcca ggtgaagagg agcgagcctg tcaccgatga 4800

agtgatgtat tcagtgacgg cggaggacat agcgacgatg gcgggtgtcc ctatcgaatc 4860

ttcctacaac cagctcaaag aagcggccct gcgcctgaaa cggcgggaag tccggttaac 4920

ccaagagccc aatggcaagg ggaaaagacc gagtgtgatg attaccggct gggtgcaaac 4980

aatcatctac cgggagggtg agggccgtgt agaactcagg ttcaccaaag acatgctgcc 5040

gtacctgacg gaactcacca aacagttcac caaatacgcc ttggctgacg tggccaagat 5100

ggacagcacc cacgcgatca ggctttacga gctgctcatg caatgggaca gcatcggcca 5160

gcgcgaaata gaaattgacc agctgcgaaa gtggtttcaa ctggaaggcc ggtatccctc 5220

gatcaaggac ttcaagttgc gagtgcttga tccagccgtg acgcagatca acgagcacag 5280

cccgctacag gtggagtggg cgcagcgaaa gaccgggcgc aaggtcacac atctgttgtt 5340

cagttttgga ccgaagaagc ccgccaaggc ggtgggtaag gccccagcga agcgcaaggc 5400

cgggaagatt tcagatgctg agatcgcgaa acaggctcgc cctggtgaga catgggaagc 5460

ggcccgcgct cgactaaccc agatgccgct tgcgcaaact attaactggc gaactactta 5520

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 5580

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 5640

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 5700

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 5760

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 5820

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 5880

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 5940

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 6000

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 6060

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 6120

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 6180

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 6240

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 6300

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 6360

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 6420

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 6480

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 6540

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 6600

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 6660

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 6720

aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 6780

gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggaaattg taagcgttaa tattttgtta 6840

aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc 6900

aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagata 6936

<210> 3

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

aacgacggcc agtgaattcg agctcggtac cctttcctgc gttgtcgact gtatttagaa 60

aaataaacaa ataggggttc c 81

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gtatgaaaag tctcgagcat tctagatcca cagcggccgc catggattct tcgtctgttt 60

ctactg 66

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cggccgctgt ggatctagaa tgctcgagac ttttcatact cccgccattc 50

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gcctattgag tatttcttat ccatttttta taacctcctt agagctcgaa ttc 53

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cgagctctaa ggaggttata aaaaatggat aagaaatact caataggctt agat 54

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gctctaatac gactcactat agggaaagct tctgtccata cccatgggta tttaccac 58

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

aagaatccat ggcggccgct gtggatctag acggcatcag agcagattgt a 51

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

tctgaatggc gggagtatga aaagtctcga ggcaacttta tgcccatgca aca 53

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

gggcgaattc gagctcggta cccggggatc ccggcatcag agcagattgt a 51

<210> 12

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

aacctgattc caatttgagc aaggcgtcga cgcaacttta tgcccatgca aca 53

<210> 13

<211> 320

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

agttgcgtcg acgccttgct caaattggaa tcaggtttgt gccaatacca gtagaaacag 60

acgaagaatc catggcggcc gctgtcatgg gcccttgaca attaatcatc cggctcgtat 120

aatgtgtggc gagaccattg gtctcagttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 180

ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttg agatctgtcc 240

atacccatgg tctagaatgc tcgagacttt tcatactccc gccattcaga agcttgagta 300

ttctatagtg tcacctaaat 320

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

tcttctggat gttcttgtgg 20

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

gtggtcttct ggatgttctt gtgg 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

aaacagaaga cctacaagaa cacc 24

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

ttttgagatc tgtccatacc catggtctag a 31

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

tctgaatggc gggagtatga aaagtctcga g 31

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

agctcccaga ccgacggatc gct 23

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

ctgggtctca tctgaagcgc a 21

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

tgcagtaagc cctgatcgat aaaatg 26

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

ggagccttgc tgccatcgtg 20

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

ttttgagatc tgtccatacc catggtctag aagctcccag accgacggat cgct 54

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

cattttatcg atcagggctt actgcactgg gtctcatctg aagcgca 47

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

tgcgcttcag atgagaccca gtgcagtaag ccctgatcga taaaatg 47

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

tctgaatggc gggagtatga aaagtctcga gggagccttg ctgccatcgt g 51

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

gcaggctgga ccagaatatc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

aactgcaacg ctttctcgat 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

ccttccagcg attcagagag 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

acggcagaca agtaactcag 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 31

gtggacggca gacaagtaac tcag 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 32

aaactgccgt ctgttcattg agtc 24

<210> 33

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 33

ttttgagatc tgtccatacc catggtctag acttcgacga gaaaagcttc gtc 53

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 34

cggggcttgt cgttgatgcg attggcgtcc gtgttcacg 39

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 35

cgtgaacacg gacgccaatc gcatcaacga caagccccg 39

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 36

aacagacttt cgcgccgcat ctatagctcc actgattgtc ttacg 45

<210> 37

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 37

cgtaagacaa tcagtggagc tatagatgcg gcgcgaaagt ctgtt 45

<210> 38

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 38

tctgaatggc gggagtatga aaagtctcga gcatgtgctg atggttgctg g 51

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 39

ttttgtaccc cgaaaattgg 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 40

agctgccgtt gatgaaatgc 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 41

gtgatttcct acggggtgtc 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 42

gcgtttcgac accggaaacc 20

Claims (10)

1.一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，包含pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种，所述的pCasPA质粒能够表达Cas9蛋白和λ-Red重组系统，所述的pACRISPR质粒能够表达sgRNA。

2.如权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，所述的pCasPA质粒包含λ-Red重组系统基因片段、Cas9蛋白基因片段以及P_araB启动子DNA片段，Cas9蛋白和λ-Red重组系统都受到阿拉伯糖启动子P_araB的调控。

3.如权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，所述的pCasPA质粒包含sacB基因片段，所述的pACRISPR质粒包含sacB反向筛选基因片段。

4.如权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，所述的pACRISPR质粒包含XbaI和XhoI酶切位点，用来插入修复模板。

5.如权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，所述的pACRISPR质粒包含两个BsaI位点，用来插入spacer片段。

6.如权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，所述的pACRISPR质粒包含sgRNA序列。

7.如权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，所述的pCasPA质粒的序列为SEQ ID NO：1，所述的pACRISPR质粒的序列为SEQ ID NO：2。

8.含有pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种的细胞。

9.含有pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种的菌株。

10.权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统在基因编辑中的作用。