CN114540389B - 一种制备基因工程病毒的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备基因工程病毒的方法及其应用。本发明提供了一种制备基因工程病毒的方法：先以待改造病毒的非侵染中间宿主为载体，使如下四种物质在所述中间宿主中完成病毒的核酸改造、筛选及重启激活，再从所述中间宿主中释放改造后病毒，得到激活的基因工程病毒；所述四种物质为：1)所述待改造病毒的核酸、2)外源目的核酸片段、3)核酸修复或重组系统、4)核酸靶向识别和/或剪切系统；总之，本发明通过λ‑red重组系统和CRISPR Cas9筛选系统结合在中间宿主中一步完成噬菌体改造，筛选与重启激活，然后在噬菌体末端宿主中完成扩增与富集。基于该平台，快速改造肺炎克雷伯噬菌体使其携带外源解聚酶。

Description

一种制备基因工程病毒的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种制备基因工程病毒的方法及其应用。
背景技术
美国国立卫生研究院(NIH)报告称，有80％的细菌感染中超过90％伤口慢性感染与生物膜有关。该类细菌感染常表现为慢性感染，高抗生素耐药，且难治愈。生物膜是一种由细菌分泌的具有黏性的胞外多聚物，帮助细菌附着在物体表面，其主要由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成。一方面，生物膜为膜内生物提供保护屏障，可保护膜内细菌免受各种极端恶劣环境的侵害。例如，保护细菌逃逸宿主免疫系统、对抗抗生素或杀菌剂、耐受环境干燥等。另一方面，大部分膜内细菌代谢率降低，导致基于干扰或抑制细菌复制类抗生素的杀菌效果急剧降低。研究表明，生物膜内细菌可产生高达1000倍的抗生素耐药。以上特性导致生物膜难以彻底消除，故生物膜相关的感染大多是慢性的，高度顽强的，难治愈的。
在临床中，高发的院内感染之一与肺炎克雷伯杆菌生物膜相关。肺炎克雷伯杆菌是一种条件致病菌，能分泌形成生物膜，黏附在仪器表面，如导尿管，器官移植支架等，进而引发尿路感染，免疫低下患者的呼吸道、肺、血液、伤口等感染。而传统的抗生素、消毒液等杀菌剂难以彻底消除肺炎克雷伯生物膜，杀灭膜内细菌。因此，当前急需一种新型的消除生物膜的方法高效清除膜内细菌。
噬菌体疗法被认为是一种有效消除生物膜高效杀菌的方法。自然界中，部分噬菌体---一类特异性侵染细菌的病毒能有效消除生物膜。该类噬菌体常携带一种裂解生物膜的酶---解聚酶。Sanjay等人利用天然分离的噬菌体KPO1K2显著消除生物膜；Shafiq等人利用天然噬菌体TSK1消除85％-100％肺炎克雷伯生物膜。但是，利用天然噬菌体直接进行生物膜消除具有以下弊端。其一，天然噬菌体的分离具有一定盲目性与随机性，并非所有噬菌体都能表达解聚酶，消除生物膜。其二，携带解聚酶的噬菌体消除生物膜能力可能偏弱。其三，天然噬菌体可操控性差，直接用于细菌感染治疗在临床效果，时效性以及安全性上都有一定的不可预见性的问题。而相比天然噬菌体而言，改造的噬菌体可控性较强，消除生物膜能力以及杀菌能力可借助改造手段进行目的性提高。因此，需要借助高效改造平台，快速高通量、目的性改造噬菌体，增加或提高噬菌体靶向消除生物膜的能力进而高效杀灭膜内细菌。
目前，利用噬菌体靶向肺炎克雷伯杆菌生物膜的主要依赖于天然分离的携带有解聚酶的肺炎克雷伯杆菌噬菌体。但该种方法具有一定的盲目性与随机性。其一，天然分离的肺炎克雷伯噬菌体不一定都能表达该类解聚酶。即使携带有该类解聚酶，但是解聚效果以及杀菌效果可能差强人意。其二，天然噬菌体具有高度宿主特异性，导致天然噬菌体宿主谱相对较窄，该类噬菌体的适用范围相对较窄。相比于分离天然噬菌体，定向改造噬菌体能具有快速高效靶向杀灭细菌的巨大潜能。
为有效解决与生物膜紧密相关的细菌感染，Timothy Lu提出靶向改造噬菌体，使其携带一种具有降解生物膜能力的酶，即解聚酶。该噬菌体在解聚酶帮助下，成功破坏生物膜，进入到生物膜内侵染并杀灭宿主菌。Timothy Lu团队基于成熟的商业化T7select415-1噬菌体展示系统改造天然的不携带解聚酶的大肠杆菌噬菌体T7，使其能携带来源于A.actinomycetemcomitans解聚酶DspB。功能验证表明该改造的T7噬菌体杀灭生物膜内大肠杆菌数量比天然的T7噬菌体高2个数量级。但该方法具有很大局限性，首先，该系统无法应用于其它类别噬菌体的改造；其次，该研究仅改造大肠杆菌噬菌体完成大肠杆菌生物膜降解及杀灭效果验证，未针对其它细菌生物膜，如肺炎克雷伯杆菌生物膜。
Oppenheim等仅使用Red系统进行噬菌体改造重组。该方法主要存在以下缺陷：(1)该方法中，噬菌体基因组的获取依赖于该噬菌体自发侵染宿主细菌大肠杆菌。(2)该方法的Red系统依赖于整合在宿主细菌基因组上的λ原噬菌体，故导致Red系统运用的灵活性低，不适用于宿主菌中无λ原噬菌体的情况。(3)该方法形成的噬菌斑为改造的和天然的混合，改造的噬菌斑只占1％-13％。
以上提及的现有改造技术均是在宿主细菌中完成。即，在天然的宿主细菌中完成噬菌体改造或激活，获得具有活性的噬菌体颗粒。但对于耐药菌或环境菌这些非实验室菌株而言，遗传操作不成熟，耐药性严重，安全性低，这些因素严重限制噬菌体的改造成功率。并且，这些现有改造技术的改造和激活是分步完成，即在酵母内或体外完成噬菌体改造，再在宿主内完成改造噬菌体的激活。这会增加噬菌体改造的时间成本。综上，目前还没有改造后携带外源解聚酶的肺炎克雷伯噬菌体，并用于靶向裂解肺炎克雷伯杆菌生物膜实现高效杀菌的案例。与此同时，也没有一个高效普适的实现一步完成改造与激活的平台。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备基因工程病毒的方法。
本发明提供的方法包括如下步骤：先以待改造病毒的非侵染中间宿主为载体，使如下四种物质在所述中间宿主中完成病毒的核酸改造、筛选及重启激活，再从所述中间宿主中释放改造后病毒，得到激活的基因工程病毒；
所述四种物质为：1)所述待改造病毒的核酸、2)外源目的核酸片段、3)核酸修复或重组系统、4)核酸靶向识别和/或剪切系统；
所述基因工程病毒的核酸与所述待改造病毒的核酸相比，具备至少一种由所述外源目的核酸片段带来的修饰改造。
上述方法还包括如下富集所述基因工程病毒的步骤：将所述激活的基因工程病毒侵染所述待改造病毒的末端宿主，实现所述基因工程病毒的扩增富集。
上述方法中，所述修饰改造为改善病毒的特征和/或引入新病毒特征；
其中，所述改善病毒为针对如下至少一种方面进行改善：宿主范围、病毒附着、病毒吸附、核酸注入速率，核酸复制、核酸组装、病毒裂解及病毒裂解周期、病毒爆发大小、免疫逃逸、免疫刺激、免疫灭活、生物膜降解、细菌噬菌体抗性、细菌抗生素致敏、毒力因子调节、目标宿主基因组编辑、靶向调控和携带抗菌肽。
上述方法中，所述待改造病毒的核酸来源于病毒颗粒或人工合成；
和/或，所述病毒颗粒来源于蓝藻、肠道共生菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌和/或艰难梭菌；
其中所述肠道共生菌可以为Prevotella copri、Megasphaera micronucifrmis、Megasphaera elsdenii、Streptococcus vestibμLaris、Eubacterium siraeum、Clostridium scindens、Clostridium symbiosum、Lactobacillus fermentum、Ruminococcus bromii、Ruminococcus bromii、Lactobacillus crispatus、Enterococcusfaecium、Dorea Longicatena、Streptococcus mitosi oralis pneumonia、Streptococcussalivarius、Streptococcus parasanguinis、Eubacterium ramμLus、Ruminococcustorques、Ruminococcus gnavus、Ruminococcus sp.5_1_39BFAA、Megamonas funiformis、Megamonas hypermegale和/或Megamonas_rupellensis。
和/或，所述外源目的核酸片段为提高生物膜降解能力对应的外源目的核酸片段，对应的改善病毒特征为提高生物膜降解能力；
和/或，所述核酸修复或重组系统包含重组酶、核酸外切酶及具有抑制宿主对外源核酸降解的蛋白；
和/或，所述重组酶是beta或beta同类重组蛋白家族的酶；
优选地，所述同源重组系统为λ-red重组系统；
和/或，所述核酸靶向识别和/或剪切系统包括核酸内切酶和至少1种sgRNA；
和/或，所述核酸内切酶为RNA引导的核酸酶；
和/或，所述RNA引导的核酸酶是Cas9或Cas9衍生的核酸酶。
优选地，所述核酸靶向识别/剪切系统包括CRIPSR Cas9系统，上述CRIPSR Cas9系统包括sgRNA和cas9蛋白。
上述方法中，所述待改造病毒为噬菌体；
和/或，所述提高生物膜降解能力对应的外源目的核酸片段为降解噬菌体宿主生物膜的1种或几种蛋白所对应的核酸；
具体可以为如下：
1)包括解聚酶dspB基因的核酸片段；
2)包括与所述解聚酶dspB基因序列一致性大于85％且具有相同功能的核酸片段；
在本发明的实施例中，解聚酶为来源于Aggregatibacteractinomycetemcomitans HK1651的解聚酶DspB。
和/或，所述核酸修复或重组系统为λ-Red重组系统；
和/或，所述核酸靶向识别和/或剪切系统为包括sgRNA和cas9蛋白的CRIPSR Cas9系统。
上述方法中，所述完成病毒的核酸改造、筛选及重启激活通过优化如下至少一种方面实现：
A)优化所述中间宿主提高重启效率；
所述优化中间宿主具体从如下中至少一种实现：中间宿主的生理活性状态、核酸、蛋白合成系统、涉及的各类酶、涉及的调控因子和合成所需底物；
所述优化中间宿主尤其具体为缩小所述中间宿主和所述待改造病毒核酸的密码子差异；在本发明的实施例中，具体通过在中间宿主中表达外源tRNA实现缩小中间宿主大肠杆菌和待改造噬菌体核酸的密码子差异；
B)优化所述待改造病毒的核酸提高重启效率；
所述优化待改造病毒的核酸具体从如下中至少一种实现：提高所述待改造病毒的核酸的转化效率、提高所述待改造病毒的核酸或蛋白的合成速度；
所述优化待改造病毒的核酸具体为在转入所述中间宿主之前将所述待改造病毒的核酸进行体外环化。
在本发明中，以制备基因工程噬菌体为例，方法包括如下步骤：先将待改造噬菌体的核酸、解聚酶编码基因、λ-red重组系统和CRIPSR Cas9系统导入待改造噬菌体的非侵染中间宿主，完成噬菌体核酸的改造、筛选及重启激活，再从所述中间宿主中释放改造后噬菌体，得到激活的改造后噬菌体。
在本发明的实施例中，所述解聚酶编码基因和所述CRIPSR Cas9系统中sgRNA通过表达解聚酶编码基因模块和sgRNA的质粒导入；
所述λ-red重组系统和所述CRIPSR Cas9系统中cas9蛋白编码基因通过同一质粒导入；
所述待改造噬菌体的核酸源自天然噬菌体的基因组，且可以为环化后的天然噬菌体的基因组；
上述待改造噬菌体的非侵染中间宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌；在本发明的实施例中，中间宿主为大肠杆菌模式菌株，可以为DH10B或携带可表达外源tRNA质粒的DH10B；
上述待改造噬菌体可自发侵染如下宿主的噬菌体：肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌或艰难梭菌；本发明的实施例中以自发侵染肺炎克雷伯杆菌的噬菌体为例。
上述方法还包括如下富集改造后噬菌体的步骤：将所述激活的改造后噬菌体侵染待改造噬菌体的宿主，实现所述改造后噬菌体的扩增富集。
为了进一步优化获得的改造后噬菌体，可以采用如下优化方案：在导入之前，将待改造噬菌体的核酸体外环化；或者选择中间宿主为如下菌或导入用于优化中间宿主和噬菌体核酸密码子差异载体的菌；所述菌具体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌。
本发明还有一个目的是提供一种用于制备基因工程病毒的试剂盒。
本发明提供的试剂盒包括如下：
1)所述待改造病毒的核酸；
2)外源目的核酸片段；
3)核酸修复或重组系统；
4)核酸靶向识别和/或剪切系统；
5)所述待改造病毒的非侵染中间宿主。
在试剂盒中，上述外源目的核酸片段和核酸靶向识别和/或剪切系统中的sgRNA可以存在于同一载体的形式出现；
上述核酸修复或重组系统和核酸靶向识别/剪切系统中的cas9蛋白可以存在于同一载体的形式出现；
上述中间宿主可以为表达外源tRNA的中间宿主。
上述试剂盒还包括λ-red重组系统的诱导物，具体为阿拉伯糖。
由上述的方法获得的基因工程病毒也是本发明保护的范围；
或，所述基因工程病毒或上述的试剂盒在如下中的应用也是本发明保护的范围：
1)杀伤病毒宿主；
2)制备杀伤病毒宿主的产品。
本发明还提供如下杀伤病毒宿主的产品：
1)所述产品包括上述基因工程病毒；
2)所述产品包括上述试剂盒；
3)所述产品，包括上述基因工程病毒和其对应的待改造病毒。
本发明提出在具有较高普适性的中间宿主中一步完成噬菌体改造与激活的平台，搭建快速高效的一步完成改造与激活的噬菌体平台，成功改造出三株携带外源解聚酶的肺炎克雷伯杆菌噬菌体。相比天然噬菌体，改造后的噬菌体裂解生物膜效果增强，且杀菌更快速高效。本发明构建携带外源解聚酶的肺炎克雷伯杆菌噬菌体的方法具有如下优点：
1、组合λ-red重组系统与CRIPSR Cas9系统。此组合可同时实现噬菌体改造与噬菌体的筛选。即将λ-red重组系统与Cas9整合到同一载体中，命名为pCas。其中，阿拉伯糖诱导型启动子调控λ-red重组系统，而非诱导性启动子调控Cas9进行持续表达。将外源DNA片段与sgRNA整合到同一载体中，命名为pSgRNA。当且仅当两个质粒同时存在于细菌中，并在细菌培养基中已加入阿拉伯糖诱导λ-red重组系统表达的情况下，噬菌体改造与筛选才能正常进行。其原理如下：携带有同源臂的外源DNA可在λ-red重组系统协助下，与噬菌体基因组发生同源重组，进而完成噬菌体改造。与此同时，Cas9蛋白在sgRNA的引导下，特异性靶向并剪切未发生同源重组的天然的噬菌体基因组，因此只有改造的噬菌体会存活，最终完成改造的噬菌体筛选。
2、采用中间宿主概念。选择表型明确的模式菌株作为中间宿主。第一可以有效避免末端宿主耐药性与质粒抗性标记冲突、常规实验不适用等问题，让常规实验简单化。第二，主要操作利用无毒无害的中间宿主，最大程度减少实验人员与临床病原菌的接触，保护了实验人员的安全。第三，中间宿主为噬菌体改造、筛选以及重启激活提供舒适的反应场所，改造成功的噬菌体在中间宿主体内完成第一代子代繁殖。
3、人为破碎中间宿主，释放中间宿主体内改造的噬菌体。并运用末端宿主菌帮助该改造的噬菌体进行大量的扩增富集。
综上所述，基于λ-red重组系统和CRISPR Cas9筛选系统，噬菌体将在中间宿主中完成改造，筛选与重启激活，并在其对应末端宿主中进行扩增与富集，最后进行特定功能验证，完成噬菌体改造。
总之，本发明通过λ-red重组系统和CRISPR Cas9筛选系统结合在中间宿主中一步完成噬菌体改造，筛选与重启激活，然后在噬菌体末端宿主中完成扩增与富集。基于该平台，快速改造肺炎克雷伯噬菌体使其携带外源解聚酶，进而增强裂解肺炎克雷伯杆菌生物膜能力以及杀灭肺炎克雷伯杆菌能力。该噬菌体改造平台可运用于其它类型噬菌体的改造，该噬菌体改造平台有一定普适性。改造的噬菌体与天然的噬菌体组合使用，可显著增强靶向裂解生物膜能力以及杀菌能力。
附图说明
图1为高效改造噬菌体的相关示意图；其中，图1a为本发明所采用的高效改造噬菌体的方法路线；图1b为本实施例解聚酶模块示意图；图1c为实施例MX5001,MX5004,MX5005基因组改造示意图。
图2为噬菌斑PCR产物凝胶电泳结果图；图2a示MX5001验证结果；图2b和图2c分别为MX5004和MX5005验证结果；图2d为改造效率统计图。
图3为连续三轮的改造噬菌体MX5001纯化验证结果图，其中a-c分别为连续三轮的改造噬菌体MX5001纯化验证结果图。
图4为杀菌能力测定结果图。
图5为噬菌体CPB0329基于优化前后的两种中间宿主的重启效率结果和噬菌体CPB0329基于基因组环化策略的重启效率结果；图5a为噬菌体CPB0329基于优化前后的两种中间宿主的重启效率结果图；图5b为噬菌体CPB0329基于基因组环化策略的重启效率结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中，术语“中间宿主”指的是噬菌体无法侵染且分子克隆技术成熟的细菌。例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌等。
本发明中，术语“末端宿主”指的是噬菌体可以自发侵染的细菌。
图1a为本发明所采用的高效改造噬菌体的方法路线：构建同时装载待重组外源DNA片段和sgRNA的pSgRNA质粒，共转化pSgRNA质粒和pCas(表达λ-red重组系统和cas9)于中间宿主中，添加阿拉伯糖诱导λ-red重组系统的表达，再转入噬菌体基因组(该基因组可来自于从头合成，或体外组装得到，或天然的噬菌体基因组)于中间宿主中进行噬菌体改造与筛选；加入氯仿破碎中间宿主，提取含改造噬菌体上清；将含改造噬菌体上清与宿主共孵育，在宿主体内完成改造的噬菌体的扩增与富集，最后，进行特定功能验证。
表1为引物序列
上述表中第2列的序列从上到下依次为序列18至序列51。
下述实施例中的噬菌体和细菌资源如无特殊说明，均可通过GPH获得：
活体资源：普通公众可以通过GPH(深圳华大生命科学研究院发起的全球噬菌体库)获取；
基因组资源：可通过CNGB数据库中获取，下面是本发明实施例涉及的噬菌体的CNGB索引号及对应的噬菌体名称：CNS0254338CPB0329、CNS0254345CPB0170、CNS0254346CPB0171、CNS0254330CPB0307、CNS0254328CPB0311、CNS0254329CPB0312、CNS0254331CPB0315、CNS0254335CPB0319。
实施例1、携带外源解聚酶的肺炎克雷伯杆菌噬菌体的构建
一、获取天然的肺炎克雷伯噬菌体及其基因组信息
本发明中采用的天然肺炎克雷伯噬菌体CPB0329于污水分离得到，且该株噬菌体基因组信息明确(CNGB索引号为CNS0254338)。
二、确定插入位点，制备携带插入位点100bp同源臂且可独立表达的解聚酶模块中的各个元件
1、确定插入位点
基于CPB0329基因组信息，选择功能注释为“minor capsid”下游12bp处为插入位点(序列4第100-101位核苷酸之间，序列4为CPB0329插入位点上下游序列)。
若功能注释中无“minor capsid”，可考虑将插入位点设置在功能注释为“majorcapsid”下游，两转录方向相对的基因下游等，选择的原则是，不影响噬菌体基因组上原基因的表达即可。
2、携带插入位点100bp同源臂且可独立表达的解聚酶模块中各元件制备
插入位点确定后，需制备携带插入位点100bp同源臂且可独立表达的解聚酶模块(携带同源臂的dspB模块)，该模块包括如下元件：插入位点上游100bp同源臂+启动子+核糖体结合位点(RBS)+解聚酶(DspB)+插入位点下游100bp同源臂(图1b)。
各元件具体制备如下：
1)插入位点上游100bp同源臂和插入位点下游100bp同源臂
根据插入位点上游100bp区域和插入位点下游100bp区域的序列，分别设计能够扩增出插入位点上游100bp区域的引物对和能够扩增出插入位点下游100bp区域的引物对，且每个引物对中的上游引物和下游引物的5'末端均有BbsI酶切位点。
提取肺炎克雷伯噬菌体CPB0329的基因组核酸(DNA)作为模板，用对应的2对引物对(表1中的ds-CPB0329-HL-F/ds-CPB0329-HL-R和ds-CPB0329-HR-F/ds-CPB0329-HR-R)分别进行PCR扩增，得到首尾两端均含有BbsI酶切位点的上游100bp同源臂(序列1)和首尾两端均含有BbsI酶切位点的下游100bp同源臂(序列3)。
2)解聚酶dspB模块
A.含有启动子和RBS的调控元件
截取噬菌体CPB0329功能为“major capsid”上游300bp序列进行启动子预测，预测工具为BPROM。完成预测后，确定该区域中存在启动子并获取启动子核心区域。最终选择CPB0329功能为“major capsid”上游203bp序列作为本发明中解聚酶模块中的启动子和RBS，即调控元件。在该203bp序列的5’末端设计添加BbsI酶切位点。
上述调控元件的选择原则：调控元件在噬菌体的末端宿主中具有活性，能正常调控基因的表达：
1)人工合成的非天然的调控元件(如人工合成的强启动子PJ23119等)
2)天然调控元件:(a)源于细菌或其它噬菌体的启动子，RBS等；(b)源于该噬菌体自身的调控元件(可通过现有的调控元件对应的预测工具进行预测得到)。
B.制备首尾两端含有BbsI酶切位点的解聚酶dspB模块
由于宿主是肺炎克雷伯菌，选取已知能够解聚肺炎克雷伯菌生物膜的解聚酶，如来源于Aggregatibacteractino mycetemcomitans HK1651的解聚酶DspB(NZ_CP007502)。在dspB基因的3’末端设计添加BbsI酶切位点。
人工合成dspB模块，该模块组成为：203bp调控元件(包括Promoter+RBS)+dspB基因。
通过PCR方式扩增人工合成dspB模块，扩增引物见表1中的ds-Pro-rbs-F和ds-dspB-R，得到首尾两端含有BbsI酶切位点的解聚酶dspB模块(序列2)。
三、制备靶向天然肺炎克雷伯噬菌体的sgRNA
1、sgRNA的筛选
选择至少2种sgRNA预测软件进行sgRNA的设计。本实施例中，同时选择CRISPRko和sgRNACas9，取2个软件预测的sgRNA交集作为最终设计。在本实施例中，由于改造的噬菌体与天然的噬菌体只存在解聚酶模块的差异，为实现高效筛选改造的噬菌体，杀灭天然噬菌体的目的，sgRNA的靶向区域需覆盖插入位点上下游。因此，选取插入位点上下游15-19bp序列作为预测软件的输入序列，取预测交集后最终设计得到1条sgRNA。
CPB0329_sgRNA1靶序列为>sg1靶序列AACTAATAAGCCAAACCCCTTGG(序列5)。
2、sgRNA的获得
虽然设计的sgRNA为20nt，但实际构建于载体上时，其为双链形式。本实施例采取双引物退火法制备双链形式的sgRNA。
设计合成用于制备上述sgRNA的引物，为表1中的CPB0329-sgRNA1-F和CPB0329-sgRNA1-R，再将这两条引物退火，得到两端带有粘性末端的sgRNA。
四、构建同时携带sgRNA和携带插入位点同源臂的解聚酶模块的pSgRNA质粒
使用pN20-GFP-CmR质粒(核苷酸序列为序列52，其中CmR抗性基因为第124-783；gg为第4635-4756，cas9handle序列为第4777-4852)，含有驱动sgRNA表达的启动子、cas9handle序列来源于S.py的终止子。
1、开环pN20-GFP-CmR质粒
用BsaI以及BbsI双酶切质粒pN20-GFP-CmR,回收4766bp的片段，得到开环pN20-GFP-CmR质粒；
2、gg序列的获得
事实上，sgRNA和解聚酶模块的插入位点之间含有约100bp序列，命名为gg，gg序列中含sgRNA的启动子，而双酶切质粒pN20-GFP-CmR后产生的短片段gg难以胶回收，故设计引物gg.v.F/R(表1所示)扩增gg序列。
以质粒pN20-GFP-CmR为模板，用引物gg.v.F和引物gg.v.R进行PCR扩增，得到首尾两端含有BbsI酶切位点的gg序列(序列6)。
3、pSgRNA质粒的构建
可以用golden gate组装法或常规酶切连接法构建同时携带sgRNA和解聚酶模块的pSgRNA质粒，本实施例采取酶切连接法构建，具体如下：
1)酶切
用BbsI-HF(NEB,R3539L)分别酶切上述步骤二中制备的首尾两端均含有BbsI酶切位点的上游100bp同源臂(序列1)、首尾两端均含有BbsI酶切位点的下游100bp同源臂(序列3)、首尾两端含有BbsI酶切位点的解聚酶dspB模块(序列2)和上述制备的首尾两端含有BbsI酶切位点的gg序列(序列6)；采用切胶回收方式回收4种酶切产物；
2)连接
使用T4 DNA ligase(NEB,M0202L)将上述4种酶切产物的纯化产物、上述步骤三中制备的两端带有粘性末端的sgRNA和上述制备的开环pN20-GFP-CmR质粒连接，得到同时携带sgRNA和携带CPB0329同源臂的解聚酶模块的质粒，命名为pSgRNA质粒。
五、制备同时携带pCas质粒和pSgRNA质粒的中间宿主
pCas质粒(addgene货号#62225)是一个温敏型质粒，需在30℃下培养，它可持续表达Cas9蛋白以及由阿拉伯糖诱导型启动子调控的λ-red重组系统。
采用化学转化方法，将100ng pCas质粒和100ng上述四构建的pSgRNA质粒共同转化至中间宿主大肠杆菌DH10B感受态(感受态浓度为50x)中，得到含有双质粒的DH10B。
将含有双质粒的DH10B在含有10mM阿拉伯糖的LB培养基中30℃培养5小时，使其OD600达到0.5-0.6，基于常规的氯化钙法制备含有双质粒的DH10B化转感受态。
六、同源重组后破碎获得改造后的肺炎克雷伯噬菌体
转化天然的肺炎克雷伯噬菌体基因组于含有双质粒的DH10B感受态，破碎DH10B，提取上清获得改造后肺炎克雷伯噬菌体，具体如下：
提取天然的肺炎克雷伯噬菌体CPB0329基因组，使用常规的化学转化法(将42℃热激时间延长为2min)将1.5ug CPB0329基因组转入200μL上述步骤五中制备的含有双质粒的DH10B化转感受态(感受态浓度为100x)。利用37℃预热的LB培养基于37℃，220rpm摇床中进行复苏，复苏2-3h后，得到含有改造后的肺炎克雷伯噬菌体的中间宿主；再向含有改造后的肺炎克雷伯噬菌体的中间宿中加入体积百分含量5％氯仿，并置于涡旋振荡仪上振荡30s破碎细胞，再12000rpm离心5min，最后收集上清，得到改造后肺炎克雷伯噬菌体(命名为MX5001)。
上述原理如下：在复苏过程中，携带同源臂的解聚酶模块将在λ-red重组系统作用下，与CPB0329基因组发生同源重组，进而完成携带解聚酶的CPB0329噬菌体基因组层面的改造；改造后的基因组利用DH10B生物合成系统(如DNA复制，转录，翻译以及蛋白折叠)，表达噬菌体相关蛋白，并完成噬菌体装配，包装等过程，最终获得改造的噬菌体活体；与此同时，Cas9蛋白在sgRNA的引导下，靶向剪切未进行同源重组的天然的CPB0329基因组，特异性杀灭天然的CPB0329噬菌体，高效快速筛选改造的噬菌体。
七、具有活性的改造后的肺炎克雷伯噬菌体的富集
本发明采用中间宿主的概念，选择最广泛使用，商业上流行的，无害的模式生物-大肠杆菌作为中间宿主，实现简单，快速地一步完成噬菌体改造激活。但是由于DH10B仅作为中间宿主而非该噬菌体可侵染的宿主，故释放到胞外的噬菌体无法侵染DH10B,无法再进行子代繁殖。因此，从中间宿主中获得的改造后的噬菌体数量有限，需通过末端宿主菌(肺炎克雷伯杆菌CSXY0266，通过GPH(深圳华大生命科学研究院的全球噬菌体库)获取)进行富集扩增。
采取噬菌体点板实验观察噬菌斑形态，噬菌体点板实验：
将200μL处于对数生长期(OD600＝0.5-0.8)末端宿主菌培养液(CSXY0266)与3ml0.4％LB软琼脂(额外添加5mM Ca2+)混合，平铺在1.5％LB固体平板上，形成双层琼脂平板。待上层琼脂凝固后，取2.5μL上述六得到的改造后肺炎克雷伯噬菌体(MX5001)点滴在上层琼脂表面，重复若干次。将该平板于37℃培养6-8小时，观察噬菌斑形态，随机点9个点。结果：3个点产生MX5001噬菌斑。
八、改造肺炎克雷伯噬菌体的验证
基于噬菌斑PCR进行验证，确定该噬菌斑是否由改造的噬菌体所产生，具体方法如下：
将上述七的实验组的3个点产生MX5001噬菌斑用枪头戳取并溶于10μL SM噬菌体保存液(NaCl(100mM),MgSO4(8mM),Tris-HCl(50mM),0.01％(w/v)Gelatin,pH7.5)中，得到改造后肺炎克雷伯噬菌体溶液；
吸取2μL改造后肺炎克雷伯噬菌体溶液作为PCR扩增模板，剩余样品暂存于4℃供后续纯化使用，用引物(MX5001.F和MX5001.R)进行PCR验证，是否成功插入外源解聚酶dspB模块。以末端宿主菌CSXY0266和天然噬菌体CPB0329的基因组DNA为对照。
结果如图2a所示，泳道1和泳道5为marker，泳道2、3、4分别为3个MX5001噬菌斑，泳道6为末端宿主菌CSXY0266，泳道7为天然噬菌体CPB0329的基因组DNA，可以看出：其一，只有改造的噬菌体MX5001产生外源解聚酶模块dspB基因上的0.3kb目的条带，即该噬菌斑含有改造的噬菌体MX5001，即噬菌体改造成功；其二，实验组产生的斑点均产生阳性目的条带，即改造效率为100％。
改造效率＝阳性斑点数/进行噬菌斑验证的总斑点数
实施例2、携带外源解聚酶的肺炎克雷伯杆菌噬菌体的构建
为进一步验证改造效率，对另外2个天然的肺炎克雷伯杆菌噬菌体CPB0170和CPB0171进行改造,改造后噬菌体分别命名为MX5004和MX5005(图1c)，改造方法与实施例1相同：
一、获取天然的肺炎克雷伯噬菌体及其基因组信息
与实施例1相同，获得肺炎克雷伯杆菌噬菌体CPB0170和CPB0171；
二、确定插入位点，制备携带插入位点100bp同源臂且可独立表达的解聚酶模块中的各个元件
1、确定插入位点：方法与实施例1相同，
CPB0170：解聚酶模块插入位点在“major capsid”下游(序列9第100-101位中间)；
CPB0171:解聚酶模块插入位点在两个转录方向相对的基因下游(序列15第100-101位中间)。
2、携带插入位点100bp同源臂且可独立表达的解聚酶模块中各元件制备
1)插入位点上游100bp同源臂和插入位点下游100bp同源臂
方法与实施例1相同，将引物替换为CPB0170、CPB0171插入位点上下游同源臂相应扩增引物(表1中的ds-CPB0170-HL-F/ds-CPB0170-HL-R、ds-CPB0171-HL-F/ds-CPB0171-HL-R、ds-CPB0170-HR-F/ds-CPB0170-HR-R、ds-CPB0171-HRF/ds-CPB0171-HR-R)，得到首尾两端均含有BbsI酶切位点的CPB0170上游100bp同源臂(序列7)、首尾两端均含有BbsI酶切位点的CPB0170下游100bp同源臂(序列8)、首尾两端均含有BbsI酶切位点的CPB0171上游100bp同源臂(序列13)、首尾两端均含有BbsI酶切位点的CPB0171下游100bp同源臂(序列14)；
2)解聚酶dspB模块
与实施例1的方法相同，获得首尾两端含有BbsI酶切位点的CPB0170解聚酶dspB模块(序列2)和首尾两端含有BbsI酶切位点的CPB0171解聚酶dspB模块(序列2)；
三、制备靶向天然肺炎克雷伯噬菌体的sgRNA
CPB0170sgRNA为靶序列为序列10、序列11或序列12。
CPB0171sgRNA为靶序列为序列16或序列17。
对应的制备引物为表1所示。
四、构建同时携带sgRNA和携带插入位点同源臂的解聚酶模块的pSgRNA质粒
将解聚酶dspB模块的上下游同源臂分别替换为CPB0170、CPB0171插入位点上下游同源臂。具体实验操作同CPB0329。
1、开环pN20-GFP-CmR质粒：与实施例1相同；
2、gg序列的获得：与实施例1相同；
3、pSgRNA质粒的构建
1)酶切
用BbsI-HF(NEB,R3539L)分别酶切上述步骤二中制备的首尾两端均含有BbsI酶切位点的对应噬菌体上游100bp同源臂、首尾两端均含有BbsI酶切位点的对应噬菌体下游100bp同源臂、首尾两端含有BbsI酶切位点的对应噬菌体解聚酶dspB模块和上述制备的首尾两端含有BbsI酶切位点的gg序列；采用切胶回收方式回收4种酶切产物；
酶切对象分别为对应的不同噬菌体的不同片段。
2)连接
使用T4 DNA ligase(NEB,M0202L)将上述4种酶切产物的纯化产物、上述步骤三中制备的两端带有粘性末端的对应噬菌体的不同sgRNA和上述制备的开环pN20-GFP-CmR质粒连接，得到同时携带sgRNA和解聚酶模块的质粒，命名为含有不同sgRNA的pSgRNA质粒(CPB0170)和含有不同sgRNA的pSgRNA质粒(CPB0171)。
五、制备同时携带pCas质粒和pSgRNA质粒的DH10B感受态
与实施例1相同。
六、同源重组后破碎获得改造肺炎克雷伯噬菌体
与实施例1相同，由CPB0170和不同靶序列的sgRNA得到改造后的肺炎克雷伯噬菌体，分别命名为MX5004-sgRNA1(对应靶序列为序列10)、MX5004-sgRNA2(对应靶序列为序列11)、MX5004-sgRNA3(对应靶序列为序列12)；
由CPB0171和不同靶序列的sgRNA得到改造后的肺炎克雷伯噬菌体，分别命名为MX5005-sgRNA1(对应靶序列为序列16)、MX5005-sgRNA2(对应靶序列为序列17)。
七、具有活性的改造后肺炎克雷伯噬菌体的富集
与实施例1相同，但是MX5004的末端宿主菌为肺炎克雷伯杆菌CSXY0187(可从GPH获得)，MX5005的末端宿主菌为肺炎克雷伯杆菌CSXY0187；
MX5004-sgRNA1、MX5004-sgRNA2、MX5004-sgRNA3、MX5005-sgRNA1、MX5005-sgRNA2分别点了10个点且全部点均产生噬菌斑。
八、改造肺炎克雷伯噬菌体的验证
与实施例1相同，MX5004-sgRNA1(MX5004-sg1)、MX5004-sgRNA2(MX5004-sg2)、MX5004-sgRNA3(MX5004-sg3)、MX5005-sgRNA1(MX5005-sg1)、MX5005-sgRNA2(MX5005-sg2)分别随机挑选3-5个噬菌斑进行PCR验证，验证引物见表1，靶向扩增插入位点上下游区域。以CPB0170末端宿主菌、CPB0171末端宿主菌、天然噬菌体CPB0170的基因组DNA、天然噬菌体CPB0171的基因组DNA为对照。
MX5004噬菌体点板实验及噬菌斑PCR验证结果如图2b所示，泳道1、7、13和19分别为marker，泳道2-5为MX5004-sgRNA1(MX5004-sg1)的噬菌斑；泳道8-12分别为MX5004-sgRNA2(MX5004-sg2)的噬菌斑；泳道14-18分别为MX5004-sgRNA3(MX5004-sg3)的噬菌斑；泳道14为SM缓冲液，泳道15为CPB0170末端宿主菌；泳道16为CPB0170的基因组DNA；可以看出，改造的噬菌体目的条带大小MX5004:1.5kb，天然的噬菌体目的条带大小为0.2kb。
MX5005噬菌体点板实验及噬菌斑PCR验证结果如图2c所示，泳道6和12分别为marker，泳道1-5为MX5005-sgRNA1(MX5005-sg1)的噬菌斑；泳道7-11分别为MX5005-sgRNA2(MX5005-sg2)的噬菌斑；泳道13为SM缓冲液，泳道14为CPB0171末端宿主菌；泳道16为CPB0171的基因组DNA；可以看出，改造的噬菌体目的条带大小MX5005:1.5kb，天然的噬菌体目的条带大小为0.2kb。
计算改造效率(阳性率)＝阳性斑点数/进行噬菌斑验证的总斑点数，结果如图2d所示，可以看出，MX5004-sgRNA1(MX5004-sg1)、MX5004-sgRNA2(MX5004-sg2)、MX5004-sgRNA3(MX5004-sg3)、MX5005-sgRNA1(MX5005-sg1)、MX5005-sgRNA2(MX5005-sg2)改造效率均为80％-100％。
上述各种来源于不同sgRNA的噬菌体均为同一种噬菌体，仅是制备方法中不同sgRNA导致纯化程度不同。
实施例3、携带外源解聚酶的肺炎克雷伯杆菌噬菌体功能验证及评估
1、纯化及验证
将实施例1的步骤八中改造成功的噬菌体MX5001、实施例21的步骤八中改造成功的噬菌体MX5004和MX5005均进行如下至少3轮连续的纯化及验证：
上述纯化的方法为：制备含有宿主菌的双层琼脂平板。制备方法同实施例1的步骤七：将200μL处于对数生长期(OD600＝0.5-0.8)末端宿主菌培养液(CSXY0266)与3ml0.4％LB软琼脂(含5mM Ca2+)混合，平铺在1.5％LB固体平板上，形成双层琼脂平板。待琼脂凝固(约20-30min)，吸取2-3μL实施例1的步骤八中PCR鉴定改造成功且条带单一的样品(噬菌斑溶液)点滴于上层平板，用无菌滤纸条进行划线，区分出一、二、三区，操作类似常规菌液划线培养技术。将平板置于37℃培养箱培养3-4小时，观察噬菌斑，用枪头随机挑取24个单噬菌斑并溶于10μL SM噬菌体保存液，取2μL进行噬菌斑PCR验证实验，具体实验条件同实施例1的步骤八。完成第一轮纯化。随机选择一个阳性样品重复以上操作，完成第二及第三轮纯化。
噬菌体MX5001结果如图3所示，a、b和c分别为3轮纯化的PCR验证结果，可以看出，均得到大小为0.3kb的单一条带；该结果表明，三轮纯化过程中随机选取的噬菌斑进行PCR验证，均为目的改造。
完成第三轮纯化后，随机选择一个阳性样品进行噬菌体点板实验，操作同实施例1的七。37℃培养6小时后，用枪头戳出整个噬菌斑溶于3ml SM噬菌体保存液，置于4℃过夜，进行膜过滤，回收并4℃保存滤液，即噬菌体母液。最后进行噬菌体双层琼脂平板法完成噬菌体效价滴定。
操作如下：取100μL上述噬菌体母液，并利用SM噬菌体保存液对该母液进行梯度稀释，得到若干梯度稀释液，分别将梯度稀释液与200μL处于对数生长期(OD600＝0.5-0.8)末端宿主菌培养液(CSXY0266)以及3ml 0.4％LB软琼脂(含5mM Ca2+)混合，平铺在1.5％LB固体平板上。将平板置于37℃培养6小时，计数噬菌斑，按以下公式计算效价：噬菌体效价(PFU/ml)＝噬菌斑数*对应的稀释倍数*10。
最终，计算得到改造的噬菌体MX5001效价为109PFU/ml。
改造的噬菌体MX5004效价为109PFU/ml。
改造的噬菌体MX5005效价为109PFU/ml。
2、杀菌能力评估
上述1中鉴定改造成功的MX5001噬菌体侵染宿主细菌,利用酶标仪动态监测细菌生长状态，进而评估噬菌体杀菌能力，具体如下：
用各种噬菌体侵染处于对数生长期(OD＝0.8)宿主菌肺炎克雷伯杆菌CSXY0266(即MOI＝1)，并基于96孔酶标板，用新鲜的LB培养液补齐每孔反应液至180μL，培养温度为37℃，双轨道方式振荡酶标板。
每10min测定起始状态为对数生长期宿主菌CSXY0266的OD600,连续测定24h，每组进行8个重复，利用酶标仪动态监测细菌生长状态，进而评估改造的噬菌体杀菌能力。以不添加噬菌体的宿主CSXY0266为对照。
上述各种噬菌体分别为：改造的噬菌体MX5001(MX5001)、天然噬菌体CPB0329(CPB0329)和等数量混合的MX5001与CPB0329(MX5001+CPB0329)。
结果如图4所示，实验组分别改造的噬菌体MX5001、天然噬菌体CPB0329和等量混合的MX5001与CPB0329，对照组为宿主菌CSXY0266；可以看出，改造的噬菌体MX5001杀菌效果明显优于天然噬菌体CPB0329；改造的噬菌体与天然噬菌体的等比组合的杀菌效果同样优于天然噬菌体CPB0329；表明，其一，相对天然噬菌体，改造的噬菌体能更快更高效杀灭宿主；其二，等量混合的改造的噬菌体与天然噬菌体的杀菌效果同样优于天然噬菌体。
实施例4、中间宿主的优化
1、优化中间宿主大肠杆菌DH10B
为进一步增强中间宿主DH10B的适用性，提高基于中间宿主DH10B重启激活噬菌体的效率，本发明对中间宿主DH10B进行优化。研究表明，噬菌体扩增存在密码子偏好性问题。鉴于噬菌体与中间宿主密码子偏好性的差异，本实施例将pRARE质粒转化中间宿主DH10B，进而利用pRARE可编码的6个大肠杆菌罕见的tRNA弥补密码子偏好性差异。具体方法如下：
用5ml含氯霉素LB培养基(氯霉素终浓度25ug/ml)培养大肠杆菌Rosetta(DE3)(70954)，并置于37℃，220rpm培养过夜。次日，使用TIANGEN快速质粒小提试剂盒(DP105-03)提取Rosetta(DE3)中的pRARE质粒。将100ng pRARE质粒转化100μL DH10B(终浓度50x)感受态中，涂布于含氯霉素LB固体平板(氯霉素终浓度25ug/ml)，37℃培养过夜。挑取单克隆培养，并制备DH10B(pRARE)化转感受态(终浓度100x)，命名携带pRARE质粒的DH10B为DH10B/pRARE。
2、验证优化后中间宿主的重启效率
选择肺炎克雷伯杆菌噬菌体CPB0329验证中间宿主优化前后重启效率改变。具体方法如下：
实验组：将1.5ug CPB0329基因组转化200μL浓度为100x的DH10B/pRARE中；
对照组：加1.5ug CPB0329基因组转化200μL浓度为100x的DH10B中；
采用1ml 37℃预热的LB培养基复苏。首先置于37℃，220rpm中培养1h，再转移至22℃，220rpm中培养3-48h。分别于3h，6h，12h，24h，48h取出200μL样品，加入体积百分含量5％氯仿(10μL)，并置于涡旋振荡仪上振荡30s破碎细胞，再12000rpm离心5min，收集上清。利用SM噬菌体保存液梯度稀释上清，取100μL各梯度稀释液及上清原液分别与200μL对数生长期宿主CSXY0266与3ml 0.4％LB软琼脂(含5mM Ca2+)混合，平铺于1.5％LB平板，置于37℃培养3h以上。计数噬菌斑，以如下公式换算重启效率：
重启效率(Log((PFU/ml)/fmol))＝Log((噬菌斑数*对应的稀释倍数*10)/重启的基因组分子量(fmol))
重启效率见图5a,DH10B组为优化前，DH10B/pRARE为优化后，可以看出，与DH10B相比，DH10B/pRARE作为中间宿主可以使整体重启效率提高10倍。
实施例5、噬菌体层面的重启优化
为进一步提高噬菌体在中间宿主中的重启效率，本实施例从噬菌体层面进行优化。优化方向出发点：其一环状DNA转化效率优于线性DNA；其二噬菌体采取滚环复制方式进行DNA扩增，若转入环状基因组则可通过减少噬菌体基因组在细菌体内成环时间进而缩短噬菌体DNA扩增时间。综上，选择体外环化噬菌体基因组作为优化策略。具体实施方法如下：
选择首尾两端具有末端重复序列的肺炎克雷伯杆菌噬菌体CPB0329为研究对象，测试体外环化后的基因组在中间宿主DH10B/pRARE中的重启效率。
实验组：采用常规的体外Gibson组装技术(NEB试剂盒，货号E2611L))环化CPB0329基因组，得到CPB0329环化基因组；
对照组：未进行任何处理的CPB0329基因组；
将等量的CPB0329环化基因组和CPB0329未环化的基因组分别转入200μL DH10B/pRARE(100x)中，42℃热激2min，再冰浴3min，加入1ml 37℃预热的LB培养基。首先37℃、220rpm培养1h，再转移至22℃，220rpm培养12h。加入体积比为5％的氯仿，涡旋振荡30s，以12000rpm转速离心5min，取出上清。利用SM噬菌体保存液梯度稀释上清，取100μL各梯度稀释液及上清原液分别与200μL对数生长期末端宿主及3ml 0.4％LB软琼脂(CPB0329组：含5mM Ca2+)混合，平铺于1.5％LB平板，置于37℃培养3h以上。计数噬菌斑，计算重启效率。
结果如图5b所示，CPB0329环化基因组重启效率比CPB0329未环化(线性)的基因组高至少1个数量级，即采取体外环化噬菌体基因组的策略可提高重启效率至少10倍。
SEQUENCE LISTING
<110>深圳华大生命科学研究院
<120> 一种制备基因工程病毒的方法及其应用
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tgccgaagac gaaaggcaaa ggaatcgctg taggcgaaac tctagtgact gtcagctttg 60
acgggtctga aatgaagtcc tttaagctgg tcgtgactaa ctaataagcc aaacccatgg 120
tcgtcttcgg ca 132
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tgccgaagac gaacccatgg aatctacagt ttggcggtca ccagttcaga taatactgat 60
tgggcatcgg gctgccgtgg ctgggctgta gagtgccctt cgagttacac aatgagtatc 120
acctcgtttc aagtagtacc tcaacagctt ggcaacgata ggcccgtttg gtcagcgtaa 180
tgactaattc tattcttaaa caacataagg agattcaaca tgaattatat taagaaaatt 240
attttatctc ttttcctact gggactattt agcgtgttga attgttgcgt aaaaggcaat 300
tccatatatc cgcaaaaaat aagtaccaag cagaccggat taatgctgga catcgcccga 360
catttttatt cacccgaggt gattaaatcc tttattgata ccatcagcct ttccggcggt 420
aattttctgc acctgcattt ttccgaccat gaaaactatg cgatagaaag ccatttactt 480
aatcaacgtg cggaaaatgc cgtgcagggc aaagacggta tttatattaa tccttatacc 540
ggaaagccat tcttgagtta tcggcaactt gacgatatca aagcctatgc taaggcaaaa 600
ggcattgagt tgattcccga gcttgacagt ccgaatcaca tgacggcgat ctttaaactg 660
gtgcaaaaag acagaggggt caagtatctt caaggattaa aatcacgcca ggtagatgat 720
gaaattgata ttactaatgc tgacagtatt gcctttatgc aatctttaat gaatgaggtt 780
attgatattt ttggcgacac gagtcagcat tttcatattg gtggcgatga atttggttat 840
tctgtggaaa gtaatcatga gtttattacg tatgccaata aactatccta ctttttagag 900
aaaaaggggt tgaaaacccg aatgtggaat gacggattaa ttaaaagtac ttttgagcaa 960
atcaacccga atattgaaat tacttattgg agctatgatg gcgatacgca ggacaaaaat 1020
gaagctgccg agcgtcgtga tatgcgggtc agtttgccgg agttgctggc gaaaggcttt 1080
actgtcctga actataattc ctattatctt tacattgttc cgaaagcttc accaaccttc 1140
tcgcaagatg ccgcctttgc cgccaaagat gttataaaaa attgggatct tggtgtttgg 1200
gatggacgaa acaccaaaaa ccgcgtacaa aatactcatg aaatagccgg cgcagcatta 1260
tcgatctggg gagaagatgc aaaagcgctg aaagacgaaa caattcagaa aaacacgaaa 1320
agtttattgg aagcggtgat tcataagacg aatggggatg agtgatcgtc ttcggca 1377
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tgccgaagac gagtgacttg gggaccactc acggtctctg aggggttttt tcgttaggag 60
cttataatat gaacatgcaa gatgcttact ttgggtctgc cgctgagctg gatgcagaag 120
acgacgatgg ca 132
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<213> Artificial sequence
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caaaggaatc gctgtaggcg aaactctagt gactgtcagc tttgacgggt ctgaaatgaa 60
gtcctttaag ctggtcgtga ctaactaata agccaaaccc cttggggacc actcacggtc 120
tctgaggggt tttttcgtta ggagcttata atatgaacat gcaagatgct tactttgggt 180
ctgccgctga gctggatgca 200
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aactaataag ccaaacccct tgg 23
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tgccgaagac gacgatgcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata 60
atggtttctt agacgtcgat atctggctgc tcggccggga tccttgacag ctagctcagt 120
cctaggtata atcacaagtc gtcttcggca 150
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tgccgaagac gaaagggggc ctccagattc gtaaggatgc cgccgggaaa agccgtgtct 60
ttaatggcta cggtgatcag gcagctaaat aataaaaaag gggcttcggc ccctttatgg 120
tcgtcttcgg ca 132
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tgccgaagac gagtgaatga attgaggtga ataatggcta aatacgaagt catcgcacga 60
ggcatctttg taaaagaaaa gggcaagatt cgtgaattgc agcttggcga ggttatgaag 120
acgacgatgg ca 132
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gggcctccag attcgtaagg atgccgccgg gaaaagccgt gtctttaatg gctacggtga 60
tcaggcagct aaataataaa aaaggggctt cggccccttt atgaattgag gtgaataatg 120
gctaaatacg aagtcatcgc acgaggcatc tttgtaaaag aaaagggcaa gattcgtgaa 180
ttgcagcttg gcgaggttat 200
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ttcggcccct ttatgaattg agg 23
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<213> Artificial sequence
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ttattcacct caattcataa agg 23
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attcacctca attcataaag ggg 23
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tgccgaagac gaaaggaagc tgcgcgtcat gccagaactg gaaaagtctt tcgaagtcgc 60
aaccccgcaa gaaaagacga caaagaaaaa gaaagcagag taaactataa cccgcaatgg 120
tcgtcttcgg ca 132
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tgccgaagac gagtgacatt tgcgggtttt ttattggggt ttctatggac gcaagatgcg 60
acaaatttac cgcgcgaaag atgatgatgc ttatcttccg tgataaaaga aaagccccgg 120
aagacgacga tggca 135
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aagctgcgcg tcatgccaga actggaaaag tctttcgaag tcgcaacccc gcaagaaaag 60
acgacaaaga aaaagaaagc agagtaaact ataacccgca catttgcggg ttttttattg 120
gggtttctat ggacgcaaga tgcgacaaat ttaccgcgcg aaagatgatg atgcttatct 180
tccgtgataa aagaaaagcc ccg 203
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taaaaaaccc gcaaatgtgc ggg 23
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actataaccc gcacatttgc ggg 23
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tgccgaagac gaaaggcaaa ggaatcgctg taggcga 37
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tgccgaagac gaccatgggt ttggcttatt agttagtcac gac 43
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tgccgaagac gaaagggggc ctccagattc gtaag 35
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tgccgaagac gaccataaag gggccgaagc cc 32
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tgccgaagac gaaaggaagc tgcgcgtcat gc 32
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tgccgaagac gaccattgcg ggttatagtt tactctgct 39
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tgccgaagac gaatggaatc tacagtttgg cggt 34
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tgccgaagac gatcactcat ccccattcgt cttatg 36
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tgccgaagac gagtgacttg gggaccactc acgg 34
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tgccatcgtc gtcttctgca tccagctcag cg 32
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tgccatcgtc gtcttcataa cctcgccaag ctgc 34
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tgccgaagac gagtgacatt tgcgggtttt ttattggggt t 41
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tgccatcgtc gtcttccggg gcttttcttt tatcacgg 38
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tgccgaagac gacgatgcct cgtgatacgc c 31
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tgccgaagac gacttgtgat tatacctagg actgagct 38
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caagaactaa taagccaaac ccct 24
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aaacaggggt ttggcttatt agtt 24
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caagttcggc ccctttatga attg 24
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aaaccaattc ataaaggggc cgaa 24
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caagttattc acctcaattc ataa 24
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aaacttatga attgaggtga ataa 24
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caagattcac ctcaattcat aaag 24
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aaacctttat gaattgaggt gaat 24
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caagtaaaaa acccgcaaat gtgc 24
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aaacgcacat ttgcgggttt ttta 24
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caagactata acccgcacat ttgc 24
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aaacgcaaat gtgcgggtta tagt 24
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gtcagctttg acgggtctga 20
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acgcaacaat tcaacacgct 20
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gggcctccag attcgtaag 19
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ataacctcgc caagctgc 18
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aagctgcgcg tcatgc 16
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cggggctttt cttttatcac gg 22
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<212> DNA
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<400> 52
tcgagttcat gtgcagctcc ataagcaaaa ggggatgata agtttatcac caccgactat 60
ttgcaacagt gccgttgatc gtgctatgat cgactgatgt catcagcggt ggagtgcaat 120
gtcatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa 180
gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac cgttcagctg 240
gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta tccggccttt 300
attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat ttcgtatggc aatgaaagac 360
ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact 420
gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt tctacacata 480
tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa agggtttatt 540
gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac 600
gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa 660
ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtctg tgatggcttc 720
catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca gggcggggcg 780
taatttgata tcgagctcgc tttggctgag ctcatgaagt tcctattccg aagttccgcg 840
aacgcgtaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 900
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 960
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1020
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1080
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1140
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1200
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1260
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1320
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ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 1500
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gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 1620
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 1680
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cgaggtcgaa aagtaaatcg 1740
cgcgggtttg ttactgataa agcaggcaag acctaaaatg tgtaaagggc aaagtgtata 1800
ctttggcgtc accccttaca tattttaggt ctttttttat tgtgcgtaac taacttgcca 1860
tcttcaaaca ggagggctgg aagaagcaga ccgctaacac agtacataaa aaaggagaca 1920
tgaacgatga acatcaaaaa gtttgcaaaa caagcaacag tattaacctt tactaccgca 1980
ctgctggcag gaggcgcaac tcaagcgttt gcgaaagaaa cgaaccaaaa gccatataag 2040
gaaacatacg gcatttccca tattacacgc catgatatgc tgcaaatccc tgaacagcaa 2100
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gcaaaaggcc tggacgtttg ggacagctgg ccattacaaa acgctgacgg cactgtcgca 2220
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tgtccaagaa tgtttccatc ttctttaaaa tcaatacctt ttaactcgat tctattaaca 4020
agggtatcac cttcaaactt gacttcagca cgtgtcttgt agttcccgtc atctttgaaa 4080
aatatagttc tttcctgtac ataaccttcg ggcatggcac tcttgaaaaa gtcatgctgt 4140
ttcatatgat ctgggtatct cgcaaagcat tgaacaccat aaccgaaagt agtgacaagt 4200
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tatgttgcat caccttcacc ctctccactg acagaaaatt tgtgcccatt aacatcacca 4320
tctaattcaa caagaattgg gacaactcca gtgaaaagtt cttctccttt acgcatggta 4380
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aaaatagtca acacgcacgg tgttagatat ttactaggaa cctgtcgtgc taataggtct 4500
aggggggtga tgagtttacc ttcaagaaac tgatcaggga tagcggtcag gtgtttttac 4560
aaccactaaa cccacagtac ccaatgatcc catgcaatga gagttgttcc gttgctcgag 4620
gtgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 4680
ggtttcttag acgtcgatat ctggctgctc ggccgggatc cttgacagct agctcagtcc 4740
taggtataat cacaagtgag accactagtg gtctctgttt tagagctaga aatagcaagt 4800
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttg 4860
gttccgagac ggttcctgca gaagcttaga tctattaccc tgttatccct ac 4912

Claims (8)

1.一种制备基因工程噬菌体的方法，包括如下步骤：
A、先将待改造噬菌体的核酸、解聚酶dspB编码基因、λ-red重组系统和CRIPSR Cas9系统导入所述待改造噬菌体的非侵染中间宿主，完成噬菌体核酸的改造、筛选及重启激活，即携带有同源臂的外源DNA可在λ-red重组系统协助下，与噬菌体基因组发生同源重组，进而完成噬菌体改造；与此同时，Cas9蛋白在sgRNA的引导下，特异性靶向并剪切未发生同源重组的天然的噬菌体基因组，因此只有改造的噬菌体会存活，最终完成改造的噬菌体筛选，再从所述中间宿主中释放改造后噬菌体，得到激活的改造后噬菌体；
B、将所述激活的改造后噬菌体侵染所述待改造噬菌体的宿主，实现所述改造后噬菌体的扩增富集；
所述噬菌体为肺炎克雷伯杆菌噬菌体；
所述解聚酶dspB编码基因包括插入位点上游100bp同源臂、启动子、核糖体结合位点、解聚酶dspB和插入位点下游100bp同源臂；
所述插入位点为肺炎克雷伯杆菌噬菌体基因组中不影响噬菌体基因组上原基因的表达的位置；
所述激活的改造后噬菌体的核酸与所述待改造噬菌体的核酸相比，具备至少一种由所述解聚酶dspB编码基因带来的修饰改造。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述修饰改造为改善噬菌体的特征和/或引入新噬菌体特征；
其中，所述改善噬菌体为针对生物膜降解进行改善。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述完成噬菌体核酸的改造、筛选及重启激活通过优化如下至少一种方面实现：
A)优化所述中间宿主提高重启效率；
所述优化中间宿主具体为缩小所述中间宿主和所述待改造噬菌体核酸的密码子差异；
B)优化所述待改造噬菌体的核酸提高重启效率；
所述优化待改造噬菌体的核酸具体为在转入所述中间宿主之前将所述待改造噬菌体的核酸进行体外环化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在导入之前，将所述待改造噬菌体的核酸体外环化。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述中间宿主为如下菌或导入用于优化中间宿主和噬菌体核酸密码子差异载体的菌；
所述菌具体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌。
6.一种用于制备权利要求1所述基因工程噬菌体的试剂盒，包括如下：
1)权利要求1中所述待改造噬菌体的核酸；
2)权利要求1中所述解聚酶dspB编码基因；
3)权利要求1中所述λ-red重组系统；
4)权利要求1中所述CRIPSR Cas9系统；和
5)权利要求1中所述待改造噬菌体的非侵染中间宿主。
7.权利要求6所述的试剂盒在制备杀伤噬菌体宿主的产品中的应用。
8.一种杀伤噬菌体宿主的产品，所述产品包括权利要求6所述的试剂盒。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108220339A (zh) * 2016-12-14 2018-06-29 深圳华大生命科学研究院 细胞改造的方法
CN108472391A (zh) * 2016-01-03 2018-08-31 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
CN109136251A (zh) * 2018-07-12 2019-01-04 上海科技大学 一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用
CN109536459A (zh) * 2018-11-14 2019-03-29 吉林大学 降解肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖及生物被膜的噬菌体解聚酶
CN109706109A (zh) * 2019-01-30 2019-05-03 中国医学科学院病原生物学研究所 一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用
CN110551668A (zh) * 2019-08-12 2019-12-10 广东省农业科学院动物科学研究所 一种肠毒素基因lt敲除的大肠杆菌及其构建方法
CN110878322A (zh) * 2018-09-06 2020-03-13 上海科技大学 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统
CN111630160A (zh) * 2017-11-29 2020-09-04 斯尼普生物群系有限公司 噬菌体和转导颗粒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3132034T3 (da) * 2014-04-14 2020-10-19 Nemesis Bioscience Ltd Terapeutikum
JP6842417B2 (ja) * 2014-12-16 2021-03-17 シー３ジェイ セラピューティクス インコーポレイテッド インビトロウイルスゲノム工学のための組成物及びその方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108472391A (zh) * 2016-01-03 2018-08-31 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
CN108220339A (zh) * 2016-12-14 2018-06-29 深圳华大生命科学研究院 细胞改造的方法
CN111630160A (zh) * 2017-11-29 2020-09-04 斯尼普生物群系有限公司 噬菌体和转导颗粒
CN109136251A (zh) * 2018-07-12 2019-01-04 上海科技大学 一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用
CN110878322A (zh) * 2018-09-06 2020-03-13 上海科技大学 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统
CN109536459A (zh) * 2018-11-14 2019-03-29 吉林大学 降解肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖及生物被膜的噬菌体解聚酶
CN109706109A (zh) * 2019-01-30 2019-05-03 中国医学科学院病原生物学研究所 一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用
CN110551668A (zh) * 2019-08-12 2019-12-10 广东省农业科学院动物科学研究所 一种肠毒素基因lt敲除的大肠杆菌及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Novel Polysaccharide Depolymerase Encoded by the Phage SH-KP152226 Confers Specific Activity Against Multidrug-Resistant Klebsiella pneumoniae via Biofilm Degradation;Yunqiang Wu et al.;Front Microbiol;20191103;第10卷(第2768期);1-15 *
噬菌体在控制细菌感染中的临床应用;李婷华;郭晓奎;;《中国抗生素杂志》(第08期);19-25 *

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