CN108220339A - 细胞改造的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了改造细胞的方法，所述细胞为具有特异性的基因断点的体细胞。该方法包括：基于所述基因断点，对所述细胞进行靶向基因改造，以便基于所述基因断点定向插入靶序列，进而使所述细胞转变为不含基因断点的细胞。利用该方法能够有效将具有基因断点的细胞转变为不具有基因断点的体细胞。

Description

细胞改造的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及细胞改造的方法。

背景技术

目前众多疾病与体细胞的基因突变相关，通常包括体细胞自身基因突变，也包括外源基因例如病毒、细菌、癌细胞侵入所引起的疾病，例如HIV、HBV、HCV等都是由病毒侵入引起的。

然而，目前对于与体细胞的基因突变相关的疾病等的研究仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种细胞改造的方法。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种细胞改造的方法，所述细胞为具有特异性的基因断点的体细胞。根据本发明的实施例，所述方法包括：基于所述基因断点，对所述细胞进行靶向基因改造，以便基于所述基因断点生成靶序列，利用靶序列联合基因和免疫细胞治疗等多种方法，进而使所述细胞死亡或者转变为不含基因断点的细胞。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

体细胞基因组因内源基因突变和外源基因插入产生多种新序列(novelsequence)，在序列衔接处产生基因断点(breakpoint)，它们多与各种疾病的发生发展相关。内源基因突变形成的基因断点包含插入缺失(Indel)、结构变异(StructureVariations，SV)等。

根据本发明的实施例，利用体细胞新序列和断点的特异性，可以通过基因编辑手段敲入一段靶向识别的序列，如：已知药物靶向基因、肿瘤特异抗原、自杀基因等，进而对具有特异性的基因断点的细胞进行基因改造，进而利用靶向药物、免疫治疗等针对性的方法将基因改造后的细胞消灭或转变为不具有基因断点的细胞。由此，本发明第一次提出在体细胞新序列断点处敲入一段靶向识别的序列，进而通过靶向该序列将具有基因断点的体细胞消灭或转变为不具有基因断点的细胞，为细胞学或基因学研究提供了全新的概念，具有十分广泛的应用前景。

根据本发明的实施例，上述方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述基因断点是由自身基因突变、外源基因侵入、病毒侵入引起的。

根据本发明的实施例，所述细胞的来源不受特别限制，可以是技术人员以科研活动为目的，通过体外诱变分离的体细胞、外源基因导入分离的体细胞或将病毒转染到分离的体细胞获得，也可直接分离于癌症、肝炎或HIV患者的体细胞。

根据本发明的实施例，预先包括通过下列步骤确定所述基因断点的步骤：将具有基因断点的体细胞和对照体细胞分别进行基因组测序，以便获得具有基因断点的细胞基因组测序结果和对照细胞的基因组测序结果；将所述具有基因断点的细胞的基因组测序结果和对照细胞的基因组测序结果进行比对，以便确定基因突变位点；基于所述基因突变位点，确定所述基因断点。

在本文中，所使用的术语“基因断点”包含由内源基因突变引起的Indel，SV等，还包含外源基因引入引起的突变，这些突变可能是与疾病相关的突变。如：癌症基因组中存在癌症细胞特异性的突变，这些突变表现为特异性新序列或基因断点。根据本发明的实施例，可以通过将具有基因断点的体细胞与对照体细胞进行全基因组测序，例如正常细胞。以癌症为例，可以将分离的癌症组织与癌旁组织进行全基因组测序，可以分析获得大量的癌症基因组中的特异性序列，即基因断点。同时，由于外源基因的插入引起的人类疾病，如HIV、HBV等。同样可以在基因组中找到插入序列引起的基因断点。这样，通过NGS测序和信息分析，可以获取具有基因断点的细胞。

根据本发明的实施例，所述基因组测序为全基因组测序。

根据本发明的实施例，所述基因突变位点包括选自下列的至少之一：病毒基因整合位点、结构变异和插入缺失。

根据本发明的实施例，所述基因断点是通过下列步骤确定的：

对原始下机fastq文件进行过滤和比对(mapping)：首先对fastq文件进行备份，去除 DNA条形码序列(barcodes)，同时将不同来源的测序结果分割开。了解测序质量(fastqc)，依据测序质量进行筛选(FASTX-Toolkit)。接下来，对参考基因组构建索引，寻找输入reads 文件的SA坐标，生成sam格式的对比文件。下一步，对sam文件进行重新排序，将sam 文件转换成bam文件，sort bam文件。

对碱基质量值进行重新矫正：结合已知序列位点(known sites)，分辨真实的变异位点和不可信的突变位点。首先确定比对区域，对比对的区域进行重新比对。接下来，对bam文件里reads的碱基质量值进行重新校正，使输出的bam文件中reads中碱基的质量值能够更加接近真实的参考基因组之间的错配概率。

去除因PCR扩增形成的重复(duplicates)：由于PCR扩增的原因导致的完全一样的reads，或由于质量问题、测序错误、比对错误、等位基因等，被认为是重复(Duplicate)。因此，SV检测应该去除重复(duplicate)，大量减少计算，降低假阳性。FastUniq可以快速的实现短reads重复片段的去除。

将比对到indel附近的reads进行局部重新比对，将indel附近的比对错误率降到最低。

最后检测SV：目前，主要有4种检测基因组结构变异的策略，分别为：(1)双末端比对(也称Pair-end Mapping，简称PEM)；(2)分离读取(Split read，简称SR)；(3)阅读深度(Read Depth，简称RD)和(4)基于de novo组装的方法。结合不同的策略，对基因组的结构变异SV进行检测。

根据本发明的实施例，所述靶向基因改造是基于选自下列的基因编辑手段的至少之一进行的：CRISPER/CAS9技术；TALEN技术；以及ZFN技术。

具体的，可以通过下列技术进行基因编辑：

(1)CRISPR/Cas9技术：该技术可以简单快速地实现基因组编辑，其原理为利用人工设计的有引导作用的序列特异性序列，即单链导向RNA(single guide RNA，sgRNA)，识别编辑位点，引导Cas9核酸内切酶对特异性序列进行切割，产生双链断裂。

(2)TALENs技术：TALENs借助TAL效应子识别特异性DNA碱基对，TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列，具有较高的灵活性。对识别DNA序列的TAL 左右臂附加一个核酸酶就形成了TALENs。可以有效地对DNA双链进行切割。

(3)ZFN技术：即锌指核糖核酸酶，由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。串联的锌指蛋白可以结合DNA结构域，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基，连接非特异性的核酸连接酶可以对DNA双链进行切割。

(4)以及未来可能出现的新基因编辑技术。

根据本发明的实施例，在进行所述靶向基因改造之前，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：

CRISPR/CAS9技术：查找基因断点临近序列，筛选包含基因断点碱基的20bp序列，且 3’含有PAM框(即：3’NGG)序列特征，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为gRNA识别的靶点；

TALEN技术：查找基因断点临近序列，筛选Left-TAL识别序列和Right-TAL识别序列，基因断点碱基应位于左右臂识别序列和切割序列范围之内，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为Left-TAL和Right-TAL识别的靶点；

ZFN技术：查找基因断点临近序列，定制覆盖基因断点碱基的ZFNs识别序列元件。

根据本发明的实施例，所述靶序列包括选自下列的至少之一：

编码药物靶向基因的序列；

编码肿瘤特异性抗原的序列；

编码肿瘤免疫检查点分子的序列；

编码细胞因子的序列；

编码溶瘤病毒合成必须基因的序列；

编码自杀基因的序列；以及

恢复性序列。

由此，可以通过基因敲入技术将外源功能基因成功地插入到特定序列的基因组中，使其在细胞内获得表达。从而，可以借助现有已知的方案杀死相应的具有基因断点体细胞。

根据本发明的实施例，所述药物靶向基因包括选自表1和表2的至少之一。

表1：部分单抗药物

表2：部分小分子靶向药物

根据本发明的实施例，所述肿瘤特异性抗原为CAR-T治疗性抗原，包括选自CD19、CD20、CD30、EGFR、GPC-3、CD22和NKG2D的至少之一。

根据本发明的实施例，所述细胞因子为IFN-gamma。

根据本发明的实施例，所述自杀基因包括选自tk-GCV、CD-5-FC的至少之一。

在本发明的另一方面，本发明还提出了可以用于实施上述方法的系统，具体的，本发明提供了一种改造细胞的系统，所述细胞为具有基因断点的体细胞。根据本发明的实施例，所述系统包括：

基因改造单元，所述基因改造单元用于基于所述基因断点，对所述细胞进行靶向基因改造，以便基于所述基因断点生成靶序列，进而使所述细胞死亡或者转变为不具有基因断点的细胞。

根据本发明的实施例，所述基因断点是由自身基因突变、外源基因侵入、病毒侵入引起的。

根据本发明的实施例，所述细胞来源于癌症、肝炎或HIV患者。

根据本发明的实施例，进一步包括：

基因断点确定单元，所述基因断点确定单元包括：

测序组件，所述测序组件用于将具有基因断点的体细胞和对照体细胞分别进行基因组测序，以便获得具有基因断点的细胞的基因组测序结果和对照细胞的基因组测序结果；

比对组件，所述比对组件用于将所述具有基因断点的细胞的基因组测序结果和对照细胞的基因组测序结果进行比对，以便确定基因突变位点；

分析组件，所述分析组件用于基于所述基因突变位点，确定所述基因断点。

根据本发明的实施例，所述基因组测序为全基因组测序。

根据本发明的实施例，所述基因突变位点包括选自下列的至少之一：病毒基因整合位点、结构变异和插入缺失。

根据本发明的实施例，所述基因断点是在插入缺失突变位点附近确定的。

根据本发明的实施例，所述靶向基因改造是基于选自下列的基因编辑手段的至少之一进行的：

CRISPER/CAS9技术；

TALEN技术；以及

ZFN技术。

根据本发明的实施例，进一步包括特异性靶位点选择单元，所述特异性靶位点选择单元适于：

针对CRISPR/CAS9技术，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：查找基因断点临近序列，筛选包含基因断点碱基的20bp序列，且3’含有PAM框(即：3’NGG)序列特征，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为gRNA识别的靶点；

针对TALEN技术，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：查找基因断点临近序列，筛选Left-TAL识别序列和Right-TAL识别序列，基因断点碱基应位于左右臂识别序列和切割序列范围之内，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为Left-TAL和Right-TAL识别的靶点；或者

针对ZFN技术，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：查找基因断点临近序列，定制覆盖基因断点碱基的ZFNs识别序列元件。

根据本发明的实施例，所述靶序列包括选自下列的至少之一：

编码药物靶向基因的序列；

编码肿瘤特异性抗原的序列；

编码肿瘤免疫检查点分子的序列；

编码细胞因子的序列；

编码溶瘤病毒合成必须基因的序列；

编码自杀基因的序列；以及

恢复性序列。

根据本发明的实施例，所述药物靶向基因包括选自表1和表2的至少之一。

根据本发明的实施例，所述肿瘤特异性抗原为CAR-T治疗性抗原，包括选自CD19、CD20、CD30、EGFR、GPC-3、CD22和NKG2D的至少之一。

根据本发明的实施例，所述细胞因子为IFN-gamma。

根据本发明的实施例，所述自杀基因包括选自tk-GCV、CD-5-FC的至少之一。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对方法所描述的特征和优点同样适用于该系统，在此不再赘述。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是根据本发明实施例的KRAS G12S sgRNA特异性测试结果图；

图2是根据本发明实施例的KRAS G12S sgRNA编辑效率检测的结果图；

图3是根据本发明实施例的CRISPR/Cas9可以有效的针对G12S位点特异性的切割的结果图；

图4是根据本发明实施例的G12S位点特异性的编辑可以抑制肿瘤细胞的克隆形成的结果图；

图5是根据本发明实施例的CRISPR/Cas9可以特异性的阻断G12S位点于S期的流式分析结果图；以及

图6是根据本发明实施例的CRISPR/Cas9可以特异性的阻断G12S位点于S期的具体的细胞周期分析的结果图。

具体实施方式

在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

下面将详细介绍根据本发明实施例的细胞改造的方法：

一、确定基因断点：1.对原始下机fastq文件进行过滤和比对(mapping)：首先对fastq 文件进行备份，去除DNA条形码(DNA barcodes)，同时将不同来源的测序结果分割开。了解测序质量(fastqc)，依据测序质量进行筛选(FASTX-Toolkit)。接下来，对参考基因组构建索引，寻找输入reads文件的SA坐标，生成sam格式的对比文件。下一步，对sam文件进行重新排序，将sam文件转换成bam文件，sort bam文件。

2.对碱基质量值进行重新矫正：结合已知的位点(known sites)，分辨真实的变异位点和不可信的突变位点。首先确定比对区域，对比对的区域进行重新比对。接下来，对bam文件里reads的碱基质量值进行重新校正，使输出的bam文件中reads中碱基的质量值能够更加接近真实的参考基因组之间的错配概率。

3.去除因PCR扩增形成的重复(duplicates)：由于PCR扩增的原因导致的完全一样的 reads，或由于质量问题、测序错误、比对错误、等位基因等，被认为是Duplicate。因此，SV detection应该去除duplicate，大量减少计算，降低假阳性。FastUniq可以快速的实现短 reads重复片段的去除。

4.将比对到indel附近的reads进行局部重新比对，将indel附近的比对错误率降到最低。 5.最后检测SV：目前，主要有4种检测基因组上结构变异的策略，分别为：

(1)双末端比对(也称Pair-end Mapping，简称PEM)；(2)分离读取(Split read，简称SR)；(3)阅读深度(Read Depth，简称RD)和(4)基于de novo组装的方法。结合不同的策略，对基因组的结构变异SV进行检测。

二、在基因断点附近设计可被基因编辑系统识别的靶向识别位点：

1.结合断点处reads支持数统计出断点的频率(frequency)，根据frequency从高到低对 SV断点进行排序。

2.统计TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中对应癌种的突变信息，查找出基因组中断点分布情况，结合数据库中突变热点(hotspot)，对SV再次进行排序。

3.按最新的SV断点排序，从高到低一次查找断点临近区域符合不同基因编辑系统的特异序列(unique sequence)，进行脱靶分析，过滤脱靶序列，降低脱靶效率。

(1)CRISPR/CAS9技术：查找基因断点临近序列，筛选包含基因断点碱基的20bp序列，且3’含有PAM框(即：3’NGG)序列特征，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为单链导向RNA(guide RNA，gRNA)识别的靶点。

(2)TALEN技术：查找基因断点临近序列，筛选左臂Left-TAL识别序列和右臂Right-TAL 识别序列，基因断点碱基应位于左右臂识别序列和切割序列范围之内，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为Left-TAL和Right-TAL识别的靶点。

(3)ZFN技术：查找基因断点临近序列，定制覆盖基因断点碱基的锌指核酸酶(ZFNs) 识别序列元件。

4.综合1.2.3对每一个适合的结构变异(SV)进行打分、排序，选取排名前20进行后续sanger测序验证；验证正确的细胞系基因断点为符合要求的基因编辑序列。

三、构建基因编辑载体，验证靶位点的单链导向RNA(guide RNA，gRNA)活性：

1.在基因断点处找到符合基因编辑系统设计规则的序列信息，如：

CRSIPR/Cas9要求3’末端具有PAM阅读框(NGG)，设计符合PAM的长度约为20bp的sgRNA；或TALEN设计时，需要Left-TAL和Right-TAL识别的序列特异性region；此处以CRISPR/Cas9为例说明基因编辑系统载体构建。

2.结合符合CRISPR/Cas9设计方案的断点(breakpoint)筛选区域，定制合成20bp长度的单链导向RNA(guide RNA，gRNA)序列，将guide RNA oligos进行引物退火，形成双链引物序列。

3.酶切CRISPR/Cas9系统目标载体，如PX330载体，和慢病毒打靶质粒系统。连接单链导向RNA(guide RNA，gRNA)进入事先用限制性内切酶处理过的px330和慢病毒载体系统中。

4.用大肠杆菌DH5a转化连接产物，挑取克隆进行菌落PCR，菌落PCR鉴定的阳性克隆进行sanger测序。

5.选取sanger测序正确的质粒进行无内毒素处理，用携带靶位点的目标sgRNA转染293T细胞系，24h后收取细胞，提取基因组DNA。通过PCR方法扩增打靶区域，T7E1酶切鉴定不同sgRNA的打靶活性。

四、构建同源重组供体载体：

1.查找插入基因(这里指插入的靶向基因序列，如：TK、CD19、NY-ESO-1、MART-1)编码框序列，编码框序列左右两侧需加入插入基因断点两侧同源臂序列，同源臂序列长度在500bp～1kb左右，作为同源重组的同源臂。

2.合成目的基因和同源臂序列整体，构建针对SV基因断点的同源臂靶向供体(targeting donor)载体，将插入基因酶切连接进入targeting donor载体中；菌落PCR验证连接是否成功，阳性克隆进行质粒提取。

3.Sanger测序验证供体(donor)载体准确无误。

五、

靶位点的敲除和目标基因的敲入具有活性的sgRNA CRISPR/Cas9系统病毒载体，进行病毒包装，包装的病毒进行目的肿瘤细胞的感染，T7E1酶切法确定打靶效率。

加入目标打靶载体进行共转，通过设计的供体载体相关引物，PCR确定细胞系断点(breakpoint)位点是否成功完成目标基因的重组。

通过抗生素筛选，获得同源重组成功的细胞系。

六、体外功能实验确定

1.插入的基因为自杀基因，加入前体药物进行杀伤实验，比较基因敲入编辑组和未编辑组细胞杀伤情况；

2.插入基因为CD19、NY-ESO-1、MART-1等抗原，结合现有的成熟CAR-T、TCR-T 细胞疗法，进行体外肿瘤杀伤实验；

3.插入基因为Her2等肿瘤高表达基因，使用针对Her2的靶向药物进行体外功能实验。

以上功能试验的结果证明了可以利用基因编辑技术在基因断点处，敲入靶向基因，联合免疫细胞疗法、靶向药物疗法、或自杀基因杀伤等，辅助多种疗法。联合对抗肿瘤，实现肿瘤的治疗。

实施例

下面将以具有人KRAS基因G12S的突变的体细胞为例，具体介绍如何通过根据本发明实施例的细胞改造的方法，将该具有基因断点的体细胞消灭或转变为不具有基因断点的细胞。

其中，本实施例中所涉及的野生型人KRAS基因序列及G12S的突变序列如下所示：

KRAS wt序列(野生型人KRAS基因序列)：

Atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtgga cgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtca agaggagtacagtgcaatgagggaccagtacatgaggactggggagggctttctttgtgtatttgccataaataatactaaatcatttgaagat attcaccattatagagaacaaattaaaagagttaaggactctgaagatgtacctatggtcctagtaggaaataaatgtgatttgccttctagaacagtagacacaaaacaggctcaggacttagcaagaagttatggaattccttttattgaaacatcagcaaagacaagacagggtgttgatgatgcc ttctatacattagttcgagaaattcgaaaacataaagaaaagatgagcaaagatggtaaaaagaagaaaaagaagtcaaagacaaagtgtgt aattatgtaa(SEQ ID NO:1)。

KRAS G12S(G12S的突变序列)：

AtgactgaatataaacttgtggtagttggagctAgtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtgga cgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtca agaggagtacagtgcaatgagggaccagtacatgaggactggggagggctttctttgtgtatttgccataaataatactaaatcatttgaagat attcaccattatagagaacaaattaaaagagttaaggactctgaagatgtacctatggtcctagtaggaaataaatgtgatttgccttctagaacagtagacacaaaacaggctcaggacttagcaagaagttatggaattccttttattgaaacatcagcaaagacaagacagggtgttgatgatgcc ttctatacattagttcgagaaattcgaaaacataaagaaaagatgagcaaagatggtaaaaagaagaaaaagaagtcaaagacaaagtgtgt aattatgtaa(SEQ ID NO:2)。

1、针对KRAS G12S突变进行了sgRNA的设计

靶向KRAS-G12S的sgRNA设计如下:

Human-KRAS-G12S：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT G CGTAGGCAAGAGTG(SEQ ID NO:3)。

灰色背景标记的A为G12S的突变位点；

灰色背景标记的TGG为sgRNA设计的NGG；

下划线：为sgRNA 20bp的靶点序列和sgRNA的序列；

sgRNA设计规则为3’端为NGG的上游20bp序列为识别序列，为CRISPR/cas9的靶向位点。

2、载体构建

合成的引物序列如表3所示：

表3：

合成的引物通过退火，连接，转化构建至LentiCRISPR V2载体上。并进行测序鉴定。

3、sgRNA特异性测试

(1)将构建好的载体转染至293T细胞中，转染方法如下：

1)转染前一天接板子，至细胞融合度达80％左右时进行转染。

2)A:DNA与50μl Opti-MEM混匀，低速离心使液体沉到管底。B:脂质体与50μlOpti-MEM混匀，低速离心使液体沉到管底，静置5min。

3)将A液、B液混合，混匀后室温静置20min。

4)最后每孔加400μl Opti-MEM。5).把混合液加入到细胞培养板中，并于4-6h换新鲜培养液。

(2)基因组DNA提取:取转染后293T细胞，200g离心5min，去上清，用PBS重悬，再次200g离心5min，去上清。基因组DNA使用天根基因组DNA提取试剂盒进行提取。

(3)T7E1(T7EndonucleaseI)assay检测编辑效率

PCR扩增KRAS片段：

使用的引物如表4所示:：

表4：

genomic-KRAS-F1	Atgcatttttcttaagcgtcgatgg(SEQ ID NO:8)
		genomic-KRAS-R1	Ccctgacatactcccaaggaaag(SEQ ID NO:9)

使用上面的PCR引物对基因组DNA进行PCR，PCR产物经过胶回收后按表5所示比例进行反应：

表5：

PCR回收产物	xμl(200ng)
		10X NEBuffer(货号：M0531S(NEB))	2μl
无DNase/RNase水	补足至19μl

在PCR仪中进行变性退火反应，反应条件如表6所示：

表6：

加入T7EndonucleaseI酶进行酶切，酶切体系如表7所示：

表7：

退火后的产物	19μl
		T7Endonuclease I(M0302S(NEB))	1μl

反应时间为37℃15min，进行1％琼脂糖电泳检测。空载体以及针对G12-wt和G12S突变位点的sgRNA分别转染293T细胞，48h后提基因组进行T7E1检测基因编辑效率。结果如图1所示，G12S sgRNA特异性良好，基本不会剪切野生型基因组。

4、sgRNA编辑效率检测

(1)PEI转染293T(GNHu44，中国科学院细胞库)包装慢病毒

1)转染前一天传代，至细胞融合度达50％-70％左右时进行转染。

2)A:DNA与Opti-MEM(11058-021，INVITROGEN)共500μl混匀，低速离心使液体沉到管底。B:PEI与Opti-MEM共500μl混匀，低速离心使液体沉到管底，静置5min。

3)将A液，B液混合，混匀后室温静置20min。

4)把混合液加入到细胞培养板中，并于4-6h换新鲜培养液。

5)继续在37℃培养箱中培养48-72h，收集上清。

6).高速离心机4℃，20000g，离心90min，浓缩病毒。

(2)慢病毒感染细胞

慢病毒浓缩液适量，感染A549(携带KRAS G12S突变)细胞系(CBP60084，COBIOER)。感染2d后，使用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选2d。

(3)T7E1assay检测编辑效率

提取puromycin抗生素筛选后的A549细胞的基因组DNA(方法同3)，进行T7E1assay检测。结果如图2，其中，A：sgKRAS-G12S的慢病毒分别感染A549和H2228细胞系，提取基因组进行T7E1检测。B：sgKRAS-G12S的慢病毒分别感染A549和H2228细胞系 (CBP12901,COBIOER)，提取基因组进行测序。

5、CRISPR/Cas9可以有效的针对G12S位点特异性的切割，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

在A549和H2228细胞系中分别编辑G12S位点，可以看到在G12S细胞系H2228中，由于特异性的G12S被编辑，相比于野生型的A549细胞系和没有经过处理的细胞系，细胞增殖水平显著的降低。结果如图3所示，其中，图3中的横坐标表示时间：Days，纵坐标表示：细胞总数。

6、在肿瘤细胞系中，G12S位点特异性的编辑可以抑制肿瘤细胞的克隆形成。

与野生型细胞H2228相比，编辑过的突变型(G12S)细胞系A549有明显的肿瘤细胞克隆形成抑制效果。结果如图4所示。其中，A549表示突变(G12S)细胞系，H2228表示野生型细胞系，斑点：甲瓒染色。

7、CRISPR/Cas9可以特异性的阻断G12S位点于S期

相比于野生型细胞(H2228)，编辑后的突变型细胞(A549)，被锁定在S期，因此说明，编辑(G12S)对于细胞具有抑制作用。结果如图5所示，流式分析数据显示，A549 细胞编辑后，细胞增殖受到影响，细胞停滞在S期。通过具体的细胞周期分析，G1，S， G2/M，可以看到在S期和G2/M期，编辑的细胞受到严重的影响。结果如图6所示，其中，横坐标为细胞周期，纵坐标为细胞数。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 细胞改造的方法

<130> PIDC3176682

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 567

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> KRAS wt序列

<400> 1

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 2

<211> 567

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> KRAS G12S序列

<400> 2

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctagtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Human-KRAS-G12S序列

<400> 3

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctagtggcg taggcaagag tg 52

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> KRAS-wt-gRNA-F序列

<400> 4

caccgcttgt ggtagttgga gctgg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> KRAS-wt-gRNA-R序列

<400> 5

aaacccagct ccaactacca caagc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> KRAS-G12S-gRNA-F序列

<400> 6

caccgcttgt ggtagttgga gctag 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> KRAS-G12S-gRNA-R序列

<400> 7

aaacctagct ccaactacca caagc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> genomic-KRAS-F1

<400> 8

atgcattttt cttaagcgtc gatgg 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> genomic-KRAS-R1序列

<400> 9

ccctgacata ctcccaagga aag 23

Claims (10)

1.一种细胞改造的方法，所述细胞为具有特异性的基因断点的体细胞，其特征在于，

所述方法包括：

基于所述基因断点，对所述细胞进行靶向基因改造，以便基于所述基因断点生成靶序列，进而使所述细胞转变为不含基因断点的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因断点是由自身基因突变、外源基因侵入、病毒侵入引起的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预先包括通过下列步骤确定所述基因断点的步骤：

将具有基因断点的细胞和对照细胞分别进行基因组测序，以便获得具有基因断点细胞的基因组测序结果和对照细胞的基因组测序结果；

将所述具有基因断点的细胞的基因组测序结果和对照细胞的基因组测序结果进行比对，以便确定基因突变位点；

基于所述基因突变位点，确定所述基因断点。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因突变位点包括选自下列的至少之一：病毒基因整合位点、结构变异和插入缺失。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向基因改造是基于选自下列的基因编辑手段的至少之一进行的：

CRISPER/CAS9技术，

TALEN技术，以及

ZFN技术；

任选地，在进行所述靶向基因改造前：

针对CRISPR/CAS9技术，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：查找所述基因断点临近序列，筛选包含基因断点碱基的20bp序列，且3’含有PAM框序列特征，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为gRNA识别的靶点，

针对TALEN技术，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：查找所述基因断点临近序列，筛选Left-TAL识别序列和Right-TAL识别序列，基因断点碱基应位于左右臂识别序列和切割序列范围之内，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为Left-TAL和Right-TAL识别的靶点，或者

针对ZFN技术，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：查找所述基因断点临近序列，定制覆盖基因断点碱基的ZFNs识别序列元件；

任选地，所述靶序列包括选自下列的至少之一：

编码药物靶向基因的序列，

编码肿瘤特异性抗原的序列，

编码肿瘤免疫检查点分子的序列，

编码细胞因子的序列，

编码溶瘤病毒合成必须基因的序列，

编码自杀基因的序列，以及

恢复性序列；

任选地，所述药物靶向基因包括选自表1和表2的至少之一；

任选地，所述肿瘤特异性抗原为CAR-T治疗性抗原，所述CAR-T治疗性抗原包括选自CD19、CD20、CD30、EGFR、GPC-3、CD22和NKG2D的至少之一；

任选地，所述细胞因子为IFN-gamma；

任选地，所述自杀基因包括选自tk-GCV、CD-5-FC的至少之一。

6.一种细胞改造的系统，所述细胞为具有特异性的基因断点的体细胞，其特征在于，所述系统包括：

基因改造单元，所述基因改造单元用于基于所述基因断点，对所述细胞进行靶向基因改造，以便基于所述基因断点生成靶序列，进而使所述细胞转变为不含基因断点的细胞。

7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述基因断点是由自身基因突变、外源基因侵入、病毒侵入引起的。

8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，进一步包括：

基因断点确定单元，所述基因断点确定单元包括：

测序组件，所述测序组件用于将具有基因断点的体细胞和对照体细胞分别进行基因组测序，以便获得具有基因断点的细胞的基因组测序结果和对照细胞的基因组测序结果；

比对组件，所述比对组件用于将所述具有基因断点的细胞的基因组测序结果和对照细胞的基因组测序结果进行比对，以便确定基因突变位点；

分析组件，所述分析组件用于基于所述基因突变位点，确定所述基因断点。

9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述基因突变位点包括选自下列的至少之一：病毒基因整合位点、结构变异和插入缺失。

10.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述靶向基因改造是基于选自下列的基因编辑手段的至少之一进行的：

CRISPER/CAS9技术，

TALEN技术，以及

ZFN技术；

任选地，进一步包括特异性靶位点选择单元，所述特异性靶位点选择单元适于：

针对CRISPR/CAS9技术，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：查找所述基因断点临近序列，筛选包含基因断点碱基的20bp序列，且3’含有PAM框序列特征，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为gRNA识别的靶点，

针对TALEN技术，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：查找所述基因断点临近序列，筛选Left-TAL识别序列和Right-TAL识别序列，基因断点碱基应位于左右臂识别序列和切割序列范围之内，在全基因组中比对，选取特异性高的序列作为Left-TAL和Right-TAL识别的靶点，或者

针对ZFN技术，预先包括通过下列步骤选择特异性靶位点：查找所述基因断点临近序列，定制覆盖基因断点碱基的ZFNs识别序列元件；

任选地，所述靶序列包括选自下列的至少之一：

编码药物靶向基因的序列，

编码肿瘤特异性抗原的序列，

编码肿瘤免疫检查点分子的序列，

编码细胞因子的序列，

编码溶瘤病毒合成必须基因的序列，

编码自杀基因的序列，以及

恢复性序列；

任选地，所述药物靶向基因包括选自表1和表2的至少之一；

任选地，所述肿瘤特异性抗原为CAR-T治疗性抗原，所述CAR-T治疗性抗原包括选自CD19、CD20、CD30、EGFR、GPC-3、CD22和NKG2D的至少之一；

任选地，所述细胞因子为IFN-gamma；

任选地，所述自杀基因包括选自tk-GCV、CD-5-FC的至少之一。