CN111484994A - CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法 - Google Patents

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Abstract

为了解决猪Fah、Rag2双基因敲除效率低、筛选困难的问题，本发明提供了一组Fah、Rag2双基因的靶序列，以及它们在CRISPR‑Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的用途。本发明还提供了一种CRISPR‑Cas9敲除猪Fah、Rag2双基因的方法。通过验证，本发明可以有效实现猪Fah、Rag2双基因的敲除，其双敲除效率高达50％，筛选也十分简单。

Description

CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法
技术领域
本发明涉及基因编辑领域，尤其涉及一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法。
背景技术
我国是肝病大国，是世界上病毒性肝炎和肝癌发病率最高、患者最多的国家。目前，全国慢性肝病患者3000万人，每年死于肝癌的病人50多万，每年用于肝病的治疗费用达1000亿元人民币。肝移植仍是目前治疗肝功能衰竭最有效的手段，但供体的短缺和移植后终生免疫抑制剂治疗严重地限制了肝移植在临床上的应用。寻找全肝或部分肝移植的替代治疗方案是临床的迫切需求。因此，肝细胞移植(Hepatocyte transplantation，HT)、生物人工肝(Bioartificial liver，BAL)及组织工程肝脏(Tissue engineered liver，TEL)等作为肝移植的替代、过渡支持或补充手段引起广泛关注，临床医生希望通过这些支持治疗手段使病人能够通过肝再生自行恢复而避免进行肝移植。
研究者将人源肝细胞植入Fab和Rag2基因双敲除(Fah-/-Rag2-/-)的小鼠体内，使人源肝细胞快速增殖，并逐渐替换掉小鼠自身肝细胞，以期获得更多有功能的肝细胞。前述的基因中，Fah编码的延胡索酰乙酰乙酸水解酶是酪氨酸分解代谢的关键的酶，缺失Fah基因会引起严重的肝损伤，致使肝细胞凋亡；而Rag2基因的缺失可能导致V(D)J的重排缺陷，导致严重的联合免疫缺陷(SCID)，减少小鼠对人肝细胞的排斥反应。人源肝细胞由于具有代谢酪氨酸的能力，在免疫力低下的Fah-/-Rag2-/-小鼠体内免受免疫系统的清除，逐渐增殖，代替小鼠肝细行使功能。按照这个原理，每只小鼠产生的人肝细胞少于1×108个，不足以用作肝细胞移植和生物人工肝治疗。
而猪在解剖，生理病理学，营养代谢和疾病特征等方面都与人类相似度更高，根据生物安全性、生理功能指标等多方面评价，基因修饰猪已然成为疾病发生机制，病理毒理研究，异种细胞再生系统，异种器官来源等多方面的重要动物模型。若使用Fah-/-Rag2-/-的猪代替Fah-/-Rag2-/-的小鼠，则可提供足量的干细胞用于肝细胞移植和生物人工肝治疗。
CRISPR-Cas9技术是一种新型的基因组靶向修饰技术，可以对生物体基因组特异位点进行定点改造，比起传统基因编辑技术(如同源重组技术、类转录激活效应子核酸酶技术、锌指核酸酶技术等)有着操作简单、成本低等优势，但由于其脱靶率较高，且十分依赖精确的sgRNA靶序列设计。通常情况下，CRISPR-Cas9技术进行基因敲除，其单等位基因敲除率可能达到80％以上，但双等位基因敲除成功率在10％以内。例如：J-T Kang的研究中，对猪纤维原细胞的RUNX3基因进行CRISPR-Cas9敲除，其双等位基因突变率仅有7.8％(Generaton of RUNX3 knockout pigs using CRISPR/Cas9-mediated genetargeting.Reprod Dom Anim 2016；51：970-978)。
目前尚未见报道使用该技术对猪的Fah和Rag2基因进行双敲除。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah基因的靶序列，所述序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明还提供了一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Rag2基因的靶序列，所述序列如SEQ ID NO.51所示。
本发明还提供了权利要求1或2所述靶序列在构建Fah、Rag2双基因敲除的猪细胞中的用途。
本发明还提供了一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成两种靶序列双链分子，分别连接入CRISPR-sgRNA空表达载体；
(2)使用腺病毒包装带有靶序列的CRISPR-sgRNA表达载体，得重组腺病毒；
(3)将前述重组病毒转入表达Cas9蛋白的猪细胞；
(4)挑取细胞单克隆，鉴定基因敲除效果；
所述靶序列如SEQ ID NO.17和51所示；
所述空表达载体接入所述靶序列双链分子后能表达出完整的sgRNA。
前述的方法中，步骤(1)所述的连接是粘性末端连接；
所述双链分子带有接头序列，用于双链分子与载体的连接。
进一步地，步骤(1)所述的接头序列为：
靶序列5’端的接头序列：CACCG；
靶序列反向互补序列的5’端的接头序列：AAAC；
靶序列反向互补序列的3’端的接头序列：C；
前述序列的方向是5’到3’。
前述的方法中，步骤(1)所述两种靶序列双链分子所接入的载体分别带有两种不同的荧光信号基因。
前述的方法中，步骤(3)之后、步骤(4)之前还包括如下步骤：
使用流式细胞仪筛选同时带有两种荧光信号的细胞。
优选地，前述方法步骤(1)所述CRISPR-sgRNA空表达载体是pHBAD-U6-gRNA质粒。
前述的方法中，步骤(4)所述鉴定是酶切鉴定或测序鉴定。
本发明具有以下有益效果：
首先，本发明的靶序列设计合理、选取得当，Fah或Rag2双等位基因除效率可达100％，其中，Fah和Rag2双敲除效率高达50％。
其次，本发明引入荧光基因辅助基因编辑细胞的筛选，使基因敲除细胞的筛选变得直观、快速。
本发明提供了猪Fah、Rag2双基因敲除的CRISPR-Cas9靶基因和对应方法，可以直接应用在Fah-/-Rag2-/-猪的培育中，在人源肝细胞增殖应用上，有着良好的前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是表1中第17号靶序列对应的基因编辑示意图。
图2是表2中第1号靶序列对应的基因编辑示意图。
图3是pHBAD-U6-gRNA-GFP载体结构图。
图4是pHBAD-U6-gRNA-RFP载体结构图。
图5是pHBLV-gRNA-Cas9-Puro载体结构图。
图6是荧光显微镜检测PIEC细胞系中的Fah-sgRNA和Rag2-sgRNA转染的荧光图：左上，自然光下视野；右上，GFP荧光视野；左下，RFP荧光视野；右下，GFP和RFP融合视野；标尺，100μm。
图7是流式细胞仪分选图。
图8是T7E1酶切电泳图：左图，Fah基因；右图，Rag2基因；M，marker；WT，野生型。
图9是双阳性细胞单克隆的荧光图：左上，自然光下视野；右上，GFP荧光视野；左下，RFP荧光视野；右下，GFP和RFP融合视野；标尺，100μm。
图10是#1和#2细胞的Fah基因的Sanger测序图。
图11是#1和#2细胞的Rag2基因的Sanger测序图。
图12是#3细胞的Fah基因的Sanger测序图。
图13是#4细胞的Rag2基因的Sanger测序图。
具体实施方式
以下实施例中涉及的试验材料和试剂：spCas9假型慢病毒购自汉恒公司，lentiGuide-Puro质粒购自Addgene公司，PIEC细胞购自中国科学院细胞库，DMEM培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清FBS购自Gibco公司。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，J.萨姆布鲁克编著)一书中描述的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 Sus scrofa(猪)Fah和Rag2基因sgRNA靶序列的选择和设计
(一)方法
1.Fah和Rag2基因的sgRNA靶序列选择
在Fah和Rag2基因外显子编码区寻找sgRNA靶序列，原则如下：
(1)序列通式为5′-N(20)NGG-3′，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合上述规则的靶序列位于正义链或反义链；
(2)针对Fah基因，选择靠近基因Fah N端的5个外显子编码区序列，靶序列可以位于Fah基因的N端的5个外显子编码区，或靶序列的一部分位于Fah基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交界，位于相邻内含子；这样的编码区序列的切割会造成Fah基因的功能敲除，残留截短的序列不会形成有功能的蛋白；
(3)如果存在多种剪切体，则在共有外显子编码区进行选择，针对Fah基因选择靠近N端的5个外显子编码区序列即可满足该条件；针对Rag2基因，选择其开放阅读框之后的序列。
(4)利用在线序列分析工具(http://crispr.mit.edu/)分析以上Fah靶序列在猪基因组中的同源情况，舍弃存在显著同源序列的靶序列，根据评分进一步挑选，所挑选的靶序列在Fah基因上是唯一的；利用在线序列分析工具(https://sg.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_SEQUENCE)分析以上Rag2靶序列在猪基因组中的同源情况，舍弃存在显著同源序列的靶序列，根据评分进一步挑选，所挑选的靶序列在Rag2基因上是唯一的；
基于以上原则，选择出表1和表2所示的靶序列集合。
表1 Fah-sgRNA靶序列合集
Figure BDA0001962457540000041
Figure BDA0001962457540000051
Figure BDA0001962457540000061
表2 Rag2-sgRNA靶序列合集
Figure BDA0001962457540000062
Figure BDA0001962457540000071
2.Fah和Rag2基因的sgRNA序列设计：
(1)分别以pHBAD-U6-gRNA-GFP质粒和pHBAD-U6-gRNA-RFP作为表达载体，根据质粒的特点，在上述N(20)靶序列的5’端添加CACCG序列，形成正向寡核苷酸序列：
5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’：
(2)在上述N(20)靶序列的反向互补序列的两端添加序列，形成反向寡核苷酸序列：
5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3’；
正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列可以互补形成具有粘性末端的双链DNA片段：
5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。
发明人通过筛选，得到表1第17号序列(SEQ ID NO.17)以及表2第1号序列(SEQ IDNO.51)分别是Fah-sgRNA和Rag2-sgRNA的最佳靶序列。以下实施例将从这两个靶序列出发，进一步说明本发明的有益效果。
实施例2分别构建Fah基因和Rag2基因的sgRNA表达载体以及腺病毒包装
1.合成DNA插入片段
(1)合成上述设计的Fah-sgRNA和Rag2-sgRNA正向和反向寡核苷酸序列
寡核苷酸序列可以由商业化的公司(如Invitrogen公司)根据提供的序列具体合成。表1中第17号靶序列对应的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：
5’-CACCGGCGATTGGTGACCAGATCC-3’(SEQ ID NO.91)：
5’-AAACGGATCTGGTCACCAATCGCC-3’(SEQ ID NO.92)。
表2中第1号靶序列对应的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：
5’-CACCGGACTGTGCAAGTCACAGCT-3’(SEQ ID NO.93)；
5’-AAACAGCTGTGACTTGCACAGTCC-3’(SEQ ID NO.94)。
前述序列对应的sgRNA靶向靶基因后的基因敲除模式图见图1(Fah)和图2(Rag2)。
将Fah-sgRNA和Rag2-sgRNA对应的正向和反向寡核苷酸序列磷酸化、退火、复性，形成具有粘性末端的双链DNA片段。
反应体系(10μL)如下所示：
正向寡核苷酸(100μM)：1μL
反向寡核苷酸(100μM)：1μL
10×T4Ligation Buffer(NEB)：1μL
ddH2O：6.5μL
T4PNK(NEB M0201S)：0.5μL
将上述反应体系放入PCR仪，并按以下程序进行反应。
反应程序：
37℃，30min；
95℃，5min;
自然降至室温；
将退火后的寡聚片段按1∶200稀释到无菌水中。
2.构建sgRNA表达载体
1)利用BbsI限制性内切酶酶切目标载体pHBAD-U6-gRNA-GFP质粒(图3)和pHBAD-U6-gRNA-RFP质粒(图4)。
按照以下反应体系进行配制：
pHBAD-U6-gRNA系列质粒：1μg
BbsI(NEB)：1μL
10×NEB Buffer：5μL
补充ddH2O至总体积50μL
将酶切反应体系置于37℃反应过夜。
(2)电泳分离并纯化载体片段
酶切结束后，将酶切混合物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，选择载体片段(约～2kb)进行切割，并通过DNA凝胶回收柱进行回收。
(3)将合成的双链DNA片段与载体主片段进行连接并转化大肠杆菌
将复性得到的Fah-sgRNA和Rag2-sgRNA双链DNA片段分别与回收得到的载体片段进行连接反应，按照以下反应体系进行配制：
pHBAD-U6-gRNA系列线性载体片段：50ng
稀释的双链DNA片段：1μL
Quick Ligase(NEB M2200S)：1μL
2×Quick Ligase Buffer(NEB)：5μL
补充ddH2O至总体积10μL
将连接混合物置于25℃反应10min。
反应结束后将连接混合物转化大肠杆菌DH5α菌株：向连接混合物中加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上孵育30min；将混合物放入42℃水浴，热激50s后放入冰上冷却2min；向混合物加入100μLLB培养基，37℃摇床培养1h；将混合物涂Amp LB平板，37℃培养14h。
(4)鉴定正确的转化克隆
从Amp LB平板上挑选若干菌落进行扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定。挑选可能正确的克隆进行测序，验证插入序列是否正确。对于正确的pHBAD-U6-Fah-gRNA-GFP和pHBAD-U6-Rag2-gRNA-RFP载体克隆进行保种。
(5)腺病毒包装
a.材料准备
病毒包装系统：pHBAd系列穿梭质粒，pHBHGLox E1，3Cre包装质粒(购自Hanbio)；扩增并抽提载体质粒pHBAD-U6-gRNA-GFP质粒和pHBAD-U6-gRNA-RFP；培养包装细胞系HEK293T细胞(购自ATCC)；DMEM培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清FBS(购自Gibco)；Lipofectamine2000(购自Invitrogen)；HEK293T细胞培养于含5％CO2的37℃培养环境中，培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
b.转染和病毒包装
第一天：将包装细胞系HEK293T传代至6em培养皿；
第二天：在HEK293T达到50％-70％融合度时按照下列配方进行转染：
配制混合物1，包含：
pHBAd系列穿梭质粒：2μg
pHBHGLox E1，3Cre载体：4μg
Opti-MEM：500μL
配制混合物2，包含：
Lipofectamine 2000：30μL
Opti-MEM：500μL。
静置5min后，将混合物1和混合物2混匀成转染混合物，静置20min。
将HEK293T培养基换为无血清DMEM培养基，加入转染混合物，37℃培养6h后换为10％FBS的DMEM培养基，继续培养。
c.病毒收集与保存
第三天：转染48h后收集含病毒的HEK293T培养基上清，用0.45μm滤头过滤后，分装，放置-80℃保存。
实施例3获得表达Cas9的假型慢病毒
1.材料准备
病毒包装系统：三质粒系统，pSPAX2，pMD2G，pHBLV-Cas9-Puro(购自Hanbio，图5)；培养包装细胞系HEK293T细胞(购自ATCC)；DMEM培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清FBS(购自Gibco)；Lipofectamine2000(购自Invitrogen)；HEK293T细胞培养于含5％CO2的37℃培养环境中，培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
2.转染和病毒包装
第一天：将包装细胞系HEK293T传代至T75，约30％融合度；
第二天：在HEK293T达到50％-60％融合度时按照下列配方进行转染：
配制混合物1，包含：
pSPAX2 10μg
pMD2G 10μg
pHBLV-Cas9-Puro载体10μg
Opti-MEM：500μL
配制混合物2，包含：
Lipofectamine 2000：30μL
Opti-MEM：500μL。
静置5min后，将混合物1和混合物2混匀成转染混合物，静置20min。
将HEK293T培养基换为无血清DMEM培养基，加入转染混合物，37℃培养6h后换为10％FBS的DMEM培养基，继续培养。
3.病毒收集与保存
第三天：转染48h后收集含病毒的HEK293T培养基上清，用0.45μm滤头过滤后，分装，放置-80℃保存。
实施例4获得表达Cas9的稳转细胞株
1.材料准备
培养细胞系PIEC细胞(购自中国科学院细胞库)；1640培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清FBS(购自Gibco)；PIEC细胞培养于含5％CO2的37℃培养环境中，培养基为含10％FBS的1640培养基。
2.慢病毒感染目的细胞
第一天：将目的细胞传代至24孔板。
第二天：待目的细胞约40％融合密度时加入30μL Cas9假型慢病毒上清及250μL1640培养基孵育4h，然后换上不含病毒的新鲜培养液培养。效率对照不需要添加慢病毒。
第四天：感染48h后在培养液中，加入嘌呤霉素至终浓度1μg/mL，没有感染病毒的效率对照样品也同时加入嘌呤霉素作为对照。
3.细胞感染效率检测和培养
第七天：未感染的效率对照细胞在嘌呤霉素的作用下应该全部凋亡(＞95％)。根据感染慢病毒细胞的凋亡情况判断细胞的感染效率，通常可以达到90％以上的感染效率(凋亡率＜10％)。必要时可以将病毒上清进行浓缩或梯度稀释后进行感染以达到合适的感染效率。
经过嘌呤霉素筛选后，未感染的细胞发生凋亡。将目的细胞重新传代并换为普通培养基培养48h。获得Cas9稳转细胞株。
实施例5 sgRNA腺病毒感染Cas9稳转细胞并检测靶序列的敲除效果
1.材料准备
培养细胞系Cas9稳转PIEC细胞；1640培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清FBS(购自Gibco)；胰蛋白酶(购自Gibco)。Cas9稳转PIEC细胞培养于含5％CO2的37℃培养环境中，培养基为含10％FBS的1640培养基。
2.Fah-sgRNA和Rag2-sgRNA腺病毒感染Cas9细胞
第一天：将目的细胞传代至24孔板。
第二天：待目的细胞约50％融合密度时加入2μL Fah-sgRNA腺病毒上清及250μL1640培养基。孵育2小时以后，吸走含有病毒的培养液，加入30μL Rag2-sgRNA腺病毒上清及250μL 1640培养基。孵育2小时以后吸走含有病毒的培养液，换上新鲜培养基培养。
第四天：感染48h后荧光显微镜下观察荧光(图6)，可见转入Fah-sgRNA腺病毒的细胞呈绿色(右上)，而转入Rag2-sgRNA腺病毒的细胞呈红色(左下)，双转染的细胞呈黄色(右下)。
3.流式分析细胞感染效率以及分选双转染细胞
将感染48小时后的细胞进行流式细胞仪无菌分选(图7)，检测转染效率并分选双荧光细胞到24孔板中，进一步扩增双阳性细胞。
4.检测Fah和Rag2基因敲除效果
(1)设计上下游引物以扩增Fah和Rag2基因片段，其中上下游引物序列如下所示：
Fah基因上游引物：gctgtgagctgtggtgtacattg(SEQ ID NO.95)
Fah基因下游引物：gtagctccgattcacctgctag(SEQ ID NO.96)
目的扩增片段包含sgRNA靶序列，大小为697bp。靶序列至片段两端的位置不少于100bp。
Rag2基因上游引物：catcagtacatcatccatggag(SEQ ID NO.97)
Rag2基因下游引物：catgagagcagtagatcatg(SEQ ID NO.98)
目的扩增片段包含sgRNA靶序列，大小为1081bp。靶序列至片段两端的位置不少于100bp。
(2)收集部分目的细胞，使用天根基因组DNA试剂盒抽提基因组DNA。同时抽提野生型目的细胞的基因组DNA。
(3)以基因组DNA为模板扩增包含靶序列的Fah和Rag2基因片段(包括感染的突变样品和野生型样品)。
扩增反应体系(25μL)如下：
上游引物(10μM)：1.25μL
下游引物(10μM)：1.25μL
10×Buffer：2.5μL
Taq酶：0.2μL
DNTP：2μL
基因组DNA：100ng
ddH2O：补足至25μL
以上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
反应程序：
94℃，5min
94℃，30s
58℃，30s
72℃，1min
72℃，5min；
其中第二步至第四步重复35个循环。
(4)电泳检测PCR产物并回收纯化
(5)将纯化后的DNA片段分别加热变性、复性，形成杂交DNA分子(包括突变样品和野生型样品)。
反应体系如下所示：
基因组PCR片段：200ng
10×T7E1buffer：1μL
反应体系共9μL
以上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
反应程序：
95℃，5min；
94℃，2sec，-0.1℃/cycle，200times；
75℃，1sec，-0.1℃/cycle，600times；
16℃，2min；
(6)用T7E1酶切割复性后的杂交DNA(包括突变样品和野生型样品)向经过变性、复性的反应混合物加入1μL T7E1酶，37℃孵育30min。
(7)电泳检测酶切产物，检测靶序列介导的Fah和Rag2基因敲除效果。
将经过酶切的DNA片段用2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，130V，25min。确定目的片段的切割情况，判断靶序列的基因敲除效果。
对突变DNA的切割识别基于以下原理：经过感染的细胞会表达sgRNA和Cas9。基因组DNA如果被sgRNA介导的Cas9蛋白靶向切割，经过修复后会在切割位点附近引入突变(野生型变为突变型)。由于野生型和突变型序列在该位置不匹配，以此为模板扩增出的野生型DNA与突变型DNA经过变复性形成的杂交分子会就产生局部的环形(loop)结构。而后者可以被T7E1酶识别并切断，导致杂交DNA分子被切割成小片段。
5.结果
流式细胞仪分选结果显示(图7)，双转染细胞百分比高达67.10％，强双转染的细胞为25.00％。
图8为电泳检测图。其中，未经过sgRNA质粒感染的野生型细胞(WT)的PCR产物未检测到小片段；而Fah和Rag2基因敲除细胞由于产生了切割，因此检测到小片段的存在，表明SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.51能作为CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah和Rag2基因的靶序列。
实施例6 Fah和Rag2基因敲除单克隆的挑选和鉴定
1.单克隆的挑选
(1)将部分经过流式分选的pHBAD-U6-Fah-gRNA-GFP和pHBAD-U6-Rag2-gRNA-RFP双阳性转染的目的细胞群进行传代，记数约200个细胞转移至10cm dish培养。
(2)培养约10天后，有相当数量的单克隆生长到肉眼可见的水平。
(3)用移液器头刮取独立的克隆，将细胞转移至24孔板中培养，每个孔对应一个克隆，并观察其荧光(如图9)。
(4)再经过约一周的培养后，有部分克隆长至足够的数量，准备做进一步的鉴定。
2.鉴定单克隆的Fah和Rag2基因敲除情况
(1)收集待检的单克隆及野生型细胞，分别抽提基因组DNA。
(2)按照实施例5的第4节所述方法，分别PCR扩增单克隆及野生型细胞的Fah和Rag2基因片段，所扩增的基因片段包含sgRNA靶序列；T7E1酶切割复性后的杂交DNA，电泳检测酶切产物，根据是否有切割片段确定单克隆是否发生有效突变。
(3)将有效突变的单克隆的PCR片段进一步测序，确定靶序列附近的突变情况。鉴定双敲除Fah和Rag2基因的单克隆。
3.结果
本实验共随机挑取4个单克隆细胞，经测序分析，全部克隆细胞实现双等位基因敲除，其中两个细胞为单基因突变，另外两个细胞为双基因突变。表明通过该方法的单基因敲除效率为100％，其中双基因敲除率为50％。双基因突变细胞测序结果如图10和图11所示，经过Fah和Rag2敲除的序列，在#1号单克隆细胞中，Fah基因上出现了1bp碱基缺失和4bp碱基的插入，Rag2基因出现了17bp和2bp碱基的缺失；在#2号单克隆细胞中，Fah基因上出现了1bp碱基插入和ibp碱基的缺失，而Rag2基因则出现了2bp碱基缺失和1bp碱基的插入。在#3号和#4号单克隆细胞均出现了Fah或Rag2基因的双链敲除(图12和图13)。
综上，本发明基因敲除效率很高，可以实现猪细胞的Fah、Rag2基因的有效双敲除，在培育Fah-/-Rag2-/-猪的应用上具有很好的前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah/Rag2双基因的方法
<130> GY026-2018P012683CC
<160> 98
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
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gcgggctgcg ggcgatcagc ggg 23
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 2
cgggactcgc cgaggtggtc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 3
tgcgggctgc gggcgatcag cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 4
cagcgggccg ggactcgccg agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 5
aagtcagaat cctcggccac agg 23
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 6
agtcagaatc ctcggccaca ggg 23
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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agacgccgta gggcaggttg tgg 23
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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ccgtagggca ggttgtggat agg 23
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cgggccggga ctcgccgagg tgg 23
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atcctcggcc acagggacga agg 23
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cgccgatcct cggtcttgac tgg 23
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<213> Sus scrofa
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<213> Sus scrofa
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ttccaccagc caaggtccat ggg 23
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tcttaacagc ttcatgggcc tgg 23
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tggcttggct ggcagatagt agg 23
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ccaactctta acagcttcat ggg 23
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ctgtactcac ctatggcggc agg 23
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cattaaagtc ctcggtgtcc tgg 23
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aggaagatgc atcgtggcgg agg 23
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gatgcatcgt ggcggaggcc tgg 23
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aggacaccga ggactttaat ggg 23
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atgcatcgtg gcggaggcct ggg 23
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ccttggccca ttaaagtcct cgg 23
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<213> Sus scrofa
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gagactgtac tcacctatgg cgg 23
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<213> Sus scrofa
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cgacgtttgt ggcgtgctgc cgg 23
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gaacatgact ccgacgtttg tgg 23
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ggactgtgca agtcacagct ggg 23
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cacctataac gaagatgatg agg 23
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caagatagga attcatgaga tgg 23
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atatggtttg gaagcaacat ggg 23
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aattcttctg agtcttcaaa ggg 23
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cataccagga gacaataaac agg 23
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attcttccag aacttcaaga tgg 23
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ttctgagtct tcaaagggag tgg 23
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tctttcaagg acaacaagat agg 23
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taagatttat gtcatgtctg tgg 23
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gataccattt atattttagg agg 23
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aatggtatca tttctggcaa tgg 23
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tacactattc catttttctg tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caccggcgat tggtgaccag atcc 24
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
aaacggatct ggtcaccaat cgc 23
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
caccggactg tgcaagtcac agct 24
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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aaacagctgt gacttgcaca gtc 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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gctgtgagct gtggtgtaca ttg 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtagctccga ttcacctgct ag 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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catcagtaca tcatccatgg ag 22
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
catgagagca gtagatcatg 20

Claims (10)

1.一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah基因的靶序列，其特征在于，所述序列如SEQ IDNO.17所示。
2.一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Rag2基因的靶序列，其特征在于，所述序列如SEQ IDNO.51所示。
3.权利要求1或2所述靶序列在构建Fah、Rag2双基因敲除的猪细胞中的用途。
4.一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成两种靶序列双链分子，分别连接入CRISPR-sgRNA空表达载体；
(2)使用腺病毒包装带有靶序列的CRISPR-sgRNA表达载体，得重组腺病毒；
(3)将前述重组病毒转入表达Cas9蛋白的猪细胞；
(4)挑取细胞单克隆，鉴定基因敲除效果；
所述靶序列如SEQ ID NO.17和51所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的连接是粘性末端连接；
所述双链分子带有接头序列，用于双链分子与载体的连接。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的接头序列为：
靶序列5’端的接头序列：CACCG；
靶序列反向互补序列的5’端的接头序列：AAAC；
靶序列反向互补序列的3’端的接头序列：C；
前述序列的方向是5’到3’。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述两种靶序列双链分子所接入的载体分别带有两种不同的荧光信号基因。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)之后、步骤(4)之前还包括如下步骤：
使用流式细胞仪筛选同时带有两种荧光信号的细胞。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述CRISPR-sgRNA空表达载体是pHBAD-U6-gRNA质粒。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述鉴定是酶切鉴定或测序鉴定。
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