CN111979243B

CN111979243B - 利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法

Info

Publication number: CN111979243B
Application number: CN202010857803.4A
Authority: CN
Inventors: 高凤山
Original assignee: Dalian University
Current assignee: Dalian University
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2040-08-24
Also published as: CN111979243A

Abstract

本发明涉及利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法，属于动物基因工程和遗传修饰技术领域。技术方案主要包括：首先进行TAP2基因敲除，把识别TAP2的sgRNA连接到pUC57‑sgRNA载体上，转化感受态细胞，获得含有靶向识别序列的pUC57‑sgRNA质粒，通过测序筛选阳性克隆。将重组质粒pUC57‑sgRNA和Cas9质粒共转染PK15细胞。在TAP2基因敲除的细胞上利用同样的方法敲除TAP1。本发明利用CRISPR/Cas9构建TAP基因敲除的PK15细胞系，为筛选多种猪源病毒CTL表位建立细胞模型，同时为外源性抗原的TAP非依赖性递呈机制的研究建立了细胞模型。

Description

利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法

技术领域

本发明涉及动物基因工程和遗传修饰技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法。

背景技术

在体内，几乎所有细胞表面都会表达主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)I类分子并向CD8+T淋巴细胞递呈抗原肽。这些抗原肽来源于蛋白酶体对内源性蛋白或细胞内病原体抗原蛋白的降解。在胞质溶胶中产生的肽需要通过抗原处理相关转运体(Transporter associated with antigen processing,TAP)转运到内质网(ER)中，并在肽转运复合物的分子伴侣如钙网蛋白、tapasin和ERp57的帮助下与MHC I重链和轻链β2m组装成pMHC复合体，经高尔基体加工后，被递呈到细胞表面，激活细胞毒杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)，起到细胞免疫作用(Belicha-Villanueva et al.,2010)。这种蛋白酶体-TAP途径被认为是经典的MHC I类分子抗原加工递呈途径(Monaco,1995)。

最近，Schuette等(Schuette and Burgdorf,2014)指出，树突状细胞等具有吞噬能力的抗原递呈细胞，其MHC I类分子除了递呈内源性的抗原肽以外，还可以递呈外源性的抗原肽。如果肽段大小合适，外源性的肽段可以直接与空载的MHC I分子结合而递呈到细胞表面，因此不需要TAP的转运。如果TAP基因缺失或将其敲除，抗原递呈细胞就可以专门递呈外源性的多肽。早先，人和小鼠均通过建立肿瘤组织模型筛选获得了TAP1和TAP2自然缺失的抗原递呈细胞系，命名为T2细胞系(Cerundolo et al.,1990；Zhou et al.,1993)。近年来，T2细胞系用来筛选MHC I类分子限制性的抗原多肽表位(Boudewijns et al.,2016；Xuet al.,2016)。

猪的MHC I类分子，也称为猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)I类分子(SLA-I)，其功能与人及其他动物MHC class I(以下称MHC I)功能一样，主要起到介导动物细胞免疫应答的作用。猪SLA-I类分子结合和递呈的病毒抗原表位已经有多个学者在研究，但均限于在体外结合实验筛选与SLA-I结合的表位(Gao et al.,2018；Zhang et al.,2011)。体外结合实验筛选猪源病毒CTL表位存在以下问题：一，SLA-I与多肽在体外的结合并不能完全保证多肽在体内具有生物学功能；二，以上研究每一次在体外筛选病毒多肽表位都涉及到蛋白表达、纯化、复性等，使表位的筛选比较费时费力。目前，急需建立一种在细胞水平上快速筛选猪源病毒CTL表位的平台。

表达猪SLA-I的细胞系目前有PK-15(猪肾细胞)和ST(猪睾丸细胞)，均为成熟的传代细胞系。其中，利用率最高的是PK-15细胞系。多项研究表明PK-15细胞系稳定表达猪SLA-I类分子。而且，多位学者已经证实，PK-15细胞系同样也表达TAP基因，并证实SLA-I类分子内源性抗原递呈与TAP相关(Deruelle et al.,2009；Feng et al.,2012)。需要指出的是，猪与人、小鼠的研究水平不同，目前还未建立肿瘤组织模型，因此无法通过筛选自然缺失TAP1和TAP2的方法建立猪源T2细胞系。然而，借助于当前最先进的基因敲除技术CRISPR/Cas9，可以建立猪源T2(swine T2,sT2)细胞系。

CRISPR/Cas9是细菌或古细菌所特有的、针对外源质粒或噬菌体入侵进行防御的获得性免疫系统。其中CRISPR RNA(crRNA)与反式激活的crRNA(tracrRNA)一起编码识别DNA，并引导Cas9核酸酶结合到靶DNA而进行基因编辑(Chylinski et al.,2013)。融合crRNA和tracrRNA为一条单链的短小导向RNA(sgRNA)的发明在基因编辑领域中是重要的突破，因为其显著简化了指导Cas9在体外特定DNA位点发挥切割活性的工作量(Dang et al.,2015)。随着这项技术的发展，其应用逐渐在细胞和动物模型的基因组工程展开。在CRISPR/Cas9介导的基因组编辑中，sgRNA通过互补碱基配对识别基因组中的靶序列。化脓链球菌的Cas9核酸酶，在间隔序列相邻基序(PAM)(NGG)的第3个碱基对处产生双链断裂。基因改变的第一步是在基因组中精确产生单链或双链断裂(SSB或DSB)。Cas9/sgRNA复合物可以在细菌(Nie et al.,2017)、酵母(Rodriguez-Lopez et al.,2016)、植物(Khromov et al.,2018)、动物(Gertsenstein and Nutter,2018)以及多种细胞系(Norouzi-Barough etal.,2018；Byrne et al.,2018；Jia et al.,2018)的基因组中产生精确的基因断裂。

发明内容

本发明将以PK15细胞为材料，通过CRISPR/Cas9技术敲除TAP1和TAP2基因，建立筛选猪源病毒CTL表位的sT2细胞系，也为病毒TAP非依赖性递呈机制研究建立细胞模型。本发明的技术方案如下：一种敲除TAP2基因的sgRNA，包括TAP2-sgRNA-1，TAP2-sgRNA-2，TAP2-sgRNA-3；

所述的TAP2-sgRNA-1的序列如下：

TAP2-sgRNA-1olige1：5′-caccGGAGGGCATCTTGCGACT-3′；SEQ ID NO.1

TAP2-sgRNA-1olige2：5′-aaacAGTCGCAAGATGCCCTCC-3′；SEQ ID NO.2

所述的TAP2-sgRNA-2的序列如下：

TAP2-sgRNA-2olige1：5′-caccGGGCTGCTGGGATATGTG-3′；SEQ ID NO.3

TAP2-sgRNA-2olige2：5′-aaacCACATATCCCAGCAGCCC-3′；SEQ ID NO.4

所述的TAP2-sgRNA-3的序列如下：

TAP2-sgRNA-3olige1：5′-caccGAAAGAAGGGGATCACC-3′；SEQ ID NO.5

TAP2-sgRNA-3olige2：5′-aaacGGTGATCCCCTTCTTTC-3′；SEQ ID NO.6。

本发明同时请求保护一种敲除TAP1基因的sgRNA，包括TAP1-sgRNA-1，TAP1-

sgRNA-2，TAP1-sgRNA-3，TAP1-sgRNA-4；

所述的TAP1-sgRNA-1的序列如下：

TAP1-sgRNA-1olige1：5′-caccGTTAGAGCTGAGCTGCTT-3′；SEQ ID NO.7

TAP1-sgRNA-1olige2：5′-aaacAAGCAGCTCAGCTCTAAC-3′；SEQ ID NO.8

所述的TAP1-sgRNA-2的序列如下：

TAP1-sgRNA-2olige1：5′-caccGGAGAGGAGAGATGGGC-3′；SEQ ID NO.9

TAP1-sgRNA-2olige2：5′-aaacGCCCATCTCTCCTCTCC-3′；SEQ ID NO.10

所述的TAP1-sgRNA-3的序列如下：

TAP1-sgRNA-3olige1：5′-caccGCTGAGCTTGGAAGGCT-3′；SEQ ID NO.11

TAP1-sgRNA-3olige2：5′-aaacAGCCTTCCAAGCTCAGC-3′；SEQ ID NO.12

所述的TAP1-sgRNA-4的序列如下：

TAP1-sgRNA-4olige1：5′-caccGGGCGCAGTTGGAAGTT-3′；SEQ ID NO.13

TAP1-sgRNA-4olige2：5′-aaacAACTTCCAACTGCGCCC-3′；SEQ ID NO.14。

本发明同时请求一种敲除TAP基因的CRISPR/Cas9系统，上述的DNA序列。

本发明同时请求保护利用所述的sgRNA进行基因敲除的方法，包括如下步骤：

将识别TAP的sgRNA连接到pUC57-sgRNA载体上，转化TOP10感受态细胞，获得高拷贝的含有靶向识别序列的pUC57-sgRNA质粒；将pUC57-sgRNA质粒和Cas9质粒共转染PK15细胞。

本发明同时请求保护利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法，包括如下步骤：

(1)分别构建识别TAP1基因和TAP2基因的sgRNA序列；所述TAP1基因的sgRNA序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，所述TAP2基因的sgRNA序列如SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示；

(2)敲除TAP2基因：将识别TAP2的sgRNA连接到pUC57-sgRNA载体上，转化TOP10感受态细胞，获得高拷贝的含有靶向识别序列的pUC57-sgRNA质粒；将pUC57-sgRNA质粒和Cas9质粒共转染PK15细胞；

(3)筛选敲除TAP2基因的单克隆细胞系；

(4)在TAP2基因敲除的细胞上敲除TAP1基因；

(5)筛选获得TAP2和TAP1双基因敲除的细胞系。

本发明利用CRISPR/Cas9技术，以猪PK15细胞为材料，分别对TAP2和TAP1进行基因敲除，构建TAP双基因缺失的细胞系。在前期研究的基础上，分别设计识别TAP2和TAP1的sgRNA序列。首先进行TAP2基因敲除，把识别TAP2的sgRNA连接到pUC57-sgRNA载体上，转化TOP10感受态细胞，获得高拷贝的含有靶向识别序列的pUC57-sgRNA质粒，通过测序筛选阳性克隆。利用脂质体转染试剂lipofectamine 2000将重组质粒pUC57-sgRNA和Cas9质粒共转染PK15细胞，sgRNA在PK15细胞内转录形成发夹结构识别特异性DNA并指导Cas9蛋白发挥切割作用，然后通过有限稀释法将单克隆细胞接种到96孔细胞培养板中生长。8天后，转移到24孔细胞培养板中扩大培养，最后转移到6孔细胞培养板中，利用酚氯仿法抽提单克隆PK15细胞基因组，利用设计的特异性引物扩增靶基因序列，并通过生物学分析软件VectorNTI比对序列，得到TAP2基因敲除的单克隆细胞系。在TAP2基因敲除的细胞上再利用同样的方法敲除TAP1，筛选获得TAP2和TAP1双基因敲除的细胞系。

TAP2基因测序结果表明，在70株PK15单克隆细胞系中，其中有2株PK15单克隆细胞系TAP2基因型发生改变，并产生移码突变，但经过测序峰型图谱分析，其中只有一株单克隆细胞峰型图谱没有杂峰干扰，确定为完全敲除。TAP1基因敲除是建立在TAP2基因敲除基础上进行的，最终获得多株TAP1基因型敲除PK15细胞系，进一步将克隆序列连接pMD-19T载体中测序验证，最终获得一株PK15细胞系为TAP1基因完全敲除PK15细胞系，从而得到了TAP1和TAP2均敲除的细胞系，命名为猪T2细胞系，或sT2细胞系。

本发明利用CRISPR/Cas9技术构建TAP基因敲除的PK15细胞系，为筛选多种猪源病毒CTL表位建立了细胞模型，同时为外源性抗原的TAP非依赖性递呈机制的研究建立了细胞模型。

本发明的有益效果如下：与其他基因编辑技术如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子如效应子核酸酶(TALEN)相比较，CRISPR/Cas9具有非常明显的优势：sgRNA更容易改造来指导Cas9发挥核酸酶活性，其操作更便利、靶位点切割更精确、工作量更少。本发明构建的sT2细胞可以用来筛选外源性的抗原多肽。

附图说明

图1为pUC57-sgRNA质粒图谱；

图2为eSpCas9质粒图谱；

图3 PK-15细胞图片；

图4光谱核型分析技术分析PK-15细胞的染色体倍型；

图5 T7EN1酶切分析TAP2 sgRNA切割；

其中：M，Trans2k plus DNA Marker；#1，PK15细胞转染Cas9相关质粒；CTR，PK15细胞未转染质粒。

图6 TAP2基因缺失单克隆细胞的筛选；

其中：tap2为对照野生型序列，其他为测定细胞株序列；序列对比区域黄色代表序列完全相同区域；浅蓝色代表部分相同区域；白色代表完全不匹配区域。

图7 C-18细胞株进一步的TA克隆验证；

其中：Tap2为野生型细胞株基因型，其余为C-18细胞株进一步的TA克隆。黄色部分代表序列完全相同的区域；绿色代表部分相同区域；白色代表完全不匹配区域。

图8 C-30细胞株进一步的TA克隆验证；

其中：Tap2为野生型细胞株基因型，其余为C-30细胞株进一步的TA克隆。序列对比区域黄色部分代表序列完全相同的区域；浅蓝色代表部分相同区域；白色代表完全不匹配区域。

图9 T7EN1酶切分析TAP1 sgRNA切割；

其中:1：sgRNA1 T7EN1酶切活性鉴定2：sgRNA2 T7EN1酶切活性鉴定M：DL 500maker C:PK15细胞未转染质粒；

图10 TAP1基因缺失单克隆细胞的筛选；

其中：NC为TAP1对照野生型序列，其他为测定细胞株序列；序列对比区域黄色代表序列完全相同区域；白色代表完全不匹配区域。

图11单克隆细胞株进一步的TA克隆验证；

其中：TAP1 DEFECT NEW为Tap1为野生型细胞株基因型，其余为单克隆细胞株进一步的TA克隆，序列对比区域黄色部分代表序列完全相同的区域；浅蓝色代表部分相同区域；白色代表完全不匹配区域。

图12 5个TAP1敲除克隆序列比对及缺失区域显示；

其中：TA克隆，测序引物选用pMD19T上通用引物，因而测序结果中(前/后)带有一部分载体上的序列。红色圈内部分，即为差异部分。

图13稳定传代sT2细胞图片；

图14 sT2细胞传代后TAP2基因敲除稳定性的检测；

其中，TAP2-exon2为野生型细胞株Tap2基因第二外显子靶序列，其余为单克隆细胞株TA克隆Tap2基因第二外显子相应于靶序列区域的测定序列。序列对比区域黄色部分代表序列完全相同的区域；浅蓝色代表部分相同区域；白色代表完全不匹配区域。

图15 sT2细胞传代后TAP1基因敲除稳定性的检测。

其中，TAP1-X2X3为野生型细胞株Tap1基因第二外显子靶序列，其余为单克隆细胞株TA克隆Tap1基因第二外显子相应于靶序列区域的测定序列。序列对比区域黄色部分代表序列完全相同的区域；浅蓝色代表部分相同区域；白色代表完全不匹配区域。

图16流式细胞术检测sT2细胞递呈外源性抗原肽能力；

其中：A,流式细胞术检测PK15、sT2细胞递呈外源性抗原的能力；B,流式细胞检测的平均荧光强度统计分析结果。*代表P＜0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。

作为优选，PK15细胞购自中国兽医监测所微生物菌种保藏管理中心(CVCC)第二代培养细胞株。TOP10菌种购自大连宝生物有限公司。质粒：pUC57-sgRNA质粒(#51132)和Cas9质粒(#71814)购自ADDGENE公司，质粒结构见图1和图2。

实施例1 PK15细胞的复苏及核型检测

从液氮中取出冻存管，立即放入37℃水浴中晃动，使冻存细胞迅速融化。将融化的冻存细胞移入带有9mL新鲜培养基的15mL离心管中，1500rpm离心3min，弃掉上清，加入预热的新鲜DMEM培养液并重悬。将重悬的PK15细胞加入到含有4mL DMEM完全培养基的25cm²细胞培养瓶中，轻轻晃动混匀，在CO₂培养箱中进行培养。培养24h后即可长满25cm²细胞培养瓶，之后进行后续的实验。利用光谱核型分析技术对细胞进行分型：

细胞核型分析：

新鲜培养细胞经秋水仙素处理后获得更多的中期分裂相，再经低渗、固定等处理。制成标本后用吉姆萨染液染色，进行染色体数量分析。

涉及试剂：

秋水仙素(使用浓度0.5μg/mL)

低渗剂(0.075M氯化钾)

固定液(甲醇：乙酸＝3:1)

吉姆萨染色液

然后进行显微镜下进行观察。

结果显示：PK15细胞系经过细胞复苏、传代，经倒置显微镜观察，细胞生长状态良好，如图3所示。通过光谱核型分析技术分析PK15细胞染色体数目，光谱核型分析得到PK15细胞染色体为57条，属于三倍体型，属于低倍体型细胞株，可以进行下一步的CRISPR/Cas9敲除PK15细胞TAP2基因的实验，如图4所示。

实施例2利用CRISPR/Cas9技术构建TAP2敲除的PK15细胞系

1 pUC57-T7-sgRNA载体构建

(1)TAP2基因靶位点的设计与合成

通过NCBI中Ensembl基因组数据库获取TAP2基因信息，目前发现该基因存在2个转录本，均编码蛋白。登陆GenBank网站，下载猪PK15细胞TAP2基因序列并获得第二外显子序列(Gene ID:733650)，根据靶点预测网站CCtop(http://crispr.cos.uni-heidelberg.de)设计针对TAP2基因第二外显子的sgRNA序列3对。在两对寡核苷酸序列的上游引物的5′端加上CACC，下游引物5′端添加AAAC，TAP2-sgRNA设计见表1。

表1 sgRNA序列

将3对设计好的sgRNA序列送至公司合成，将合成的sgRNA序列退火形成双链。sgRNA序列退火反应体系如下：在10μL体系中，olige1(10mmol/L)和olige2(10mmol/L)各加1μL，10×Ex taq buffer 1μL，DDH₂O 7μL。95℃水浴中反应5min，自然冷却至室温。

(2)pUC57-T7-sgRNA载体构建

用限制性核酸内切酶Bsa I酶对pUC57-T7-gRNA进行单酶切，酶切体系如下：在20μL反应体系中，10×Buffer2.1 2μL，pUC57-T7-sgRNA 1μg，Bsa I内切酶1μL，补足DDH₂O至体系20μL。体系混匀后，37℃作用2h，1.0％的琼脂糖凝胶电泳120V，25min，回收充分切开的pUC57-T7-gRNA载体。

(3)载体连接

将退火的寡核苷酸序列3对TAP2-sgRNA双链寡核苷酸序列分别与pUC57-T7-gRNA载体连接，16℃作用12h。连接体系如下：在10μL连接体系中，双链寡核苷酸序7μL，pUC57-T7-gRNA载体1μL，10×T4DNA buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL。

(4)质粒转化

将构建好的3个重组pUC57-T7-sgRNA质粒转化到TOP10感受态中，在37℃培养箱中培养过夜的平板长出很多单克隆菌落，用10μL枪头挑取单克隆菌落并加到5mL带有Kan抗性的LB培养基中，每个平板挑取4个菌落。将试管放到37℃摇床中180r/min，培养过夜。将过夜培养的菌液按照质粒提取试剂盒提供的碱裂解法提取质粒。

2引物的设计与合成

以TAP2基因的第二个外显子中设计的靶点左右两端各150bp左右设计引物扩增第二个外显子序列，引物序列如下所示：

TAP2_detect_F：5′-GAATGCCTTGTGTCCTAGGAG-3′

TAP2_detect_R：5′-TCAATCACGAGGCCAGAATAG-3′

3测序

将提取的三种pUC57-T7-sgRNA质粒分别进行测序，阳性克隆质粒分别命名为TAP2-sgRNA-1，TAP2-sgRNA-2，TAP2-sgRNA-3，测定浓度后，-20℃保存备用。

4细胞转染

在细胞培养瓶中培养PK15细胞，并传代两次以上，用1.5mL 0.25％的胰蛋白酶消化液消化细胞并计数，在6孔板中每孔接种3×10⁵个细胞，24h之后用lipoectine2000脂质体转染试剂转染pUC57-T7-sgRNA和Cas9质粒，转染方法如下：

①转染的前一天，在1.5mL无抗生素培养基中接种3×10⁵个细胞，以保证在转染时候细胞的密度达到70％左右。

②在250μL无血清Opti-MEM I低血清培养基中稀释质粒，pUC57-T7-sgRNA1和pUC57-T7-sgRNA2共2μg，Cas9质粒2μg，并轻轻混匀。使用前轻轻混匀Lipofectamine2000，然后8μL的量稀释在Opti-MEM培养基中。室温下静置5分钟。混合Lipofectamine 2000和DNA的稀释液(总体积为500μL)，轻轻混匀并在室温下静置20分钟。

③细胞板的每个孔中加混合液500μL，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。

④细胞于37℃CO₂培养箱中培养6h后，将含有转染试剂的培养基去除，加入1.5mL新鲜的DMEM培养基。

⑤细胞转染24h后，胰酶消化收集细胞，将细胞浓度稀释至10cells/ml，96孔板每孔100微升。

5 T7EN1酶切分析pUC57-T7-sgRNA活性

①提取基因组

收集剩余的转染后细胞，用酚氯仿法提取细胞基因组，方法如下：

1)收集细胞，PBS洗涤离心2次，弃上清，加入400μL裂解液，重悬细胞，37℃保温12～24h；

2)加450μL平衡酚，混匀，12000rpm离心10min，转移上层水相；

3)加入450μL氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，12000rpm离心10min，转移上层水相；

4)加入1/10体积3M乙酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积无水乙醇，混匀，置—20℃1h；

5)12000rpm离心10min。70％乙醇洗涤1次，晾干后，加入50μL灭菌水，－20℃保存备用。

②以提取的基因组为模板，以TAP2_detect_F/TAP2_detect_R作为引物对，PCR扩增靶点，在50ul体系中，添加10×Buffer 5ul，ddH2O 37.7ul，上下游引物各2ul(均为10μmol/L)，dNTPs 1μL(10mmol/L each)，DNA Polymerase(5U/μL,Vazyme Biotech)0.3ul，模板2μL。PCR程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，4个循环；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。72℃总延伸7min。4℃保存。

③T7EN1错配酶酶切分析

上述PCR产物用T7EN1错配酶分析pUC57-T7-sgRNA重组质粒是否表现出切割活性。反应条件为：37℃作用30min，1.0％琼脂糖凝胶电泳，120V，25min，紫外分析仪检测pUC57-T7-sgRNA重组质粒是否表现指导活性。酶切体系如下：在20μL体系中，基因组400ng，T7EN1错配酶(10U/μL,Vazyme Biotech)0.2μL，Reaction Buffer 2μL，补充DDH₂O至20μL。

6单克隆敲除细胞系培养及TAP2基因型鉴定

将酶切阳性的单克隆细胞从96孔板培养开始，逐级进行扩大培养，直至转移到培养皿产生大量的培养细胞。消化细胞，一半细胞用于冻存，一半细胞用上述酚/氯仿法抽提细胞基因组，并通过上述PCR方法扩增目的基因并送公司测序。

7 TA克隆验证TAP2等位基因敲除细胞系

对测序结果表明基因型有变化的细胞株，进一步进行TA克隆验证。靶基因连接pMD19-T载体，转化TOP10感受态细胞中，挑取单克隆菌落进行测序验证是否是等位基因敲除细胞系。筛选出具有稳定的TAP2敲除的细胞株。

8 TAP基因敲除PK15细胞冻存

用0.25％胰蛋白酶消化液消化TAP2基因敲除的单克隆PK15细胞15min，2mL正常DMEM培养基终止消化，并吹散成单个细胞，血细胞计数板计数，取1×10⁶个细胞用1mL冻存液重悬，4℃放置20min，转移到20℃放置2h，然后转到-80℃超低温冰箱，24h后转移到液氮中。

结果如下：

1 TAP2-sgRNA构建

将载体pUC57-T7-gRNA经过Bsa I酶切，然后分别与三种TAP2-sgRNA连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆、提取质粒及测序鉴定。阳性克隆质粒分别命名为TAP2-sgRNA-1，TAP2-sgRNA-2，TAP2-sgRNA-3，测定浓度并调整为1μg/μL，-20℃保存备用。

2 PK15细胞中TAP2-sgRNA转染

取8μL Lip2000(Invitrogen)作为脂质体，将TAP2-sgRNA-1，TAP2-sgRNA-2，TAP2-sgRNA-3及Cas9 Nickase表达质粒共4μg转染PK-15细胞，细胞转染24h后，胰酶消化收集细胞，将细胞浓度稀释至10cells/ml，96孔板每孔100微升。

3 T7EN1酶切分析

收集剩余的转染后细胞，酚氯仿法提取细胞基因组，PCR扩增靶点，经T7EN1酶切，核酸电泳显示sgRNA产生有效切割。说明质粒共转染成功，可进行下一步的单克隆培养，见图5。

4阳性细胞筛选

TAP2细胞脂质体转染得70个细胞克隆，测序结果表明基因型发生改变的克隆有18个，见图6。

5 TA克隆验证

对测序结果表明基因型有变化的细胞株，进一步进行TA克隆验证，获得阳性单克隆株2株。分别是C18细胞株(-34bp，-82bp)和C30细胞株(-7bp)。C18细胞株(-34bp，-82bp)挑选15个克隆测序，获得有效结果11个。其中，C18-5、C18-11、C18-13测序峰图有杂峰，C18-14为空载体，见图7。

C30细胞株(-7bp)挑选12个克隆测序，获得有效结果8个。其中，C30-2、C30-12测序峰图有小杂峰。C30-6、C30-11为空载体，见图8。

最终选择C18细胞株进行后续TAP1基因敲除实验。

实施例3利用CRISPR/Cas9技术构建TAP1敲除的PK15细胞系

1 PUC57-sgRNA载体构建

(1)TAP1基因靶位点的设计与合成

通过NCBI中Ensembl数据库获得猪TAP1基因转录本信息，TAP1ENSSSCG00000025618，TAP1基因有2个转录本，分别是TAP1-201和TAP1-202。以TAP1基因的第二个外显子作为敲除序列，利用sgRNA预测网站(http://crispr.cos.uni-heidelberg.de)设计了4对寡核苷酸靶点识别序列。在4对寡核苷酸序列的上游引物的5＇端加上CACC，下游引物5＇端添加AAAC。4对sgRNA序列见表2。

表2 sgRNA序列

将4对设计好的sgRNA序列送至公司合成，将合成的sgRNA序列退火形成双链。sgRNA序列退火反应体系：在10μL体系中，olige1(10mmol/L)和olige2(10mmol/L)各加1μL，10×Ex taq buffer 1μL，DDH₂O 7μL。95℃水浴中反应5min，自然冷却至室温。

(2)pUC57-T7-sgRNA载体构建

用限制性核酸内切酶BsaI对pUC57-T7-sgRNA进行单酶切。酶切体系如下：在20μL反应体系中，10×Buffer2.1 2μL，pUC57-T7-sgRNA 1μg，Bsa I内切酶1μL，补足DDH₂O至体系20μL。体系混匀后，37℃作用2h，1.0％的琼脂糖凝胶电泳120V，25min，回收充分切开的pUC57-T7-gRNA载体。

(3)载体连接

将退火形成的4对双链寡核苷酸与pUC57-T7-sgRNA载体链接，将配置好的连接体系放入16℃低温水浴锅中，连接12h。连接体系如下：在10μL连接体系中，双链寡核苷酸序7μL，pUC57-T7-gRNA载体1μL，10×T4DNA buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL。

(4)质粒转化

将构建好的4个重组pUC57-T7-sgRNA质粒转化到TOP10感受态中，在37℃培养箱中培养过夜的平板长出很多单克隆菌落，用10μL枪头挑取单克隆菌落并加到5mL带有Kan抗性的LB培养基中，每个平板挑取4个菌落。将试管放到37℃摇床中180r/min，培养过夜。将过夜培养的菌液按照质粒提取试剂盒提供的碱裂解法提取质粒。

2引物的设计与合成

以TAP1基因的第二个外显子中设计的靶点左右两端各150bp左右设计引物扩增第二个外显子序列，引物如下所示：

TAP1_detect_F2：5′-TGGATAAGAGCAAGCCCACC-3′

TAP1_detect_R：5′-AGATGAAGTGTGGGGATACAAA-3′

3测序

将提取的4种pUC57-T7-sgRNA质粒分别进行测序，阳性克隆质粒分别命名为TAP1-sgRNA-1，TAP1-sgRNA-2，TAP1-sgRNA-3，TAP1-sgRNA-4，测定浓度后，-20℃保存备用。

4细胞转染

5 T7EN1酶切分析PUC57-sgRNA活性

①提取基因组

2)加450μL平衡酚，混匀，12000rpm离心10min，转移上层水相；

4)加入1/10体积3M乙酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积无水乙醇，混匀，置-20℃1h；

②以提取的基因组为模板，以TAP1_detect_F2/TAP1_detect_R作为引物对，PCR扩增靶点，在50ul体系中，添加10×Buffer 5ul，ddH2O 37.7ul，上下游引物各2ul(均为10μmol/L)，dNTPs 1μL(10mmol/L each)，DNA Polymerase(5U/μL,Vazyme Biotech)0.3ul，模板2μL。PCR程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，4个循环；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环。72℃总延伸7min。4℃保存。

③T7EN1错配酶酶切分析

细胞转染24h后，加入2mL PBS清洗细胞，重复一次，加入1.5mL 0.25％胰蛋白酶消化液消化15min，收集细胞，将细胞浓度稀释至7-8cell/mL，共10mL，接种至96孔板，每孔加入100μL培养基。细胞在96孔板中培养3天后，标记出96孔板中生长的单细胞，细胞在96孔板中培养8天后，标记的单克隆细胞形成细胞团，100μL PBS清洗单克隆细胞，加入30μL0.25％胰蛋白酶消化液原孔消化10min，并加入70μL含血清DMEM培养基重悬细胞并转移至24孔板中培养，培养8天左右，待细胞较多用200μL 0.25％胰蛋白酶消化液消化细胞15min重悬细胞，转入6孔板中继续扩大培养，3-4天细胞将铺满整个6孔板，消化细胞，一半细胞用于冻存，一般细胞提取基因组用于鉴定。用上述酚/氯仿法抽提细胞基因组，并通过核酸检测仪测定每管核酸浓度，PCR扩增目的基因并测序。

6单克隆敲除细胞系培养及TAP1基因型鉴定

7 TA克隆验证TAP1等位基因敲除细胞系

8 TAP1基因敲除单克隆细胞的冻存

用0.25％胰蛋白酶消化液消化TAP1基因敲除的单克隆PK15细胞15min，2mL正常DMEM培养基终止消化，并吹散成单个细胞，血细胞计数板计数，取1×10⁶个细胞用1mL冻存液重悬，4℃放置20min，转移到20℃放置2h，然后转到-80℃超低温冰箱，24h后转移到液氮中。最后得到的细胞即为TAP1和TAP2均敲除的sT2细胞系。

结果如下：

1 TAP1-sgRNA构建

将载体pUC57-T7-gRNA经过Bsa I酶切，然后分别与四种TAP1-sgRNA连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆、提取质粒及测序鉴定。阳性克隆质粒分别命名为TAP1-sgRNA-1，TAP1-sgRNA-2，TAP1-sgRNA-3，TAP1-sgRNA-4，测定浓度并调整为1μg/μL，-20℃保存备用。

2 PK15细胞中TAP1-sgRNA转染

取8μL Lip2000(Invitrogen)作为脂质体，将靶点载体及Cas9 Nickase表达质粒共4μg转染PK-15细胞，细胞转染24h后，胰酶消化收集细胞，将细胞浓度稀释至10cells/ml，96孔板每孔100微升。

3 T7EN1酶切分析

收集剩余的转染后细胞，酚氯仿法提取细胞基因组，PCR扩增靶点，经T7EN1酶切，核酸电泳显示sgRNA产生有效切割。说明质粒共转染成功，可进行下一步的单克隆培养，见图9。

4阳性细胞筛选

将筛选获得的单克隆细胞从96孔板开始，逐级进行扩大培养，直至转移到培养皿产生大量的培养细胞。酚氯仿法抽提技术提取基因组，进行PCR鉴定和序列测定。结果(见下图10)表明，靶向位点基因序列发生部分缺失，疑似获得阳性细胞株。5TA克隆验证

PCR产物连接至pMD19T载体，转化，挑选5个正反向测序，测序引物选用pMD19T上通用引物。结果显示，与野生型对照(TAP1 DETET NEW)相比，5个克隆的TAP1序列均发生缺失。5个克隆除了个别位点碱基有差异外，缺失区域非常一致。结果见图11。

进一步的多重序列比对，显示5个TAP1敲除克隆序列与野生型在聚类上明显分开，并呈现明显的基因缺失区域，见图12。

实施例4 sT2细胞系TAP1和TAP2缺失的再次验证

提取sT2细胞基因组，分别利用TAP2_detect_F/TAP2_detect_R和TAP1_detect_F2/TAP1_detect_R作为引物对，按照上述分别对应的PCR扩增条件扩增靶基因片段，并按照上述提供的TA克隆方法克隆靶基因，TAP2和TAP1各送7个克隆进行测序，序列分析验证测TAP2和TAP1基因敲除情况。

结果如下：

1 sT2细胞的培养

敲除TAP1和TAP2基因的细胞命名为sT2细胞，在正常的培养条件下传代3次，状态没有明显的变化，如图13所示。

2 sT2细胞TAP1和TAP2基因敲除的验证

将传代3次的sT2细胞提取基因组，分别利用TAP2_detect_F/TAP2_detect_R和TAP1_detect_F2/TAP1_detect_R作为引物对，PCR扩增分别扩增TAP2和TAP1靶基因区，并进行T-A克隆和测序。

2.1 TAP2基因敲除验证

测序结果拼接后显示：TAP2-6、TAP2-8和TAP2-10具有双向特殊结构，无法拼接。所以在比对过程中，舍弃TAP2-6、TAP2-8和TAP2-10。其他7个双向测序拼接结果与TAP2的检测结果比对，结果显示，与野生型细胞株的TAP2基因相比，7个克隆均显示了一定的缺失区域，尽管缺失区域不完全一致，但已经说明了TAP2基因缺失稳定保留，见图14。

2.2 TAP1基因敲除验证

PCR产物连接至pMD19T Simple载体，转化到Top 10感受态细胞中。挑选10个进行测序。测序结果中TAP1-X205测序无信号，测序结果经过拼接后TAP1-X201，203，204，206为空载体。所以选择其他5个拼接结果进行比对。序列比对结果显示，与野生型细胞株(TAP1-X2X3)相比，除个别位置存在碱基的突变外，其余位置均保持非常一致的缺失，说明TAP1基因的缺失稳定存在，见图15。

实施例5 PK15、sT2外源性抗原递呈能力检测

1.多肽表位合成

根据文献报道(Zhang et al.,2011)，猪SLA-I类分子存在一阳性结合多肽：ATAAATEAY，来自于Ebola virus vp35，氨基酸位置为155-163，序列由合肥国肽生物科技有限公司合成，纯度为90％以上，在本发明专利命名为EB155，作为阳性的外源性多肽，检测sT2细胞是否具有递呈外源性抗原多肽的能力。

2.sT2外源性抗原递呈能力检测

(1)选取状态较好的PK15、sT2，分别给2种细胞计数，均为4×106个细胞，于37℃、5％的CO2培养箱中培养12h后，分别给细胞中负载EB155肽类，浓度为50ug/mL，培养16h。同时设置对照组；

(2)孵育细胞后，从培养箱中取出细胞，预冷1×PBS洗涤2-3次(洗的时候小心，避免细胞表面的蛋白丢失)，消化收集细胞，计数后取1×106个细胞；

(3)4％多聚甲醛，室温固定20min，预冷1×PBS洗2次。然后用0.22μm微膜过滤的3％BSA室温封闭10min，1×PBS冲洗2次；

(4)向2个细胞中加入200μL 1:500倍1×PBS稀释的β2m单克隆抗体(3.5mg/mL,委托上海强耀生物科技有限公司)，4℃孵育1h，冷的1×PBS冲洗2-3次，除去未结合的特殊抗体。

(5)加入200μL 1:500倍1×PBS稀释的PE Rat anti-Mouse IgG溶液，室温下避光孵育1h，预冷1×PBS洗2次，加500μL 1×PBS重悬，过滤后用流式细胞仪进行检测。

结果如下：

EB155肽类作为PK15、sT2细胞系阳性肽，分别负载在2种细胞系中。实验组也设置了只染PE标记的IgG作为背景对照组，与单纯的PK15、sT2细胞没有差别，说明染色结果是通过PE与β2m单克隆抗体进行特异性结合的细胞流式检测结果。在PK15和sT2细胞系中，结果显示sT2细胞可以递呈外源性肽，与对照细胞相比较，差异显著。结果见图16所示。

根据SLA-I类分子抗原递呈机理，当抗原多肽被递呈到细胞表面时，就会形成由SLA-I重链、β2m轻链和抗原多肽形成的复合体，如果用β2m单抗进行流式检测，将会检测到较强的信号，反应到结果图上就会出现相对于对照细胞PK15,荧光信号峰图出现向右明显的偏移。本实验结果符合上述判断依据，说明在sT2细胞表面形成了SLA-I-肽-β2m的复合体；由于sT2细胞是敲除了TAP基因的细胞系，丧失了递呈内源性抗原的能力，从而可以证明st2细胞递呈的是外源性的多肽。最终证明本发明构建的sT2细胞可以用来筛选外源性的抗原多肽。