CN112480238B - 烟台黑猪sla-2基因真核表达细胞系的构建及表达 - Google Patents
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Abstract
烟台黑猪SLA‑2基因真核表达细胞系的构建及表达，属于基因领域。本发明选择烟台黑猪为研究对象，在实验室前期已经成功构建烟台黑猪SLA‑2‑YT/pMD18‑T全基因克隆表达载体的工作基础上，构建烟台黑猪SLA‑2‑YT编码区基因的真核表达载体，并使其在sT2细胞系中高度表达，为探究烟台黑猪SLA‑2‑YT基因的遗传特性、蛋白功能活性及表位递呈规律等奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于基因领域，具体涉及烟台黑猪SLA-2基因真核表达细胞系的构建及表达。
背景技术
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是染色体上由高度多态、紧密连锁的基因座位组成的一个遗传区域，上世纪40年代，Snell等人在对近交系小鼠进行免疫试验时首先发现了MHC基因，自此，与MHC相关的研究引起了科技工作者的兴趣[1]。MHC基因的编码产物分布于细胞膜上，是免疫系统中非常重要且极具多态性的一类细胞表面转膜蛋白，称为MHC抗原[2 , 3]，根据其分布区域、化学结构和功能的差异可分为3类，分别是MHC I、MHC II和MHC III。MHC广泛分布于几乎所有的脊椎动物体内，不同动物的MHC有不同的命名方法，猪的MHC也叫猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)。1970年，Vaiman等人[4-6]首次发现SLA，Viza等人[5]还发现SLA在抗原递呈、免疫应答等方面发挥重要作用。猪是接近人类的模式动物，因此引起了人们对SLA研究的极大兴趣[7,8]。深入研究SLA基因的表达和功能，不仅可以为异种移植治疗人类疾病提供可能，也为兽医临床领域的细胞免疫治疗、分子表位疫苗的研制提供理论基础。与人的MHC一样，SLA由3个基因簇组成，分别是SLAI、II、III。SLAI类分子包括重链和轻链，对猪的免疫系统至关重要[9]。轻链不具有多态性，只有一个等位基因β2m；重链具有多态性,包括胞内区、跨膜区、胞外区和信号肽四个区域，含有SLA-1、SLA-2和SLA-3三个功能性基因[10,11]，其中，SLA-2比SLA-1和SLA-3在信号肽的起始端多3个氨基酸，可在体外结合抗原。重链与轻链以非共价键结合构成SLAI类分子，在细胞内主要识别内源性抗原肽[12]，另外发现它也可以通过交叉递呈途径识别外源性抗原肽[13]。被识别的多肽与SLAI类分子的重链和轻链形成抗原肽-MHC分子复合物(pMHC)并被递呈到细胞表面，此三分子复合物进一步与CD8+T淋巴细胞表面的T细胞受体(Tcell receptor,TCR)结合，激活CD8+T淋巴细胞，使活化的CD8+T淋巴细胞转化为有细胞毒性的T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)，发挥毒性作用并对靶细胞造成杀伤，启动机体的细胞免疫应答[14]。据此，可以借助SLAI类分子来进行CTL多肽表位的筛选。由于SLAI类分子的重链极具多态性，如果猪的品系不同，其递呈外源性抗原肽的规律也会有差异，所以有必要建立不同品系猪SLA I类分子表位递呈规律的研究平台。烟台黑猪经过长期的自然选择和风土驯化，具有良好的种质特性，如适应性强、产仔数多、哺乳率高、抗病力强、耐粗饲、成熟早、风味独特、肉质细嫩等，是我国优良的地方猪种之一，保护并开发好地方猪品种，保护和利用好其宝贵的基因资源具有十分重要的意义[15,16]。SLA-2基因属于SLA-I类分子重要的功能基因，本实验室已完成烟台黑猪SLA-2基因克隆，姜巍、董宋鹏等人构建了烟台黑猪SLA-2基因的原核表达载体，并对其进行了诱导表达[17]。但是，目前烟台黑猪SLA-2基因真核表达研究尚未开展，其表位递呈规律研究平台也尚未建立。
参考文献：
[1]Snell G D.Methods for the study of histocompatibility genes[J].JGenet,1948,49(2):87-108.
[2]Kelley J,Walter L,Trowsdale J.Comparative genomics of majorhistocompatibility complexes[J].Immunogenetics,2005,56(10):683-695.
[3]林友福,俞耀飞,李金江,等.脊椎动物的主要组织相容性复合体基因研究进展[J].生物学教学,2018,43(08):9-10.
[4]Vaiman M,Renard C,Lafage P,et al.Evidence for a histocompatibilitysystem in swine(SLA)[J].Transplantation,1970,10(2):155-164.
[5]Viza D,Sugar J R,Binns R M.Lymphocyte stimulation in pigs:evidencefor the existence of a single major histocompatibility locus,PL-A[J].Nature,1970,227(5261):949-950.
[6]Vaiman M,Metzger J J,Renard C,et al.Immune response gene(s)controlling the humoral antilysozyme response(Ir-Lys)linked to the majorhistocompatibility complexSL-Ain the pig[J].Immunogenetics,1978,7(1):231-238.
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[9]Zhang N,Qi J,Feng S,et al.Crystal structure of swine majorhistocompatibility complex class I SLA-10401and identification of2009pandemic swine-origin influenza A H1N1 virus cytotoxic T lymphocyteepitope peptides[J].JVirol,2011,85(22):11709-11724.
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发明内容
针对上述不足本发明选择烟台黑猪为研究对象，在实验室前期已经成功构建烟台黑猪SLA-2-YT/pMD18-T全基因克隆表达载体的工作基础上，构建烟台黑猪SLA-2-YT编码区基因的真核表达载体，并使其在sT2细胞系中高度表达，为探究烟台黑猪SLA-2-YT基因的遗传特性、蛋白功能活性及表位递呈规律等奠定基础。
本发明烟台黑猪SLA-2基因真核表达细胞系的构建及表达步骤如下：
(1)引物的设计与合成；
(2)目的基因PCR扩增与DNA片段回收；
(3)烟台黑猪SLA-2编码区基因TA克隆载体的构建；
(4)烟台黑猪SLA-2编码区基因真核表达载体的构建；
(5)嘌呤霉素终浓度测定；
(6)慢病毒包装；
(7)慢病毒感染sT2细胞及抗性筛选；
(8)Western Blotting检测外源基因的表达；
(9)统计学处理。
有益效果：本发明成功构建了SLA-2-YT/pCDH重组真核表达载体，并成功转染至sT2细胞，使其在sT2细胞中高度表达，为研究外源SLA-2-YT在sT2细胞中的抗原递呈规律及CTL多肽表位筛选奠定了基础。
附图说明
图1为SLA-2-YT/pCDH重组表达质粒示意图。
图2为烟台黑猪SLA-2-YT基因CDS区PCR扩增与加尾。
图3为重组质粒SLA-2-YT/pMD19-T Simple双酶切鉴定。其中M:DNA Marker 2000；1-7:重组质粒SLA-2-YT/pMD19-T Simple双酶切产物。
图4为VectorNTI 11.5分析SLA-2-YT/pMD19-T Simple真核表达载体序列。
图5为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体回收图。其中M:DNA Marker 10000；1：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体经Xba I和Not I双酶切后的回收产物
图6为重组质粒SLA-2-YT/pCDH双酶切鉴定。其中M:DNA Marker 10000；1～3:重组质粒SLA-2-YT/pCDH双酶切产物
图7为嘌呤霉素作用于sT2细胞的致死浓度曲线。X轴为嘌呤霉素作用的浓度，Y轴不同浓度对应孔板中活细胞的数量
图8为光学显微镜下实验所用细胞及慢病毒感染后的细胞。其中A为PK15细胞，B为sT2细胞，C为转染空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的sT2细胞，D为转染SLA-2-YT/pCDH的sT2细胞。
图9为Western Blotting检测SLA-2-YT/pCDH在sT2细胞中的表达图。A为WesternBlotting检测结果；B为相对IOD值统计分析结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，主要材料、试剂与仪器如下：
(1)菌株、载体和细胞
烟台黑猪SLA-2-YT/pMD18-T菌种、psPAX2菌种、pMD2.G菌种由本实验室保存；pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro真核表达载体菌种购自中国上海思享生物科技有限公司；pMD19-TSimple Vector和Escherichia coli.Top10菌种购自宝生物工程(大连)有限公司；Stbl 3感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司；人胚胎肾上皮细胞(HEK-293T)由大连医科大学李文哲教授课题组惠赠；猪肾上皮细胞(PK15)购自中国兽医监测所微生物菌种保藏管理中心并由本实验室保存；sT2细胞由本实验室在前期工作中利用CRISPR/Cas9技术将PK15细胞的Tap转运蛋白基因(Tap1、Tap2)敲除后获得并保存。
(2)主要试剂
胰蛋白胨、氯化钠、酵母提取物、琼脂粉、琼脂糖、牛血清白蛋白V、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；Super-Fidelity DNA Polymerase、核酸染料Ultra Gelred Nucleic Acid Stain(10000×)购自诺唯赞有限公司；T4 DNA Ligase、DL 2000DNA Marker、dNTP、EcoR I限制性内切酶、Hind III限制性内切酶、Xba I限制性快速内切酶、Not I限制性快速内切酶、10×Loading Buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司；1kb DNA Ladder购于北京索莱宝科技有限公司；无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118，EndoFree Mini Plasmid Kit Ⅱ)购自天根生化科技(北京)有限公司；Lipoectine2000脂质体转染试剂购自诺唯赞有限公司；胎牛血清购自BI公司；DMEM高糖培养基、Opti-MEM培养基和0.25％胰蛋白酶消化液购自Gibco公司；细胞培养瓶、细胞培养皿购自NEST公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自宝生物(大连)有限公司；Western Blotting使用的0.45μmPVDF膜购自Millipore公司；小鼠SLA-1-HB01单克隆抗体由本实验室自制；GAPDH Mouse Monoclonal antibody(货号：60004-1-Ig)购自Proteintech公司；Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(货号：D110087)购自上海生工生物工程有限公司；通用型抗体稀释液和超敏ECL化学发光试剂盒购自新赛美生物科技有限公司；离心管、枪头等实验耗材均购自上海生工生物工程有限公司；其他常见的分子生物学试剂以及化学试剂都来自天津化学试剂有限公司和北京索莱宝科技有限公司。
(3)主要仪器
不同规格的移液器购自Eppendorf公司；梯度PCR仪购自基因有限公司；DYY-2C型电泳仪、DYCP-31DN型琼脂糖水平电泳仪、WD-9403C型紫外分析仪、DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪、DYCZ-40D型迷你转印电泳仪购自北京市六一仪器厂；高速离心机购自ThermoFisher SIENTIFIC；A2型二级生物安全柜(S系列)和/>二氧化碳培养箱(通用型)购自ESCO公司；GEAI1600系列超灵敏多功能成像仪购自通用电气公司。
实施例1
(1)引物的设计与合成
根据GeneBank数据库中烟台黑猪SLA-2-YT编码区(coding sequence,CDS)基因序列(GeneBank序列号:AB672508.1)，遵守引物设计原则，使用Vector NTI 11.5和Oligo 7软件，设计1对扩增烟台黑猪SLA-2基因编码区序列的特异性正、反向寡核苷酸引物(上下游引物)，根据pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的序列和结构特点，选择的限制性内切酶为：Xba I和Not I，在上下游引物的5’端分别添加酶切位点和保护性碱基，引物信息见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
表1 PCR引物信息
下划线：内切酶酶切位点；阴影：保护性碱基
(2)目的基因PCR扩增与DNA片段回收
以SLA-2-YT/pMD18-T质粒为模板，以pSLA-2-YT-F/pSLA-2-YT-R作引物，用Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶系统进行PCR，扩增SLA-2-YT编码区基因序列，PCR反应体系为：5×SF buffer(with 10mmol/L MgSO4)，5μL；dNTP Mix(10mmol/Leach)，1μL；SLA-2-YT/pMD18-T全基因质粒(提取后稀释30倍)，4μL；SLA-2-YT-F(25μmol/L)，1μL；SLA-2-YT-R(25μmol/L)，1μL；/>Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μL)，0.5μL；超纯水补足至25μL；PCR扩增程序为：95℃，预变性3min；95℃变性30s，66℃退火30s；72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃彻底延伸10min。PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪成像。确认目的条带的大小正确后，用DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收。由于用DNA聚合酶/>Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增的目的片段末端平滑化不易与pMD19-T Simple Vector连接，因此需要在回收后的PCR产物DNA双链的3’端分别添加PolyA尾(碱基“A”)，使其转变为粘性末端，反应液体系如下：10×Ex Taq buffer,5μL；dATP(10mmol/L),1μL；PCR回收产物，35μL；Ex Taq酶(5U/μL)，1μL，超纯水补足至50μL；条件为：72℃水浴15min。添加Poly A尾后的PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统成像，目的条带用DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收并保存回收产物。
(3)烟台黑猪SLA-2编码区基因TA克隆载体的构建
将回收的目的条带与pMD19-T Simple Vector连接，反应体系为：pMD 19-TSimple Vector，0.5μL；加PolyA尾回收产物，9.5μL；Solution I,10μL；条件为：16℃低温水浴2小时。将连接产物转化至Escherichia coli.Top10感受态细胞，涂平板，37℃过夜培养，挑取生长良好的重组单克隆菌落扩大培养后进行质粒提取，将提取的重组质粒用Not I/Xba I进行双酶切验证，选择初步鉴定正确的阳性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司测序。通过双向DNA测序确认插入序列的完整性后，将测序正确的阳性克隆菌株命名为SLA-2-YT/pMD 19-T Simple，并保存菌种供后期实验使用。
(4)烟台黑猪SLA-2编码区基因真核表达载体的构建
从超低温冰箱取出SLA-2-YT/pMD19-T Simple和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro菌种，经平板划线、挑取单菌落培养过后，用DNA质粒小提中量试剂盒提取质粒，并用琼脂糖凝胶电泳检测。对SLA-2-YT/pMD19-T Simple质粒进行Not I/Xba I双酶切处理，回收目的条带；对真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒(环状)同样进行Not I/Xba I双酶切处理，使载体线性化，并回收载体条带。将目的条带与载体条带用T4 DNA连接酶连接，反应体系为：目的条带，15μL(μg)；载体条带，0.5μL(μg)；超纯水，1.5μL；条件为：45℃水浴5min,立即冰浴2min.然后向反应液中加入10×T4 DNA Ligase Buffer,2μL；T4 DNALigase，1μL；混匀后在16℃低温水浴中过夜放置。连接产物转化至Stbl 3感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素(AMP+)的LB平板上，37℃过夜培养；然后挑取单菌落至AMP+LB液体培养基中，37℃振荡培养12h；培养的菌液提取质粒后利用双酶切鉴定真核重组DNA载体中是否携带插入片段；将初步鉴定正确的阳性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司测序，使用Vector NTI 11.5对DNA测序结果进行序列分析验证插入核苷酸序列的正确性。将测序正确的阳性重组菌株命名为SLA-2-YT/pCDH，重组质粒SLA-2-YT/pCDH图谱见图1。
(5)嘌呤霉素终浓度测定
复苏的sT2细胞传代两次待细胞状态稳定后，以每孔4×105个细胞铺24孔板，共铺33个孔，37℃CO2培养箱中培养至细胞融合率达到70％～80％时，每孔添加终浓度为0、5、10、15、30、60、90、200、300、500、1000μg/mL的嘌呤霉素，并将培养基补足至2mL，每个浓度重复3次，每2天使用含有对应浓度的嘌呤霉素的培养基对细胞进行换液，7天后可以杀死所有细胞的最低浓度即为筛选转染外源基因的sT2细胞的最佳嘌呤霉素终浓度。
(6)慢病毒包装
将冻存的HEK-293T细胞复苏，传代两次待细胞状态稳定后进行慢病毒包装前的细胞铺板，每个60mm培养皿接种1.5×106个细胞，待培养皿中的HEK-293T细胞融合率达到80～90％后，按照Lipoectine2000脂质体转染试剂的说明书将pCDH-CMV-MCS-EF1-Pruo质粒和SLA-2-YT/pCDH重组质粒分别转染到HEK-293T细胞中，放入37℃CO2培养箱中培养6h，去除培养皿中含转染试剂的培养基，更换为4mL新鲜的DMEM培养基，分别于更换培养基后48h、72h收集培养皿中的上清液，经3000rpm/min离心10min、0.22μm PVDF膜滤器过滤，根据文献测定并计算病毒滴度，将余留的病毒液冻存于超低温冰箱中，备用。
(7)慢病毒感染sT2细胞及抗性筛选
根据文献及最佳感染复数(multiple ofinfection,MOI)值计算公式：MOI值＝病毒滴度(TU/mL)×病毒体积(mL)/细胞个数，设定MOI值梯度为2.5、5、10、20、40、60，分别进行病毒感染预实验，确定感染sT2细胞的最佳MOI值范围。将冻存的sT2细胞复苏，传代2次后进行慢病毒感染前的细胞铺板，状态良好的细胞以每孔1.5×105个细胞接种于6孔板中，37℃CO2培养箱中培养12h至细胞完全贴壁，从超低温冰箱取出1.2.6中收集的病毒液于4℃解冻备用，参考最佳MOI值，将1.5mL病毒液与0.5mL DMEM培养基混匀后加入需感染的孔板中，同时在其中一个孔板中只加入2mL DMEM培养基，作为对照组，37℃CO2培养箱中培养；病毒感染24h后去除含病毒的培养基，更换为新鲜的DMEM培养基，继续在37℃CO2培养箱中培养；换液6～8h后，加入终浓度为30μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，待6孔板中细胞长满后传代至100mm细胞培养皿中继续培养至细胞长满，一部分细胞进行Western Blotting验证，另一部分细胞添加嘌呤霉素继续筛选，直到获得成功转染外源基因的单克隆细胞，扩大培养并命名为pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2，将部分细胞冻存于液氮罐中，备用。
(8)Western Blotting检测外源基因的表达
复苏PK15、sT2两个细胞株，传代两次待细胞状态稳定，使用RIPA细胞裂解液分别提取PK15、sT2和1.2.7中筛选得到的pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，然后将蛋白原液、超纯水和5×蛋白上样缓冲液按比例混匀后煮沸5～10min,制成终浓度为30μg/μL的蛋白溶液样品，分别取10μL样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后参考预染Marker进行切胶并将蛋白转印到PVDF膜上，转膜结束后，使用1×丽春红染液染色，确认转膜成功后参考预染Marker切割目的条带和内参GAPDH条带，用5％BSA溶液在室温下封闭1h，除去封闭液后，含目的条带的膜中加入稀释(视抗体推荐倍数稀释)的小鼠抗SLA-1-HB01单克隆抗体，含GAPDH条带的膜加入稀释的小鼠抗GAPDH单克隆抗体，室温孵育1h,再4℃孵育过夜，去除抗体溶液，用1×TBST溶液洗膜4次，每次5min,彻底洗去未与蛋白结合的一抗，分别加入稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1h，然后用1×TBST洗膜4次，每次5min,最后采用超敏ECL化学发光试剂盒进行显色，通过GEAI600多功能超灵敏成像仪进行显影成像，以检测sT2细胞中pCDH及SLA-2-YT-pCDH的表达量。
(9)统计学处理
采用Image J软件分析Western Blotting杂交条带的累积光密度值(IOD)，计算目的蛋白的相对光密度值(目的条带的IOD值与内参GAPDH的IOD值之比)，然后采用GraphPadPrism 8.0.1软件对数据进行单因素方差分析。
结果：
(1)烟台黑猪SLA-2-YT CDS区基因PCR扩增及加尾
利用引物pSLA-2-YT-F/pSLA-2-YT-R对烟台黑猪SLA-2-YT基因编码区进行PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳并回收，回收产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，经凝胶成像仪成像，结果(图2A)显示扩增的目的基因条带大小约为1100bp，与理论设计值1104bp相符，表明目的基因被成功扩增。PCR回收产物加PolyA尾并回收，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图2B)显示回收产物大小约1100bp，表明加PloyA尾产物也回收成功。
A为烟台黑猪SLA-2-YT基因CDS区PCR扩增产物的检测图，M：DNA Marker 2000；1：SLA-2-YT基因CDS区的PCR扩增产物，参照Marker可知目的条带大小约1100bp(理论设计值为1104bp)；B为PCR扩增产物加PolyA尾后的回收产物检测图，M：DNA Marker 2000；1：PCR扩增产物经加尾后的回收产物，参照Marker可知目的条带大小约为1100bp(理论设计值为1104bp)
(2)SLA-2-YT/pMD19-T Simple克隆表达载体鉴定
重组质粒SLA-2-YT/pMD19-T Simple限制性双酶切鉴定
利用Xba I、Not I限制性内切酶对SLA-2-YT/pMD19-T Simple质粒进行双酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测，根据结果(图3)可以看出：每个样品的泳道上均有两个条带，靠近点样孔端的条带为载体带，大小约为2692bp，离点样孔较远的条带为目的条带，大小约为1100bp，1～7号样品的载体条带大小正确，即1～7号样品可能为成功构建的克隆质粒，将对应的三个菌株送去生物公司测序，测序结果经分析后显示1、2号菌株的序列正确，即1、2号为成功构建的重组克隆表达菌株。
序列分析
SLA-2-YT/pMD19-T Simple经核酸序列测序后，用Vector NTI 11.5进行序列比对，结果(图4)显示SLA-2-YT/pMD19-T Simple重组克隆表达载体中插入的SLA-2-YT编码区基因序列与原序列100％同源,没有出现核苷酸突变。
(3)SLA-2-YT/pCDH真核表达载体鉴定
重组质粒SLA-2-YT/pCDH限制性双酶切鉴定
真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒首先经限制性内切酶Xba I、Not I双酶切后进行胶回收，0.8％琼脂糖凝胶电泳结果(图5)显示回收的条带大小约为7300bp，与理论值7384bp相符，表明载体回收成功。SLA-2-YT/Pmd 19-T Simple质粒经双酶切并回收目的基因后，与真核表达载体在T4 DNA Ligase的作用下连接，导入Stbl 3感受态细胞经转化、挑取单菌落扩大培养后，再次进行双酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图6)显示：每个样品的泳道上均有两个条带，靠近点样孔端的条带为载体带，大小约为7384bp，离点样孔较远的条带为目的条带，大小约为1100bp，1～3号样品的载体条带和目的条带的大小正确。为进一步确定目的基因与真核表达载体连接成功与否，将对应的3个菌株送去生物公司测序，测序结果经分析后显示2、3号菌株的序列正确，表明基因插入成功，即2、3号为成功构建的重组真核表达菌株。
序列分析
SLA-2-YT/pCDH进行核酸序列测定后，经VectorNTI 11.5进行序列比对，证实SLA-2-YT/pCDH重组真核表达载体中插入的SLA-2-YT编码区基因序列与原序列的同源性仍为100％，没有出现核苷酸突变，能够正确编码对应的蛋白。
(4)嘌呤霉素最佳浓度筛选
通过不同浓度的嘌呤霉素作用于转染的sT2细胞，168h后对存活细胞使用血球计数板计数。结果(图7)显示：不加嘌呤霉素的孔板内的细胞正常增殖，由于孔板底面积有限，细胞增殖数目受到限制；而添加了嘌呤霉素的孔板中的细胞增殖在不同程度上被抑制。各孔板中的细胞由于嘌呤霉素的浓度不断增大，出现了不同程度的死亡现象，直至500μg/mL对应孔板中细胞无存活。
(5)HEK-293T细胞慢病毒包装及感染sT2细胞
将携带SLA-2-YT的质粒和两种包装质粒共同转染HEK-293T细胞后，成功包装出慢病毒质粒。通过不同浓度的病毒液感染HEK-293T细胞，测得病毒滴度约为1×105TU/mL，通过设定MOI值梯度，用1.2.6中获得的慢病毒进行感染，通过显微镜每天多次观察细胞状态，确定慢病毒的最佳感染sT2细胞复数为20。另外，本研究涉及的猪肾上皮细胞(PK15细胞)、用于慢病毒感染的sT2细胞(Tap基因敲除的PK15细胞)，导入空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒的sT2细胞，导入SLA-2-YT/pCDH重组质粒的sT2细胞在光学显微镜下的形态如图8所示，可见这些细胞生长状态良好、相互之间的外观形态无明显区别。
(6)Western Blotting检测SLA-2-YT/pCDH表达
以PK15细胞系为阳性对照，转染空载体pCDH的sT2细胞为阴性对照，未转染SLA-2-YT/pCDH质粒的sT2细胞系为空白对照，通过Western Blotting实验检测SLA-2-YT/pCDH的表达情况。结果(图9)表明，筛选出的4株细胞，与sT2、pCDH/sT2相比较，3号细胞株的SLA-2-YT基因得到了高丰度表达，大小约为45kDa，与理论值相符。用Image J软件分析累积光密度值后计算目的蛋白的相对表达量，用GraphPad Prism 8.0.1作图并通过计算得出PK15细胞、sT2细胞、pCDH/sT2细胞、SLA-2-YT-pCDH/sT23号细胞株的相对表达量之间差异显著(P<0.01)。表明插入载体的SLA-2-YT已在sT2细胞中成功表达，且表达量较高。
本研究使用的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体是慢病毒载体系统，载体序列上有多个限制性内切酶位点，可在PCR引物上添加酶切位点利于目的基因与真核表达载体连接，它还具有氨苄青霉素抗性，筛选标记为嘌呤霉素，便于前期单克隆菌株的扩大培养和质粒转染后的细胞筛选；选择Stbl 3菌株作为真核表达载体的宿主菌，它是慢病毒载体系统优良的宿主菌株，其基因组中含有重组酶recA13突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率。MHC I类分子在体内负责将抗原多肽递呈到细胞表面进而激活T淋巴细胞。经典的抗原递呈理论认为外源性抗原被MHC II类分子递呈到细胞表面激活CD4+T淋巴细胞启动体液免疫；而内源性抗原被蛋白酶体水解以后经Tap转运蛋白运输到内质网中，与内质网中的MHC I类分子结合后，途径高尔基体被递呈到细胞表面，激活CD8+T淋巴细胞最终启动体液免疫。近年来，随着对MHC分子递呈过程的认识不断加深，发现外源性抗原不仅能与MHC II类分子结合，也可以被MHC I类分子递呈，此过程被称为交叉递呈途径。本研究用于转染的细胞是实验室前期利用基因编辑技术针对PK15细胞敲除了Tap转运蛋白基因(Tap1、Tap2)的sT2细胞，该细胞中需Tap转运蛋白参与递呈外源性抗原的胞质途径被阻断，将外源MHC I分子在此细胞内高度表达，可以在细胞水平上构建CTL多肽表位的快速筛选平台。本实验将编码烟台黑猪SLA Ⅰ类分子重链的基因SLA-2-YT编码区连接到真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro上，构建出SLA-2-YT/pCDH真核表达载体，并借助脂质体转染技术将其转染到sT2细胞中，再利用前期选择的真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro具有嘌呤霉素筛选标记这一特点，选择适宜浓度的嘌呤霉素对转染后的sT2细胞进行筛选，使烟台黑猪的MHC Ⅰ类分子在sT2细胞中高度表达，目的是建立外源SLA-2-YT在sT2细胞中的抗原递呈研究体系，为后续的抗原递呈及CTL多肽表位筛选提供细胞研究平台，以期尽快研制出能有效防治生猪疫病的多肽表位疫苗。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。
Claims (1)
1.烟台黑猪SLA-2基因真核表达细胞系的构建及表达，其特征在于，该方法的步骤如下：
(1)引物的设计与合成，其中选择的限制性内切酶为：Xba I和Not I，在上下游引物的5’端分别添加酶切位点和保护性碱基；
(2)目的基因PCR扩增与DNA片段回收，详细步骤为：以SLA-2-YT/pMD18-T质粒为模板，以pSLA-2-YT-F/pSLA-2-YT-R作引物，用Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶系统进行PCR，扩增SLA-2-YT编码区基因序列，PCR反应体系为：5×SF buffer，5μL；dNTPMix，1μL；SLA-2-YT/pMD18-T全基因质粒，4μL；SLA-2-YT-F，1μL；SLA-2-YT-R，1μL；/>Super-Fidelity DNA Polymerase，0.5μL；超纯水补足至25μL；PCR扩增程序为：95℃，预变性3min；95℃变性30s，66℃退火30s；72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃彻底延伸10min；PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪成像；确认目的条带的大小正确后，用DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收；由于用DNA聚合酶/>Super-FidelityDNAPolymerase进行PCR扩增的目的片段末端平滑化不易与pMD19-T Simple Vector连接，因此需要在回收后的PCR产物DNA双链的3’端分别添加PolyA尾，使其转变为粘性末端，反应液体系如下：10×Ex Taq buffer,5μL；dATP，1μL；PCR回收产物，35μL；Ex Taq酶，1μL，超纯水补足至50μL；条件为：72℃水浴15min；添加PolyA尾后的PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统成像，目的条带用DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收并保存回收产物，其中SLA-2-YT编码区基因序列见GeneBank，序列号为AB672508.1,pSLA-2-YT-F引物序列为GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC；pSLA-2-YT-R引物序列为GTTGCGGCCGCTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC；
(3)烟台黑猪SLA-2编码区基因TA克隆载体的构建，详细步骤为：将回收的目的条带与pMD19-T Simple Vector连接，反应体系为：pMD 19-T Simple Vector，0.5μL；加PolyA尾回收产物，9.5μL；Solution I,10μL；条件为：16℃低温水浴2小时；将连接产物转化至Escherichia coli.Top10感受态细胞，涂平板，37℃过夜培养，挑取生长良好的重组单克隆菌落扩大培养后进行质粒提取，将提取的重组质粒用Not I/Xba I进行双酶切验证，选择初步鉴定正确的阳性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司测序；通过双向DNA测序确认插入序列的完整性后，将测序正确的阳性克隆菌株命名为SLA-2-YT/pMD 19-T Simple，并保存菌种供后期实验使用；
(4)烟台黑猪SLA-2编码区基因真核表达载体的构建，详细步骤为：从超低温冰箱取出SLA-2-YT/pMD19-T Simple和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro菌种，经平板划线、挑取单菌落培养过后，用DNA质粒小提中量试剂盒提取质粒，并用琼脂糖凝胶电泳检测；对SLA-2-YT/pMD19-T Simple质粒进行Not I/Xba I双酶切处理，回收目的条带；对真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒同样进行Not I/Xba I双酶切处理，使载体线性化，并回收载体条带；将目的条带与载体条带用T4 DNA连接酶连接，反应体系为：目的条带，15μL；载体条带，0.5μL；超纯水，1.5μL；条件为：45℃水浴5min,立即冰浴2min.然后向反应液中加入10×T4DNALigase Buffer,2μL；T4 DNALigase，1μL；混匀后在16℃低温水浴中过夜放置；连接产物转化至Stbl 3感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养；然后挑取单菌落至AMP+LB液体培养基中，37℃振荡培养12h；培养的菌液提取质粒后利用双酶切鉴定真核重组DNA载体中是否携带插入片段；将初步鉴定正确的阳性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司测序，使用VectorNTI 11.5对DNA测序结果进行序列分析验证插入核苷酸序列的正确性；
(5)嘌呤霉素终浓度测定，详细步骤为：复苏的sT2细胞传代两次待细胞状态稳定后，以每孔4×105个细胞铺24孔板，共铺33个孔，37℃CO2培养箱中培养至细胞融合率达到70％～80％时，每孔添加终浓度为0、5、10、15、30、60、90、200、300、500、1000μg/mL的嘌呤霉素，并将培养基补足至2mL，每个浓度重复3次，每2天使用含有对应浓度的嘌呤霉素的培养基对细胞进行换液，7天后可以杀死所有细胞的最低浓度即为筛选转染外源基因的sT2细胞的最佳嘌呤霉素终浓度，其中sT2细胞是采用CRISPR/Cas9技术将PK15细胞的Tap1、Tap2敲除后获得；
(6)慢病毒包装，详细步骤为：将冻存的HEK-293T细胞复苏，传代两次待细胞状态稳定后进行慢病毒包装前的细胞铺板，每个60mm培养皿接种1.5×106个细胞，待培养皿中的HEK-293T细胞融合率达到80～90％后，按照Lipoectine2000脂质体转染试剂的说明书将pCDH-CMV-MCS-EF1-Pruo质粒和SLA-2-YT/pCDH重组质粒分别转染到HEK-293T细胞中，放入37℃CO2培养箱中培养6h，去除培养皿中含转染试剂的培养基，更换为4mL新鲜的DMEM培养基，分别于更换培养基后48h、72h收集培养皿中的上清液，经3000rpm/min离心10min、0.22μm PVDF膜滤器过滤，根据文献测定并计算病毒滴度，将余留的病毒液冻存于超低温冰箱中，备用；
(7)慢病毒感染sT2细胞及抗性筛选，详细步骤为：设定MOI值梯度为2.5、5、10、20、40、60，分别进行病毒感染预实验，确定感染sT2细胞的最佳MOI值范围；将冻存的sT2细胞复苏，传代2次后进行慢病毒感染前的细胞铺板，状态良好的细胞以每孔1.5×105个细胞接种于6孔板中，37℃CO2培养箱中培养12h至细胞完全贴壁，从超低温冰箱取出1.2.6中收集的病毒液于4℃解冻备用，参考最佳MOI值，将1.5mL病毒液与0.5mL DMEM培养基混匀后加入需感染的孔板中，同时在其中一个孔板中只加入2mLDMEM培养基，作为对照组，37℃CO2培养箱中培养；病毒感染24h后去除含病毒的培养基，更换为新鲜的DMEM培养基，继续在37℃CO2培养箱中培养；换液6～8h后，加入终浓度为30μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，待6孔板中细胞长满后传代至100mm细胞培养皿中继续培养至细胞长满，一部分细胞进行Western Blotting验证，另一部分细胞添加嘌呤霉素继续筛选，直到获得成功转染外源基因的单克隆细胞，扩大培养并命名为pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2，将部分细胞冻存于液氮罐中，备用；
(8)Western Blotting检测外源基因的表达，详细步骤为：复苏PK15、sT2两个细胞株，传代两次待细胞状态稳定，使用RIPA细胞裂解液分别提取PK15、sT2和1.2.7中筛选得到的pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，然后将蛋白原液、超纯水和5×蛋白上样缓冲液按比例混匀后煮沸5～10min,制成终浓度为30μg/μL的蛋白溶液样品，分别取10μL样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后参考预染Marker进行切胶并将蛋白转印到PVDF膜上，转膜结束后，使用1×丽春红染液染色，确认转膜成功后参考预染Marker切割目的条带和内参GAPDH条带，用5％BSA溶液在室温下封闭1h，除去封闭液后，含目的条带的膜中加入稀释的小鼠抗SLA-1-HB01单克隆抗体，含GAPDH条带的膜加入稀释的小鼠抗GAPDH单克隆抗体，室温孵育1h,再4℃孵育过夜，去除抗体溶液，用1×TBST溶液洗膜4次，每次5min,彻底洗去未与蛋白结合的一抗，分别加入稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1h，然后用1×TBST洗膜4次，每次5min,最后采用超敏ECL化学发光试剂盒进行显色，通过GE AI600多功能超灵敏成像仪进行显影成像，以检测sT2细胞中pCDH及SLA-2-YT-pCDH的表达量；
(9)统计学处理，详细步骤为：采用Image J软件分析Western Blotting杂交条带的累积光密度值，计算目的蛋白的相对光密度值，然后采用GraphPad Prism 8.0.1软件对数据进行单因素方差分析。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Gao Fengshan Inventor before: Gao Fengshan Inventor before: Hu Xiao |
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| GR01 | Patent grant | ||
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