CN105087620B - 一种过表达猪共刺激受体4‑1bb载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种过表达猪共刺激受体4‑1BB载体及其应用。PCR扩增rosa26基因内含子1左右同源臂，4‑1BB调控序列，OCT4特异启动子；将同源左臂、4‑1BB表达框、含LoxP位点的Cre、Neo表达框、同源右臂、负筛选DTA依次连接，得到4‑1BB同源重组载体p4BOCNDR。将该载体与含特异性靶向猪rosa26基因内含子1的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体共转入猪胎儿成纤维细胞中，以阳性细胞为供体细胞，卵母细胞为受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠获得在rosa26基因第一内含子定点整合有4‑1BB基因且自动删除标记基因的转基因猪。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统进行的4-1BB基因修饰方法以及4-1BB转基因猪的制备方法。
背景技术
哺乳动物及其它脊椎动物在应对外界各种病原微生物侵袭及排除异物维持自身平衡的过程中，逐渐形成了强有力的免疫保护屏障。包括体液免疫和细胞免疫。T细胞是大多数免疫反应的核心。识别特异性抗原后，T细胞被活化、增殖、分化，从而具有效应功能或辅助作用。初始T细胞的活化需要来自抗原递呈细胞的两种刺激信号。第一种是TCR/CD3与抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APCs)表面特异的MHC-抗原肽复合物结合产生的特异性的抗原刺激信号；第二种是由T细胞表面的共刺激受体分子和抗原递呈细胞(APCs)表面相应的配体结合产生的非特异性的刺激信号。如果缺失第二种信号，TCR与抗原肽的识别通常导致T细胞的凋亡或无能状态(Anergy)。
4-1BB存在于初始CD4+T和CD8+T细胞表面，与APCs表面的4-1BBL配体结合，为T细胞的存活、增殖与分化提供重要的共刺激信号。研究表明，4-1BB信号途径不仅能够有效诱导T细胞介导抗肿瘤，控制病毒感染，而且在调节自身免疫性疾病、移植排斥反应以及炎症反应等方面发挥重要作用。此外，基于小鼠和猪模型发现，4-1BB在体外、体内均能够刺激T细胞的激活、增殖和效应功能，是潜在的广谱抗病基因。
作为养猪大国，猪病疫情严重制约了养猪企业的扩张与发展。在我国，猪场常发的传染性疾病，如蓝耳病、猪圆环病毒Ⅱ型感染、猪流感、猪瘟、猪气喘病、猪大肠杆菌病和猪附红细胞体病等，给养猪业造成极大的危害。然而，我国猪用疫苗的应用尚存在许多问题，如副反应较大，免疫效果不理想等。而4-1BB的生物学功能，提示可以通过转基因的手段增强猪群的抗病能力。
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒。CRISPR/Cas系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效。2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂(double strandbreak,DSB),细胞可通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)进行修复，导致基因发生移码突变，丧失功能。除此之外，该系统还能与同源重组载体、寡聚核苷酸共同作用，使靶基因发生高效的精确修饰。2014年，Scott JG等利用CRISPR/Cas介导的同源重组在斑马鱼上实现了基因的替换。Hui Yang等利用相同的策略一步获得了带有报告基因的小鼠。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研究、疾病模型、基因治疗等领域得到广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种过表达4-1BB基因的同源重组载体及其应用，即通过基因工程手段增加宿主4-1BB基因的拷贝数，从而降低T细胞活化的阈值，增强T细胞的效应功能，达到广谱抗病效果。
本发明的另一目的是利用CRISPR-Cas9系统介导同源重组4-1BB基因修饰以获得4-1BB转基因抗病猪。
本发明提供的一种4-1BB基因的同源重组载体，通过以下方法制备得到：以目标生物基因组为模板，PCR扩增左右同源臂，4-1BB表达框，胚胎期特异性调控元件OCT4；将同源左臂、4-1BB表达框、含LoxP位点的OCT4调控的Cre表达框和Neo表达框、同源右臂、负筛选DTA依次连接，得到4-1BB同源重组载体。
进一步地，本发明提供的4-1BB基因的同源重组载体，其目标生物为猪；通过以下步骤制备得到：
(1)以pd2EYFP-N1为载体骨架，利用NdeI和KpnI插入猪rosa26基因内含子1的同源左臂，同时引入EcoRv酶切位点；
(2)利用EcoRV和KpnI插入4-1BB表达框；
(3)利用EcoRI和NotI将Neo表达框与Cre基因连接起来，再利用NdeI和NotI将其连在OCT4启动子下游，组成LoxP-OCT4-Cre-3’utr-SV40-Neo-3’utr-LoxP，利用KpnI和NotI将上述双框连到含4-1BB的骨架载体上，同时引入AscI酶切位点；
(4)利用AscI和PacI插入猪rosa26基因内含子1的同源右臂；
(5)利用PacI和NotI插入DTA表达框，构建成p4BOCNDR同源重组载体。
在p4BOCNDR同源重组载体中，4B代表猪共刺激受体分子4-1BB基因；O代表猪早期胚胎发育转录因子OCT4的特异性启动子；C代表编码重组酶Cre基因；N代表真核细胞常用的药物筛选标记基因Neo；D代表负筛选白喉毒素A基因DTA；R代表插入位点rosa26基因。
所述同源左臂为猪基因组rosa26位点内含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；
所述同源右臂是rosa26位点内含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述4-1BB表达框的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述Cre表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，由胚胎期特异性启动子OCT4调控。
Neo为正筛选标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述DTA为负筛选标记，如SEQ ID NO.6所示。
本发明的4-1BB基因的同源重组载体，用于PCR扩增猪rosa26基因内含子1的同源左臂的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；
用于PCR扩增猪rosa26基因内含子1的同源右臂的引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.9-10所示；
用于PCR扩增4-1BB表达框的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示；
用于PCR扩增OCT4启动子的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示；
用于PCR扩增Cre的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示。
用于PCR扩增Neo的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示；
用于PCR扩增DTA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19-20所示。
本发明提供了同源重组载体p4BOCNDR在制备抗病转基因猪中的应用。
本发明提供了特异性靶向猪rosa26基因内含子1的sgRNA，其DNA序列如SEQ IDNO.21所示或如SEQ ID NO.22所示。二者为互补配对的寡聚核苷酸。
本发明提供了含有上述sgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体。
本发明的含有上述CRISPR/Cas9打靶载体，其通过以下方法制备得到，将SEQ IDNO.21、22所示的寡聚核苷酸在94℃，5min，再37℃，10min，然后4℃，5min；pX330骨架载体用限制性内切酶Bbs Ⅰ进行酶切过夜，回收后，与退火的寡聚核苷酸连接。
进一步地，本发明提供了一种4-1BB转基因猪的制备方法，将本发明的4-1BB基因的同源重组载体与本发明的含有上述的sgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体共转入猪胎儿成纤维细胞中，获得经鉴定为定点整合4-1BB基因的阳性细胞；以阳性细胞为核移植供体细胞，卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠获得在rosa26基因第一个内含子定点整合有4-1BB基因且自动删除标记基因的转基因猪。
上述方法中，鉴定定点整合4-1BB基因的阳性细胞的PCR方法使用的引物为：
短臂引物SF：5’-CGCACCCTTACCTTGTCCCA-3’(SEQ ID NO.23)，该引物位于同源臂上游；短臂引物SR：5’-GAAGGTGGGATGGAGGGTGA-3’(SEQ ID NO.24)，该引物位于4-1BB启动子上，PCR产物大小为2500bp。
长臂引物LF：5’-ACCGCTTCCTCGTGCTTTAC-3’(SEQ ID NO.25)，该引物位于Neo基因上；长臂引物LR：5’-AGCTGCCTCCTGTGATTACC-3’(SEQ ID NO.26)，该引物位于同源臂下游，PCR产物大小为8000bp。
本发明首次利用CRISPR/Cas9技术介导4-1BB基因同源重组，增加宿主4-1BB基因的拷贝数，从而降低宿主T细胞活化的阈值，增强T细胞的效应功能。该方法成本低，大幅缩短获得纯合子猪的时间，并保证目的基因表达不受基因编辑的影响，为利用CRISPR/Cas9技术介导4-1BB同源重组进行基因功能研究及动物疾病模型建立奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例2中CRISPR/Cas9打靶载体构建过程。
图2为本发明实施例3中4-1BB转基因猪胎儿成纤维细胞筛选。
图3为本发明实施例3中阳性细胞单克隆PCR鉴定引物设计策略。
图4为本发明实施例3中阳性细胞单克隆短臂PCR鉴定结果，图中M为DNA MARKER:D2000plus DNA Ladder，N为阴性对照，P为阳性细胞单克隆短臂PCR鉴定结果。
图5为本发明实施例3中阳性细胞单克隆长臂PCR鉴定结果，图中M为DNA MARKER:D2000plus DNA Ladder，N为阴性对照，P为阳性细胞单克隆长臂PCR鉴定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 4-1BB同源重组载体的构建
构建4-1BB同源重组载体的步骤，包括以目标生物基因组为模板，PCR扩增左右同源臂，4-1BB调控序列，胚胎期特异性调控元件OCT4。将同源左臂、4-1BB表达框、含LoxP位点的Cre、Neo表达框、同源右臂、负筛选DTA依次连接，形成4-1BB同源重组载体p4BOCNDR。具体构建过程如下：
取生产性能测定优良的约克夏猪耳组织，采用组织块接种法建立猪成纤维细胞系，命名为YKX001，常规细胞传代以及冷冻保存。细胞培养、传代和冻存方法详见《精编细胞生物学实验指南》(J.S.博尼费斯农等著，章静波等译，2007年，科学出版社)。
同源左臂(5’arm)扩增：利用已公布的猪基因组序列(GenBank：NW_003612282)，设计同源左臂扩增引物，5-F：5’-TATCATATGTCGTTTGTTACGCTGGAAGGGGAAG-3’(SEQ ID NO.7)，下划线部分为NdeI限制性内切酶；5-R：5’-TATTACGTACTACGATATCGCTTAGGTGTTGCCTGGACTCATTTCC-3’(SEQ ID NO.8)，下划线部分依次为SnaBI和EcoRV限制性内切酶。提取上述成纤维细胞系YKX001基因组DNA，以其为模板，扩增同源左臂。PCR产物为rosa26基因内含子1中一段长度为1197bp的序列，作为同源左臂(具体序列见SEQ ID NO.1)。
同源右臂(3’arm)扩增：按照上述方法设计引物，3-F：5’-TATGGCGCGCCACTGCGATTGGACCTGAGG-3’(SEQ ID NO.9)，下划线部分为AscI限制性内切酶；3-R：5’-TATGCGGCCGCATGGTTAATTAAGGGACAGTACTGATAGTCAGCCTCTTGC-3’(SEQ ID NO.10)，下划线部分依次为NotI和PacI内切酶。PCR产物为rosa26基因内含子1中一段长度为6395bp的序列，作为同源右臂(具体序列见SEQ ID NO.2)。
4-1BB表达框扩增：4-F：5’-TATGATATCCGGACGATCTGTCTACAACCCACAC-3’(SEQ IDNO.11)，下划线部分为EcoRV限制性内切酶；4-R：5’-TATGGCGCGCCAATTTAGGTACCGTTAGGTGCTCCACGAAAAACTGC-3’(SEQ ID NO.12)，下划线部分依次为AscI和KpnI限制性内切酶(4-1BB表达框具体序列见SEQ ID NO.3)。
OCT4启动子扩增：利用已公布的猪OCT4调控序列，设计引物并添加上LoxP序列，O-F：5’-TATGGTACCGCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGTGGTTCAGCGGTAATGAACC-3’(SEQ ID NO.13)，下划线部分为KpnI限制性内切酶，粗体部分为LoxP序列；O-R：5’-TATGCGGCCGCAAATTTGGCGCGCCAAATTTCATATGAGAAGGCGAAGTCGGAAGCCAGGTG-3’(SEQ IDNO.14)，下划线部分依次为NotI，AscI和NdeI限制性内切酶。PCR产物为3475bp序列。
Cre扩增(含3’调控元件)：C-F：5’-TATCATATGATGCCCAAGAAGAAGAGGAAGG-3’(SEQID NO.15)，下划线部分为NdeI内切酶；C-R：5’-TATGGCGCGCCAATTGAATTCCTAATCGCCATCTTCCAGCAGGC-3’(SEQ ID NO.16)，下划线部分为AscI和EcoRI内切酶。
Neo表达框扩增：N-F：5’-TATGAATTCGCGACTCTAGATCATAATCAGC-3’(SEQ IDNO.17)，下划线部分为EcoRI内切酶；N-R：5’-TATGGCGCGCCGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCAACACCGTGCGTTTTATTCTGTC-3’(SEQID NO.18)，下划线部分为AscI内切酶，粗体是LoxP位点。
DTA表达框扩增：D-F：5’-TGTTAATTAAAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTC-3’(SEQID NO.19)，下划线部分是PacI内切酶；D-R：5’-TATGCGGCCGCGGTACCGCCTCAGAAGCCATAGAGC-3’(SEQ ID NO.20)，下划线部分是NotI内切酶。
以pd2EYFP-N1为载体骨架，第一步利用NdeI和KpnI插入同源左臂5’arm，同时引入EcoRv酶切位点；第二步利用EcoRV和KpnI插入4-1BB表达框；第三步先利用EcoRI和NotI将Neo表达框与Cre基因连接起来，再利用NdeI和NotI将其连在OCT4启动子下游，组成LoxP-OCT4-Cre-3’utr-SV40-Neo-3’utr-LoxP，利用KpnI和NotI将上述双框连到含4-1BB的骨架载体上，同时引入AscI酶切位点；第四步利用AscI和PacI插入同源右臂3’arm；第五步利用PacI和NotI插入DTA表达框，构建成p4BOCNDR同源重组载体。测序验证其正确后，扩大培养，去内毒素大提。
实施例2 CRISPR/Cas9打靶载体的构建
根据CRISPR靶序列设计网站(http://crispr.genome-engineering.org/)对猪rosa26位点第一内含子的打靶位点进行预测分析。从候选靶位点中选出一个评分最高的序列，命名为target1。其序列和反向互补序列分别是TCCAGTCCCAGACATAGCAT(SEQ ID NO.21)和ATGCTATGTCTGGGACTGGA(SEQ ID NO.22)，分别合成互补配对的寡居核苷酸。如表1所示，其中下划线为酶切位点。
表1寡聚核苷酸序列
将合成的一对寡聚核苷酸序列稀释至100μM，按10μL反应体系，分别取1μL，加入10×PCR buffer，混匀，退火处理，94℃，5min；37℃，10min；4℃，5min。得到的退火产物即可与BbsI酶切过的pX330骨架连接。常规转化方法参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克著，黄培堂译，2002年，化学工业出版社)。
表2退火反应体系
挑取单克隆，测序验证其正确后，扩大培养，去内毒素大提。CRISPR/Cas9打靶载体构建过程如图1所示。
实施例3 4-1BB转基因细胞系的制备与鉴定
选用性别为公的50日胎龄的约克夏猪皮肤成纤维细胞系，细胞复苏、培养和传代参照《精编细胞生物学实验指南》(J.S.博尼费斯农等著，章静波等译，2007年，科学出版社)。待细胞生长汇合至80％左右，消化收集细胞(约1×106个)，加入实施例1和2中构建的载体各2μg和100μL Nucleofector试剂混匀，加入电击杯中，用A-024程序进行电击转染。然后按1:20接种至10cm培养皿中，37.5℃，5％CO2培养箱中培养。24h后更换含500μg/mL G418的完全培养基(10％FBS+DMEM)，每3～4天换液一次，96h后G418浓度增加到800μg/mL。培养至第8天可见克隆点形成。第10～11天镜下标记克隆点位置，用细胞克隆环将其消化，接种到24孔板。待其汇合度达90％，消化细胞，一部分留在原孔继续培养用于鉴定其整合位点，另一部分接种到6孔板用于细胞冻存。筛选过程如图2所示。
对所得到的40个细胞克隆进行鉴定：
PCR鉴定引物设计策略见图3。短臂引物SF：5’-CGCACCCTTACCTTGTCCCA-3’，该引物位于同源臂上游；短臂引物SR：5’-GAAGGTGGGATGGAGGGTGA-3’，该引物位于4-1BB启动子上，PCR产物大小为2500bp。长臂引物LF：5’-ACCGCTTCCTCGTGCTTTAC-3’，该引物位于Neo基因上；长臂引物LR：5’-AGCTGCCTCCTGTGATTACC-3’，该引物位于同源臂下游，PCR产物大小为8000bp。消化24孔板单克隆细胞，提取基因组，以野生型猪成纤维细胞基因组为阴性对照，用KOD聚合酶对长、短臂进行扩增，0.8％琼脂糖电泳检测结果。PCR鉴定结果分别如图4、图5所示。其中阳性克隆为1个，状态良好，适宜做核移植供体细胞。
实施例4核移植胚胎构建及转基因猪的制备
克隆胚胎的构建与移植方法参照李秋艳(2008)、李俊(2010)等人的博士论文中的描述。具体如下：
1.猪卵母细胞体外成熟
从屠宰场取卵巢，放入28℃～35℃含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，在2h内运回实验室，用配有18号针头的20mL注射器抽吸卵巢上3～6mm的卵泡。将抽取液放入50mL离心管，37℃静置15min去上清，加入冲卵液PVA-DPBS重悬沉淀，静置15min，去上清。将重悬液加入直径60mm塑料培养皿中，在体式显微镜下，用口吸管挑选胞质均匀，卵丘致密且包裹2层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs)，用成熟培养液洗涤3次，转入在培养箱中已平衡2h以上的培养液滴内(每100液滴放25枚)。用胚胎级矿物油覆盖，置于39℃，5％CO2，100％湿度的培养箱培养42～44h。
2.体细胞准备
利用血清饥饿法，将实施例3中获得的打靶阳性细胞待其生长至80％汇合时，进行血清饥饿处理，即把培养液中的FBS浓度从20％降至0.5％继续培养2～5天，常规消化，离心洗涤，最后加1mL显微操作液重悬细胞沉淀备用。
3.卵母细胞去核与核移植
利用盲吸法进行成熟卵母细胞去核，把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入39℃，5％CO2，100％湿度的培养箱平衡10min，然后在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜上用固定吸管吸持卵母细胞，用去核/注射针吸取第一极体及其附近可能含有卵母细胞核的胞质。然后挑选折光性强、表面光滑的体细胞，从去核时裂口处放入卵周隙，用注射针点压透明带。每批操作30个卵母细胞，结束后将供体细胞-卵胞质构成的重构卵转移到培养液PZM3中，在39℃，5％CO2，100％湿度的培养箱中恢复1h。
4.融合与激活
将恢复好的重构卵转移到融合液中平衡2min，用融合/激活液洗涤3遍，每批5～8个放入已经铺满融合液的融合槽中，使供体细胞—受体卵细胞膜接触面与电极平行，100μs，1.4kv/cm的直流电脉冲诱导融合，用PZM3培养液洗涤3遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，放入39℃，5％CO2，100％湿度培养箱中培养4h，在体视显微镜下判定融合。
5.胚胎培养
将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍，转入预平衡2h以上的胚胎培养液PZM3中，在39℃，5％CO2，90％N2，饱和湿度条件下培养至48h和168h时，记录卵裂和囊胚情况。
6.胚胎移植
用公猪试情结合压背反应，挑选自然发情母猪。用刀片将手术切口部位(尾部倒数第2对和第3对乳头之间)的毛刮干净，用碘酒棉球消毒2min，再用酒精棉球脱碘。铺上创巾，沿腹中线方向切开7～10cm的切口，钝性分离肌肉组织和脂肪组织。用两把止血钳固定住腹膜后，在之间将腹膜切开，用手指将子宫夹出，并导出卵巢查看排卵情况。同时，将克隆胚胎从保温箱中取出，在显微镜下，将胚胎转移至胚胎移植管中，尽量少带培养液。然后将胚胎移植管从输卵管伞口探入输卵管至少5cm大致壶腹-峡部结合处，将克隆胚胎缓慢注射到输卵管中。将子宫和输卵管回位，分别对腹膜、白膜、肌肉层和皮层进行缝合，并用碘酒消毒伤口。术后第10天，肌肉注射800IU hGG，第13天注射500IU PMSG。30天后，B超检测是否妊娠。
克隆猪出生后，采用实施例3中的PCR方法对克隆猪进行鉴定，确定其为4-1BB转基因猪。
上述结果表明，本发明已成功获得上调表达共刺激受体4-1BB分子转基因猪。本发明提供的4-1BB转基因猪，其T淋巴细胞高表达4-1BB受体，可以增强在受到抗原刺激时的活化、增殖和效应功能，进而增强宿主的适应性免疫应答，增强疫苗免疫效果。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种4-1BB基因的同源重组载体，其特征在于，通过以下方法制备得到：以目标生物基因组为模板，PCR扩增左右同源臂，4-1BB表达框，胚胎期特异性调控元件OCT4；将同源左臂、4-1BB表达框、含LoxP位点的OCT4调控的Cre表达框和Neo表达框、同源右臂、负筛选DTA依次连接，得到4-1BB同源重组载体。
2.如权利要求1所述的同源重组载体，其特征在于，所述的目标生物为猪；通过以下步骤制备得到：
(1)以pd2EYFP-N1为载体骨架，利用NdeI和KpnI插入猪rosa26基因内含子1的同源左臂，同时引入EcoRv酶切位点；
(2)利用EcoRV和KpnI插入4-1BB表达框；
(3)利用EcoRI和NotI将Neo表达框与Cre基因连接起来，再利用NdeI和NotI将其连在OCT4启动子下游，组成LoxP-OCT4-Cre-3’utr-SV40-Neo-3’utr-LoxP，利用KpnI和NotI将上述双框连到含4-1BB的骨架载体上，同时引入AscI酶切位点；
(4)利用AscI和PacI插入猪rosa26基因内含子1的同源右臂；
(5)利用PacI和NotI插入DTA表达框，构建成p4BOCNDR同源重组载体。
3.如权利要求2所述的同源重组载体，其特征在于，所述同源左臂为猪基因组rosa26位点内含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述同源右臂是rosa26位点内含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述4-1BB表达框的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述Cre表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，由胚胎期特异性启动子OCT4调控。
4.如权利要求2所述的同源重组载体，其特征在于，Neo为正筛选标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述DTA为负筛选标记，如SEQ ID NO.6所示。
5.如权利要求3所述的同源重组载体，其特征在于，用于PCR扩增猪rosa26基因内含子1的同源左臂的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；
用于PCR扩增猪rosa26基因内含子1的同源右臂的引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.9-10所示；
用于PCR扩增4-1BB表达框的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示；
用于PCR扩增OCT4启动子的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示；
用于PCR扩增Cre的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示。
6.权利要求1-4任一所述的同源重组载体在制备抗病转基因猪中的应用。
7.特异性靶向猪rosa26基因内含子1的sgRNA，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO.21所示或如SEQ ID NO.22所示。
8.含有权利要求7所述sgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体。
9.如权利要求8所述的CRISPR/Cas9打靶载体，其通过以下方法制备得到，将SEQ IDNO.21、22所示的寡聚核苷酸在94℃，5min，再37℃，10min，然后4℃，5min；pX330骨架载体用限制性内切酶BbsⅠ进行酶切过夜，回收后，与退火的寡聚核苷酸连接。
10.一种4-1BB转基因猪的制备方法，其特征在于，将权利要求1-5任一所述的4-1BB基因的同源重组载体与权利要求8-9任一所述的CRISPR/Cas9打靶载体共转入猪胎儿成纤维细胞中，获得经鉴定为定点整合4-1BB基因的阳性细胞；以阳性细胞为核移植供体细胞，卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠获得在rosa26基因第一个内含子定点整合有4-1BB基因且自动删除标记基因的转基因猪。
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