CN104651402A

CN104651402A - 通用型基因打靶载体

Info

Publication number: CN104651402A
Application number: CN201510118781.9A
Authority: CN
Inventors: 毕延震; 郑新民; 华再东; 任红艳; 张立苹; 刘西梅; 华文君; 李莉; 肖红卫; 魏庆信
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2035-03-18
Also published as: CN104651402B

Abstract

本发明公开了一种通用型基因打靶载体，属于生物工程领域。该通用型基因打靶载体使用新霉素磷酸转移酶和EGFP为正选择标记，DsRed为负选择标记；正选择标记基因表达框的两侧各含有1个同向排列的LoxP位点；在LoxP位点附近各含有一段由稀有限制性内切酶位点组成的多克隆位点，便于基因打靶臂的克隆。该载体含有2个归巢限制性内切酶位点，分别为I-CeuI和I-SceI，可作为通用酶切位点将该载体线性化。本发明提供的通用型基因打靶载体，不仅具备单药物和双荧光筛选功能，而且其含有的LoxP位点可介导选择标记的高效删除反应，这为动物安全转基因技术提供了新材料，具有重要的应用前景。

Description

通用型基因打靶载体

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种通用型基因打靶载体。

背景技术

动物转基因技术在基因功能与信号通路解析、构建疾病动物模型、创制生物反应器以及家畜新品种培育等方面，有重要应用价值。动物转基因技术可以从分子手段、转移方式和细胞介质三个层面进行分类。分子手段主要是指修饰位点的特异性，包括非定点型和定点型两类。DNA随机整合、病毒介导、转座酶/子等是非定点型，其共同缺陷是无法对整合位点和拷贝数进行严格控制，外源基因的表达也难以预期，因此很难运用到转基因家畜育种上来。在这个背景下，各种定点型技术应运而生。定点型技术的发展又分为两个阶段。第一阶段是非双链断裂依赖型(double-stranded break independent,DBS-independent)，这主要是指传统基因打靶和位点特异重组酶家族。传统基因打靶依赖于同源重组，而自然条件下同源重组的频率很低，因此其可操作性不高。FLP/FRT、Cre/LoxP等位点特异重组系统介导可逆重组反应，这就决定其净效能仍然较低。第二阶段是双链断裂依赖型(double-stranded break dependent,DBS-dependent)，这主要是指近年来出现的ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活样因子核酸酶)和Cas9等新技术。它们的共同点是可在特异的靶位点造成双链断裂，而双链断裂诱发同源重组的频率将提高2-3个数量级，可操作性大为改善(Shamim HR et al.,2013)。从分子修饰技术的发展趋势和转基因家畜育种的实际要求来看，定点型技术将是未来应用的主流。

基因打靶过程中，如何提高中靶细胞的富集和筛选效率是一个难点。自然状态下，哺乳动物细胞内同源重组的概率不到10^-6，这在实际中几乎不具有操作性。后来，有研究者发展了“正负选择法”。正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶(neo)、潮霉素B磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸转移酶(Hprt)、胸腺嘧啶激酶(tk)及嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)。负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)、SacB、rpsl(strA)、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、ccdB等。同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留(包括tk)。胸苷激酶蛋白(TK)可使无毒的丙氧鸟苷(GVC)转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和GVC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GVC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。

上述“正负选择法”在一定程度上提高了中靶细胞的富集效率，但是对转基因家畜来讲，存在几个缺陷。第一，筛选之后会残留neo等选择标记，有可能影响转基因个体的生长发育。第二，经过正负筛选，家畜原代体细胞本身遭受了两次药物处理，发育潜能大为降低，很难再用于体细胞核移植。因此，有必要发展一种通用型基因打靶载体，既能提高中靶细胞的富集效率，又能在筛选之后删除选择标记，同时还能减少化学药物对细胞的冲击，有利于提高动物克隆的效率。这对转基因家畜的研究和应用，无疑大有裨益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种既能提高中靶细胞的富集效率，又能在筛选之后删除选择标记，同时还能减少化学药物对细胞冲击的通用型基因打靶载体。

本发明提供的通用型基因打靶载体，使用新霉素磷酸转移酶和EGFP为正选择标记，DsRed为负选择标记；紧靠正选择标记表达框的5′和3′端分别含有一个同向排列的LoxP位点，可在Cre/LoxP重组酶系统的作用下删除正选择标记表达框；在5′LoxP位点的上游和3′LoxP位点的下游各含有一段具有稀有限制性内切酶位点的多克隆位点，便于基因打靶臂的克隆；该载体还含有2个归巢限制性内切酶位点，分别为I-CeuI和I-SceI，可作为通用酶切位点将该载体线性化。

本发明所述的通用型基因打靶载体全长7640bp，为序列表中SEQ.ID.NO.1所示的核酸分子。

所述的基因打靶臂，具体是指一段DNA序列，包括编码蛋白质的DNA和非蛋白质编码的DNA。

所述的基因打靶，包括但不限于：天然同源重组、锌指核酸酶技术(ZFN)、转录样激活因子核酸酶技术(TALEn)、CRISPR/Cas9、Cas9Nickase等。

通过电穿孔将本发明提供的通用载体转染湖北白猪胎儿成纤维细胞，筛选到同时表达EGFP(绿色荧光蛋白)和DsRed(红色荧光蛋白)的细胞克隆。将Cre重组酶表达载体转染该细胞克隆后，其正选择标记的删除效率达到51％；采用流式细胞术(FACS)检测，发现EGFP的表达量下降47％。本发明提供的通用型基因打靶载体，不仅具备单药物和双荧光筛选功能，而且其含有的LoxP位点可介导选择标记的高效删除反应，这为动物安全转基因技术提供了新材料，具有重要的科学价值和应用前景。

附图说明

图1通用型基因打靶载体的酶切鉴定

该载体全长7640bp(泳道1)，采用SalI和ApaI双酶切，释放出1.5kb和6kb两条DNA片段(泳道2)；采用ClaI单酶切，释放出一条7.4kb的DNA片段(泳道3；线性化)，M为1kb DNA分子量标准。

图2通用型基因打靶载体的图谱

该通用型打靶载体命名为“HRX-2MCS”，全长7640bp，Amp抗性。

图3稳定整合通用型基因打靶载体的细胞单克隆(红绿)

该通用型打靶载体含有绿色、红色双荧光报告基因。左侧为细胞克隆的明场照片，中间为绿色荧光照片，右侧为红色荧光照片。

图4质粒表达Cre重组酶介导的选择标记删除反应

将表达Cre重组酶的载体pTurbo-Cre转染细胞系，设置不转染质粒的空白对照和阴性对照pcDNA3.1。48h后收获细胞，提取基因组DNA，用跨5′LoxP位点的特异引物检测删除反应。图示电泳图中，“水”为PCR的空白对照，“野生型”为用野生型基因组DNA的阴性对照，“HRX-2MCS”为质粒阴性对照，“空白”为细胞转染的空白对照，“pcDNA3.1”为细胞转染的阴性对照，“pTurbo-Cre”为转染Cre表达载体的细胞样品，M为DL2000分子量标准。TFRC为PCR模板量的内参，其PCR产物长度为81bp。图中260bp的产物为删除反应发生后的PCR片段。

图5质粒表达Cre重组酶介导的选择标记删除效率的定量检测

采用实时荧光定量PCR技术检测删除效率，内参为猪TFRC基因(单倍体基因组为1个拷贝)，“空白”为细胞转染的空白对照，“pcDNA3.1”为细胞转染的阴性对照，“pTurbo-Cre”为转染Cre表达载体的细胞样品。拷贝数计算采用绝对定量法。如图所示，删除效率为51％。

图6删除反应产物测序

将PCR扩增得到的删除产物克隆、测序，如图所示：正选择标记表达框被删除，仅残留1个LoxP位点,其5′和3′为质粒的序列。

图7流式分选(FACS)检测EGFP的表达变化

发生删除反应之后，EGFP的表达降低，采用流式分选可准确测定其表达变化。PK15为对照细胞，本身没有荧光；“空白”为细胞转染的空白对照，“pcDNA3.1”为细胞转染的阴性对照，“pTurbo-Cre”为转染Cre表达载体的细胞样品。该实验证明EGFP的表达降低45％，进一步证实了Cre/LoxP系统可在猪细胞内高效删除选择标记。

具体实施方式

实施例1通用型基因打靶载体的构建与酶切验证

(1)主要试剂与材料来源

pBCPB⁺载体购自Addgene，pEGFP-C1-EGFP购自Clontech。Lamda DNA marker和AseI限制性内切酶购自Fermentas。高保真DNA聚合酶KOD Plus及其配套的缓冲液(10×buffer)，dNTP，MgSO₄均购自东洋纺生物科技有限公司。重组载体按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超纯质粒抽提试剂盒说明书进行。DNA割胶回收试剂盒购自Qiagen公司。测序委托深圳华大基因有限公司完成。

扩增attB序列的引物为AttB-F:gtcattaatCGCCATTCAGGCTGCGCA(SEQ.ID.NO.2)，AttB-R:gtcattaatCTCGGCCTCGACTCTAG(SEQ.ID.NO.3)。下划线序列表示AseI酶切位点。引物由上海英骏生物科技有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用TE缓冲液(pH＝8.0)稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。

(2)操作步骤

-以KOD Plus扩增attB序列，反应体系组成为：

成分	初始浓度	用量	终浓度
				PCR buffer	10×	5μl	1×
dNTP	2mmol/L	5μl	200μmol/L
				MgSO₄	25mmol/L	2μl	1mmol/L
KOD Plus	1unit/μl	1μl	0.02unit/μl
				AttB-F	10μmol/L	4μl	800nmo/L
AttB-R	10μmol/L	4μl	800nmo/L
				pBCPB⁺	25ng/μl	1μl	0.5ng/μl
双蒸水		28μl
				总体积		50μl

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。

-反应条件如下：

-产物检测：

PCR反应结束后，取5μl产物用1％琼脂糖凝胶做电泳检测，EB染色，紫外成像系统拍照记录结果。扩增产物长度为400bp。

-PCR产物割胶回收

PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下以锋利刀片割取含400bp目的条带的凝胶，按照Qiagen公司DNA回收试剂盒回收PCR产物。

-限制性内切酶AseI酶切PCR产物，反应体系如下:

成分	初始浓度	用量	终浓度
				Buffer Tango^TM	10×	3μl	1×

AseI	10units/μl	1μl	0.33unit/μl
				回收DNA	50ng/μl	26μl	40ng/μl
总体积		30μl

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放在37℃水浴锅中酶切过夜。

-限制性内切酶AseI酶切pEGFP-C1载体，反应体系如下:

成分	初始浓度	用量	终浓度
				Buffer Tango^TM	10×	3μl	1×
AseI	10units/μl	1μl	0.33unit/μl
				pEGFP-C1	50ng/μl	26μl	40ng/μl
总体积		30μl

-按照Qiagen公司DNA回收试剂盒的步骤回收上述2种酶切产物。

-将回收的酶切产物连接，反应体系如下：

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放在37℃水浴锅中连接过夜。结束后置于冰上，用于转化。

-转化大肠杆菌DH5α，转化体系如下：

成分	用量
		连接产物	10μl
DH5α感受态细胞	100μl
		总体积	110μl

将以上成分混匀，冰浴30min；42℃热激90s；加入不含有氨苄抗生素的液体LB培养基500μl，置于37℃摇床以200rpm/min的转速复苏45min；在台式离心机上以8000rpm/min的转速离心，将菌体沉淀下来，然后去除450μl LB培养基；将剩余的100μl样品涂布在。氨苄青霉素LB平板上，置于37℃温箱过夜培养16h。挑取细菌单克隆送深圳华大测序。

-阳性重组子的酶切鉴定，用AseI酶切重组载体，体系如下：

成分	初始浓度	用量	终浓度
				Buffer Tango^TM	10×	3μl	1×
AseI	10units/μl	1μl	0.33unit/μl
				pEGFP-C1-attB	50ng/μl	26μl	40ng/μl
总体积		30μl

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放在37℃水浴锅中酶切过夜。1％琼脂糖凝胶检测片段插入情况。

实施例2筛选整合通用型基因打靶载体的细胞克隆

(1)主要试剂与材料来源

猪肾PK15细胞系购自ATCC。Fugene HD转染试剂购自Roche。фC31整合酶表达载体pCMV-фC31购自Addgene。无内毒素质粒制备按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超纯质粒抽提试剂盒说明书进行。G418抗生素购自Sigma。DMEM、DPBS、胎牛血清、Opti-MEM、DMSO购自Invitrogen。

(2)操作步骤

-细胞铺板

将PK15细胞用胰酶消化为单细胞悬液后，按照10⁴细胞/孔铺于24孔板，生长过夜。转染之前用预热至37℃的DPBS洗涤细胞2次，然后换为新鲜完全培养基。

-细胞转染，体系如下：

成分	用量
		pCMV-фC31	1μl(1μg)
pEGFP-C1-attB	1μl(50ng)

Opti-MEM	90μl
		Fugene HD	8μl
总体积	100μl

在室温下配制上述转染复合物，孵育20min后逐滴加到PK15细胞上，放回培养箱内继续培养。

-G418筛选

培养24h后，将细胞用胰酶消化为单细胞悬液，按照1:20的密度分盘，传至10cm培养皿，添加800μg/ml的G418，持续培养14天，待单个细胞成长为肉眼可见克隆点。

-单克隆细胞分离

采用胰酶点消化法分离单克隆细胞。将2μl胰酶吸到单克隆细胞上，消化30s后轻轻吸打，将细胞吸起，传至6孔板中。6孔板培养基内含有100μg/ml的G418，用以维持单克隆细胞的生长。带细胞蔓延整个6孔板后，即可冻存、采样，用于后续分析。

实施例3标记基因删除反应的定性检测

(1)主要试剂与材料来源

本研究采用Takara公司的LA Taq DNA聚合酶进行检测，相应的检测引物为M5F与M3R，预期产物长度为400bp左右。

(2)操作步骤

LA Taq DNA聚合酶PCR

1)体系：

2)循环条件：(30个循环)

3)电泳：

①PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，样品：5μl；6×Buffer：1μl；marker：2μl；

②电泳结果用ChemiDOC^TM XRS+(Bio-Rad)成像，观察结果，拍照。

实施例4标记基因删除效率的定量检测

(1)主要试剂与材料来源

定量检测的引物设计:CMV-Neo-IRES-EGFP荧光定量PCR引物及TFRC(NCBI Reference Sequence：NM_214001.1)荧光定量PCR引物如下表所示：

PCR引物设计

(2)定量检测方法

反应参数按照Bio-Rad CFX96定量PCR仪器说明书进行设置，具体检测步骤如下：

1)在内参基因猪转铁蛋白受体TFRC(transferring receptor)的延伸步骤采集荧光；

2)反应结束后，紧跟着进行溶解曲线(Tm)分析，温度控范围为65℃-99℃，增量为0.5℃；

3)各待测样品组分别设置三个平行样本，增加所选取检测样本的客观性；

4)内参基因TFRC的标准曲线采用梯度野生型猪基因组DNA来建立，相关梯度参数设置为：100ng-10ng-1ng-100pg-10pg；

5)CMV-Neo-IRES-EGFP表达框标准曲线采用梯度ΔMSTN质粒来建立，相关梯度参数设置为：10ng-1ng-100pg-10pg-1pg；

6)转基因拷贝数按CMV-Neo^R-IRES-EGFP拷贝数＝CMV-Neo-IRES-EGFP分子数/TFRC分子数×2来计算；

7)Cre-LoxP重组酶介导的选择标记基因的DNA水平删除效率按照CMV-Neo-IRES-EGFP在单位质量的基因组DNA中的拷贝个数变化来计算，本研究以100ng为单位质量；

8)数据整理，分析，计算删除效率。

实施例5删除反应产物的测序分析

(1)主要试剂与材料来源

采用康为世纪动物组织基因组DNA提取试剂盒制备猪基因组DNA，Taq DNA聚合酶、dNTP均购自Fermentas公司。猪基因组特异引物为511-RR：ACAGTAACCAACACTGTGTC(SEQ.ID.NO.8),载体特异引物为IV-F2：CGCCACCTCTGACTTGAGCG(SEQ.ID.NO.9)。引物由上海英骏生物科技有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用TE缓冲液(pH＝8.0)稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。

(2)操作步骤

-PCR检测体系组成如下：

成分	用量
		10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)	2μl
dNTP mixture(2.5mM each)	1μl
		Taq DNA聚合酶(5U/μl)	0.5μl
511-RR primer(10μM)	1μl
		IV-F2primer(10μM)	1μl
模板	1μl
		双蒸水	13.5μl
总体积	20μl

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放入PCR仪中按照下述条件运行：

-PCR结束后，采用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物。

实施例6流式分选检测EGFP的表达量变化

(1)主要试剂与材料来源

试验中所采用的流式细胞分选仪为BD FACS Aria III。

(2)操作步骤

1)细胞处理：

①将转染后的细胞用胰酶消化，吹打，使其形成细胞悬液；

②用100目孔径的尼龙滤网对细胞进行过滤，以滤除未消化开的大片细胞团块，并将死亡细胞尸体及杂质一并滤除；

③置振荡仪上振荡1min，使其形成单细胞悬液，并保证细胞数量不少于6×10⁵个/ml；

④置于离心机中进行固液分离，1000r/min，5min，弃培养基；

⑤加DPBS缓冲液200μl，振荡1min，使细胞形成单细胞悬液，离心管封口，送检，进行筛选检测。

2)筛选步骤：

①将装单细胞悬液的离心管的管耳剪掉，置振荡仪上振荡1min，使细胞重悬，置于检测室中，无菌条件下进行流式细胞分选仪检测；

②以未转染任何质粒的猪肾PK15细胞作为空白对照，计数一万个细胞样本P1，测定总荧光表达量P2的GFP-A-Mean水平，设定阈值；

③进行待测样品的检测，数据整理输出，带回分析。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 通用型基因打靶载体

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7640

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatacgta actataacgg tcctaaggta gcgaatatgc ggtgtgaaat accgcacaga 240

tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg 300

gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct 360

gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg 420

gccagtgaat tcgagctcgg cgcgcctcat gattaattaa atcgatgcga tcgcagctca 480

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tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 1020

caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 1080

cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg ctagcatgat tgaacaagat ggattgcacg 1140

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tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 1260

tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 1320

ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 1380

gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 1440

ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 1500

ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 1560

aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 1620

aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 1680

gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 1740

gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 1800

ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 1860

ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga ctcgagggat 1920

ccgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg 1980

gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc 2040

ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa 2100

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cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg 2280

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tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg 2820

acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca 2880

tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt 2940

acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg 3000

tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc 3060

agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca 3120

cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt 3180

tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa agcggccgcg 3240

actctagatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct 3300

cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt 3360

tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 3420

atttttttca ctgcagatcc ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcgacct 3480

gcaggcatgc gtcgacgccg gcgatgcatc ctcagctcga cctgcaggca tgcaagcttc 3540

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 3600

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 3660

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 3720

cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 3780

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttacg 3840

ccttaagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct 3900

ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 3960

aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg 4020

ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtatggc tgattatgat ctagagtcgc 4080

ggccgctcta ctgggagccg gagtggcggg cctcggcgtg ctcgtactgc tccaccacgg 4140

tgtagtcctc gttgtggttg gtgatgtcca gcttggagtc cacgtagtgg ttgccgggca 4200

gctgcacggg cttcttggcc ttgtacacgg tcttgaagtc gcaggtgtag tggccgccgt 4260

ccttcagctt cagggcgtgg gagatctcgc ccttcagcac gccgtcctgg gggtacagct 4320

tctcggtgga gggctcccag ccggcagtct tcttctgcat tacggggccg tcggcgggga 4380

agttcacgcc cttgaacttc accttgtaga tgaaggtgcc gtcctgcagg gaggagtcct 4440

gctgcacctc caccacgccg ccgtcctcga agttcatgga gcgctcccag gtgaagccct 4500

cggggaagga cagcttcatg tagtcgggga tgtcggcggg gtgcttcacg taggccttgg 4560

agccgtactg gaactggggg gacaggatgt cccaggcgaa gggcaggggg ccgcccttgg 4620

tcacctgcag cttggcggtc tgggtgccct cgtagggctt gccctcgccc tcgccctcga 4680

tctcgaagta gtggccgttc acggagccct ccatgcgcac cttgaactgc atgaactcct 4740

tgatgacgtc ctcggtgttg tccatggtgg cgctcggatc tgacggttca ctaaaccagc 4800

tctgcttata tagacctccc accgtacacg cctaccgccc atttgcgtca atggggcgga 4860

gttgttacga cattttggaa agtcccgttg attttggtgc caaaacaaac tcccattgac 4920

gtcaatgggg tggagacttg gaaatccccg tgagtcaaac cgctatccac gcccattgat 4980

gtactgccaa aaccgcatca ccatggtaat agcgatgact aatacgtaga tgtactgcca 5040

agtaggaaag tcccataagg tcatgtactg ggcataatgc caggcgggcc atttaccgtc 5100

attgacgtca atagggggcg tacttggcat atgatacact tgatgtactg ccaagtgggc 5160

agtttaccgt aaatactcca cccattgacg tcaatggaaa gtccctattg gcgttactat 5220

gggaacatac gtcattattg acgtcaatgg gcgggggtcg ttgggcggtc agccaggcgg 5280

gccatttacc gtaagttatg taacgcggaa ctccatatat gggctatgaa ctaatgaccc 5340

cgtaattgat tactattaat aactaaagct tagttacgct agggataaca gggtaatata 5400

gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 5460

tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 5520

ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 5580

ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 5640

ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 5700

agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 5760

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 5820

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 5880

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 5940

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 6000

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 6060

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 6120

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 6180

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 6240

taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 6300

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 6360

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 6420

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 6480

catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 6540

atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 6600

ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 6660

gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 6720

agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 6780

gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 6840

agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 6900

catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 6960

aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 7020

gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 7080

taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 7140

caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 7200

ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 7260

ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 7320

tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 7380

aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 7440

actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 7500

catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 7560

agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 7620

tatcacgagg ccctttcgtc 7640

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcattaatc gccattcagg ctgcgca 27

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcattaatc tcggcctcga ctctag 26

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggttacaaat aaagcaatag c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agttagaggg taacgacagc atc 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagacagaaa ctttcgaagc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagtctgtg gtatccaatc c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acagtaacca acactgtgtc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgccacctct gacttgagcg 20

Claims

1.一种通用型基因打靶载体，其特征在于，包含正选择标记和负选择标记，使用新霉素磷酸转移酶和EGFP为正选择标记，DsRed为负选择标记；靠正选择标记表达框的5′和3′端分别含有一个同向排列的LoxP位点，可在Cre/LoxP重组酶系统的作用下删除正选择标记表达框；在5′LoxP位点的上游和3′LoxP位点的下游各含有一段具有稀有限制性内切酶位点的多克隆位点，便于基因打靶臂的克隆；该载体还含有2个归巢限制性内切酶位点，分别为I-CeuI和I-SceI，可作为通用酶切位点将该载体线性化。

2. 根据权利要求1所述的通用型基因打靶载体，其特征在于，所述的通用型基因打靶载体全长7640bp，为序列表中SEQ.ID.NO.1所示的核酸分子。

3. 根据权利要求1所述的通用型基因打靶载体，其特征在于，所述的基因打靶臂，包括编码蛋白质的DNA和非蛋白质编码的DNA。

4. 根据权利要求1所述的通用型基因打靶载体，其特征在于，所述的基因打靶，包括天然同源重组、锌指核酸酶技术、转录样激活因子核酸酶技术、CRISPR/Cas9或Cas9 Nickase。