CN114214346B - 靶向肝前体细胞的质粒系统及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向肝前体细胞的质粒系统Prom1‑GFP‑DTR，该质粒系统的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，插入CD133启动子序列、编码绿色荧光蛋白和白喉毒素受体的DNA序列。本发明通过实验证明Prom1‑GFP‑DTR质粒系统可有效整合到肝前体细胞基因组中，由于GFP的荧光标记作用以及DTR与DT结合的清除细胞作用，Prom1+肝前体细胞可得到有效清除，从而得到一种靶向肝前体细胞的质粒系统。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种靶向肝前体细胞的质粒系统、构建方法及其在肝细胞肝癌靶向治疗中清除肝前体细胞减缓肿瘤进程的应用。
背景技术
原发性肝癌是全球范围内最常见的消化系统恶性肿瘤，肝细胞肝癌约占原发性肝癌90％的病例。原发性肝癌是中国最致命的肿瘤之一，其发病率与致死率居高不下。肝癌在中国男性癌症发病率为第三位，在女性中为第七位，其死亡率在癌症排名中高居第五位。(《健康中国行动(2019-2030)》)原发性肝癌发病初期具备病程短，病情恶化快且临床症状不明显的特点，造成一经确诊往往发展为晚期的结果，严重危害人群健康及生命。近年来，靶向治疗晚期恶性肝癌取得一系列突破。
肝前体细胞被视为肝细胞肝癌复发、恶化和化疗抗性的主要致病因素。肝前体细胞在肝损伤时活化，转分化为肝细胞或胆管细胞。在很多慢性损伤中肝细胞活化受抑制，肝前体细胞成为活化增殖的主要部分。研究表明，慢性炎症促进肝前体细胞向肝肿瘤干细胞恶性转化。(Li XF,Chen C,Xiang DM,et al.(2017)Chronic inflammation-elicitedliver progenitor cell conversion to liver cancer stem cell with clinicalsignificance.Hepatology66(6):1934-1951.)肝前体细胞的活化加快肝脏疾病进展，造成肝癌恶化。能否靶向清除肝前体细胞减缓肝癌进程成为研究热点。RNA干扰技术和肝前体细胞表面标记物抗体制备为根治肝癌提出一种新的思路。
PROMININ(CD133)是目前最确定的肝前体细胞表面标志物之一。(Lee HY,HongIS.(2020)Targeting Liver Cancer Stem Cells:An Alternative TherapeuticApproach for Liver Cancer.Cancers(Basel)12(10):2746.)人CD133由5个跨膜单链糖蛋白组成，包含两个大的细胞外环作为重要的表面标志物，属于PROMININ家族。(Grosse-Gehling P,Fargeas CA,Dittfeld C,et al.(2013)CD133 as a biomarker for putativecancer stem cells in solid tumours:limitations,problems and challenges.JPathol 229(3):355-78.)CD133参与自我更新、多谱系分化以及致瘤性和治疗耐受性等许多分子机制。近期研究表明，无论体内还是体外实验，在受损肝脏和肝细胞肝癌的组织中CD133+细胞转分化为非肝细胞样谱系。(TsuchiyaA,Kamimura H,Takamura M,et al.(2009)Clinicopathological analysis of CD133 and NCAM human hepatic stem/progenitor cells in damaged livers and hepatocellular carcinomas.Hepatol Res39(11):1080-90.)因此，研究人员已尝试开发针对PROM1+肝前体细胞的治疗策略。
越来越多的证据说明靶向清除前体细胞有助于减缓肝细胞肝癌进展，然而调控肝前体细胞的相关分子机制与肿瘤微环境如何变化仍然没有得到明确阐释。开展靶向肝前体细胞的相关研究，可为肝癌提供新颖的治疗途径。目前尚无有关靶向肝前体细胞系统构建相关报道，更无有关靶向清除Prom1+肝前体细胞相关研究。
发明内容
本发明依托上述研究进行，提供一种靶向肝前体细胞的质粒系统Prom1-GFP-DTR，还提供了该质粒系统的构建方法和应用。
本发明设计了可以融合到小鼠宿主基因组的质粒系统Prom1-GFP-DTR。尾静脉注射Prom1-GFP-DTR质粒系统与Sleeping Beauty转座子系统后，Prom1+肝前体细胞启动表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)与白喉毒素受体(Diphtheria ToxinReceptor,DTR)，使得Prom1+肝前体细胞携带绿色荧光标记。而后通过腹腔注射白喉毒素(Diphtheria Toxin,DT)，特异性清除表达含有整合至宿主的基因组的肝前体细胞，绿色荧光标记消失。
本发明的第一方面，提供了一种靶向肝前体细胞的质粒系统Prom1-GFP-DTR，该质粒系统的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，结构如图1所示，插入有编码CD133启动子、绿色荧光蛋白以及白喉毒素受体的多核苷酸。其中，编码CD133启动子的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，编码绿色荧光蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，编码白喉毒素受体的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
Prom1-GFP-DTR质粒系统与Sleeping Beauty转座子系统共转染细胞后，CD133启动子促使Prom1+肝前体细胞启动表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)与白喉毒素受体(Diphtheria Toxin Receptor,DTR)。
本发明的第二方面，提供了上述质粒系统的制备方法，包括如下步骤：
A、无缝克隆法进行质粒构建
利用NdeI、BsrGI对CD133启动子、绿色荧光蛋白以及白喉毒素受体的PCR产物及载体进行双酶切，反应采用高盐缓冲体系，置于37℃水浴3小时，充分酶切；然后经0.8％琼脂糖电泳分离后，回收凝胶；将酶切片断和载体按照摩尔比2：1混合，进行重组反应。
B、工程菌的制备
取感受态DH5α大肠杆菌于冰上融化；向感受态DH5α大肠杆菌中加入上述构建的质粒，轻轻混匀，静置于冰浴中30分钟，42℃水浴中热激60～90秒，快速将其置于冰浴冷却2分钟，冷却过程中不能振荡大肠杆菌；加入0.9ml无菌的不含抗生素的LB培养基(含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠，pH7.0)，轻柔混匀后于37℃，180～200rpm摇床上培养1小时；以600g的转速离心3分钟，收集已转化的宿主菌，弃去上清，加入0.3ml含氨苄青霉素LB培养基重悬；将已转化的宿主菌均匀涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养12～16小时，即获得含有重组质粒的单克隆菌落。
挑取克隆菌落，加入含氨苄青霉素的LB培养基，37℃，180～200rpm摇床上培养12小时，抽提宿主菌的质粒，用NdeI、BsrGI双酶切能够切出一条2950bp，一条3900bp的条带，该宿主菌即为阳性重组子。
C、质粒pT-Prom1-GFP-DTR的抽取和纯化
取经验证为阳性重组子的单克隆宿主菌，加入含氨苄青霉素的LB培养基，37℃，180～200rpm摇床上培养12～16小时。菌液12000g离心2min，弃上清，收集菌体，并按照试剂盒说明进行质粒抽提和纯化。
本发明的第三方面，提供了上述质粒系统在制备治疗肝细胞肝癌药物中的用途。
优选的，该治疗肝细胞肝癌药物为靶向肝前体细胞的药物，其活性组分包括上述质粒系统、以及带动该质粒系统发生转座的转座子系统，使其整合到Prom1+肝前体细胞的基因组中。
根据实验验证，肝细胞肝癌模型成功建立后，通过免疫荧光实验表明，Prom1-GFP-DTR系统能够成功标记Prom1+肿瘤前体细胞，并且DT处理后绿色荧光消失；苏木精伊红染色实验表明，DT处理组肿瘤进展显著减缓(图4)。
基于此，本发明的第四方面，提供了一种靶向肝前体细胞的药物组合物，包括活性组分以及药学上可用的辅料；该活性组分包括上述质粒系统、以及带动该质粒系统发生转座整合至细胞基因组内的转座子系统，该转座子系统为Sleeping Beauty转座子系统。
本发明的第五方面，提供了一种治疗肝细胞肝癌的药物组合，包括上述靶向肝前体细胞的药物组合物，以及与该药物组合物配合使用的白喉毒素。
使用时，先将靶向肝前体细胞的药物组合物导入体内，间隔一段时间后，注射白喉毒素，白喉毒素通过与白喉毒素受体结合，特异性清除表达含有整合至宿主的基因组的肝前体细胞。
本发明的有益效果如下：
本发明通过实验证明Prom1-GFP-DTR质粒系统可有效整合到肝前体细胞基因组中，由于GFP的荧光标记作用以及DTR与DT结合的清除细胞作用，Prom+肝前体细胞可得到有效清除，从而得到一种靶向肝前体细胞的质粒系统。
本发明采用诱导型表达载体，可降低大规模克隆时的成本，以利于规模化生产。由于Prom+肝前体细胞为肝前体细胞主要细胞子集，靶向清除Prom+肝前体细胞为研究肝细胞肝癌肿瘤微环境变化以及分子机制调节具有显著意义。
附图说明
图1为无缝克隆法构建质粒Prom1-GFP-DTR的结构示意图。
图2为质粒Prom1-GFP-DTR的酶切电泳图。
图3为质粒Prom1-GFP-DTR的验证实验，A为小鼠肝细胞肝癌造模以及靶向质粒Prom1-GFP-DTR尾静脉注射示意图，B为实验处理过程示意图。
图4为免疫组化、免疫荧光、苏木素伊红染色实验结果。
具体实施方式
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
实施例1质粒Prom1-GFP-DTR构建及纯化
1、质粒构建
采用无缝克隆法进行构建，具体构建步骤如下：
用NdeI、BsrGI双酶切，与NdeI、BsrGI双酶切的载体pT-EGFP连接。酶切的限制性内切酶购自New England Biolabs(NEB)公司，反应采用酶说明书所推荐的体系进行。
具体反应过程如下：利用NdeI、BsrGI对上述PCR产物及载体进行双酶切，反应采用高盐(H)缓冲体系，置于37℃水浴3小时，充分酶切。然后经0.8％琼脂糖电泳分离后，使用TIANGEN公司凝胶回收试剂盒(产品目录号：DP209)进行凝胶回收。酶切片断和载体按照摩尔比2：1混合，使用Vazyme公司CloneExpressⅡ试剂盒(产品目录号：C112)进行重组反应，反应按照说明书推荐体系进行。
2、工程菌的制备
将上述连接后的产物转化感受态DH5α大肠杆菌菌株(DH5α感受态细胞，MD101-1，新赛美生物科技有限公司)，得到工程菌DH5α(pT-Prom1-GFP-DTR)。
具体步骤为：取0.1ml感受态DH5α大肠杆菌于冰上融化；向感受态DH5α大肠杆菌中加入10ng上述构建的质粒，轻轻混匀，静置于冰浴中30分钟，42℃水浴中热激60秒(最长热激时间不能超过90秒)，快速将其置于冰浴冷却2分钟，冷却过程中不能振荡大肠杆菌。加入0.9ml无菌(高压灭菌)的不含抗生素的LB培养基(含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠，pH7.0)，轻柔混匀后于37℃，180～200rpm摇床上培养1小时。以600g的转速离心3分钟，收集已转化的宿主菌，弃去上清，加入0.3ml含氨苄青霉素LB培养基重悬。将已转化的宿主菌均匀涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜(12～16小时)，即获得含有重组质粒的单克隆菌落。
挑取隆菌落，加入5mL含氨苄青霉素的LB培养基，37℃，180～200rpm摇床上培养12小时，抽提宿主菌的质粒，用NdeI、BsrGI双酶切能够切出一条2950bp，一条3900bp的条带(见图2)，该宿主菌即为阳性重组子。
含有质粒pT-Prom1-GFP-DTR的大肠杆菌菌株DH5α为工程菌DH5α(pT-Prom1-GFP-DTR)。
3、质粒pT-Prom1-GFP-DTR的抽取和纯化
工程菌DH5α(pT-Prom1-GFP-DTR)可用于大量生产质粒pT-Prom1-GFP-DTR。取2mL经验证为阳性重组子的单克隆宿主菌，加入500mL含氨苄青霉素的LB培养基，37℃，180～200rpm摇床上培养12～16小时。菌液12000g离心2min，弃上清，收集菌体。使用Vazyme公司FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit(产品目录号：DC202)，进行质粒抽提和纯化，反应按照说明书推荐体系进行。
构建完毕的质粒系统Prom1-GFP-DTR的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，结构如图1所示，该重组表达质粒系统中插入有编码CD133启动子、绿色荧光蛋白以及白喉毒素受体的多核苷酸。编码CD133启动子的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，编码绿色荧光蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，编码白喉毒素受体的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
采用内切酶NdeI/Bsp1407I将质粒Prom1-GFP-DTR酶切呈2950+3.9K大小的片段，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
质粒系统Prom1-GFP-DTR的碱基序列(SEQ ID NO.1)
CGCTCaCaATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCTACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACTTAAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTTTACAGACAGATTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATTCCAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAAGTTGACTGTGCCTTTAAACAGCTTGGAAAATTCCAGAAAATGATGTCATGGCTTTAGAAGCTTCTGATAGACTAATTGACATCATTTGAGTCAATTGGAGGTGTACCTGTGGATGTATTTCAAGGAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATATCGATACTAGTAGGCAGCTCGGGGACAGCTAGGAGCTCCCAGGAGAGAGAACTCAAGTCTCAAGCTAACACCATCCTCAGTAGCCTGTCTGCCTCTGAGCAGGAAAGCTGTGGAGCCCAGGAGACTGTAAAGGGGAGAACTGGCCATCTTAGACTTCTCTAGTACTCCAACACTGCTTGCTTCAGTTTTCCGTGGTTTCTCAGTGGTCTTTCTGAATGAACTCTTTCTACACCTTCGCCGTGTAGAGGTCAATTTCAATTTCACCTTCCCCTGCCCATCCTCAGTGTATGCTATATTTTGTGGTGAGAAAATTACTAAATTAAAGTTCATTTGTCAGGGCTGGGGAGATTGGTGAGTGGTATAAAGCATCGGTTGTTTTGGCAGAGGCACTCCCTCTTTGCAGAGTTTAATTCCCTGCACCCAGCCCGTATGGCAGCTCACAACCCTTTGTAACTCCAGTGACAGGGAAGCCAACACCTTCTTTTGACCAACTCCACGGTAAAGTGCTACACATACATTCATGCAGGCAAAACATTCATACACGTAAACTATTTTTAAAAGGCCATGTGTCCACATACCTATTCTTCCAACATCTGTGCAGCCATTCTTTCATCTCTCCGTCCATCTACCTAACAACCCGCACACAATTAATACGCATCCTTTGATGGTAAAAATGTCCCAGAGGCGCTATTCTTCCTTGGTCTATTCTCTACCCACTTTTGGTTGAATCCAGGAATGTAATTGATCAAAAGGACCAGCGTTGTGTTTGTCCCTGATAGCACAGGGATACACTACAGCCAATTTTTCTCCCCCTTAGATGATTTTTGTTTGTTTGTTTGTTTTTTAGTTGTTTTAAATAAAATGCACTGAGTACCGGTATCGTGTCTAAAGAGCCAGGAAAGTGTGGAGGTTAGAGATTTTAGGAGCTAGCGGCCTTCCAAGCAGCGATTTAGGATTAGGTGATAGAGAAGGGTGTTCTGGGACTGAGCAGGGATTTCAGCAGGAAATAAATGCTCTGTCCCGTGGGTGTCCCCAGGGCATTGTAGCCTCTCAGAAGGTCCAATCAGTGCGCTCAGACTCAGAGCCCTAGGCTCCTGCTCTTTAAATTACCGAGCCTTGTGGAGACCCCGGCACCTGGCCTTAAGCTCAGCCCTGAGTAAGTACGTTTCTGAAGGAGTCGGTGTTCCTTTAGTTCCATCCCCAAACCTCTGCCAGAGACCCTAGAGGACGCAACAGGTTCCCAGAGTCCTGGAGTCCCGTGGTCCTGACTCAGGCACCCTTAGCCAACCCGGGGCGGAGCAGTGGGACGGGCTCTCACCCAATCACTCTTGTGGTGCCCTGGGGCTGGACCTTAAATAATTCATGAATTAAGTGGAAGGAGCCCAGCTTAGAGGCGAGGGGCTGGAGGGTTCCGAGACCCGGAGGAGAGCTGGACCGGAGAGGTGAGTTGCTCCGAGTGCCGACCCAGCGCGGGGCGCTGAGCTCCCCCTCTTCTAGAACACCCAGGGCAGGGATGAGGAGTGGAGAAGCTCGAGCAACGTCTTCCTCTGCCTCCACAGCAGGTGGCGGGCTCGAGCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCTAGCGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTACTAGTCTCGAGACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTGGTGCTGAAGCTCTTTCTGGCTGCAGTTCTCTCGGCACTGGTGACTGGCGAGAGCCTGGAGCGGCTTCGGAGAGGGCTAGCTGCTGGAACCAGCAACCCGGACCCTCCCACTGTATCCACGGACCAGCTGCTACCCCTAGGAGGCGGCCGGGACCGGAAAGTCCGTGACTTGCAAGAGGCAGATCTGGACCTTTTGAGAGTCACTTTATCCTCCAAGCCACAAGCACTGGCCACACCAAACAAGGAGGAGCACGGGAAAAGAAAGAAGAAAGGCAAGGGGCTAGGGAAGAAGAGGGACCCATGTCTTCGGAAATACAAGGACTTCTGCATCCATGGAGAATGCAAATATGTGAAGGAGCTCCGGGCTCCCTCCTGCATCTGCCACCCGGGTTACCATGGAGAGAGGTGTCATGGGCTGAGCCTCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCAGCCAACCATCCTGGCCGTGGTGGCTGTGGTGCTGTCATCTGTCTGTCTGCTGGTCATCGTGGGGCTTCTCATGTTTAGGTACCATAGGAGAGGAGGTTATGATGTGGAAAATGAAGAGAAAGTGAAGTTGGGCATGACTAATTCCCACTGAGCGGCCGCCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGGATCCCCTTGAAATACATCCACAGGTACACCTCCAATTGACTCAAATGATGTCAATTAGTCTATCAGAAGCTTCTAAAGCCATGACATCATTTTCTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAACTTAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGGAATTGTGATACAGTGAATTATAAGTGAAATAATCTGTCTGTAAACAATTGTTGGAAAAATGACTTGTGTCATGCACAAAGTAGATGTCCTAACTGACTTGCCAAAACTATTGTTTGTTAACAAGAAATTTGTGGAGTAGTTGAAAAACGAGTTTTAATGACTCCAACTTAAGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTGTATAGGTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGC
编码CD133启动子的碱基序列(SEQ ID NO.2)
AGGCAGCTCGGGGACAGCTAGGAGCTCCCAGGAGAGAGAACTCAAGTCTCAAGCTAACACCATCCTCAGTAGCCTGTCTGCCTCTGAGCAGGAAAGCTGTGGAGCCCAGGAGACTGTAAAGGGGAGAACTGGCCATCTTAGACTTCTCTAGTACTCCAACACTGCTTGCTTCAGTTTTCCGTGGTTTCTCAGTGGTCTTTCTGAATGAACTCTTTCTACACCTTCGCCGTGTAGAGGTCAATTTCAATTTCACCTTCCCCTGCCCATCCTCAGTGTATGCTATATTTTGTGGTGAGAAAATTACTAAATTAAAGTTCATTTGTCAGGGCTGGGGAGATTGGTGAGTGGTATAAAGCATCGGTTGTTTTGGCAGAGGCACTCCCTCTTTGCAGAGTTTAATTCCCTGCACCCAGCCCGTATGGCAGCTCACAACCCTTTGTAACTCCAGTGACAGGGAAGCCAACACCTTCTTTTGACCAACTCCACGGTAAAGTGCTACACATACATTCATGCAGGCAAAACATTCATACACGTAAACTATTTTTAAAAGGCCATGTGTCCACATACCTATTCTTCCAACATCTGTGCAGCCATTCTTTCATCTCTCCGTCCATCTACCTAACAACCCGCACACAATTAATACGCATCCTTTGATGGTAAAAATGTCCCAGAGGCGCTATTCTTCCTTGGTCTATTCTCTACCCACTTTTGGTTGAATCCAGGAATGTAATTGATCAAAAGGACCAGCGTTGTGTTTGTCCCTGATAGCACAGGGATACACTACAGCCAATTTTTCTCCCCCTTAGATGATTTTTGTTTGTTTGTTTGTTTTTTAGTTGTTTTAAATAAAATGCACTGAGTACCGGTATCGTGTCTAAAGAGCCAGGAAAGTGTGGAGGTTAGAGATTTTAGGAGCTAGCGGCCTTCCAAGCAGCGATTTAGGATTAGGTGATAGAGAAGGGTGTTCTGGGACTGAGCAGGGATTTCAGCAGGAAATAAATGCTCTGTCCCGTGGGTGTCCCCAGGGCATTGTAGCCTCTCAGAAGGTCCAATCAGTGCGCTCAGACTCAGAGCCCTAGGCTCCTGCTCTTTAAATTACCGAGCCTTGTGGAGACCCCGGCACCTGGCCTTAAGCTCAGCCCTGAGTAAGTACGTTTCTGAAGGAGTCGGTGTTCCTTTAGTTCCATCCCCAAACCTCTGCCAGAGACCCTAGAGGACGCAACAGGTTCCCAGAGTCCTGGAGTCCCGTGGTCCTGACTCAGGCACCCTTAGCCAACCCGGGGCGGAGCAGTGGGACGGGCTCTCACCCAATCACTCTTGTGGTGCCCTGGGGCTGGACCTTAAATAATTCATGAATTAAGTGGAAGGAGCCCAGCTTAGAGGCGAGGGGCTGGAGGGTTCCGAGACCCGGAGGAGAGCTGGACCGGAGAGGTGAGTTGCTCCGAGTGCCGACCCAGCGCGGGGCGCTGAGCTCCCCCTCTTCTAGAACACCCAGGGCAGGGATGAGGAGTGGAGAAGCTCGAGCAACGTCTTCCTCTGCCTCCACAGCAGGTGGCGGG
编码绿色荧光蛋白的碱基序列(SEQ ID NO.3)
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
白喉毒素受体的碱基序列(SEQ ID NO.4)
ATGAAGCTGCTGCCGTCGGTGGTGCTGAAGCTCTTTCTGGCTGCAGTTCTCTCGGCACTGGTGACTGGCGAGAGCCTGGAGCGGCTTCGGAGAGGGCTAGCTGCTGGAACCAGCAACCCGGACCCTCCCACTGTATCCACGGACCAGCTGCTACCCCTAGGAGGCGGCCGGGACCGGAAAGTCCGTGACTTGCAAGAGGCAGATCTGGACCTTTTGAGAGTCACTTTATCCTCCAAGCCACAAGCACTGGCCACACCAAACAAGGAGGAGCACGGGAAAAGAAAGAAGAAAGGCAAGGGGCTAGGGAAGAAGAGGGACCCATGTCTTCGGAAATACAAGGACTTCTGCATCCATGGAGAATGCAAATATGTGAAGGAGCTCCGGGCTCCCTCCTGCATCTGCCACCCGGGTTACCATGGAGAGAGGTGTCATGGGCTGAGCCTCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCAGCCAACCATCCTGGCCGTGGTGGCTGTGGTGCTGTCATCTGTCTGTCTGCTGGTCATCGTGGGGCTTCTCATGTTTAGGTACCATAGGAGAGGAGGTTATGATGTGGAAAATGAAGAGAAAGTGAAGTTGGGCATGACTAATTCCCACTGA
实施例2靶向验证
以HMET和CTNNB1-S45Y诱导的小鼠肝细胞肝癌模型为例，说明Prom1-GFP-DTR质粒系统整合到宿主基因组，并且靶向清除Prom1+肝前体细胞，减缓肝细胞肝癌进展。
6周龄FVB公鼠鼠尾静脉注射HMET、CTNNB1-S45Y两种诱癌质粒，Prom1-GFP-DTR靶向质粒以及Sleeping Beauty转座子系统(图3A)。从第2周开始按照如图3B方式给予DT处理，靶向清除标记的Prom1+肿瘤前体细胞，对照组给予等量生理盐水处理，第8周取材。
实验结果如图4所示，根据免疫组化实验，注射HMET、CTNNB1-S45Y两种诱癌质粒后，肝实质细胞大小不一，排列不规则，异型性增加，说明肝细胞肝癌模型成功建立；免疫荧光实验表明，Prom1-GFP-DTR系统成功标记Prom1+肿瘤前体细胞，并且DT处理后绿色荧光消失；苏木精伊红染色实验表明，DT处理组肿瘤进展显著减缓。
上述实验结果证明，Prom1-GFP-DTR质粒系统可有效整合到肝前体细胞基因组中，由于GFP的荧光标记作用以及DTR与DT结合的清除细胞作用，Prom+肝前体细胞可得到有效清除，从而得到一种靶向肝前体细胞的质粒系统。
本发明采用诱导型表达载体，可降低大规模克隆时的成本，以利于规模化生产。由于Prom+肝前体细胞为肝前体细胞主要细胞子集，靶向清除Prom+肝前体细胞为研究肝细胞肝癌肿瘤微环境变化以及分子机制调节具有显著意义。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军海军军医大学第三附属医院
<120> 靶向肝前体细胞的质粒系统及应用
<130> 权利要求书、说明书
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6863
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 60
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 120
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 180
ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 240
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 300
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 360
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 420
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 480
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 540
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 600
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 660
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 720
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 780
agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 840
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 900
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 960
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 1020
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 1080
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 1140
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 1200
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 1260
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 1320
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 1380
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 1440
ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 1500
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 1560
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 1620
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 1680
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 1740
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 1800
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 1860
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 1920
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 1980
gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 2040
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 2100
ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 2160
aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 2220
tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 2280
gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 2340
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 2400
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 2460
aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 2520
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 2580
ccagtgaatt cgagctcggt accctacagt tgaagtcgga agtttacata cacttaagtt 2640
ggagtcatta aaactcgttt ttcaactact ccacaaattt cttgttaaca aacaatagtt 2700
ttggcaagtc agttaggaca tctactttgt gcatgacaca agtcattttt ccaacaattg 2760
tttacagaca gattatttca cttataattc actgtatcac aattccagtg ggtcagaagt 2820
ttacatacac taagttgact gtgcctttaa acagcttgga aaattccaga aaatgatgtc 2880
atggctttag aagcttctga tagactaatt gacatcattt gagtcaattg gaggtgtacc 2940
tgtggatgta tttcaaggaa ttctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc 3000
aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatatc gatactagta ggcagctcgg 3060
ggacagctag gagctcccag gagagagaac tcaagtctca agctaacacc atcctcagta 3120
gcctgtctgc ctctgagcag gaaagctgtg gagcccagga gactgtaaag gggagaactg 3180
gccatcttag acttctctag tactccaaca ctgcttgctt cagttttccg tggtttctca 3240
gtggtctttc tgaatgaact ctttctacac cttcgccgtg tagaggtcaa tttcaatttc 3300
accttcccct gcccatcctc agtgtatgct atattttgtg gtgagaaaat tactaaatta 3360
aagttcattt gtcagggctg gggagattgg tgagtggtat aaagcatcgg ttgttttggc 3420
agaggcactc cctctttgca gagtttaatt ccctgcaccc agcccgtatg gcagctcaca 3480
accctttgta actccagtga cagggaagcc aacaccttct tttgaccaac tccacggtaa 3540
agtgctacac atacattcat gcaggcaaaa cattcataca cgtaaactat ttttaaaagg 3600
ccatgtgtcc acatacctat tcttccaaca tctgtgcagc cattctttca tctctccgtc 3660
catctaccta acaacccgca cacaattaat acgcatcctt tgatggtaaa aatgtcccag 3720
aggcgctatt cttccttggt ctattctcta cccacttttg gttgaatcca ggaatgtaat 3780
tgatcaaaag gaccagcgtt gtgtttgtcc ctgatagcac agggatacac tacagccaat 3840
ttttctcccc cttagatgat ttttgtttgt ttgtttgttt tttagttgtt ttaaataaaa 3900
tgcactgagt accggtatcg tgtctaaaga gccaggaaag tgtggaggtt agagatttta 3960
ggagctagcg gccttccaag cagcgattta ggattaggtg atagagaagg gtgttctggg 4020
actgagcagg gatttcagca ggaaataaat gctctgtccc gtgggtgtcc ccagggcatt 4080
gtagcctctc agaaggtcca atcagtgcgc tcagactcag agccctaggc tcctgctctt 4140
taaattaccg agccttgtgg agaccccggc acctggcctt aagctcagcc ctgagtaagt 4200
acgtttctga aggagtcggt gttcctttag ttccatcccc aaacctctgc cagagaccct 4260
agaggacgca acaggttccc agagtcctgg agtcccgtgg tcctgactca ggcaccctta 4320
gccaacccgg ggcggagcag tgggacgggc tctcacccaa tcactcttgt ggtgccctgg 4380
ggctggacct taaataattc atgaattaag tggaaggagc ccagcttaga ggcgaggggc 4440
tggagggttc cgagacccgg aggagagctg gaccggagag gtgagttgct ccgagtgccg 4500
acccagcgcg gggcgctgag ctccccctct tctagaacac ccagggcagg gatgaggagt 4560
ggagaagctc gagcaacgtc ttcctctgcc tccacagcag gtggcgggct cgagcaccat 4620
ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg 4680
cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg 4740
caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct 4800
cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca 4860
gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt 4920
caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt 4980
gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa 5040
gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg 5100
catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga 5160
ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta 5220
cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct 5280
gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaaggctag 5340
cgagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gccctactag 5400
tctcgagacc atgaagctgc tgccgtcggt ggtgctgaag ctctttctgg ctgcagttct 5460
ctcggcactg gtgactggcg agagcctgga gcggcttcgg agagggctag ctgctggaac 5520
cagcaacccg gaccctccca ctgtatccac ggaccagctg ctacccctag gaggcggccg 5580
ggaccggaaa gtccgtgact tgcaagaggc agatctggac cttttgagag tcactttatc 5640
ctccaagcca caagcactgg ccacaccaaa caaggaggag cacgggaaaa gaaagaagaa 5700
aggcaagggg ctagggaaga agagggaccc atgtcttcgg aaatacaagg acttctgcat 5760
ccatggagaa tgcaaatatg tgaaggagct ccgggctccc tcctgcatct gccacccggg 5820
ttaccatgga gagaggtgtc atgggctgag cctcaaggtt ctgcccacat ggtccacccc 5880
ggtgcagcca accatcctgg ccgtggtggc tgtggtgctg tcatctgtct gtctgctggt 5940
catcgtgggg cttctcatgt ttaggtacca taggagagga ggttatgatg tggaaaatga 6000
agagaaagtg aagttgggca tgactaattc ccactgagcg gccgccgact gtgccttcta 6060
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 6120
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 6180
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 6240
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggggatccc cttgaaatac atccacaggt 6300
acacctccaa ttgactcaaa tgatgtcaat tagtctatca gaagcttcta aagccatgac 6360
atcattttct ggaattttcc aagctgttta aaggcacagt caacttagtg tatgtaaact 6420
tctgacccac tggaattgtg atacagtgaa ttataagtga aataatctgt ctgtaaacaa 6480
ttgttggaaa aatgacttgt gtcatgcaca aagtagatgt cctaactgac ttgccaaaac 6540
tattgtttgt taacaagaaa tttgtggagt agttgaaaaa cgagttttaa tgactccaac 6600
ttaagtgtat gtaaacttcc gacttcaact gtataggtct agagtcgacc tgcaggcatg 6660
caagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 6720
ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 6780
gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 6840
gccagctgca ttaatgaatc ggc 6863
<210> 2
<211> 1559
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
aggcagctcg gggacagcta ggagctccca ggagagagaa ctcaagtctc aagctaacac 60
catcctcagt agcctgtctg cctctgagca ggaaagctgt ggagcccagg agactgtaaa 120
ggggagaact ggccatctta gacttctcta gtactccaac actgcttgct tcagttttcc 180
gtggtttctc agtggtcttt ctgaatgaac tctttctaca ccttcgccgt gtagaggtca 240
atttcaattt caccttcccc tgcccatcct cagtgtatgc tatattttgt ggtgagaaaa 300
ttactaaatt aaagttcatt tgtcagggct ggggagattg gtgagtggta taaagcatcg 360
gttgttttgg cagaggcact ccctctttgc agagtttaat tccctgcacc cagcccgtat 420
ggcagctcac aaccctttgt aactccagtg acagggaagc caacaccttc ttttgaccaa 480
ctccacggta aagtgctaca catacattca tgcaggcaaa acattcatac acgtaaacta 540
tttttaaaag gccatgtgtc cacataccta ttcttccaac atctgtgcag ccattctttc 600
atctctccgt ccatctacct aacaacccgc acacaattaa tacgcatcct ttgatggtaa 660
aaatgtccca gaggcgctat tcttccttgg tctattctct acccactttt ggttgaatcc 720
aggaatgtaa ttgatcaaaa ggaccagcgt tgtgtttgtc cctgatagca cagggataca 780
ctacagccaa tttttctccc ccttagatga tttttgtttg tttgtttgtt ttttagttgt 840
tttaaataaa atgcactgag taccggtatc gtgtctaaag agccaggaaa gtgtggaggt 900
tagagatttt aggagctagc ggccttccaa gcagcgattt aggattaggt gatagagaag 960
ggtgttctgg gactgagcag ggatttcagc aggaaataaa tgctctgtcc cgtgggtgtc 1020
cccagggcat tgtagcctct cagaaggtcc aatcagtgcg ctcagactca gagccctagg 1080
ctcctgctct ttaaattacc gagccttgtg gagaccccgg cacctggcct taagctcagc 1140
cctgagtaag tacgtttctg aaggagtcgg tgttccttta gttccatccc caaacctctg 1200
ccagagaccc tagaggacgc aacaggttcc cagagtcctg gagtcccgtg gtcctgactc 1260
aggcaccctt agccaacccg gggcggagca gtgggacggg ctctcaccca atcactcttg 1320
tggtgccctg gggctggacc ttaaataatt catgaattaa gtggaaggag cccagcttag 1380
aggcgagggg ctggagggtt ccgagacccg gaggagagct ggaccggaga ggtgagttgc 1440
tccgagtgcc gacccagcgc ggggcgctga gctccccctc ttctagaaca cccagggcag 1500
ggatgaggag tggagaagct cgagcaacgt cttcctctgc ctccacagca ggtggcggg 1559
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 4
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
atgaagctgc tgccgtcggt ggtgctgaag ctctttctgg ctgcagttct ctcggcactg 60
gtgactggcg agagcctgga gcggcttcgg agagggctag ctgctggaac cagcaacccg 120
gaccctccca ctgtatccac ggaccagctg ctacccctag gaggcggccg ggaccggaaa 180
gtccgtgact tgcaagaggc agatctggac cttttgagag tcactttatc ctccaagcca 240
caagcactgg ccacaccaaa caaggaggag cacgggaaaa gaaagaagaa aggcaagggg 300
ctagggaaga agagggaccc atgtcttcgg aaatacaagg acttctgcat ccatggagaa 360
tgcaaatatg tgaaggagct ccgggctccc tcctgcatct gccacccggg ttaccatgga 420
gagaggtgtc atgggctgag cctcaaggtt ctgcccacat ggtccacccc ggtgcagcca 480
accatcctgg ccgtggtggc tgtggtgctg tcatctgtct gtctgctggt catcgtgggg 540
cttctcatgt ttaggtacca taggagagga ggttatgatg tggaaaatga agagaaagtg 600
aagttgggca tgactaattc ccactga 627
Claims (7)
1.一种靶向肝前体细胞的质粒系统Prom1-GFP-DTR，其特征在于，该质粒系统的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的靶向肝前体细胞的质粒系统Prom1-GFP-DTR的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、无缝克隆法进行质粒构建
利用NdeI、BsrGI对CD133启动子、绿色荧光蛋白以及白喉毒素受体的PCR产物及载体进行双酶切，反应采用高盐缓冲体系，置于37℃水浴3小时，充分酶切；然后经0.8％琼脂糖电泳分离后，回收凝胶；将酶切片断和载体按照摩尔比2：1混合，进行重组反应；
B、工程菌的制备
取感受态DH5α大肠杆菌于冰上融化；向感受态DH5α大肠杆菌中加入上述构建的质粒，轻轻混匀，静置于冰浴中30分钟，42℃水浴中热激60～90秒，快速将其置于冰浴冷却2分钟，冷却过程中不能振荡大肠杆菌；加入0.9ml无菌的不含抗生素的LB培养基，轻柔混匀后于37℃，180～200rpm摇床上培养1小时；以600g的转速离心3分钟，收集已转化的宿主菌，弃去上清，加入含氨苄青霉素LB培养基重悬；将已转化的宿主菌均匀涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养12～16小时，即获得含有重组质粒的单克隆菌落，
挑取克隆菌落，加入含氨苄青霉素的LB培养基，37℃，180～200rpm摇床上培养12小时，抽提宿主菌的质粒，用NdeI、BsrGI双酶切能够切出一条2950bp，一条3900bp的条带，该宿主菌即为阳性重组子；
C、质粒Prom1-GFP-DTR的抽取和纯化
取经验证为阳性重组子的单克隆宿主菌，加入含氨苄青霉素的LB培养基，37℃，180～200rpm摇床上培养12～16小时；菌液12000g离心2min，弃上清，收集菌体，并按照试剂盒说明进行质粒抽提和纯化。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
其中，步骤B中，所述LB培养基含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠，pH7.0。
4.权利要求1所述的质粒系统在制备治疗肝细胞肝癌药物中的用途，其特征在于：所述治疗肝细胞肝癌药物为靶向肝前体细胞的药物。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：
其中，靶向肝前体细胞药物的活性组分包括所述质粒系统、带动该质粒系统发生转座的转座子系统，所述转座子系统为Sleeping Beauty转座子系统。
6.一种靶向肝前体细胞的药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可用的辅料，所述活性组分包括所述质粒系统、带动该质粒系统发生转座的转座子系统，
所述质粒系统为权利要求1所述的质粒系统，所述转座子系统为Sleeping
Beauty转座子系统。
7.一种治疗肝细胞肝癌的药物组合，其特征在于，包括权利要求6所述的靶向肝前体细胞的药物组合物，以及与该药物组合物配合使用的白喉毒素。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102181399A (zh) * | 2011-03-09 | 2011-09-14 | 上海市肿瘤研究所 | 一种cd133高表达鼠肝肿瘤细胞系及制备方法 |
| JP2018177705A (ja) * | 2017-04-14 | 2018-11-15 | 国立大学法人 新潟大学 | 肝がんの治療剤 |
| CN111088280A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-01 | 浙江大学医学院附属第一医院 | 打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用 |
| CN111607614A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-09-01 | 乾元康安(苏州)生物科技有限公司 | 白喉毒素调控清除免疫细胞的cd45-dtr转基因小鼠的构建方法与应用 |
-
2021
- 2021-11-04 CN CN202111299004.0A patent/CN114214346B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102181399A (zh) * | 2011-03-09 | 2011-09-14 | 上海市肿瘤研究所 | 一种cd133高表达鼠肝肿瘤细胞系及制备方法 |
| JP2018177705A (ja) * | 2017-04-14 | 2018-11-15 | 国立大学法人 新潟大学 | 肝がんの治療剤 |
| CN111088280A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-01 | 浙江大学医学院附属第一医院 | 打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用 |
| CN111607614A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-09-01 | 乾元康安(苏州)生物科技有限公司 | 白喉毒素调控清除免疫细胞的cd45-dtr转基因小鼠的构建方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Targeting Liver Cancer Stem Cells: An Alternative Therapeutic Approach for Liver Cancer;Hwa-Yong Lee等;Cancers;第12卷(第10期);摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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