CN104357459B - 携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用。一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.22所示。该全长感染性克隆成功制备出携带绿色荧光蛋白的重组乙型脑炎病毒。本发明成功获得的携带绿色荧光蛋白基因的重组乙型脑炎病毒，在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

Description

携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制 备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒及制备方法和应用，应用包括在解析脑神经环路、乙型脑炎病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选中的应用。

背景技术

人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础，成年人的大脑中约有10¹¹个神经元,并经10¹⁵个突触相互连接而构成脑神经网络。神经网络的正常连接，使得人体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，如：阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等，但是还没有有效的手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。我国政府高度重视脑科学的研究，《国家中长期科学和技术发展规划》将“脑科学与认知科学”列为八大前沿科学问题之一,有一批科学家已投身于该领域的研究，并取得了一系列的成果。2012年，中国科学院启动了战略性先导科技专项“脑功能联结图谱研究”，并在2014年成立了“脑科学卓越创新中心”。2013年，美国和欧盟已经开始实施人脑图谱研究计划。脑科学研究计划是继人类基因组计划后又一个具有挑战的伟大计划，该计划的研究成果将会和人类基因组计划的成果一样造福人类。性能优良的神经环路示踪工具对于顺利开展该项目具有十分重要的作用。

乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成3个结构蛋白(C、prM、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。乙型脑炎病毒具有广泛的宿主范围，包括：人、猪、鼠、猴、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟类等，能够进入神经系统而引起脑炎。给人类的健康和农业生产带来了巨大损失。目前，有预防该病毒感染的疫苗，对于保障人类的健康和提高农业生产的效率发挥了重要作用。但是，目前还没有有效的药物来特异的治疗该病毒感染引起的疾病。另外，乙型脑炎病毒感染脑神经系统的特性使其成为具备解析神经环路的能力。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了具有表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎病毒全长感染性克隆。将在神经环路标记、抗原表位分析、药物筛选平台的建立、药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种携带绿色荧光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein，EGFP)基因的乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)全长感染性克隆，其序列为SEQ ID NO：22所示。

本发明的目的在于提供了一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的制备方法，方法简单，易行。

本发明的目的在于提供了一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆应用，该全长感染性克隆可应用于脑科学研究和药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下：

(1)拼接乙型脑炎病毒全长基因组序列；

①分节段合成乙型脑炎病毒基因组的互补DNA：以乙型脑炎病毒的全基因组序列(GenBank登陆号AB196923)为对象，并在其基因组的6713位点将原序列的碱基A变成T，但是没有改变氨基酸的编码。分别合成片段F1、F2、F3和F4，每个片段分别连接到载体pUC57。

F1、F2、F3和F4片段的序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4所示。

②乙型脑炎病毒基因组四个片段的拼接：用SalI和KpnI酶切pMW118，采用胶回收的方法回收pMW118的大片段，采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F1和F2片段插入到pMW118，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2；然后使用NaeI和KpnI酶切pJEVF1-F2，采用胶回收的方法回收pJEVF1-F2的大片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F3和F4片段插入到pJEVF1-F2，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2-F3-F4，即为乙型脑炎病毒的全长感染性克隆pJEVFL；

(2)构建携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆；

①将EGFP基因插入到乙型脑炎病毒的E基因和NS1基因之间：合成序列SEQ ID NO:14，并将该片断连接进入pUC57。以pEGFP-C1质粒为模板，扩增EGFP片段为SEQ ID NO:19所示。

使用SacI酶切pJEVFL，然后采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19片段插入到pJEVFL，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVFL-EGFP，其序列为SEQ ID NO:22所示。

携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的应用，包括以下应用：

(1)携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆(本发明或称pJEVFL-EGFP)制备病毒的能力：

用KpnI酶切pJEVFL-EGFP，回收被酶切的产物，使用MEGAscript T7TranscriptionKit分别体外转录酶切后的pJEVFL-EGFP成为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞作为对照组，通过Olympus倒置荧光显微镜观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达情况。本发明的全长感染性克隆成功制备表达EGFP的重组JEV(本发明或称JEV-EGFP)。

(2)JEV-EGFP在研究脑神经环路平台中的应用：

取0.3μl JEV-EGFP病毒定位注射到鼠嗅球，感染后6天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。

所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猴、豚鼠、人、蝙蝠、猪、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟等动物的神经环路标记。

(3)JEV-EGFP在分析抗原表位和抗乙型脑炎病毒药物(抗体药)筛选中的应用：

在6孔细胞培养板中接种8×10⁵BHK21细胞/孔，在37℃,5％(v/v)CO₂培养条件下，汇合度达到90％时。将50μl pJEVFL-EGFP P0代病毒液与50μl乙型脑炎病毒的抗体混合，37℃吸附30min，然后将该混合液加入各孔，37℃吸附1h；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5％(v/v)CO₂的培养箱中培养72h，使用荧光显微镜观察。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明制备了表达EGFP的乙型脑炎病毒(JEV-EGFP)，其具有可视化的特点，便于开展相关的研究。目前国内外还没有用于表达绿色荧光蛋白的重组乙型脑炎病毒，本发明填补了该空白。

2.本发明对于开展JEV的基础性研究(如致病机制、复制机制等)和应用性研究(如神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值；

3.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。JEV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于鼠等非灵长类动物，而且还能用于非人灵长类动物的脑科学研究。

附图说明

图1为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的构建示意图。

图2为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒产生的细胞病变和表达荧光示意图。

A：未感染病毒的细胞；

B：JEV-EGFP感染BHK21细胞产生的细胞病变；

C：JEV-EGFP感染BHK21细胞表达荧光蛋白。

图3为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒解析鼠脑神经环路的示意图。

A：JEV-EGFP标记鼠嗅球；

B：JEV-EGFP标记鼠梨状皮层；

C：JEV-EGFP标记鼠前嗅核。

图4为一种携带EGFP基因的JEV用于抗原表位分析和抑制乙型脑炎病毒的抗体药的作用示意图。

A：不含抗体而含有JEV-EGFP的对照孔；

B：1:10稀释的抗体对JEV-EGFP的抑制作用；

C：1:100稀释的抗体对JEV-EGFP的抑制作用；

C：不含抗体和病毒的对照孔。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术

实施例1：携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下：

(1)拼接JEV全长基因组序列；

①分节段合成乙型脑炎病毒基因组的互补DNA：以乙型脑炎病毒的全基因组序列(GenBank登陆号AB196923)为对象，并在其基因组的6713位点将原序列的碱基A变成T，但是没有改变氨基酸的编码。分别合成片段F1、F2、F3和F4，每个片段分别连接到载体pUC57。片段的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。为了大量富集目标片段用于后续的基因组组装，分别采用PCR的方法富集片段EQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。DNA片段F1的引物：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，DNA片段F2的引物：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，DNA片段F3的引物：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，DNA片段F4的引物：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，另外SEQ ID NO:5含有T7RNA聚合酶启动子序列SEQ ID NO:13；

本发明所有PCR所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR的反应体系均为50μl：5×Q5Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μM Forward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，Q5High-Fidelity DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃30s，98℃5s，55℃10s，72℃40s，72℃2min，4℃10min，30个循环；

②JEV基因组四个片段的拼接：采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组的方法，将扩增的四个片段连接到低拷贝载体pMW118。用SalI和KpnI酶切pMW118，采用胶回收的方法回收pMW118的大片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，采用Gibson Assembly Cloning Kit将F1和F2片段插入到pMW118，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2；

然后使用NaeI和KpnI酶切pJEVF1-F2，采用胶回收的方法回收pJEVF1-F2的大片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，采用Gibson Assembly CloningKit将F3和F4片段插入到pJEVF1-F2，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2-F3-F4，即为JEV病毒的全长感染性克隆pJEVFL；

鉴定pJEVF1-F2所用的引物为片段F1的引物为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

鉴定pJEVF1-F2-F3-F4所用的引物为片段F2的引物为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

(2)构建携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆；

①将EGFP基因插入到JEV的E基因和NS1基因之间：为了便于后续克隆的构建和避免病毒内部发生同源重组，采用基因片段合成的方法合成序列SEQ ID NO:14，并将该片断连接进入pUC57。使用NEB Q5High-Fidelity DNA Polymerase扩增SEQ ID NO:14。DNA片段SEQ ID NO:14的引物：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。SEQ ID NO:14含有合成的E基因的C端部分序列SEQ ID NO:17，合成的NS1基因的N端部分序列SEQ ID NO:18。

另外，以pEGFP-C1质粒为模板，扩增EGFP片段SEQ ID NO:19。扩增DNA片段SEQ IDNO:19的引物：SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收DNA片断，使用Thermo ScientificNanoDrop 2000测定DNA的浓度，使用浓度为1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用；

PCR的反应体系均为50μl：5×Q5Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，Q5High-Fidelity DNA Polymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃30s，98℃5s，55℃10s，72℃40s，72℃2min，4℃10min，30个循环；

使用SacI酶切pJEVFL，然后采用Gibson Assembly Cloning Kit将SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19片段插入到pJEVFL，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVFL-EGFP，其序列为SEQ ID NO：22所示。

实施例2：pJEVFL-EGFP成功制备出表达EGFP的JEV，其步骤是：

用KpnI酶切pJEVFL-EGFP,使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收被酶切的产物，使用Thermo Scientific NanoDrop2000测定DNA的浓度，使用浓度为1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用；使用MEGAscript T7Transcription Kit分别体外转录酶切后的pJEVFL-EGFP,成为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞作为对照组，通过倒置荧光显微镜(Olympus)观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达。

未转染pJEVFL-EGFP RNA的细胞，无细胞病变发生(图2A)，在明场下观察转染pJEVFL-EGFP RNA的BHK21细胞，可见明显的细胞病变(图2B)，表明已经产生了重组病毒；在相同的视野下，使用蓝色激发荧光，可见明显的绿色(图2C)，表明重组病毒可以表达携带的外源基因绿色荧光蛋白。以上数据表明携带EGFP基因的重组乙型脑炎病毒全长感染性克隆具有制备乙型脑炎病毒及表达外源基因的能力，按常规方法搜集制得的。

以下应用实施例均使用的是本实施例制备的由pJEVFL-EGFP成功制备出的表达绿色荧光蛋白的JEV(JEV-EGFP)，使用的病毒滴度为3×10⁶PFU/ml。

实施例3：JEV-EGFP在解析脑神经环路中的应用，其步骤是：

取0.3μl实施例2制备的重组JEV(JEV-EGFP)定位注射到鼠嗅球，感染后6天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。在重组病毒注射到嗅球的一个点之后，可见明显的荧光呈环状的标记，表明重组病毒能够在鼠脑内产生病毒，且该病毒具有表达绿色荧光蛋白的能力(图3A),进一步分析与嗅球相连接的脑区，可见在鼠脑的梨状皮层(图3B)和鼠脑的前嗅核(图3C)均有绿色荧光蛋白的表达，表明重组的病毒能够在神经网络中运输，具有标记脑神经环路的能力。

实施例4：JEV-EGFP在分析抗原表位和筛选抗JEV药物(抗体药)中的应用，其步骤是：

在6孔细胞培养板中接种8×10⁵BHK21细胞/孔，在37℃,5％(v/v)CO₂培养条件下，汇合度达到90％时。将50μl实施例2制备的重组JEV(JEV-EGFP)P0代病毒液与50μl JEV的E蛋白多克隆抗体(浓度分别为1：10和1：100稀释)混合，37℃吸附30min，然后将该混合液加入各孔，37℃吸附1h；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5％(v/v)CO₂的培养箱中培养72h，使用荧光显微镜观察。

乙型脑炎病毒感染细胞是通过病毒表面的配体(抗原)与细胞表面的受体结合而引导病毒进入细胞，一蛋白配体与细胞表面受体类似物结合之后则无法引导病毒进入细胞，针对病毒抗原的抗体具有类似细胞表面受体的性质，病毒抗原能够通过特定的表位与抗体结合。基于此原理，该实施例将表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎病毒分别与不同含量的抗体体外孵育，然后再感染细胞，检测其荧光的表达。在不含抗体而含有重组乙型脑炎病毒的对照孔，荧光分布于整个视野(图4A)。而当与抗体体外孵育后再感染BHK21细胞，则严重的影响了病毒进入细胞的能力(图4B和4C)，只含有抗体而未感染病毒的细胞组未见细胞病变和绿色荧光蛋白(图4D)。该实施例表明该重组病毒的配体与其对应的抗体通过特定抗原表位的结合而抑制病毒进入细胞，一方面提示该病毒能够用于分析抗原表位；另一方面提示该重组病毒能够用于筛选抗乙型脑炎病毒药物(如抗体药)。

最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所

<120> 携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用

<130> 携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用

<160> 22

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 3462

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt 60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg 120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg 180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg gccagtacgt ttcgtgctgg 240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat 300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtagcaatga aacatctcac tagtttcaaa cgagaacttg 360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg 420

aaggctcaat catgtggctc gcgagcttgg cagttgtcat agcttgtgca ggagccatga 480

agttgtcaaa tttccagggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg 540

ttatcgtgat tcccacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgacgtcg 600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc 660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca 720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga gatccgtgtc ggtccaaaca catggggaga 780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca 840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg 900

gctggatgct tggcagtaac aacggtcaac gcgtggtatt caccatcctc ctgctgctgg 960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa tcgtgacttc atagaaggag 1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttggtgc tagaaggaga tagctgcttg acaattatgg 1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgatcaacat cgaagctagc caacttgctg 1140

aggtcagaag ttactgttat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc 1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag 1260

gcttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca 1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaaag cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca 1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ttcggaaaac catgggaatt 1440

attcagcgca agttggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt 1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgag ccaaggagtg 1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata 1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa 1680

acagagaact cctcatggag tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc 1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgttggcagg agccatcgtg gtggagtact 1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg 1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgca cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg 1920

cggacactgg tcacggaaca gttgtcattg aactctccta ctctgggagt gatggcccct 1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg 2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaattc aaaggtgctg gtcgagatgg 2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc 2160

attggcacaa agctggaagc acgctgggca aagccttttc aacaactttg aagggagctc 2220

agagactggc agcgttgggt gacacagcct gggactttgg ctccattgga ggggtcttca 2280

actccatagg aaaagccgtt caccaagtgt ttggtggtgc cttcagaaca ctctttgggg 2340

gaatgtcttg gatcacacaa gggctaatgg gtgccctact actctggatg ggcgtcaacg 2400

cacgagaccg atcaattgct ttggccttct tagccacagg aggtgtgctc gtgttcttag 2460

cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cacaagaaaa gagatgaggt 2520

gtggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg tataaatatt 2580

tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag gaaggcgtgt 2640

gcggagtcag atctgtcact agactggagc atcaaatgtg ggaagccgta cgggatgaat 2700

tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg 2760

ggagatatcg ctcagcccct aaacgcctat ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct 2820

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tcgaagactt cggctttggc atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaga 3000

gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gtacggctgt caaaggacat gtggcagtcc 3060

atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg 3120

cagtctttgg agaggttaaa tcttgcactt ggccagagac acacacccta tggggagatg 3180

gtgttgagga aagtgaactc atcattccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca 3240

atcggaggga agggtataag acacaaaacc agggaccttg ggacgagaat ggcatagtct 3300

tggactttga ctattgccca gggacaaaag tcaccattac agaggattgt ggcaagagag 3360

gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat cactgactgg tgctgtcgca 3420

gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ct 3462

<210> 2

<211> 2136

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccggacagaa aatggctgct ggtacggaat ggaaatcaga cctgttaggc atgatgaaac 60

aacactcgtc agatcacagg ttgatgcttt taatggtgaa atggttgacc cttttcagct 120

gggccttctg gtgatgtttc tggccaccca ggaggtcctt cgcaagaggt ggacggccag 180

attgaccatt cctgcggttt tgggggcctt acttgtgctg atgcttgggg gcatcactta 240

cactgatttg gcgaggtatg tggtgctagt cgctgctgct ttcgcagagg ccaacagtgg 300

aggagacgtc ctgcaccttg ctttgattgc cgtttttaag atccaaccag catttttagt 360

gatgaacatg cttagcacga gatggacgaa ccaagaaaac gtggttctgg tcctaggggc 420

tgcctttttc caattggcct cagtagatct gcaaatagga gttcacggaa tcctgaatgc 480

cgccgctata gcatggatga ttgtccgggc gatcaccttc cccacaacct cctccgtcac 540

catgccagtc ttagcgcttc taaccccggg aatgagggct ctatacctag atacttacag 600

aatcatcctc ctcgtcatag ggatttgctc tctgctgcaa gagaggaaaa agaccatggc 660

aaaaaagaaa ggagctgtac tcttgggctt agcgctcaca tccactggat ggttttcgcc 720

caccactata gctgccggac taatggtctg caacccaaac aagaagagag ggtggccagc 780

tactgagttt ttgtcggcag ttggattgat gtttgccatc gtaggtggtt tggcagagtt 840

ggatattgaa tccatgtcaa tacccttcat gctggcaggt ctcatggcag tgtcctacgt 900

ggtgtcagga aaagcaacag atatgtggct tgaacgggcc gccgacatca gctgggagat 960

ggatgctgca atcacaggaa gcagtcggag gctggatgtg aagctggatg aagacggaga 1020

ttttcacttg attgatgatc ccggtgttcc atggaaggtc tgggtcctgc gcatgtcttg 1080

cattggctta gccgccctca cgccttgggc cattgttccc gccgcttttg gttattggct 1140

cactttaaaa acaacaaaaa gaggaggcgt gttttgggac acgccatccc caaaaccttg 1200

ctcaaaagga gacaccacta caggagttta ccgcattatg gctagaggga ttcttggcac 1260

ttaccaggcc ggcgtcggag tcatgtacga gaatgttttc cacacactat ggcacacaac 1320

tagaggagca gccattatga gtggagaagg aaaattgacg ccatactggg gtagtgtgaa 1380

agaagaccgc atagcttacg gaggcccatg gaggtttgat cgaaaatgga atggaacaga 1440

tgacgtgcaa gtgatcgtgg tagaaccggg gaaggctgca gtaaacatcc agacaaaacc 1500

aggggtgttt cggactccct tcggggaggt tggggctgtt agtctggatt acccgcgagg 1560

aacatccggc tcacccattc tggattccaa tggagacatc ataggcctgt acggcaatgg 1620

agttgagctt ggcgatggtt catacgtcag cgccatcgtg cagggtgacc gtcaggagga 1680

accagtccca gaagcttaca ccccaaacat gttgagaaag agacagatga ctgtactaga 1740

tttgcaccct ggttcaggga aaaccaggaa aattctgcca caaataatta aggacgctat 1800

ccagcagcgc ctaagaacag ctgtgttggc accgacgcgg gtggtagcag cagaaatggc 1860

agaagctttg agagggctcc cagtacgata tcaaacttca gcagtgcaga gagagcacca 1920

agggaatgaa atagtggatg tgatgtgcca cgccactctg acccatagac tgatgtcacc 1980

gaacagagtg cccaactaca acctatttgt catggatgaa gctcatttca ccgacccagc 2040

cagtatagct gcacgaggat acattgctac caaggtggaa ttaggggagg cagcagccat 2100

ctttatgaca gcgaccccgc ctggaaccac ggatcc 2136

<210> 3

<211> 3231

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttggcactt accaggccgg cgtcggagtc atgtacgaga atgttttcca cacactatgg 60

cacacaacta gaggagcagc cattatgagt ggagaaggaa aattgacgcc atactggggt 120

agtgtgaaag aagaccgcat agcttacgga ggcccatgga ggtttgatcg aaaatggaat 180

ggaacagatg acgtgcaagt gatcgtggta gaaccgggga aggctgcagt aaacatccag 240

acaaaaccag gggtgtttcg gactcccttc ggggaggttg gggctgttag tctggattac 300

ccgcgaggaa catccggctc acccattctg gattccaatg gagacatcat aggcctgtac 360

ggcaatggag ttgagcttgg cgatggttca tacgtcagcg ccatcgtgca gggtgaccgt 420

caggaggaac cagtcccaga agcttacacc ccaaacatgt tgagaaagag acagatgact 480

gtactagatt tgcaccctgg ttcagggaaa accaggaaaa ttctgccaca aataattaag 540

gacgctatcc agcagcgcct aagaacagct gtgttggcac cgacgcgggt ggtagcagca 600

gaaatggcag aagctttgag agggctccca gtacgatatc aaacttcagc agtgcagaga 660

gagcaccaag ggaatgaaat agtggatgtg atgtgccacg ccactctgac ccatagactg 720

atgtcaccga acagagtgcc caactacaac ctatttgtca tggatgaagc tcatttcacc 780

gacccagcca gtatagctgc acgaggatac attgctacca aggtggaatt aggggaggca 840

gcagccatct ttatgacagc gaccccgcct ggaaccacgg atccttttcc tgactcaaat 900

gccccaatcc atgatttgca agatgagata ccagacaggg cgtggagcag tggatacgaa 960

tggatcacag aatatgcggg aaaaaccgtg tggtttgtgg caagcgtaaa aatggggaat 1020

gagattgcaa tgtgcctcca aagagcgggg aaaaaggtca tccaactcaa ccgcaagtcc 1080

tatgacacag aatacccaaa atgtaagaat ggagactggg attttgtcat caccaccgac 1140

atctctgaaa tgggggccaa cttcggtgcg agcagggtca tcgactgtag aaagagcgtg 1200

aagcctacca tcttagaaga gggagaaggc agagtcatcc tcggaaaccc atcccccata 1260

accagcgcaa gcgcagctca acggaggggc agggtaggca gaaaccccaa ccaggttgga 1320

gatgaatacc actatggggg ggccaccagt gaagatgaca gtaatctagc ccattggaca 1380

gaggcaaaga tcatgttaga caacatacac atgcccaatg gactggtggc ccagctctat 1440

ggaccagaga gggaaaaggc cttcacaatg gatggcgaat accgtctcag aggtgaagaa 1500

aagaaaaact tcttagagct gcttaggacg gctgacctcc cggtgtggct ggcctacaag 1560

gtggcgtcca atggcattca gtacaccgac agaaagtggt gttttgatgg gccgcgcacg 1620

aatgccatac tggaggacaa catcgaggta gagatagtca cccggatggg tgagaggaaa 1680

atcctcaagc cgagatggct tgatgcaaga gtttatgcag atcaccaagc cctcaagtgg 1740

ttcaaagact tcgcagcagg aaagagatca gccgttagct tcatagaggt gctcggtcgt 1800

atgcctgagc atttcatggg aaagacgcgg gaagctttag acaccatgta cttggttgca 1860

acggctgaga aaggtgggaa agcacaccga atggctctcg aagagctgcc agatgcactg 1920

gaaaccatta cacttattgt tgctatcact gtgatgacag gaggattctt tctactcatg 1980

atgcagcgaa agggtatagg gaagatgggt cttggtgctc tagtgctcac gctagctacc 2040

ttcttcctgt gggcggcaga ggttcctgga accaaaatag cggggaccct gctgatcgcc 2100

ctgctgctta tggtggttct catcccagaa ccggaaaaac agaggtcaca gacagataac 2160

caactggcgg tgtttctcat ctgtgtcttg accgtggttg gagtggtggc agcaaacgag 2220

tacgggatgc tagaaaaaac caaagcagac ctcaagagca tgtttggcgg aaagacgcag 2280

gcatcaggac tgactggatt gccaagcatg gcactggacc tgcgtccagc cacagcttgg 2340

gcactgtatg gggggagcac agtcgtgcta acccctcttc tgaagcacct gatcacgtcg 2400

gaatacgtca ccacatcgct agcctcaatt aactcacaag ctggctcatt atttgtcttg 2460

ccacgaggcg tgccttttac cgacctagac ttgaccgttg gcctcgtcct ccttggctgt 2520

tggggtcaaa tcaccctcac aacgtttttg acagccatgg ttctggcgac acttcactat 2580

gggtacatgc tccctggatg gcaagcagaa gcactcaggg ctgcccagag aaggacagcg 2640

gctggaataa tgaagaatgc cgttgttgac ggaatggtcg ccactgatgt gcctgaactg 2700

gaaaggacca ctcctctgat gcaaaagaaa gtcggacagg tgctcctcat aggggtaagc 2760

gtggcagcgt tcctcgtcaa ccccaatgtc accactgtga gagaagcagg ggtgttggtg 2820

acggcggcta cgctcacttt gtgggacaat ggagccagtg ccgtttggaa ttccaccact 2880

gccacgggac tctgccatgt aatgcgaggt agctacctgg ctggaggctc cattgcttgg 2940

actctcatca agaacgctga caagccctcc ttgaaaaggg gaaggcctgg gggcaggacg 3000

ctaggggagc agtggaagga aaaactaaat gccatgagca gagaagagtt ttttaaatac 3060

cggagagagg ccataatcga ggtggaccgc actgaagcac gcagggctag acgtgaaaat 3120

aacatagtgg gaggacatcc ggtttcgcga ggctcagcaa aactccgttg gctcgtggag 3180

aaaggatttg tctcgccaat aggaaaagtc attgatctag ggtgtgggcg t 3231

<210> 4

<211> 3069

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgatctagg gtgtgggcgt ggaggatgga gctactacgc agcaaccctg aagaaggtcc 60

aggaagtcag aggatacacg aaaggtgggg cgggacatga agaaccgatg ctcatgcaga 120

gctacggctg gaacctggtc tccctgaaga gtggagtgga cgtgttttac aaaccttcag 180

agcccagtga cactctgttc tgcgacatag gggaatcctc cccaagtcca gaagtagaag 240

aacaacgcac attacgcgtc ctagagatga catctgactg gttgcaccga ggacctagag 300

agttctgcat aaaagttctt tgcccctaca tgcccaaggt tatagaaaaa atggaagttc 360

tgcagcgccg cttcggaggt gggctagtgc gtctccccct gtcccgcaac tccaatcacg 420

agatgtattg ggttagtgga gccgctggca atgtggtgca cgctgtgaac atgaccagcc 480

aggtactact ggggcgaatg gatcgcacag tgtggagagg gccaaagtat gaggaagatg 540

tcaacctagg gagcggaaca agagccgtgg gaaagggaga agtccatagc aatcaggaga 600

aaatcaagaa gagaatccag aagcttaaag aagaattcgc cacaacgtgg cacaaagacc 660

ctgagcatcc ataccgcact tggacatacc acggaagcta tgaagtgaag gctactggct 720

cagctagctc tctcgtcaac ggagtggtga agctcatgag caaaccttgg gacgccattg 780

ccaacgtcac caccatggcc atgactgaca ccaccccgtt tggacagcaa agagttttca 840

aggagaaagt tgacacgaag gctcctgagc caccagctgg agccaaggaa gtgctcaacg 900

agaccaccaa ctggctgtgg gcctacttgt cacgggaaaa aagaccccgc ttgtgcacca 960

aggaagaatt cataaagaaa gtcaatagca acgcggctct tggagcagtg ttcgctgaac 1020

agaatcaatg gagcacggcg cgtgaggctg tggatgaccc gcggttttgg gagatggttg 1080

atgaagagag ggaaaaccat ctgcgaggag agtgtcacac atgtatctat aacatgatgg 1140

gaaaaagaga gaagaagcct ggagagtttg gaaaagctaa aggaagcagg gccatttggt 1200

tcatgtggct tggagcacgg tatctagagt ttgaagcttt ggggttcctg aatgaagacc 1260

attggctgag ccgagagaat tcaggaggtg gagtggaagg ctcaggcgtc caaaagctgg 1320

gatacatcct ccgtgacata gcaggaaagc aaggagggaa aatgtacgct gatgataccg 1380

ccgggtggga cactagaatt accagaactg atttagaaaa tgaagctaag gtgctggagc 1440

ttctagatgg tgaacaccgc atgctcgccc gagccataat tgaattgact tacaggcaca 1500

aagtggtcaa ggtcatgaga cctgcagcag aaggaaagac cgtgatggac gtgatatcaa 1560

gagaagatca aagggggagt ggacaggtgg tcacttatgc tcttaacact ttcacgaaca 1620

tcgctgtcca gctcgtcagg ctgatggagg ctgagggggt cattggacca caacacttgg 1680

aacagctacc tagaaaaaac aagatagctg tcaggacctg gctctttgag aatggagagg 1740

agagagtgac caggatggcg atcagcggag acgactgtgt cgtcaagccg ctggacgaca 1800

gattcgccac ggccctccac ttcctcaacg caatgtcaaa ggtcagaaag gacatccagg 1860

aatggaagcc ttcgcatggc tggcacgact ggcagcaagt tcccttctgc tctaaccatt 1920

ttcaggagat tgtgatgaaa gatggaagga gtatcgttgt cccgtgcaga ggacaggatg 1980

agctgatagg cagggctcgc atctccccag gagctggatg gaatgtgaag gacacagctt 2040

gtctggccaa agcatatgca cagatgtggc tactcctata cttccatcgt agggacttgc 2100

gtctcatggc aaatgcgatt tgctcagcag tgccagtgga ttgggtgccc acgggcagga 2160

catcctggtc gatacactcg aaaggagagt ggatgaccac agaagacatg ctgcaggtct 2220

ggaacagagt ctggattgaa gaaaatgaat ggatgatgga caagactcca atcacaagct 2280

ggacagacgt tccgtacgtg ggaaagcgtg aggacatctg gtgtggcagc ctcatcggaa 2340

cgcgatccag agcaacctgg gctgagaaca tctacgcggc gataaaccag gttagagctg 2400

tcattgggaa agaaaattat gttgactaca tgacctcact caggagatac gaagacgtct 2460

tgatccagga agacagggtc atctagtgtg atttaaggta gaaaagtaga ctatgtaaat 2520

aatgtaaatg agaaaatgca tgcatatgga gtcaggccag caaaagctgc caccggatac 2580

tgggtagacg gtgctgcctg cgtctcagtc ccaggaggac tgggttaaca aatctgacaa 2640

cagaaagtga gaaagccctc agaaccgtct cggaagcagg tccctgctca ctggaagttg 2700

aaggaccaac gtcaggccac aaatttgtgc cactccgctg gggagtgcgg cctgcgcagc 2760

cccaggagga ctgggttacc aaagccgttg aggcccccac ggcccaagcc tcgtctagga 2820

tgcaatagac gaggtgtaag gactagaggt tagaggagac cccgtggaaa caacaacatg 2880

cggcccaagc cccctcgaag ctgtagagga ggtggaagga ctagaggtta gaggagaccc 2940

cgcatttgca tcaaacagca tattgacacc tgggaataga ctgggagatc ttctgctcta 3000

tctcaacatc agctactagg cacagagcgc cgaagtatgt agctggtggt gagtaagaac 3060

acaggatct 3069

<210> 5

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caagcttgca tgcctgcagg tcgacggtaa tacgactcac tatagagaag tttatctgtg 60

tgaac 65

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agccattttc tgtccggaat cgtaggggcg gaaggga 37

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccggacagaa aatggctgct g 21

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgacagctta tcatcgatgg gtaccggatc cgtggttcca ggcgg 45

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cttggcactt accaggccgg c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgcccacac cctagatcaa 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgatctagg gtgtgggcgt g 21

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgacagctta tcatcgatgg gtaccagatc ctgtgttctt actcac 46

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

taatacgact cactatag 18

<210> 14

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagctcaaag gctcgccgct ctgggcgata ccgcttggga tttcggcagc atcggcggag 60

tgtttaattc tatcggcaag gctgtgcatc aggtcttcgg cggagctttt aggaccctgt 120

tcggaggcat gagctggatt acccagggcc tgatgggcgc tctcctgctt tggatgggag 180

tgaatgccag agataggagc atcgccctgg cttttctagc taccggcggc gtcctggtct 240

ttttggccac aaacgtccac gccgataccg gctgcgctat cgatattacc cggccgatgg 300

tgagcaaggg cgaggagc 318

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caacaacttt gaagggagct caaaggctcg ccgct 35

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctcctcgccc ttgctcacca tcggccgggt aatatcgata gcgcagc 47

<210> 17

<211> 263

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gagctcaaag gctcgccgct ctgggcgata ccgcttggga tttcggcagc atcggcggag 60

tgtttaattc tatcggcaag gctgtgcatc aggtcttcgg cggagctttt aggaccctgt 120

tcggaggcat gagctggatt acccagggcc tgatgggcgc tctcctgctt tggatgggag 180

tgaatgccag agataggagc atcgccctgg cttttctagc taccggcggc gtcctggtct 240

ttttggccac aaacgtccac gcc 263

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gataccggct gcgctatcga tattacc 27

<210> 19

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atggtgagca agggcgagga g 21

<210> 21

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cccaacgctg ccagtctctg agctcccttc aaagttgttg aaaaggcttt ctcgagcttg 60

tacagctcgt cca 73

<210> 22

<211> 16257

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt 60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg 120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg 180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg gccagtacgt ttcgtgctgg 240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat 300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtagcaatga aacatctcac tagtttcaaa cgagaacttg 360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg 420

aaggctcaat catgtggctc gcgagcttgg cagttgtcat agcttgtgca ggagccatga 480

agttgtcaaa tttccagggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg 540

ttatcgtgat tcccacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgacgtcg 600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc 660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca 720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga gatccgtgtc ggtccaaaca catggggaga 780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca 840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg 900

gctggatgct tggcagtaac aacggtcaac gcgtggtatt caccatcctc ctgctgctgg 960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa tcgtgacttc atagaaggag 1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttggtgc tagaaggaga tagctgcttg acaattatgg 1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgatcaacat cgaagctagc caacttgctg 1140

aggtcagaag ttactgttat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc 1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag 1260

gcttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca 1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaaag cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca 1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ttcggaaaac catgggaatt 1440

attcagcgca agttggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt 1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgag ccaaggagtg 1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata 1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa 1680

acagagaact cctcatggag tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc 1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgttggcagg agccatcgtg gtggagtact 1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg 1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgca cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg 1920

cggacactgg tcacggaaca gttgtcattg aactctccta ctctgggagt gatggcccct 1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg 2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaattc aaaggtgctg gtcgagatgg 2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc 2160

attggcacaa agctggaagc acgctgggca aagccttttc aacaactttg aagggagctc 2220

aaaggctcgc cgctctgggc gataccgctt gggatttcgg cagcatcggc ggagtgttta 2280

attctatcgg caaggctgtg catcaggtct tcggcggagc ttttaggacc ctgttcggag 2340

gcatgagctg gattacccag ggcctgatgg gcgctctcct gctttggatg ggagtgaatg 2400

ccagagatag gagcatcgcc ctggcttttc tagctaccgg cggcgtcctg gtctttttgg 2460

ccacaaacgt ccacgccgat accggctgcg ctatcgatat tacccggccg atggtgagca 2520

agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa 2580

acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga 2640

ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca 2700

ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact 2760

tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg 2820

acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca 2880

tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt 2940

acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg 3000

tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc 3060

agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca 3120

cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt 3180

tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagctc gagaaagcct 3240

tttcaacaac tttgaaggga gctcagagac tggcagcgtt gggtgacaca gcctgggact 3300

ttggctccat tggaggggtc ttcaactcca taggaaaagc cgttcaccaa gtgtttggtg 3360

gtgccttcag aacactcttt gggggaatgt cttggatcac acaagggcta atgggtgccc 3420

tactactctg gatgggcgtc aacgcacgag accgatcaat tgctttggcc ttcttagcca 3480

caggaggtgt gctcgtgttc ttagcgacca atgtgcatgc tgacactgga tgtgccattg 3540

acatcacaag aaaagagatg aggtgtggaa gtggcatctt cgtgcacaac gacgtggaag 3600

cctgggtgga taggtataaa tatttgccag aaacgcccag atccctagcg aagatcgtcc 3660

acaaagcgca caaggaaggc gtgtgcggag tcagatctgt cactagactg gagcatcaaa 3720

tgtgggaagc cgtacgggat gaattgaacg tcctgctcaa agagaatgca gtggacctca 3780

gtgtggttgt gaacaagccc gtggggagat atcgctcagc ccctaaacgc ctatccatga 3840

cgcaagagaa gtttgaaatg ggctggaaag catggggaaa aagcattctc tttgccccgg 3900

aattggctaa ctccacattt gtcgtagatg gacctgagac aaaggaatgc cctgatgagc 3960

acagagcttg gaacagcatg caaatcgaag acttcggctt tggcatcaca tcaacccgtg 4020

tgtggctgaa gattagagag gagagcactg acgagtgtga tggagcgatc ataggtacgg 4080

ctgtcaaagg acatgtggca gtccatagtg acttgtcgta ctggattgag agtcgctaca 4140

acgacacatg gaaacttgag agggcagtct ttggagaggt taaatcttgc acttggccag 4200

agacacacac cctatgggga gatggtgttg aggaaagtga actcatcatt ccgcatacca 4260

tagccggacc aaaaagcaag cacaatcgga gggaagggta taagacacaa aaccagggac 4320

cttgggacga gaatggcata gtcttggact ttgactattg cccagggaca aaagtcacca 4380

ttacagagga ttgtggcaag agaggccctt cggtcagaac cactactgac agtggaaagt 4440

tgatcactga ctggtgctgt cgcagttgct cccttccgcc cctacgattc cggacagaaa 4500

atggctgctg gtacggaatg gaaatcagac ctgttaggca tgatgaaaca acactcgtca 4560

gatcacaggt tgatgctttt aatggtgaaa tggttgaccc ttttcagctg ggccttctgg 4620

tgatgtttct ggccacccag gaggtccttc gcaagaggtg gacggccaga ttgaccattc 4680

ctgcggtttt gggggcctta cttgtgctga tgcttggggg catcacttac actgatttgg 4740

cgaggtatgt ggtgctagtc gctgctgctt tcgcagaggc caacagtgga ggagacgtcc 4800

tgcaccttgc tttgattgcc gtttttaaga tccaaccagc atttttagtg atgaacatgc 4860

ttagcacgag atggacgaac caagaaaacg tggttctggt cctaggggct gcctttttcc 4920

aattggcctc agtagatctg caaataggag ttcacggaat cctgaatgcc gccgctatag 4980

catggatgat tgtccgggcg atcaccttcc ccacaacctc ctccgtcacc atgccagtct 5040

tagcgcttct aaccccggga atgagggctc tatacctaga tacttacaga atcatcctcc 5100

tcgtcatagg gatttgctct ctgctgcaag agaggaaaaa gaccatggca aaaaagaaag 5160

gagctgtact cttgggctta gcgctcacat ccactggatg gttttcgccc accactatag 5220

ctgccggact aatggtctgc aacccaaaca agaagagagg gtggccagct actgagtttt 5280

tgtcggcagt tggattgatg tttgccatcg taggtggttt ggcagagttg gatattgaat 5340

ccatgtcaat acccttcatg ctggcaggtc tcatggcagt gtcctacgtg gtgtcaggaa 5400

aagcaacaga tatgtggctt gaacgggccg ccgacatcag ctgggagatg gatgctgcaa 5460

tcacaggaag cagtcggagg ctggatgtga agctggatga agacggagat tttcacttga 5520

ttgatgatcc cggtgttcca tggaaggtct gggtcctgcg catgtcttgc attggcttag 5580

ccgccctcac gccttgggcc attgttcccg ccgcttttgg ttattggctc actttaaaaa 5640

caacaaaaag aggaggcgtg ttttgggaca cgccatcccc aaaaccttgc tcaaaaggag 5700

acaccactac aggagtttac cgcattatgg ctagagggat tcttggcact taccaggccg 5760

gcgtcggagt catgtacgag aatgttttcc acacactatg gcacacaact agaggagcag 5820

ccattatgag tggagaagga aaattgacgc catactgggg tagtgtgaaa gaagaccgca 5880

tagcttacgg aggcccatgg aggtttgatc gaaaatggaa tggaacagat gacgtgcaag 5940

tgatcgtggt agaaccgggg aaggctgcag taaacatcca gacaaaacca ggggtgtttc 6000

ggactccctt cggggaggtt ggggctgtta gtctggatta cccgcgagga acatccggct 6060

cacccattct ggattccaat ggagacatca taggcctgta cggcaatgga gttgagcttg 6120

gcgatggttc atacgtcagc gccatcgtgc agggtgaccg tcaggaggaa ccagtcccag 6180

aagcttacac cccaaacatg ttgagaaaga gacagatgac tgtactagat ttgcaccctg 6240

gttcagggaa aaccaggaaa attctgccac aaataattaa ggacgctatc cagcagcgcc 6300

taagaacagc tgtgttggca ccgacgcggg tggtagcagc agaaatggca gaagctttga 6360

gagggctccc agtacgatat caaacttcag cagtgcagag agagcaccaa gggaatgaaa 6420

tagtggatgt gatgtgccac gccactctga cccatagact gatgtcaccg aacagagtgc 6480

ccaactacaa cctatttgtc atggatgaag ctcatttcac cgacccagcc agtatagctg 6540

cacgaggata cattgctacc aaggtggaat taggggaggc agcagccatc tttatgacag 6600

cgaccccgcc tggaaccacg gatccttttc ctgactcaaa tgccccaatc catgatttgc 6660

aagatgagat accagacagg gcgtggagca gtggatacga atggatcaca gaatatgcgg 6720

gaaaaaccgt gtggtttgtg gcaagcgtaa aaatggggaa tgagattgca atgtgcctcc 6780

aaagagcggg gaaaaaggtc atccaactca accgcaagtc ctatgacaca gaatacccaa 6840

aatgtaagaa tggagactgg gattttgtca tcaccaccga catctctgaa atgggggcca 6900

acttcggtgc gagcagggtc atcgactgta gaaagagcgt gaagcctacc atcttagaag 6960

agggagaagg cagagtcatc ctcggaaacc catcccccat aaccagcgca agcgcagctc 7020

aacggagggg cagggtaggc agaaacccca accaggttgg agatgaatac cactatgggg 7080

gggccaccag tgaagatgac agtaatctag cccattggac agaggcaaag atcatgttag 7140

acaacataca catgcccaat ggactggtgg cccagctcta tggaccagag agggaaaagg 7200

ccttcacaat ggatggcgaa taccgtctca gaggtgaaga aaagaaaaac ttcttagagc 7260

tgcttaggac ggctgacctc ccggtgtggc tggcctacaa ggtggcgtcc aatggcattc 7320

agtacaccga cagaaagtgg tgttttgatg ggccgcgcac gaatgccata ctggaggaca 7380

acatcgaggt agagatagtc acccggatgg gtgagaggaa aatcctcaag ccgagatggc 7440

ttgatgcaag agtttatgca gatcaccaag ccctcaagtg gttcaaagac ttcgcagcag 7500

gaaagagatc agccgttagc ttcatagagg tgctcggtcg tatgcctgag catttcatgg 7560

gaaagacgcg ggaagcttta gacaccatgt acttggttgc aacggctgag aaaggtggga 7620

aagcacaccg aatggctctc gaagagctgc cagatgcact ggaaaccatt acacttattg 7680

ttgctatcac tgtgatgaca ggaggattct ttctactcat gatgcagcga aagggtatag 7740

ggaagatggg tcttggtgct ctagtgctca cgctagctac cttcttcctg tgggcggcag 7800

aggttcctgg aaccaaaata gcggggaccc tgctgatcgc cctgctgctt atggtggttc 7860

tcatcccaga accggaaaaa cagaggtcac agacagataa ccaactggcg gtgtttctca 7920

tctgtgtctt gaccgtggtt ggagtggtgg cagcaaacga gtacgggatg ctagaaaaaa 7980

ccaaagcaga cctcaagagc atgtttggcg gaaagacgca ggcatcagga ctgactggat 8040

tgccaagcat ggcactggac ctgcgtccag ccacagcttg ggcactgtat ggggggagca 8100

cagtcgtgct aacccctctt ctgaagcacc tgatcacgtc ggaatacgtc accacatcgc 8160

tagcctcaat taactcacaa gctggctcat tatttgtctt gccacgaggc gtgcctttta 8220

ccgacctaga cttgaccgtt ggcctcgtcc tccttggctg ttggggtcaa atcaccctca 8280

caacgttttt gacagccatg gttctggcga cacttcacta tgggtacatg ctccctggat 8340

ggcaagcaga agcactcagg gctgcccaga gaaggacagc ggctggaata atgaagaatg 8400

ccgttgttga cggaatggtc gccactgatg tgcctgaact ggaaaggacc actcctctga 8460

tgcaaaagaa agtcggacag gtgctcctca taggggtaag cgtggcagcg ttcctcgtca 8520

accccaatgt caccactgtg agagaagcag gggtgttggt gacggcggct acgctcactt 8580

tgtgggacaa tggagccagt gccgtttgga attccaccac tgccacggga ctctgccatg 8640

taatgcgagg tagctacctg gctggaggct ccattgcttg gactctcatc aagaacgctg 8700

acaagccctc cttgaaaagg ggaaggcctg ggggcaggac gctaggggag cagtggaagg 8760

aaaaactaaa tgccatgagc agagaagagt tttttaaata ccggagagag gccataatcg 8820

aggtggaccg cactgaagca cgcagggcta gacgtgaaaa taacatagtg ggaggacatc 8880

cggtttcgcg aggctcagca aaactccgtt ggctcgtgga gaaaggattt gtctcgccaa 8940

taggaaaagt cattgatcta gggtgtgggc gtggaggatg gagctactac gcagcaaccc 9000

tgaagaaggt ccaggaagtc agaggataca cgaaaggtgg ggcgggacat gaagaaccga 9060

tgctcatgca gagctacggc tggaacctgg tctccctgaa gagtggagtg gacgtgtttt 9120

acaaaccttc agagcccagt gacactctgt tctgcgacat aggggaatcc tccccaagtc 9180

cagaagtaga agaacaacgc acattacgcg tcctagagat gacatctgac tggttgcacc 9240

gaggacctag agagttctgc ataaaagttc tttgccccta catgcccaag gttatagaaa 9300

aaatggaagt tctgcagcgc cgcttcggag gtgggctagt gcgtctcccc ctgtcccgca 9360

actccaatca cgagatgtat tgggttagtg gagccgctgg caatgtggtg cacgctgtga 9420

acatgaccag ccaggtacta ctggggcgaa tggatcgcac agtgtggaga gggccaaagt 9480

atgaggaaga tgtcaaccta gggagcggaa caagagccgt gggaaaggga gaagtccata 9540

gcaatcagga gaaaatcaag aagagaatcc agaagcttaa agaagaattc gccacaacgt 9600

ggcacaaaga ccctgagcat ccataccgca cttggacata ccacggaagc tatgaagtga 9660

aggctactgg ctcagctagc tctctcgtca acggagtggt gaagctcatg agcaaacctt 9720

gggacgccat tgccaacgtc accaccatgg ccatgactga caccaccccg tttggacagc 9780

aaagagtttt caaggagaaa gttgacacga aggctcctga gccaccagct ggagccaagg 9840

aagtgctcaa cgagaccacc aactggctgt gggcctactt gtcacgggaa aaaagacccc 9900

gcttgtgcac caaggaagaa ttcataaaga aagtcaatag caacgcggct cttggagcag 9960

tgttcgctga acagaatcaa tggagcacgg cgcgtgaggc tgtggatgac ccgcggtttt 10020

gggagatggt tgatgaagag agggaaaacc atctgcgagg agagtgtcac acatgtatct 10080

ataacatgat gggaaaaaga gagaagaagc ctggagagtt tggaaaagct aaaggaagca 10140

gggccatttg gttcatgtgg cttggagcac ggtatctaga gtttgaagct ttggggttcc 10200

tgaatgaaga ccattggctg agccgagaga attcaggagg tggagtggaa ggctcaggcg 10260

tccaaaagct gggatacatc ctccgtgaca tagcaggaaa gcaaggaggg aaaatgtacg 10320

ctgatgatac cgccgggtgg gacactagaa ttaccagaac tgatttagaa aatgaagcta 10380

aggtgctgga gcttctagat ggtgaacacc gcatgctcgc ccgagccata attgaattga 10440

cttacaggca caaagtggtc aaggtcatga gacctgcagc agaaggaaag accgtgatgg 10500

acgtgatatc aagagaagat caaaggggga gtggacaggt ggtcacttat gctcttaaca 10560

ctttcacgaa catcgctgtc cagctcgtca ggctgatgga ggctgagggg gtcattggac 10620

cacaacactt ggaacagcta cctagaaaaa acaagatagc tgtcaggacc tggctctttg 10680

agaatggaga ggagagagtg accaggatgg cgatcagcgg agacgactgt gtcgtcaagc 10740

cgctggacga cagattcgcc acggccctcc acttcctcaa cgcaatgtca aaggtcagaa 10800

aggacatcca ggaatggaag ccttcgcatg gctggcacga ctggcagcaa gttcccttct 10860

gctctaacca ttttcaggag attgtgatga aagatggaag gagtatcgtt gtcccgtgca 10920

gaggacagga tgagctgata ggcagggctc gcatctcccc aggagctgga tggaatgtga 10980

aggacacagc ttgtctggcc aaagcatatg cacagatgtg gctactccta tacttccatc 11040

gtagggactt gcgtctcatg gcaaatgcga tttgctcagc agtgccagtg gattgggtgc 11100

ccacgggcag gacatcctgg tcgatacact cgaaaggaga gtggatgacc acagaagaca 11160

tgctgcaggt ctggaacaga gtctggattg aagaaaatga atggatgatg gacaagactc 11220

caatcacaag ctggacagac gttccgtacg tgggaaagcg tgaggacatc tggtgtggca 11280

gcctcatcgg aacgcgatcc agagcaacct gggctgagaa catctacgcg gcgataaacc 11340

aggttagagc tgtcattggg aaagaaaatt atgttgacta catgacctca ctcaggagat 11400

acgaagacgt cttgatccag gaagacaggg tcatctagtg tgatttaagg tagaaaagta 11460

gactatgtaa ataatgtaaa tgagaaaatg catgcatatg gagtcaggcc agcaaaagct 11520

gccaccggat actgggtaga cggtgctgcc tgcgtctcag tcccaggagg actgggttaa 11580

caaatctgac aacagaaagt gagaaagccc tcagaaccgt ctcggaagca ggtccctgct 11640

cactggaagt tgaaggacca acgtcaggcc acaaatttgt gccactccgc tggggagtgc 11700

ggcctgcgca gccccaggag gactgggtta ccaaagccgt tgaggccccc acggcccaag 11760

cctcgtctag gatgcaatag acgaggtgta aggactagag gttagaggag accccgtgga 11820

aacaacaaca tgcggcccaa gccccctcga agctgtagag gaggtggaag gactagaggt 11880

tagaggagac cccgcatttg catcaaacag catattgaca cctgggaata gactgggaga 11940

tcttctgctc tatctcaaca tcagctacta ggcacagagc gccgaagtat gtagctggtg 12000

gtgagtaaga acacaggatc tggtacccat cgatgataag ctgtcaaaca tgagaatccg 12060

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 12120

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 12180

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 12240

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctt tctcaatgct 12300

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 12360

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 12420

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 12480

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 12540

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 12600

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 12660

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 12720

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 12780

tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 12840

agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 12900

gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 12960

agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 13020

cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 13080

ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 13140

cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt 13200

cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 13260

ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 13320

tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 13380

catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 13440

gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata 13500

gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 13560

tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 13620

catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 13680

aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 13740

attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 13800

aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 13860

aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 13920

ttcaagaatt gacagtaaga cgggtaagcc tgttgatgat accgctgcct tactgggtgc 13980

attagccagt ctgaatgacc tgtcacggga taatccgaag tggtcagact ggaaaatcag 14040

agggcaggaa ctgcagaaca gcaaaaagtc agatagcacc acatagcaga cccgccataa 14100

aacgccctga gaagcccgtg acgggctttt cttgtattat gggtagtttc cttgcatgaa 14160

tccataaaag gcgcctgtag tgccatttac ccccattcac tgccagagcc gtgagcgcag 14220

cgaactgaat gtcacgaaaa agacagcgac tcaggtgcct gatggtcgga gacaaaagga 14280

atattcagcg atttgcccga gcttgcgagg gtgctactta agcctttagg gttttaaggt 14340

ctgttttgta gaggagcaaa cagcgtttgc gacatccttt tgtaatactg cggaactgac 14400

taaagtagtg agttatacac agggctggga tctattcttt ttatcttttt ttattctttc 14460

tttattctat aaattataac cacttgaata taaacaaaaa aaacacacaa aggtctagcg 14520

gaatttacag agggtctagc agaatttaca agttttccag caaaggtcta gcagaattta 14580

cagataccca caactcaaag gaaaaggact agtaattatc attgactagc ccatctcaat 14640

tggtatagtg attaaaatca cctagaccaa ttgagatgta tgtctgaatt agttgttttc 14700

aaagcaaatg aactagcgat tagtcgctat gacttaacgg agcatgaaac caagctaatt 14760

ttatgctgtg tggcactact caaccccacg attgaaaacc ctacaaggaa agaacggacg 14820

gtatcgttca cttataacca atacgctcag atgatgaaca tcagtaggga aaatgcttat 14880

ggtgtattag ctaaagcaac cagagagctg atgacgagaa ctgtggaaat caggaatcct 14940

ttggttaaag gctttgagat tttccagtgg acaaactatg ccaagttctc aagcgaaaaa 15000

ttagaattag tttttagtga agagatattg ccttatcttt tccagttaaa aaaattcata 15060

aaatataatc tggaacatgt taagtctttt gaaaacaaat actctatgag gatttatgag 15120

tggttattaa aagaactaac acaaaagaaa actcacaagg caaatataga gattagcctt 15180

gatgaattta agttcatgtt aatgcttgaa aataactacc atgagtttaa aaggcttaac 15240

caatgggttt tgaaaccaat aagtaaagat ttaaacactt acagcaatat gaaattggtg 15300

gttgataagc gaggccgccc gactgatacg ttgattttcc aagttgaact agatagacaa 15360

atggatctcg taaccgaact tgagaacaac cagataaaaa tgaatggtga caaaatacca 15420

acaaccatta catcagattc ctacctacgt aacggactaa gaaaaacact acacgatgct 15480

ttaactgcaa aaattcagct caccagtttt gaggcaaaat ttttgagtga catgcaaagt 15540

aagcatgatc tcaatggttc gttctcatgg ctcacgcaaa aacaacgaac cacactagag 15600

aacatactgg ctaaatacgg aaggatctga ggttcttatg gctcttgtat ctatcagtga 15660

agcatcaaga ctaacaaaca aaagtagaac aactgttcac cgttacatat caaagggaaa 15720

actgtccata tgcacagatg aaaacggtgt aaaaaagata gatacatcag agcttttacg 15780

agtttttggt gcattcaaag ctgttcacca tgaacagatc gacaatgtaa cagatgaaca 15840

gcatgtaaca cctaatagaa caggtgaaac cagtaaaaca aagcaactag aacatgaaat 15900

tgaacacctg agacaacttg ttacagctca acagtcacac atagacagcc tgaaacaggc 15960

gatgctgctt atcgaatcaa agctgccgac aacacgggag ccagtgacgc ctcccgtggg 16020

gaaaaaatca tggcaattct ggaagaaata gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg 16080

ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg 16140

tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac 16200

gacggccagt gccaagcttg catgcctgca ggtcgacggt aatacgactc actatag 16257

Claims (7)

1.一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其序列为SEQ IDNO.22所示。

2.权利要求1所述的全长感染性克隆，其构建方法如下：

(1)拼接乙型脑炎病毒全长基因组序列；

①分节段合成乙型脑炎病毒基因组的互补DNA：合成片段F1、F2、F3和F4，每个片段分别连接到载体pUC57；F1、F2、F3和F4片段的序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4所示；

②乙型脑炎病毒基因组四个片段的拼接：用SalI和KpnI酶切pMW118，采用胶回收的方法回收pMW118的大片段，采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F1和F2片段插入到pMW118，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2；然后使用NaeI和KpnI酶切pJEVF1-F2，采用胶回收的方法回收pJEVF1-F2的大片段，使用浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F3和F4片段插入到pJEVF1-F2，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2-F3-F4，即为乙型脑炎病毒的全长感染性克隆pJEVFL；

(2)构建携带EGFP基因的JEV全长感染性克隆；

①将EGFP基因插入到乙型脑炎病毒的E基因和NS1基因之间：合成序列SEQ ID NO:14，并将该片段连接进入pUC57；以pEGFP-C1质粒为模板，扩增EGFP片段为SEQ ID NO:19所示；使用SacI酶切pJEVFL，然后采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:19片段插入到pJEVFL，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVFL-EGFP，其序列为SEQ IDNO:22所示。

3.权利要求1所述的全长感染性克隆制备出的重组病毒。

4.权利要求1所述的全长感染性克隆在制备携带绿色荧光蛋白基因的重组乙型脑炎病毒中的应用。

5.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备研究脑神经环路药物中的应用。

6.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备抗乙型脑炎病毒药物中的应用。

7.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备研究乙型脑炎病毒抗原表位中的应用。