CN104357459A - 携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用。一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其序列为SEQIDNO.22所示。该全长感染性克隆成功制备出携带绿色荧光蛋白的重组乙型脑炎病毒。本发明成功获得的携带绿色荧光蛋白基因的重组乙型脑炎病毒，在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

Description

携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒及制备方法和应用，应用包括在解析脑神经环路、乙型脑炎病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选中的应用。

背景技术

人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础，成年人的大脑中约有10¹¹个神经元,并经10¹⁵个突触相互连接而构成脑神经网络。神经网络的正常连接，使得人体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，如：阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等，但是还没有有效的手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。我国政府高度重视脑科学的研究，《国家中长期科学和技术发展规划》将“脑科学与认知科学”列为八大前沿科学问题之一,有一批科学家已投身于该领域的研究，并取得了一系列的成果。2012年，中国科学院启动了战略性先导科技专项“脑功能联结图谱研究”，并在2014年成立了“脑科学卓越创新中心”。2013年，美国和欧盟已经开始实施人脑图谱研究计划。脑科学研究计划是继人类基因组计划后又一个具有挑战的伟大计划，该计划的研究成果将会和人类基因组计划的成果一样造福人类。性能优良的神经环路示踪工具对于顺利开展该项目具有十分重要的作用。

乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成3个结构蛋白(C、prM、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。乙型脑炎病毒具有广泛的宿主范围，包括：人、猪、鼠、猴、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟类等，能够进入神经系统而引起脑炎。给人类的健康和农业生产带来了巨大损失。目前，有预防该病毒感染的疫苗，对于保障人类的健康和提高农业生产的效率发挥了重要作用。但是，目前还没有有效的药物来特异的治疗该病毒感染引起的疾病。另外，乙型脑炎病毒感染脑神经系统的特性使其成为具备解析神经环路的能力。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了具有表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎病毒全长感染性克隆。将在神经环路标记、抗原表位分析、药物筛选平台的建立、药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种携带绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)基因的乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)全长感染性克隆，其序列为SEQ ID NO：22所示。

本发明的目的在于提供了一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的制备方法，方法简单，易行。

本发明的目的在于提供了一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆应用，该全长感染性克隆可应用于脑科学研究和药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下：

(1)拼接乙型脑炎病毒全长基因组序列；

①分节段合成乙型脑炎病毒基因组的互补DNA：以乙型脑炎病毒的全基因组序列(GenBank登陆号AB196923)为对象，并在其基因组的6713位点将原序列的碱基A变成T，但是没有改变氨基酸的编码。分别合成片段F1、F2、F3和F4，每个片段分别连接到载体pUC57。

F1、F2、F3和F4片段的序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。

②乙型脑炎病毒基因组四个片段的拼接：用SalI和KpnI酶切pMW118，采用胶回收的方法回收pMW118的大片段，采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F1和F2片段插入到pMW118，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2；然后使用NaeI和KpnI酶切pJEVF1-F2，采用胶回收的方法回收pJEVF1-F2的大片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F3和F4片段插入到pJEVF1-F2，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2-F3-F4，即为乙型脑炎病毒的全长感染性克隆pJEVFL；

(2)构建携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆；

①将EGFP基因插入到乙型脑炎病毒的E基因和NS1基因之间：合成序列SEQ ID NO:14，并将该片断连接进入pUC57。以pEGFP-C1质粒为模板，扩增EGFP片段为SEQ ID NO:19所示。

使用SacI酶切pJEVFL，然后采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将SEQID NO:14和SEQ ID NO:19片段插入到pJEVFL，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVFL-EGFP，其序列为SEQ ID NO:22所示。

携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的应用，包括以下应用：

(1)携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆(本发明或称pJEVFL-EGFP)制备病毒的能力：

用KpnI酶切pJEVFL-EGFP，回收被酶切的产物，使用MEGAscript T7Transcription Kit分别体外转录酶切后的pJEVFL-EGFP成为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞作为对照组，通过Olympus倒置荧光显微镜观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达情况。本发明的全长感染性克隆成功制备表达EGFP的重组JEV(本发明或称JEV-EGFP)。

(2)JEV-EGFP在研究脑神经环路平台中的应用：

取0.3μl JEV-EGFP病毒定位注射到鼠嗅球，感染后6天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。

所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猴、豚鼠、人、蝙蝠、猪、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟等动物的神经环路标记。

(3)JEV-EGFP在分析抗原表位和抗乙型脑炎病毒药物(抗体药)筛选中的应用：

在6孔细胞培养板中接种8×10⁵BHK21细胞/孔，在37℃,5％(v/v)CO₂培养条件下，汇合度达到90％时。将50μl pJEVFL-EGFP P0代病毒液与50μl乙型脑炎病毒的抗体混合，37℃吸附30min，然后将该混合液加入各孔，37℃吸附1h；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5％(v/v)CO₂的培养箱中培养72h，使用荧光显微镜观察。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明制备了表达EGFP的乙型脑炎病毒(JEV-EGFP)，其具有可视化的特点，便于开展相关的研究。目前国内外还没有用于表达绿色荧光蛋白的重组乙型脑炎病毒，本发明填补了该空白。

2.本发明对于开展JEV的基础性研究(如致病机制、复制机制等)和应用性研究(如神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值；

3.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。JEV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于鼠等非灵长类动物，而且还能用于非人灵长类动物的脑科学研究。

附图说明

图1为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的构建示意图。

图2为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒产生的细胞病变和表达荧光示意图。

A：未感染病毒的细胞；

B：JEV-EGFP感染BHK21细胞产生的细胞病变；

C：JEV-EGFP感染BHK21细胞表达荧光蛋白。

图3为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒解析鼠脑神经环路的示意图。

A：JEV-EGFP标记鼠嗅球；

B：JEV-EGFP标记鼠梨状皮层；

C：JEV-EGFP标记鼠前嗅核。

图4为一种携带EGFP基因的JEV用于抗原表位分析和抑制乙型脑炎病毒的抗体药的作用示意图。

A：不含抗体而含有JEV-EGFP的对照孔；

B：1:10稀释的抗体对JEV-EGFP的抑制作用；

C：1:100稀释的抗体对JEV-EGFP的抑制作用；

C：不含抗体和病毒的对照孔。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术

实施例1：携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下：

(1)拼接JEV全长基因组序列；

①分节段合成乙型脑炎病毒基因组的互补DNA：以乙型脑炎病毒的全基因组序列(GenBank登陆号AB196923)为对象，并在其基因组的6713位点将原序列的碱基A变成T，但是没有改变氨基酸的编码。分别合成片段F1、F2、F3和F4，每个片段分别连接到载体pUC57。片段的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。为了大量富集目标片段用于后续的基因组组装，分别采用PCR的方法富集片段EQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。DNA片段F1的引物：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，DNA片段F2的引物：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，DNA片段F3的引物：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，DNA片段F4的引物：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，另外SEQ ID NO:5含有T7RNA聚合酶启动子序列SEQ ID NO:13；

本发明所有PCR所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR的反应体系均为50μl：5×Q5Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μM Forward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，Q5High-Fidelity DNA Polymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃30s，98℃5s，55℃10s，72℃40s，72℃2min，4℃10min，30个循环；

②JEV基因组四个片段的拼接：采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组的方法，将扩增的四个片段连接到低拷贝载体pMW118。用SalI和KpnI酶切pMW118，采用胶回收的方法回收pMW118的大片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，采用Gibson Assembly Cloning Kit将F1和F2片段插入到pMW118，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2；

然后使用NaeI和KpnI酶切pJEVF1-F2，采用胶回收的方法回收pJEVF1-F2的大片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，采用Gibson Assembly Cloning Kit将F3和F4片段插入到pJEVF1-F2，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2-F3-F4，即为JEV病毒的全长感染性克隆pJEVFL；

鉴定pJEVF1-F2所用的引物为片段F1的引物为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

鉴定pJEVF1-F2-F3-F4所用的引物为片段F2的引物为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

(2)构建携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆；

①将EGFP基因插入到JEV的E基因和NS1基因之间：为了便于后续克隆的构建和避免病毒内部发生同源重组，采用基因片段合成的方法合成序列SEQ ID NO:14，并将该片断连接进入pUC57。使用NEB Q5High-Fidelity DNA Polymerase扩增SEQ ID NO:14。DNA片段SEQ ID NO:14的引物：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。SEQ ID NO:14含有合成的E基因的C端部分序列SEQ ID NO:17，合成的NS1基因的N端部分序列SEQ ID NO:18。

另外，以pEGFP-C1质粒为模板，扩增EGFP片段SEQ ID NO:19。扩增DNA片段SEQID NO:19的引物：SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收DNA片断，使用Thermo ScientificNanoDrop 2000测定DNA的浓度，使用浓度为1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用；

PCR的反应体系均为50μl：5×Q5Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，Q5High-FidelityDNA Polymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃30s，98℃5s，55℃10s，72℃40s，72℃2min，4℃10min，30个循环；

使用SacI酶切pJEVFL，然后采用Gibson Assembly Cloning Kit将SEQ ID NO:14和SEQID NO:19片段插入到pJEVFL，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVFL-EGFP，其序列为SEQ ID NO：22所示。

实施例2：pJEVFL-EGFP成功制备出表达EGFP的JEV，其步骤是：

用KpnI酶切pJEVFL-EGFP,使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收被酶切的产物，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000测定DNA的浓度，使用浓度为1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用；使用MEGAscript T7Transcription Kit分别体外转录酶切后的pJEVFL-EGFP,成为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞作为对照组，通过倒置荧光显微镜(Olympus)观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达。

未转染pJEVFL-EGFP RNA的细胞，无细胞病变发生(图2A)，在明场下观察转染pJEVFL-EGFP RNA的BHK21细胞，可见明显的细胞病变(图2B)，表明已经产生了重组病毒；在相同的视野下，使用蓝色激发荧光，可见明显的绿色(图2C)，表明重组病毒可以表达携带的外源基因绿色荧光蛋白。以上数据表明携带EGFP基因的重组乙型脑炎病毒全长感染性克隆具有制备乙型脑炎病毒及表达外源基因的能力，按常规方法搜集制得的。

以下应用实施例均使用的是本实施例制备的由pJEVFL-EGFP成功制备出的表达绿色荧光蛋白的JEV(JEV-EGFP)，使用的病毒滴度为3×10⁶PFU/ml。

实施例3：JEV-EGFP在解析脑神经环路中的应用，其步骤是：

取0.3μl实施例2制备的重组JEV(JEV-EGFP)定位注射到鼠嗅球，感染后6天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。在重组病毒注射到嗅球的一个点之后，可见明显的荧光呈环状的标记，表明重组病毒能够在鼠脑内产生病毒，且该病毒具有表达绿色荧光蛋白的能力(图3A),进一步分析与嗅球相连接的脑区，可见在鼠脑的梨状皮层(图3B)和鼠脑的前嗅核(图3C)均有绿色荧光蛋白的表达，表明重组的病毒能够在神经网络中运输，具有标记脑神经环路的能力。

实施例4：JEV-EGFP在分析抗原表位和筛选抗JEV药物(抗体药)中的应用，其步骤是：

在6孔细胞培养板中接种8×10⁵BHK21细胞/孔，在37℃,5％(v/v)CO₂培养条件下，汇合度达到90％时。将50μl实施例2制备的重组JEV(JEV-EGFP)P0代病毒液与50μl JEV的E蛋白多克隆抗体(浓度分别为1：10和1：100稀释)混合，37℃吸附30min，然后将该混合液加入各孔，37℃吸附1h；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5％(v/v)CO₂的培养箱中培养72h，使用荧光显微镜观察。

乙型脑炎病毒感染细胞是通过病毒表面的配体(抗原)与细胞表面的受体结合而引导病毒进入细胞，一蛋白配体与细胞表面受体类似物结合之后则无法引导病毒进入细胞，针对病毒抗原的抗体具有类似细胞表面受体的性质，病毒抗原能够通过特定的表位与抗体结合。基于此原理，该实施例将表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎病毒分别与不同含量的抗体体外孵育，然后再感染细胞，检测其荧光的表达。在不含抗体而含有重组乙型脑炎病毒的对照孔，荧光分布于整个视野(图4A)。而当与抗体体外孵育后再感染BHK21细胞，则严重的影响了病毒进入细胞的能力(图4B和4C)，只含有抗体而未感染病毒的细胞组未见细胞病变和绿色荧光蛋白(图4D)。该实施例表明该重组病毒的配体与其对应的抗体通过特定抗原表位的结合而抑制病毒进入细胞，一方面提示该病毒能够用于分析抗原表位；另一方面提示该重组病毒能够用于筛选抗乙型脑炎病毒药物(如抗体药)。

最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

                         SEQUENCE LISTING

<110>  中国科学院武汉物理与数学研究所

<120>  携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用

<130>  携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用

<160>  22   

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  3462

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt     60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg    120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg    180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg gccagtacgt ttcgtgctgg    240

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caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg   1860

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gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg   2040

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tcgaagactt cggctttggc atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaga   3000

gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gtacggctgt caaaggacat gtggcagtcc   3060

atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg   3120

cagtctttgg agaggttaaa tcttgcactt ggccagagac acacacccta tggggagatg   3180

gtgttgagga aagtgaactc atcattccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca   3240

atcggaggga agggtataag acacaaaacc agggaccttg ggacgagaat ggcatagtct   3300

tggactttga ctattgccca gggacaaaag tcaccattac agaggattgt ggcaagagag   3360

gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat cactgactgg tgctgtcgca   3420

gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ct                      3462

<210>  2

<211>  2136

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ccggacagaa aatggctgct ggtacggaat ggaaatcaga cctgttaggc atgatgaaac     60

aacactcgtc agatcacagg ttgatgcttt taatggtgaa atggttgacc cttttcagct    120

gggccttctg gtgatgtttc tggccaccca ggaggtcctt cgcaagaggt ggacggccag    180

attgaccatt cctgcggttt tgggggcctt acttgtgctg atgcttgggg gcatcactta    240

cactgatttg gcgaggtatg tggtgctagt cgctgctgct ttcgcagagg ccaacagtgg    300

aggagacgtc ctgcaccttg ctttgattgc cgtttttaag atccaaccag catttttagt    360

gatgaacatg cttagcacga gatggacgaa ccaagaaaac gtggttctgg tcctaggggc    420

tgcctttttc caattggcct cagtagatct gcaaatagga gttcacggaa tcctgaatgc    480

cgccgctata gcatggatga ttgtccgggc gatcaccttc cccacaacct cctccgtcac    540

catgccagtc ttagcgcttc taaccccggg aatgagggct ctatacctag atacttacag    600

aatcatcctc ctcgtcatag ggatttgctc tctgctgcaa gagaggaaaa agaccatggc    660

aaaaaagaaa ggagctgtac tcttgggctt agcgctcaca tccactggat ggttttcgcc    720

caccactata gctgccggac taatggtctg caacccaaac aagaagagag ggtggccagc    780

tactgagttt ttgtcggcag ttggattgat gtttgccatc gtaggtggtt tggcagagtt    840

ggatattgaa tccatgtcaa tacccttcat gctggcaggt ctcatggcag tgtcctacgt    900

ggtgtcagga aaagcaacag atatgtggct tgaacgggcc gccgacatca gctgggagat    960

ggatgctgca atcacaggaa gcagtcggag gctggatgtg aagctggatg aagacggaga   1020

ttttcacttg attgatgatc ccggtgttcc atggaaggtc tgggtcctgc gcatgtcttg   1080

cattggctta gccgccctca cgccttgggc cattgttccc gccgcttttg gttattggct   1140

cactttaaaa acaacaaaaa gaggaggcgt gttttgggac acgccatccc caaaaccttg   1200

ctcaaaagga gacaccacta caggagttta ccgcattatg gctagaggga ttcttggcac   1260

ttaccaggcc ggcgtcggag tcatgtacga gaatgttttc cacacactat ggcacacaac   1320

tagaggagca gccattatga gtggagaagg aaaattgacg ccatactggg gtagtgtgaa   1380

agaagaccgc atagcttacg gaggcccatg gaggtttgat cgaaaatgga atggaacaga   1440

tgacgtgcaa gtgatcgtgg tagaaccggg gaaggctgca gtaaacatcc agacaaaacc   1500

aggggtgttt cggactccct tcggggaggt tggggctgtt agtctggatt acccgcgagg   1560

aacatccggc tcacccattc tggattccaa tggagacatc ataggcctgt acggcaatgg   1620

agttgagctt ggcgatggtt catacgtcag cgccatcgtg cagggtgacc gtcaggagga   1680

accagtccca gaagcttaca ccccaaacat gttgagaaag agacagatga ctgtactaga   1740

tttgcaccct ggttcaggga aaaccaggaa aattctgcca caaataatta aggacgctat   1800

ccagcagcgc ctaagaacag ctgtgttggc accgacgcgg gtggtagcag cagaaatggc   1860

agaagctttg agagggctcc cagtacgata tcaaacttca gcagtgcaga gagagcacca   1920

agggaatgaa atagtggatg tgatgtgcca cgccactctg acccatagac tgatgtcacc   1980

gaacagagtg cccaactaca acctatttgt catggatgaa gctcatttca ccgacccagc   2040

cagtatagct gcacgaggat acattgctac caaggtggaa ttaggggagg cagcagccat   2100

ctttatgaca gcgaccccgc ctggaaccac ggatcc                             2136

<210>  3

<211>  3231

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

cttggcactt accaggccgg cgtcggagtc atgtacgaga atgttttcca cacactatgg     60

cacacaacta gaggagcagc cattatgagt ggagaaggaa aattgacgcc atactggggt    120

agtgtgaaag aagaccgcat agcttacgga ggcccatgga ggtttgatcg aaaatggaat    180

ggaacagatg acgtgcaagt gatcgtggta gaaccgggga aggctgcagt aaacatccag    240

acaaaaccag gggtgtttcg gactcccttc ggggaggttg gggctgttag tctggattac    300

ccgcgaggaa catccggctc acccattctg gattccaatg gagacatcat aggcctgtac    360

ggcaatggag ttgagcttgg cgatggttca tacgtcagcg ccatcgtgca gggtgaccgt    420

caggaggaac cagtcccaga agcttacacc ccaaacatgt tgagaaagag acagatgact    480

gtactagatt tgcaccctgg ttcagggaaa accaggaaaa ttctgccaca aataattaag    540

gacgctatcc agcagcgcct aagaacagct gtgttggcac cgacgcgggt ggtagcagca    600

gaaatggcag aagctttgag agggctccca gtacgatatc aaacttcagc agtgcagaga    660

gagcaccaag ggaatgaaat agtggatgtg atgtgccacg ccactctgac ccatagactg    720

atgtcaccga acagagtgcc caactacaac ctatttgtca tggatgaagc tcatttcacc    780

gacccagcca gtatagctgc acgaggatac attgctacca aggtggaatt aggggaggca    840

gcagccatct ttatgacagc gaccccgcct ggaaccacgg atccttttcc tgactcaaat    900

gccccaatcc atgatttgca agatgagata ccagacaggg cgtggagcag tggatacgaa    960

tggatcacag aatatgcggg aaaaaccgtg tggtttgtgg caagcgtaaa aatggggaat   1020

gagattgcaa tgtgcctcca aagagcgggg aaaaaggtca tccaactcaa ccgcaagtcc   1080

tatgacacag aatacccaaa atgtaagaat ggagactggg attttgtcat caccaccgac   1140

atctctgaaa tgggggccaa cttcggtgcg agcagggtca tcgactgtag aaagagcgtg   1200

aagcctacca tcttagaaga gggagaaggc agagtcatcc tcggaaaccc atcccccata   1260

accagcgcaa gcgcagctca acggaggggc agggtaggca gaaaccccaa ccaggttgga   1320

gatgaatacc actatggggg ggccaccagt gaagatgaca gtaatctagc ccattggaca   1380

gaggcaaaga tcatgttaga caacatacac atgcccaatg gactggtggc ccagctctat   1440

ggaccagaga gggaaaaggc cttcacaatg gatggcgaat accgtctcag aggtgaagaa   1500

aagaaaaact tcttagagct gcttaggacg gctgacctcc cggtgtggct ggcctacaag   1560

gtggcgtcca atggcattca gtacaccgac agaaagtggt gttttgatgg gccgcgcacg   1620

aatgccatac tggaggacaa catcgaggta gagatagtca cccggatggg tgagaggaaa   1680

atcctcaagc cgagatggct tgatgcaaga gtttatgcag atcaccaagc cctcaagtgg   1740

ttcaaagact tcgcagcagg aaagagatca gccgttagct tcatagaggt gctcggtcgt   1800

atgcctgagc atttcatggg aaagacgcgg gaagctttag acaccatgta cttggttgca   1860

acggctgaga aaggtgggaa agcacaccga atggctctcg aagagctgcc agatgcactg   1920

gaaaccatta cacttattgt tgctatcact gtgatgacag gaggattctt tctactcatg   1980

atgcagcgaa agggtatagg gaagatgggt cttggtgctc tagtgctcac gctagctacc   2040

ttcttcctgt gggcggcaga ggttcctgga accaaaatag cggggaccct gctgatcgcc   2100

ctgctgctta tggtggttct catcccagaa ccggaaaaac agaggtcaca gacagataac   2160

caactggcgg tgtttctcat ctgtgtcttg accgtggttg gagtggtggc agcaaacgag   2220

tacgggatgc tagaaaaaac caaagcagac ctcaagagca tgtttggcgg aaagacgcag   2280

gcatcaggac tgactggatt gccaagcatg gcactggacc tgcgtccagc cacagcttgg   2340

gcactgtatg gggggagcac agtcgtgcta acccctcttc tgaagcacct gatcacgtcg   2400

gaatacgtca ccacatcgct agcctcaatt aactcacaag ctggctcatt atttgtcttg   2460

ccacgaggcg tgccttttac cgacctagac ttgaccgttg gcctcgtcct ccttggctgt   2520

tggggtcaaa tcaccctcac aacgtttttg acagccatgg ttctggcgac acttcactat   2580

gggtacatgc tccctggatg gcaagcagaa gcactcaggg ctgcccagag aaggacagcg   2640

gctggaataa tgaagaatgc cgttgttgac ggaatggtcg ccactgatgt gcctgaactg   2700

gaaaggacca ctcctctgat gcaaaagaaa gtcggacagg tgctcctcat aggggtaagc   2760

gtggcagcgt tcctcgtcaa ccccaatgtc accactgtga gagaagcagg ggtgttggtg   2820

acggcggcta cgctcacttt gtgggacaat ggagccagtg ccgtttggaa ttccaccact   2880

gccacgggac tctgccatgt aatgcgaggt agctacctgg ctggaggctc cattgcttgg   2940

actctcatca agaacgctga caagccctcc ttgaaaaggg gaaggcctgg gggcaggacg   3000

ctaggggagc agtggaagga aaaactaaat gccatgagca gagaagagtt ttttaaatac   3060

cggagagagg ccataatcga ggtggaccgc actgaagcac gcagggctag acgtgaaaat   3120

aacatagtgg gaggacatcc ggtttcgcga ggctcagcaa aactccgttg gctcgtggag   3180

aaaggatttg tctcgccaat aggaaaagtc attgatctag ggtgtgggcg t            3231

<210>  4

<211>  3069

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

ttgatctagg gtgtgggcgt ggaggatgga gctactacgc agcaaccctg aagaaggtcc     60

aggaagtcag aggatacacg aaaggtgggg cgggacatga agaaccgatg ctcatgcaga    120

gctacggctg gaacctggtc tccctgaaga gtggagtgga cgtgttttac aaaccttcag    180

agcccagtga cactctgttc tgcgacatag gggaatcctc cccaagtcca gaagtagaag    240

aacaacgcac attacgcgtc ctagagatga catctgactg gttgcaccga ggacctagag    300

agttctgcat aaaagttctt tgcccctaca tgcccaaggt tatagaaaaa atggaagttc    360

tgcagcgccg cttcggaggt gggctagtgc gtctccccct gtcccgcaac tccaatcacg    420

agatgtattg ggttagtgga gccgctggca atgtggtgca cgctgtgaac atgaccagcc    480

aggtactact ggggcgaatg gatcgcacag tgtggagagg gccaaagtat gaggaagatg    540

tcaacctagg gagcggaaca agagccgtgg gaaagggaga agtccatagc aatcaggaga    600

aaatcaagaa gagaatccag aagcttaaag aagaattcgc cacaacgtgg cacaaagacc    660

ctgagcatcc ataccgcact tggacatacc acggaagcta tgaagtgaag gctactggct    720

cagctagctc tctcgtcaac ggagtggtga agctcatgag caaaccttgg gacgccattg    780

ccaacgtcac caccatggcc atgactgaca ccaccccgtt tggacagcaa agagttttca    840

aggagaaagt tgacacgaag gctcctgagc caccagctgg agccaaggaa gtgctcaacg    900

agaccaccaa ctggctgtgg gcctacttgt cacgggaaaa aagaccccgc ttgtgcacca    960

aggaagaatt cataaagaaa gtcaatagca acgcggctct tggagcagtg ttcgctgaac   1020

agaatcaatg gagcacggcg cgtgaggctg tggatgaccc gcggttttgg gagatggttg   1080

atgaagagag ggaaaaccat ctgcgaggag agtgtcacac atgtatctat aacatgatgg   1140

gaaaaagaga gaagaagcct ggagagtttg gaaaagctaa aggaagcagg gccatttggt   1200

tcatgtggct tggagcacgg tatctagagt ttgaagcttt ggggttcctg aatgaagacc   1260

attggctgag ccgagagaat tcaggaggtg gagtggaagg ctcaggcgtc caaaagctgg   1320

gatacatcct ccgtgacata gcaggaaagc aaggagggaa aatgtacgct gatgataccg   1380

ccgggtggga cactagaatt accagaactg atttagaaaa tgaagctaag gtgctggagc   1440

ttctagatgg tgaacaccgc atgctcgccc gagccataat tgaattgact tacaggcaca   1500

aagtggtcaa ggtcatgaga cctgcagcag aaggaaagac cgtgatggac gtgatatcaa   1560

gagaagatca aagggggagt ggacaggtgg tcacttatgc tcttaacact ttcacgaaca   1620

tcgctgtcca gctcgtcagg ctgatggagg ctgagggggt cattggacca caacacttgg   1680

aacagctacc tagaaaaaac aagatagctg tcaggacctg gctctttgag aatggagagg   1740

agagagtgac caggatggcg atcagcggag acgactgtgt cgtcaagccg ctggacgaca   1800

gattcgccac ggccctccac ttcctcaacg caatgtcaaa ggtcagaaag gacatccagg   1860

aatggaagcc ttcgcatggc tggcacgact ggcagcaagt tcccttctgc tctaaccatt   1920

ttcaggagat tgtgatgaaa gatggaagga gtatcgttgt cccgtgcaga ggacaggatg   1980

agctgatagg cagggctcgc atctccccag gagctggatg gaatgtgaag gacacagctt   2040

gtctggccaa agcatatgca cagatgtggc tactcctata cttccatcgt agggacttgc   2100

gtctcatggc aaatgcgatt tgctcagcag tgccagtgga ttgggtgccc acgggcagga   2160

catcctggtc gatacactcg aaaggagagt ggatgaccac agaagacatg ctgcaggtct   2220

ggaacagagt ctggattgaa gaaaatgaat ggatgatgga caagactcca atcacaagct   2280

ggacagacgt tccgtacgtg ggaaagcgtg aggacatctg gtgtggcagc ctcatcggaa   2340

cgcgatccag agcaacctgg gctgagaaca tctacgcggc gataaaccag gttagagctg   2400

tcattgggaa agaaaattat gttgactaca tgacctcact caggagatac gaagacgtct   2460

tgatccagga agacagggtc atctagtgtg atttaaggta gaaaagtaga ctatgtaaat   2520

aatgtaaatg agaaaatgca tgcatatgga gtcaggccag caaaagctgc caccggatac   2580

tgggtagacg gtgctgcctg cgtctcagtc ccaggaggac tgggttaaca aatctgacaa   2640

cagaaagtga gaaagccctc agaaccgtct cggaagcagg tccctgctca ctggaagttg   2700

aaggaccaac gtcaggccac aaatttgtgc cactccgctg gggagtgcgg cctgcgcagc   2760

cccaggagga ctgggttacc aaagccgttg aggcccccac ggcccaagcc tcgtctagga   2820

tgcaatagac gaggtgtaag gactagaggt tagaggagac cccgtggaaa caacaacatg   2880

cggcccaagc cccctcgaag ctgtagagga ggtggaagga ctagaggtta gaggagaccc   2940

cgcatttgca tcaaacagca tattgacacc tgggaataga ctgggagatc ttctgctcta   3000

tctcaacatc agctactagg cacagagcgc cgaagtatgt agctggtggt gagtaagaac   3060

acaggatct                                                           3069

<210>  5

<211>  65

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

caagcttgca tgcctgcagg tcgacggtaa tacgactcac tatagagaag tttatctgtg     60

tgaac                                                                 65

<210>  6

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

agccattttc tgtccggaat cgtaggggcg gaaggga                              37

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

ccggacagaa aatggctgct g                                               21

<210>  8

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

tgacagctta tcatcgatgg gtaccggatc cgtggttcca ggcgg                     45

<210>  9

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

cttggcactt accaggccgg c                                               21

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  10

acgcccacac cctagatcaa                                                 20

<210>  11

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  11

ttgatctagg gtgtgggcgt g                                               21

<210>  12

<211>  46

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  12

tgacagctta tcatcgatgg gtaccagatc ctgtgttctt actcac                    46

<210>  13

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  13

taatacgact cactatag                                                   18

<210>  14

<211>  318

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  14

gagctcaaag gctcgccgct ctgggcgata ccgcttggga tttcggcagc atcggcggag     60

tgtttaattc tatcggcaag gctgtgcatc aggtcttcgg cggagctttt aggaccctgt    120

tcggaggcat gagctggatt acccagggcc tgatgggcgc tctcctgctt tggatgggag    180

tgaatgccag agataggagc atcgccctgg cttttctagc taccggcggc gtcctggtct    240

ttttggccac aaacgtccac gccgataccg gctgcgctat cgatattacc cggccgatgg    300

tgagcaaggg cgaggagc                                                  318

<210>  15

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  15

caacaacttt gaagggagct caaaggctcg ccgct                                35

<210>  16

<211>  47

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  16

ctcctcgccc ttgctcacca tcggccgggt aatatcgata gcgcagc                   47

<210>  17

<211>  263

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  17

gagctcaaag gctcgccgct ctgggcgata ccgcttggga tttcggcagc atcggcggag     60

tgtttaattc tatcggcaag gctgtgcatc aggtcttcgg cggagctttt aggaccctgt    120

tcggaggcat gagctggatt acccagggcc tgatgggcgc tctcctgctt tggatgggag    180

tgaatgccag agataggagc atcgccctgg cttttctagc taccggcggc gtcctggtct    240

ttttggccac aaacgtccac gcc                                            263

<210>  18

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  18

gataccggct gcgctatcga tattacc                                         27

<210>  19

<211>  717

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  19

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac     60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc    540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag       717

<210>  20

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  20

atggtgagca agggcgagga g                                               21

<210>  21

<211>  73

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  21

cccaacgctg ccagtctctg agctcccttc aaagttgttg aaaaggcttt ctcgagcttg     60

tacagctcgt cca                                                        73

<210>  22

<211>  16257

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  22

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt     60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg    120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg    180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg gccagtacgt ttcgtgctgg    240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat    300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtagcaatga aacatctcac tagtttcaaa cgagaacttg    360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg    420

aaggctcaat catgtggctc gcgagcttgg cagttgtcat agcttgtgca ggagccatga    480

agttgtcaaa tttccagggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg    540

ttatcgtgat tcccacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgacgtcg    600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc    660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca    720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga gatccgtgtc ggtccaaaca catggggaga    780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca    840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg    900

gctggatgct tggcagtaac aacggtcaac gcgtggtatt caccatcctc ctgctgctgg    960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa tcgtgacttc atagaaggag   1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttggtgc tagaaggaga tagctgcttg acaattatgg   1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgatcaacat cgaagctagc caacttgctg   1140

aggtcagaag ttactgttat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc   1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag   1260

gcttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca   1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaaag cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca   1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ttcggaaaac catgggaatt   1440

attcagcgca agttggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt   1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgag ccaaggagtg   1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata   1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa   1680

acagagaact cctcatggag tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc   1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgttggcagg agccatcgtg gtggagtact   1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg   1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgca cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg   1920

cggacactgg tcacggaaca gttgtcattg aactctccta ctctgggagt gatggcccct   1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg   2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaattc aaaggtgctg gtcgagatgg   2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc   2160

attggcacaa agctggaagc acgctgggca aagccttttc aacaactttg aagggagctc   2220

aaaggctcgc cgctctgggc gataccgctt gggatttcgg cagcatcggc ggagtgttta   2280

attctatcgg caaggctgtg catcaggtct tcggcggagc ttttaggacc ctgttcggag   2340

gcatgagctg gattacccag ggcctgatgg gcgctctcct gctttggatg ggagtgaatg   2400

ccagagatag gagcatcgcc ctggcttttc tagctaccgg cggcgtcctg gtctttttgg   2460

ccacaaacgt ccacgccgat accggctgcg ctatcgatat tacccggccg atggtgagca   2520

agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa   2580

acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga   2640

ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca   2700

ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact   2760

tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg   2820

acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca   2880

tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt   2940

acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg   3000

tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc   3060

agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca   3120

cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt   3180

tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagctc gagaaagcct   3240

tttcaacaac tttgaaggga gctcagagac tggcagcgtt gggtgacaca gcctgggact   3300

ttggctccat tggaggggtc ttcaactcca taggaaaagc cgttcaccaa gtgtttggtg   3360

gtgccttcag aacactcttt gggggaatgt cttggatcac acaagggcta atgggtgccc   3420

tactactctg gatgggcgtc aacgcacgag accgatcaat tgctttggcc ttcttagcca   3480

caggaggtgt gctcgtgttc ttagcgacca atgtgcatgc tgacactgga tgtgccattg   3540

acatcacaag aaaagagatg aggtgtggaa gtggcatctt cgtgcacaac gacgtggaag   3600

cctgggtgga taggtataaa tatttgccag aaacgcccag atccctagcg aagatcgtcc   3660

acaaagcgca caaggaaggc gtgtgcggag tcagatctgt cactagactg gagcatcaaa   3720

tgtgggaagc cgtacgggat gaattgaacg tcctgctcaa agagaatgca gtggacctca   3780

gtgtggttgt gaacaagccc gtggggagat atcgctcagc ccctaaacgc ctatccatga   3840

cgcaagagaa gtttgaaatg ggctggaaag catggggaaa aagcattctc tttgccccgg   3900

aattggctaa ctccacattt gtcgtagatg gacctgagac aaaggaatgc cctgatgagc   3960

acagagcttg gaacagcatg caaatcgaag acttcggctt tggcatcaca tcaacccgtg   4020

tgtggctgaa gattagagag gagagcactg acgagtgtga tggagcgatc ataggtacgg   4080

ctgtcaaagg acatgtggca gtccatagtg acttgtcgta ctggattgag agtcgctaca   4140

acgacacatg gaaacttgag agggcagtct ttggagaggt taaatcttgc acttggccag   4200

agacacacac cctatgggga gatggtgttg aggaaagtga actcatcatt ccgcatacca   4260

tagccggacc aaaaagcaag cacaatcgga gggaagggta taagacacaa aaccagggac   4320

cttgggacga gaatggcata gtcttggact ttgactattg cccagggaca aaagtcacca   4380

ttacagagga ttgtggcaag agaggccctt cggtcagaac cactactgac agtggaaagt   4440

tgatcactga ctggtgctgt cgcagttgct cccttccgcc cctacgattc cggacagaaa   4500

atggctgctg gtacggaatg gaaatcagac ctgttaggca tgatgaaaca acactcgtca   4560

gatcacaggt tgatgctttt aatggtgaaa tggttgaccc ttttcagctg ggccttctgg   4620

tgatgtttct ggccacccag gaggtccttc gcaagaggtg gacggccaga ttgaccattc   4680

ctgcggtttt gggggcctta cttgtgctga tgcttggggg catcacttac actgatttgg   4740

cgaggtatgt ggtgctagtc gctgctgctt tcgcagaggc caacagtgga ggagacgtcc   4800

tgcaccttgc tttgattgcc gtttttaaga tccaaccagc atttttagtg atgaacatgc   4860

ttagcacgag atggacgaac caagaaaacg tggttctggt cctaggggct gcctttttcc   4920

aattggcctc agtagatctg caaataggag ttcacggaat cctgaatgcc gccgctatag   4980

catggatgat tgtccgggcg atcaccttcc ccacaacctc ctccgtcacc atgccagtct   5040

tagcgcttct aaccccggga atgagggctc tatacctaga tacttacaga atcatcctcc   5100

tcgtcatagg gatttgctct ctgctgcaag agaggaaaaa gaccatggca aaaaagaaag   5160

gagctgtact cttgggctta gcgctcacat ccactggatg gttttcgccc accactatag   5220

ctgccggact aatggtctgc aacccaaaca agaagagagg gtggccagct actgagtttt   5280

tgtcggcagt tggattgatg tttgccatcg taggtggttt ggcagagttg gatattgaat   5340

ccatgtcaat acccttcatg ctggcaggtc tcatggcagt gtcctacgtg gtgtcaggaa   5400

aagcaacaga tatgtggctt gaacgggccg ccgacatcag ctgggagatg gatgctgcaa   5460

tcacaggaag cagtcggagg ctggatgtga agctggatga agacggagat tttcacttga   5520

ttgatgatcc cggtgttcca tggaaggtct gggtcctgcg catgtcttgc attggcttag   5580

ccgccctcac gccttgggcc attgttcccg ccgcttttgg ttattggctc actttaaaaa   5640

caacaaaaag aggaggcgtg ttttgggaca cgccatcccc aaaaccttgc tcaaaaggag   5700

acaccactac aggagtttac cgcattatgg ctagagggat tcttggcact taccaggccg   5760

gcgtcggagt catgtacgag aatgttttcc acacactatg gcacacaact agaggagcag   5820

ccattatgag tggagaagga aaattgacgc catactgggg tagtgtgaaa gaagaccgca   5880

tagcttacgg aggcccatgg aggtttgatc gaaaatggaa tggaacagat gacgtgcaag   5940

tgatcgtggt agaaccgggg aaggctgcag taaacatcca gacaaaacca ggggtgtttc   6000

ggactccctt cggggaggtt ggggctgtta gtctggatta cccgcgagga acatccggct   6060

cacccattct ggattccaat ggagacatca taggcctgta cggcaatgga gttgagcttg   6120

gcgatggttc atacgtcagc gccatcgtgc agggtgaccg tcaggaggaa ccagtcccag   6180

aagcttacac cccaaacatg ttgagaaaga gacagatgac tgtactagat ttgcaccctg   6240

gttcagggaa aaccaggaaa attctgccac aaataattaa ggacgctatc cagcagcgcc   6300

taagaacagc tgtgttggca ccgacgcggg tggtagcagc agaaatggca gaagctttga   6360

gagggctccc agtacgatat caaacttcag cagtgcagag agagcaccaa gggaatgaaa   6420

tagtggatgt gatgtgccac gccactctga cccatagact gatgtcaccg aacagagtgc   6480

ccaactacaa cctatttgtc atggatgaag ctcatttcac cgacccagcc agtatagctg   6540

cacgaggata cattgctacc aaggtggaat taggggaggc agcagccatc tttatgacag   6600

cgaccccgcc tggaaccacg gatccttttc ctgactcaaa tgccccaatc catgatttgc   6660

aagatgagat accagacagg gcgtggagca gtggatacga atggatcaca gaatatgcgg   6720

gaaaaaccgt gtggtttgtg gcaagcgtaa aaatggggaa tgagattgca atgtgcctcc   6780

aaagagcggg gaaaaaggtc atccaactca accgcaagtc ctatgacaca gaatacccaa   6840

aatgtaagaa tggagactgg gattttgtca tcaccaccga catctctgaa atgggggcca   6900

acttcggtgc gagcagggtc atcgactgta gaaagagcgt gaagcctacc atcttagaag   6960

agggagaagg cagagtcatc ctcggaaacc catcccccat aaccagcgca agcgcagctc   7020

aacggagggg cagggtaggc agaaacccca accaggttgg agatgaatac cactatgggg   7080

gggccaccag tgaagatgac agtaatctag cccattggac agaggcaaag atcatgttag   7140

acaacataca catgcccaat ggactggtgg cccagctcta tggaccagag agggaaaagg   7200

ccttcacaat ggatggcgaa taccgtctca gaggtgaaga aaagaaaaac ttcttagagc   7260

tgcttaggac ggctgacctc ccggtgtggc tggcctacaa ggtggcgtcc aatggcattc   7320

agtacaccga cagaaagtgg tgttttgatg ggccgcgcac gaatgccata ctggaggaca   7380

acatcgaggt agagatagtc acccggatgg gtgagaggaa aatcctcaag ccgagatggc   7440

ttgatgcaag agtttatgca gatcaccaag ccctcaagtg gttcaaagac ttcgcagcag   7500

gaaagagatc agccgttagc ttcatagagg tgctcggtcg tatgcctgag catttcatgg   7560

gaaagacgcg ggaagcttta gacaccatgt acttggttgc aacggctgag aaaggtggga   7620

aagcacaccg aatggctctc gaagagctgc cagatgcact ggaaaccatt acacttattg   7680

ttgctatcac tgtgatgaca ggaggattct ttctactcat gatgcagcga aagggtatag   7740

ggaagatggg tcttggtgct ctagtgctca cgctagctac cttcttcctg tgggcggcag   7800

aggttcctgg aaccaaaata gcggggaccc tgctgatcgc cctgctgctt atggtggttc   7860

tcatcccaga accggaaaaa cagaggtcac agacagataa ccaactggcg gtgtttctca   7920

tctgtgtctt gaccgtggtt ggagtggtgg cagcaaacga gtacgggatg ctagaaaaaa   7980

ccaaagcaga cctcaagagc atgtttggcg gaaagacgca ggcatcagga ctgactggat   8040

tgccaagcat ggcactggac ctgcgtccag ccacagcttg ggcactgtat ggggggagca   8100

cagtcgtgct aacccctctt ctgaagcacc tgatcacgtc ggaatacgtc accacatcgc   8160

tagcctcaat taactcacaa gctggctcat tatttgtctt gccacgaggc gtgcctttta   8220

ccgacctaga cttgaccgtt ggcctcgtcc tccttggctg ttggggtcaa atcaccctca   8280

caacgttttt gacagccatg gttctggcga cacttcacta tgggtacatg ctccctggat   8340

ggcaagcaga agcactcagg gctgcccaga gaaggacagc ggctggaata atgaagaatg   8400

ccgttgttga cggaatggtc gccactgatg tgcctgaact ggaaaggacc actcctctga   8460

tgcaaaagaa agtcggacag gtgctcctca taggggtaag cgtggcagcg ttcctcgtca   8520

accccaatgt caccactgtg agagaagcag gggtgttggt gacggcggct acgctcactt   8580

tgtgggacaa tggagccagt gccgtttgga attccaccac tgccacggga ctctgccatg   8640

taatgcgagg tagctacctg gctggaggct ccattgcttg gactctcatc aagaacgctg   8700

acaagccctc cttgaaaagg ggaaggcctg ggggcaggac gctaggggag cagtggaagg   8760

aaaaactaaa tgccatgagc agagaagagt tttttaaata ccggagagag gccataatcg   8820

aggtggaccg cactgaagca cgcagggcta gacgtgaaaa taacatagtg ggaggacatc   8880

cggtttcgcg aggctcagca aaactccgtt ggctcgtgga gaaaggattt gtctcgccaa   8940

taggaaaagt cattgatcta gggtgtgggc gtggaggatg gagctactac gcagcaaccc   9000

tgaagaaggt ccaggaagtc agaggataca cgaaaggtgg ggcgggacat gaagaaccga   9060

tgctcatgca gagctacggc tggaacctgg tctccctgaa gagtggagtg gacgtgtttt   9120

acaaaccttc agagcccagt gacactctgt tctgcgacat aggggaatcc tccccaagtc   9180

cagaagtaga agaacaacgc acattacgcg tcctagagat gacatctgac tggttgcacc   9240

gaggacctag agagttctgc ataaaagttc tttgccccta catgcccaag gttatagaaa   9300

aaatggaagt tctgcagcgc cgcttcggag gtgggctagt gcgtctcccc ctgtcccgca   9360

actccaatca cgagatgtat tgggttagtg gagccgctgg caatgtggtg cacgctgtga   9420

acatgaccag ccaggtacta ctggggcgaa tggatcgcac agtgtggaga gggccaaagt   9480

atgaggaaga tgtcaaccta gggagcggaa caagagccgt gggaaaggga gaagtccata   9540

gcaatcagga gaaaatcaag aagagaatcc agaagcttaa agaagaattc gccacaacgt   9600

ggcacaaaga ccctgagcat ccataccgca cttggacata ccacggaagc tatgaagtga   9660

aggctactgg ctcagctagc tctctcgtca acggagtggt gaagctcatg agcaaacctt   9720

gggacgccat tgccaacgtc accaccatgg ccatgactga caccaccccg tttggacagc   9780

aaagagtttt caaggagaaa gttgacacga aggctcctga gccaccagct ggagccaagg   9840

aagtgctcaa cgagaccacc aactggctgt gggcctactt gtcacgggaa aaaagacccc   9900

gcttgtgcac caaggaagaa ttcataaaga aagtcaatag caacgcggct cttggagcag   9960

tgttcgctga acagaatcaa tggagcacgg cgcgtgaggc tgtggatgac ccgcggtttt  10020

gggagatggt tgatgaagag agggaaaacc atctgcgagg agagtgtcac acatgtatct  10080

ataacatgat gggaaaaaga gagaagaagc ctggagagtt tggaaaagct aaaggaagca  10140

gggccatttg gttcatgtgg cttggagcac ggtatctaga gtttgaagct ttggggttcc  10200

tgaatgaaga ccattggctg agccgagaga attcaggagg tggagtggaa ggctcaggcg  10260

tccaaaagct gggatacatc ctccgtgaca tagcaggaaa gcaaggaggg aaaatgtacg  10320

ctgatgatac cgccgggtgg gacactagaa ttaccagaac tgatttagaa aatgaagcta  10380

aggtgctgga gcttctagat ggtgaacacc gcatgctcgc ccgagccata attgaattga  10440

cttacaggca caaagtggtc aaggtcatga gacctgcagc agaaggaaag accgtgatgg  10500

acgtgatatc aagagaagat caaaggggga gtggacaggt ggtcacttat gctcttaaca  10560

ctttcacgaa catcgctgtc cagctcgtca ggctgatgga ggctgagggg gtcattggac  10620

cacaacactt ggaacagcta cctagaaaaa acaagatagc tgtcaggacc tggctctttg  10680

agaatggaga ggagagagtg accaggatgg cgatcagcgg agacgactgt gtcgtcaagc  10740

cgctggacga cagattcgcc acggccctcc acttcctcaa cgcaatgtca aaggtcagaa  10800

aggacatcca ggaatggaag ccttcgcatg gctggcacga ctggcagcaa gttcccttct  10860

gctctaacca ttttcaggag attgtgatga aagatggaag gagtatcgtt gtcccgtgca  10920

gaggacagga tgagctgata ggcagggctc gcatctcccc aggagctgga tggaatgtga  10980

aggacacagc ttgtctggcc aaagcatatg cacagatgtg gctactccta tacttccatc  11040

gtagggactt gcgtctcatg gcaaatgcga tttgctcagc agtgccagtg gattgggtgc  11100

ccacgggcag gacatcctgg tcgatacact cgaaaggaga gtggatgacc acagaagaca  11160

tgctgcaggt ctggaacaga gtctggattg aagaaaatga atggatgatg gacaagactc  11220

caatcacaag ctggacagac gttccgtacg tgggaaagcg tgaggacatc tggtgtggca  11280

gcctcatcgg aacgcgatcc agagcaacct gggctgagaa catctacgcg gcgataaacc  11340

aggttagagc tgtcattggg aaagaaaatt atgttgacta catgacctca ctcaggagat  11400

acgaagacgt cttgatccag gaagacaggg tcatctagtg tgatttaagg tagaaaagta  11460

gactatgtaa ataatgtaaa tgagaaaatg catgcatatg gagtcaggcc agcaaaagct  11520

gccaccggat actgggtaga cggtgctgcc tgcgtctcag tcccaggagg actgggttaa  11580

caaatctgac aacagaaagt gagaaagccc tcagaaccgt ctcggaagca ggtccctgct  11640

cactggaagt tgaaggacca acgtcaggcc acaaatttgt gccactccgc tggggagtgc  11700

ggcctgcgca gccccaggag gactgggtta ccaaagccgt tgaggccccc acggcccaag  11760

cctcgtctag gatgcaatag acgaggtgta aggactagag gttagaggag accccgtgga  11820

aacaacaaca tgcggcccaa gccccctcga agctgtagag gaggtggaag gactagaggt  11880

tagaggagac cccgcatttg catcaaacag catattgaca cctgggaata gactgggaga  11940

tcttctgctc tatctcaaca tcagctacta ggcacagagc gccgaagtat gtagctggtg  12000

gtgagtaaga acacaggatc tggtacccat cgatgataag ctgtcaaaca tgagaatccg  12060

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac  12120

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca  12180

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gacggccagt gccaagcttg catgcctgca ggtcgacggt aatacgactc actatag     16257

 

Claims (7)

1.一种携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.22所示。

2.权利要求1所述的全长感染性克隆，其构建方法如下：

（1）拼接乙型脑炎病毒全长基因组序列；

①分节段合成乙型脑炎病毒基因组的互补DNA：合成片段F1、F2、F3和F4，每个片段分别连接到载体pUC57；F1、F2、F3和F4片段的序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；

②乙型脑炎病毒基因组四个片段的拼接：用SalI和KpnI酶切pMW118，采用胶回收的方法回收pMW118的大片段，采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F1和F2片段插入到pMW118，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2；然后使用NaeI和KpnI酶切pJEVF1-F2，采用胶回收的方法回收pJEVF1-F2的大片段，使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将F3和F4片段插入到pJEVF1-F2，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVF1-F2-F3-F4，即为乙型脑炎病毒的全长感染性克隆pJEVFL；

（2）构建携带EGFP基因的JEV全长感染性克隆；

①将EGFP基因插入到乙型脑炎病毒的E基因和NS1基因之间：合成序列SEQ ID NO:14，并将该片断连接进入pUC57；以pEGFP-C1质粒为模板，扩增EGFP 片段为SEQ ID NO:19所示；

使用SacI酶切pJEVFL，然后采用Gibson Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒将SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19片段插入到pJEVFL，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEVFL-EGFP，其序列为SEQ ID NO:22所示。

3.权利要求1所述的全长感染性克隆制备出的重组病毒。

4.权利要求1所述的全长感染性克隆在制备携带绿色荧光蛋白基因的重组乙型脑炎病毒中的应用。

5.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备研究脑神经环路平台中的应用。

6.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备抗乙型脑炎病毒药物中的应用。

7.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备研究乙型脑炎病毒抗原表位中的应用。