CN110279705A - 一种治疗强直性肌营养不良症i型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法，涉及生物医疗技术领域，采用miR‑322/‑503或者单独miR‑322或miR‑503及其前体的序列以及高度相似序列，可以直接靶向作用于毒性RNA并降解毒性RNA，从而抑制细胞核内焦点的形成，恢复正常RNA可变剪切模式，提高成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力；miR‑322/‑503可以抑制毒性RNA水平，可以从根本上治疗DM1；同时，miR‑322/‑503为细胞自身产生的分子，用于细胞和机体的治疗时安全风险较小。

Description

一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，特别是指一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法。

背景技术

强直性肌营养不良症I型(DM1)是最常见的成年发病的肌肉萎缩疾病，是由DMPKmRNA的3`UTR区域过度扩增的CUG重复片段导致的。在正常人体内，DMPK mRNA中含有不超过34个CUG重复片段，而在DM1中，DMPK mRNA含有50个以上CUG重复序列，且显示出的疾病症状随CUG重复序列数目增加而更加恶化。含有过度扩增的CUG重复序列的RNA被称为“毒性RNA”。毒性RNA在细胞核内形成类似“发卡”的二级结构，吸附MBNL1蛋白，形成细胞核内焦点(ribonuclear foci)，并导致可发挥作用的MBNL1蛋白和Celf1蛋白水平的改变。MBNL1和Celf1是重要的RNA可变剪切调控蛋白，其水平的改变导致DM1内特征性的异常RNA可变剪切。同时DM1中成肌细胞分化成骨骼肌细胞的能力降低导致DM1中骨骼肌的萎缩和功能减退。由于毒性RNA是DM1的根本致病因素，抑制细胞内毒性RNA的水平是根治DM1的关键。

目前提出治疗DM1方法主要有三种。第一种主要是通过转基因过表达或者敲低的手段恢复正常细胞内的MBNL1和Celf1水平，借以恢复部分的RNA可变剪切模式，从而减轻一些DM1的症状。此方法未能抑制细胞内毒性RNA的水平，无法从根本上治疗DM1，并且通过转基因方式导入外源基因序列影响细胞内蛋白水平存在未知安全风险；第二种主要是通过化学分子、多肽或者小干扰RNA等作用于毒性RNA，使其不能形成“发卡”二级结构或者直接降解，从而达到抑制毒性RNA水平的目的。此方案可以抑制细胞内毒性RNA水平，但引入的化学分子、多肽或者小干扰RNA等均为外源分子，是否会引起细胞和机体的其他不良反应未知；第三种主要是通过基因编辑的手段在细胞基因组上切除编码毒性RNA的DNA片段，此方案可以从根本上去除毒性RNA的来源，但是目前基因编辑的手段尚不成熟，存在脱靶的问题。

申请人发现，目前的三种手段均具有治疗效果有限，并存在较大安全风险的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法，以解决现有技术中治疗效果有限，且存在较大安全风险的问题。

基于上述目的本发明提供的一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法，包括如下步骤，采用miR-322/-503和/或单独miR-322或miR-503和/或miR-322前体的序列或miR-503前体的序列以及高度相似序列，直接靶向作用于毒性RNA并降解毒性RNA，从而抑制细胞核内焦点的形成，恢复正常RNA可变剪切模式，提高成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力。

可选的，所述miR-322具有SEQ ID NO.1的碱基序列。

可选的，所述miR-503具有SEQ ID NO.2的碱基序列。

可选的，所述miR-322前体具有SEQ ID NO.3的碱基序列。

可选的，所述miR-503前体具有SEQ ID NO.4的碱基序列。

可选的，还包括采用正向引物和反向引物，依次经过PCR扩增、与pLL4.0载体进行EcoRI酶切、末端处理和胶回收、用T4连接酶进行连接反应、转化大肠杆菌感受态，获的miR-322/-503的表达载体。

可选的，所述正向引物序列为5’-CTCGAGGAATTCGCTGGCAAGAGTGATCCAGATGTT-3’。

可选的，所述反向引物序列为5’-CTCGAGGAATTCTTTACCTGAGCAGCAAGTGAGGC-3’。

可选的，所述pLL4.0载体具有SEQ ID NO.5的碱基序列。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法，采用miR-322/-503或者单独miR-322或miR-503及其前体的序列以及高度相似序列，可以直接靶向作用于毒性RNA并降解毒性RNA，从而抑制细胞核内焦点的形成，恢复正常RNA可变剪切模式，提高成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力；miR-322/-503可以抑制毒性RNA水平，可以从根本上治疗DM1；同时，miR-322/-503为细胞自身产生的分子，用于细胞和机体的治疗时安全风险较小。

附图说明

图1为本发明实施例3’UTR区域含5个和200个拷贝CUG重复序列的GFP表达质粒示意图；

图2为本发明实施例正常和DM1疾病细胞模型中MBNL1蛋白的免疫荧光染色示意图；

图3为本发明实施例正常和DM1疾病细胞模型中体外细胞分化成骨骼肌细胞的能力示意图；

图4为本发明实施例对DM1中特征性的被异常RNA可变剪切基因的检测结果示意图；

图5为本发明实施例检验miR-322/-503对DM1疾病中细胞核内焦点的作用示意图；

图6为本发明实施例检验miR-322/-503对DM1疾病中成肌细胞分化为骨骼肌细胞能力的作用示意图；

图7为本发明实施例检验miR-322/-503对DM1疾病中异常RNA可变剪切的作用示意图；

图8为本发明实施例GFP表达水平示意图；

图9为本发明实施例miR-322/-503对DM1疾病治疗流程示意图。

具体实施方式

为下面通过对实施例的描述，本发明的具体实施方式如所涉及的制造工艺及操作使用方法等，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

为了解决现有技术中的治疗强直性肌营养不良症I型的方法治疗效果有限，且存在较大安全风险的问题，本发明实施例提供的一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法，包括如下步骤，采用miR-322/-503和/或单独miR-322或miR-503和/或miR-322前体的序列或miR-503前体的序列以及高度相似序列，直接靶向作用于毒性RNA并降解毒性RNA，从而抑制细胞核内焦点的形成，恢复正常RNA可变剪切模式，提高成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力。

microRNA(miRNA)是细胞内一类20～22碱基的非编码RNA分子，其可通过识别对应靶点RNA分子的3’UTR区域降低靶点基因的水平。miRNA由于其来源于生物体本身，并且分子较小容易被递送，目前被广泛用于各种疾病的诊断和治疗中。

miR-322/-503和/或单独miR-322或miR-503和/或miR-322前体的序列或miR-503前体的序列以及高度相似序列，通过抑制DM1疾病中细胞核内焦点的形成，改善DM1疾病中成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力，抑制异常RNA可变剪切的发生，靶向结合过度扩增CUG重复序列并使过度扩增CUG重复序列降解，以达到治疗和修复DM1疾病缺陷的作用，作为细胞和机体的内源分子具有较高的安全性。

以下以miR-322/-503在DM1疾病模型的小鼠成肌细胞中的实验为例说明miR-322/-503对DM1的治疗作用。

一、获取miR-322/-503的表达载体：首先，从miRNA数据库miRBase(mirbase.org)获得小鼠miR-322和miR-503的序列，

miR-322：5’-CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGGA-3’；

miR-503：5’-UAGCAGCGGGAACAGUACUGCAG-3’。

然后，利用正向引物和反向引物从小鼠基因组上PCR扩增出764碱基对长度的DNA片段。将上述获得的DNA片段使用PCR Cleanup试剂盒(Axygen，Catalog No.:AP-PCR-250)进行纯化。将纯化后的DNA片段在37℃使用EcoRI(Thermo Scientific，Catalog No.:FD0274)酶切反应3小时。将pLL4.0(碱基序列如SEQ ID NO.5)空载体在37℃利用EcoRI(Thermo Scientific，Catalog No.:FD0274)和FastAP(Thermo Scientific，Catalog No.:EF0651)酶切同时末端去磷反应1.5小时。将上述DNA片段和pLL4.0载体酶切和去磷的产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切取750bp和7243bp的条带进行胶回收，胶回收利用胶回收试剂盒(Axygen，Catalog No.:AP-GX-250)依据说明书进行。将胶回收的DNA片段与pLL4.0载体进行连接反应，连接反应使用T4连接酶(Thermo Scientific，Catalog No.:EL0011)依据说明书进行。连接后的产物转化大肠杆菌感受态，转化后涂带氨苄抗性的LB培养基平板。

正向引物5’-CTCGAGGAATTCGCTGGCAAGAGTGATCCAGATGTT-3’；

反向引物5’-CTCGAGGAATTCTTTACCTGAGCAGCAAGTGAGGC-3’；

挑取转化后的大肠杆菌单菌落提取质粒，并测序确保miR-322/-503表达片段正确接入pLL4.0载体，获得的质粒记做pLL4.0-miR-322/-503。

二、获取正常和DM1疾病模型的小鼠成肌细胞：将3’UTR区域含有可转录5个拷贝CUG重复序列(GFP-CUG5)和200个拷贝CUG重复序列(GFP-CUG200)的GFP表达质粒(见图1)分别转染C2C12细胞，并用G418筛选稳定转染的细胞，分别得到C2C12-CUG5细胞系(正常)和C2C12-CUG200细胞系(DM1)。

三、对两种细胞体系进行验证，确保正常和DM1疾病模型构建成功：

1、通过针对MBNL1蛋白的免疫荧光染色，发现DM1细胞模型形成明显的细胞核内焦点，而正常细胞没有此现象(见图2)；

2、通过进行体外细胞分化，发现DM1细胞模型相对于正常细胞分化成骨骼肌细胞的能力明显降低(见图3)；

3、通过对ANXA7和ZASP这些DM1中特征性的被异常RNA可变剪切基因的检测，发现在DM1组中RNA可变剪切符合已知的DM1疾病模式，即包含ANXA7的第6号外显子(e6)和ZASP的第11号外显子(e11)的剪切形式在DM1疾病中降低(见图4)。

综上，正常和DM1疾病模型的小鼠成肌细胞构建成功。

四、构建在DM1细胞模型内对照细胞和过表达miR-322/-503的细胞系：

将pLL4.0空质粒和步骤一中获得的pLL4.0-miR-322/-503转入步骤二中获得的DM1疾病模型的小鼠成肌细胞内，并用puromycin筛选稳定转染的细胞，分别获得DM1对照细胞和DM1过表达miR-322/-503细胞。

1、检验miR-322/-503对DM1疾病中细胞核内焦点的作用：将DM1对照细胞和DM1过表达miR-322/-503细胞进行MBNL1蛋白的免疫荧光染色，在荧光显微镜下进行观察和拍照，发现miR-322/-503可以显著地抑制细胞核内焦点的形成(见图5)；

2、检验miR-322/-503对DM1疾病中成肌细胞分化为骨骼肌细胞能力的作用：将DM1对照细胞和DM1过表达miR-322/-503细胞进行为期6天的体外分化实验，并在分化结束时(第6天)进行针对骨骼肌细胞特异性的结构蛋白MHC进行免疫荧光染色，并统计其骨骼肌细胞分化的指标——骨骼肌细胞面积和核融合指数，发现miR-322/-503可以显著地提高成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力(见图6)；

3、检验miR-322/-503对DM1疾病中异常RNA可变剪切的作用：将DM1对照细胞和DM1过表达miR-322/-503细胞进行为期6天的体外分化实验，并在第0、1、2、4、6天提取细胞RNA样品，进行逆转录和PCR检测ANXA7和ZASP基因的RNA可变剪切模式，发现DM1过表达miR-322/-503细胞基因的RNA可变剪切模式因miR-322/-503过表达，而由DM1疾病模式向正常模式转变(包含ANXA7的第6号外显子(e6)和ZASP的第11号外显子(e11)的剪切形式的比例在过表达miR-322/-503后显著增加)，说明miR-322/-503可以抑制DM1疾病中异常RNA可变剪切的发生，(见图7)。

4、检验miR-322/-503降解异常扩增CUG片段的能力：将以下四组质粒组合瞬时转染293T细胞:

(1)GFP-CUG5和pLL4.0；

(2)GFP-CUG5和pLL4.0-miR-322/-503；

(3)GFP-CUG200和pLL4.0；

(4)GFP-CUG200和pLL4.0-miR-322/-503。

转染24小时后更换培养基，48小时后胰酶消化收集单细胞进行流式细胞术检验GFP的水平。miRNA可以通过识别靶点基因的3’UTR区域降低靶点基因的水平，而上述组合中CUG重复序列存在于GFP的3’UTR区域。通过对比以上四组的GFP表达水平，我们发现仅第四组呈现GFP分布左移，说明GFP水平下降。(见图8)；因此，miR-322/-503可以特异性地识别200拷贝的CUG重复序列，而不识别5拷贝的CUG重复序列。也就是说，miR-322/-503特异性地识别DM1疾病中过度扩增的CUG片段，并降低其水平，而对于正常范围的CUG重复序列无明显作用。

这不仅说明了miR-322/-503可以作用于毒性RNA并将其降解，也说明了miR-322/-503仅特异性地针对DM1疾病起作用而在正常状态下不起作用，提示其具有临床应用前景。miR-322/-503对DM1疾病治疗作用机理的流程(见图9)所示，miR-322/-503或者单独miR-322或miR-503可以特异性靶向作用于毒性RNA的CUG重复序列并将其降解；可以治疗或改善强直性肌营养不良I型(DM1)的缺陷，比如细胞核内焦点、成肌细胞分化能力下降和异常的RNA可变剪切模式等，通过抑制DM1疾病中细胞核内焦点的形成，改善DM1疾病中成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力，抑制异常RNA可变剪切的发生，以达到治疗和修复DM1疾病缺陷的作用，作为细胞和机体的内源分子具有较高的安全性。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法

<130> 2019/06/21

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> miR-322(RNA)

<400> 1

cagcagcaau ucauguuuug ga 22

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> miR-503（RNA）

<400> 2

uagcagcggg aacaguacug cag 23

<210> 3

<211> 95

<212> RNA

<213> miR-322前体（RNA）

<400> 3

ccucguugac uccgaagggc ugcagcagca auucauguuu uggaguauug ccaagguuca 60

aaacaugaag cgcugcaaca ccccuucgug gggaa 95

<210> 4

<211> 71

<212> RNA

<213> miR-503前体序列（RNA)

<400> 4

ugcccuagca gcgggaacag uacugcagug aguguuuggu gcccuggagu auuguuucca 60

cugccugggu a 71

<210> 5

<211> 7243

<212> DNA

<213> pLL4.0载体(DNA)

<400> 5

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240

attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300

atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360

acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420

tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600

tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660

ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720

accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780

gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020

gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080

ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140

ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200

ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260

aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320

tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380

caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440

aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500

aaagtaagac caccgcacag caagcggccg gccgcgctga tcttcagacc tggaggagga 1560

gatatgaggg acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca 1620

ttaggagtag cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg 1680

ggaataggag ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg 1740

tcaatgacgc tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac 1800

aatttgctga gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc 1860

aagcagctcc aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg 1920

gggatttggg gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt 1980

tggagtaata aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga 2040

gaaattaaca attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa 2100

gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt 2160

aacataacaa attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta 2220

ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca 2280

ccattatcgt ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata 2340

gaagaagaag gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatcggca 2400

ctgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg 2460

ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca 2520

aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga 2580

cagcagagat ccagtttggt tagtaccggg cccgctctag agatccgacg ccgccatctc 2640

taggcccgcg ccggccccct cgcacagact tgtgggagaa gctcggctac tcccctgccc 2700

cggttaattt gcatataata tttcctagta actatagagg cttaatgtgc gataaaagac 2760

agataatctg ttctttttaa tactagctac attttacatg ataggcttgg atttctataa 2820

gagatacaaa tactaaatta ttattttaaa aaacagcaca aaaggaaact caccctaact 2880

gtaaagtaat tgtgtgtttt gagactataa atatcccttg gagaaaagcc ttgttaacgc 2940

gcggtgaccc tcgagatccg cggccgcgcc ggctctagat cgcgaacgcg tgaattctac 3000

cgggtagggg aggcgctttt cccaaggcag tctggagcat gcgctttagc agccccgctg 3060

ggcacttggc gctacacaag tggcctctgg cctcgcacac attccacatc caccggtagg 3120

cgccaaccgg ctccgttctt tggtggcccc ttcgcgccac cttctactcc tcccctagtc 3180

aggaagttcc cccccgcccc gcagctcgcg tcgtgcagga cgtgacaaat ggaagtagca 3240

cgtctcacta gtctcgtgca gatggacagc accgctgagc aatggaagcg ggtaggcctt 3300

tggggcagcg gccaatagca gctttgctcc ttcgctttct gggctcagag gctgggaagg 3360

ggtgggtccg ggggcgggct caggggcggg ctcaggggcg gggcgggcgc ccgaaggtcc 3420

tccggaggcc cggcattctg cacgcttcaa aagcgcacgt ctgccgcgct gttctcctct 3480

tcctcatctc cgggcctttc gacctgcagc ccaagcttac catgaccgag tacaagccca 3540

cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc ccagggccgt acgcaccctc gccgccgcgt 3600

tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg tcgatccgga ccgccacatc gagcgggtca 3660

ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag gtgtgggtcg 3720

cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg 3780

tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc 3840

aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca 3900

ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg 3960

gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca 4020

acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag 4080

gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg acgggcgcgt ctggaacaat 4140

caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct 4200

tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg 4260

gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg 4320

cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt 4380

tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt 4440

gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg 4500

ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc 4560

tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat 4620

ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc 4680

cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg aattaattct 4740

gcagtcgaga cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca gctaccaatg 4800

ctgattgtgc ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc 4860

agctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa 4920

ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatatccttg atctgtggat 4980

ctaccacaca caaggctact tccctgattg gcagaactac acaccagggc cagggatcag 5040

atatccactg acctttggat ggtgctacaa gctagtacca gttgagcaag agaaggtaga 5100

agaagccaat gaaggagaga acacccgctt gttacaccct gtgagcctgc atgggatgga 5160

tgacccggag agagaagtat tagagtggag gtttgacagc cgcctagcat ttcatcacat 5220

ggcccgagag ctgcatccgg actgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg 5280

ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt 5340

gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc 5400

cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 5460

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 5520

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 5580

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 5640

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 5700

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 5760

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 5820

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 5880

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 5940

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 6000

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 6060

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 6120

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 6180

gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 6240

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 6300

ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 6360

atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 6420

agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 6480

ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 6540

tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 6600

ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 6660

caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 6720

gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 6780

atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 6840

accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 6900

aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 6960

gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 7020

tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 7080

aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 7140

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 7200

aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gac 7243

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 正向引物（DNA)

<400> 6

ctcgaggaat tcgctggcaa gagtgatcca gatgtt 36

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 反向引物（DNA）

<400> 7

ctcgaggaat tctttacctg agcagcaagt gaggc 35

Claims (9)

1.一种治疗强直性肌营养不良症I型的方法，其特征在于，包括如下步骤，采用miR-322/-503和/或单独miR-322或miR-503和/或miR-322前体的序列或miR-503前体的序列以及高度相似序列，直接靶向作用于毒性RNA并降解毒性RNA，从而抑制细胞核内焦点的形成，恢复正常RNA可变剪切模式，提高成肌细胞分化为骨骼肌细胞的能力。

2.根据权利要求1所述的治疗强直性肌营养不良症I型的方法，其特征在于，所述miR-322具有SEQ ID NO.1的碱基序列。

3.根据权利要求1所述的治疗强直性肌营养不良症I型的方法，其特征在于，所述miR-503具有SEQ ID NO.2的碱基序列。

4.根据权利要求1所述的治疗强直性肌营养不良症I型的方法，其特征在于，所述miR-322前体具有SEQ ID NO.3的碱基序列。

5.根据权利要求1所述的治疗强直性肌营养不良症I型的方法，其特征在于，所述miR-503前体具有SEQ ID NO.4的碱基序列。

6.根据权利要求1所述的治疗强直性肌营养不良症I型的方法，其特征在于，还包括采用正向引物和反向引物，依次经过PCR扩增、与pLL4.0载体进行EcoRI酶切、末端处理和胶回收、用T4连接酶进行连接反应、转化大肠杆菌感受态，获的miR-322/-503的表达载体。

7.根据权利要求6所述的治疗强直性肌营养不良症I型的方法，其特征在于，所述正向引物序列为5’-CTCGAGGAATTCGCTGGCAAGAGTGATCCAGATGTT-3’。

8.根据权利要求6所述的治疗强直性肌营养不良症I型的方法，其特征在于，所述反向引物序列为5’-CTCGAGGAATTCTTTACCTGAGCAGCAAGTGAGGC-3’。

9.根据权利要求6所述的治疗强直性肌营养不良症I型的方法，其特征在于，所述pLL4.0载体具有SEQ ID NO.5的碱基序列。