CN109750017B - 一种碱性纤维素酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种碱性纤维素酶及其制备方法和应用。本发明的碱性纤维素酶的基因来源于真正的碱性纤维质环境碱性腌竹池，碱性纤维素酶具体制备方法为：通过分子生物学手段获取样品的宏基因组；再高通量测序获得碱性纤维素酶的基因序列；然后将碱性纤维素酶基因扩增并整合至表达载体中，该载体转化宿主细胞；最后再培养已转化的细胞得到的发酵液中提取即得。本发明的碱性纤维素酶核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，与现有纤维素酶相似性不超过49％，在中碱性PH条件下具有较高酶活，应用于纺织抛光亦有很好效果，在纺织、洗涤、造纸等行业应用效果也很明显。

Description

一种碱性纤维素酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种碱性纤维素酶及其制备和应用。

背景技术

纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合物，绝大多数由绿色植物通过光合作用合成。微生物对纤维素的降解、转化是自然界中碳素转化的主要环节。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的多组分酶的总称。目前，纤维素酶产品广泛应用于纺织、饲料、酿造、制药、造纸等行业，尤其是在纺织行业的应用范围目前正在不断扩大。

纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。主要的有：康氏木霉、里氏木霉、黑曲霉、斜卧青霉、芽孢杆菌等。丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，而嗜碱细菌产生的纤维素酶在碱性范围起作用。丝状真菌产生的纤维素酶往往酶系齐全，包括β-1,4-外切葡聚糖酶，β-1,4-内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，其作用于织物强度较大，造成失重率较高，织物成品容易损坏。碱性纤维素酶是β-1,4-内切葡聚糖酶，其作用于纤维素的非结晶区，对织物损伤较低。

针对碱性纤维素酶，以往的研究常常是在富含纤维素的土壤腐殖质中寻找具有碱性特性的酶，或是在碱性的盐湖等环境中寻找耐碱性菌株，测试其纤维素降解能力；换言之，以往筛选菌株所选取的环境样品，往往并不同时具备碱性与富含纤维素这两个条件。通过传统筛菌方式获得碱性纤维素酶必须基于在实验室能够成功分离并培养该菌株，而一些不能实验室培养的微生物很有可能存在一些稀有或特殊的碱性纤维素酶。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种碱性纤维素酶基因及其制备和应用，利用宏基因组分子手段从真正的碱性纤维质环境碱性腌竹池中直接分离获取碱性纤维素酶基因，并在工程酵母中进行重组表达得到的一种新的碱性纤维素酶基因。

本发明通过以下技术方案实现：

一种碱性纤维素酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述碱性纤维素酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述碱性纤维素酶与现有纤维素酶相似性不超过49％。

一种碱性纤维素酶的制备方法，包括：

1)分析选择取样地，采样，通过分子生物学手段获取样品的宏基因组；

2)对1)中宏基因组进行高通量测序获得碱性纤维素酶的基因序列；

3)将2)所得的碱性纤维素酶基因扩增并整合至表达载体中，并用该载体转化宿主细胞；

4)培养3)中已转化的细胞得到含有重组碱性纤维素酶的发酵液；

5)从4)中发酵液中制得碱性纤维素酶。

进一步的，所述方法还包括步骤6)：测试分析碱性纤维素酶的酶学性质。

进一步的，所述步骤1)中，样品来源于碱性腌竹池。

进一步的，所述步骤3)中，宿主细胞包括酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母、克鲁维酵母等。优选毕赤酵母。

进一步的，上述碱性纤维素酶在纺织布抛光领域的应用。

本发明有益效果：

本发明取样的碱性腌竹池位于广东省四会市邓村历史悠久，当地族谱和县志记载，古时中原人迁徙至该地区，带来了古法造竹纸的技术，利用当地丰富的竹资源和水资源，开始设立作坊造纸。该类腌竹池是专用于石灰水浸泡竹子，池中供微生物利用的碳源只有竹纤维，且检测得到改类碱性腌竹池的pH值为10，可认为该腌竹池同时具备碱性与富含纤维素这两个条件，是真正的碱性纤维质环境。池中的微生物历经近千年，产生了微生物(尤其是碱性纤维素酶)的进化。该古法造竹纸的技术已得到很好的保护和传承，该种碱性腌竹池目前也仍存续使用且使用状态稳定，而在同一采样点，并用同样的方法是可以重复获得表达本发明的碱性纤维素酶的基因的，且在该腌竹池使用状态稳定的情况下，一定时期内其中的微生物基因突变概率很小很小，甚至不突变。此处的“一定时期”可以百年计。

本发明以上述碱性、并且富含纤维素的碱性腌竹池的样品为研究对象，生长于该类腌竹池中的细菌长期以纤维素作为优势碳源，进化出了较强的、适于碱性pH的纤维素降解能力。利用分子生物学手段从真正的碱性纤维质环境中分离纤维素酶基因，序列分析显示其与已经报道的纤维素酶同源性低于50％。进一步将分离的基因在微生物中进行重组表达。对重组表达的纤维素酶进行酶学性质分析，其在中碱性PH条件下具有较高酶活，应用于纺织抛光亦有很好效果。

本发明所获得的碱性纤维素酶基因是通过宏基因组技术从真正的碱性高纤维环境中筛选得到的，避免传统的筛菌及克隆过程，应用效果明显，可用于纺织、洗涤、造纸等行业。

附图说明

图1样本宏基因组DNA电泳图。

图2碱性纤维素酶基因CEL6561扩增电泳图。

图3表达载体pPIC9K-CEL6561。

图4转化子降解羧甲基纤维素能力筛选。

图5碱性纤维素酶CEL6561的pH特性。

图6碱性纤维素酶CEL6561的温度特性。

图7碱性纤维素酶CEL6561处理织物抛光实验。

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

实施例1

获取样本的宏基因组及测序

首先将50mL样本置于50mL离心管中，剧烈震荡，100g低速离心10min，去掉底部竹纤维，上清转移至新离心管4600g离心30min，取沉淀并用磷酸钾缓冲液重新两遍，离心收集菌体作为宏基因组提取的样本。

使用快速土壤DNA分离试剂盒(生工生物)提取宏基因组DNA，电泳检测提取的宏基因组DNA(图1)，泳道1和2有明显DNA条带，宏基因组DNA提取成功。提取的DNA样品送往北京贝瑞和康生物技术有限公司做宏基因组测序。测序数据显示，CEL6561序列包含糖基水解家族9的保守结构域，判定其具有纤维水解能力，将其核苷酸序列列为纤维素酶基因序列。CEL6561的核酸序列全长1602bp(见SEQ ID NO.1)，氨基酸(见SEQ ID NO.2)533个。将氨基酸序列上传至NCBI数据库比对显示，序列CEL6561与现有数据库中的蛋白(NCBI登录号WP_073281770)同源性最高只有49％。

综上所述，可以确定CEL6561是不同于现有碱性纤维素酶的新的碱性纤维素酶。

实施例2纤维素酶CEL6561序列的重组表达

根据CEL6561核酸序列，设计引物：

6561-F：CCGGAATTCAGTACGATAAACAAGAAGATTAGAGG，

6561-R:ATAAGAATGCGGCCGCTTAAATGAGCACAGACAACAAAT

在序列两端引入合适的酶切位点EcoRI和NotI。扩增体系是：引物6561-F(10mM)1uL、引物6561-R(10mM)1uL、模版1uL(10ng/uL)、Prime STAR Mix 25uL、补ddH₂O至50uL；扩增程序如下：98℃，10s；63℃，5s；72℃，10s；循环数30次。扩增产物电泳检测如图2，1600bp处有明显条带。对获得的基因片段采用EcoRI和NotI酶切，然后引入pPIC9K质粒(购于NEB公司)中，得到的重组质粒命名为pPIC9K-CEL6561(图3)，经酶切及测序检测(英潍捷基生物公司)，序列正确，见SEQ ID NO.3。

酶切体系(50μL)：限制性内切酶共2μL，酶切缓冲液5μL，质粒＜1μg，剩余体积用水补齐。

连接体系(15μL)：连接酶反应液10μL，EcoRI-pPIC9K-NotI长片段5μL，EcoRI-CEL6561-NotI短片段2.5μL，补ddH20至20μL。

将质粒pPIC9K-CEL6561用SacII线性化后，电转GS115毕赤酵母，在MD板上筛选转化子，在添加G418的YPD板上筛选拷贝数较高的转化子，在YPC(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1％羧甲基纤维素)板上筛选降解纤维能力较高的转化子(图4)。1号转化子(命名为GS115-CEL1)具有最大的水解圈，具有最高的纤维素降解活力。

实施例3重组纤维素酶的发酵及酶学性质分析

将转化子GS115-CEL1单菌落挑于含50mLBMGY培养基的250mL的三角瓶中，30℃，250rpm过夜培养；室温3000g离心5min收集菌体，用10mL BMMY培养基重悬细胞于50mL离心管中继续培养；每隔24h添加终浓度为0.5％的甲醇继续诱导纤维素酶表达；每隔24h取样测纤维素酶酶活，第五天酶活最高，达56U/mL,用第五天的酶样做酶学性质分析，最佳pH为6-6.5,在pH7至pH8也保留了60％以上的酶活(图5)；最佳温度40-60℃(图6)，超过70℃酶活损失较严重。

实施例4纤维素酶纺织布抛光应用实验

称取100g烘干的棉布加入pH6.0的8公斤水中，将水与布一起倒入洗衣机中，添加本发明申请发酵的纤维素酶液100g，机器温度控制在55℃，转速180rpm，运行时间1h；对照组用清水替代酶液，其他条件不变。抛光完成后，将布匹完全烘干，称重，计算失重率。并查看抛光效果(布匹表面微小绒毛有无减少)。结果如图7显示，实验组明显具备较好的抛光效果，对照组表面仍然具有大量的微小纤毛。实验组失重率为2.1％，对照组失重率仅为0.12％，可见纤维素酶CEL6561具备较好的抛光潜力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州中国科学院先进技术研究所

<120> 一种碱性纤维素酶及其制备和应用

<130> CNP201710367

<141> 2017-11-06

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagtacga taaacaagaa gattagagga aatcaagtag ggtatgatcc agaatttgag 60

aagatattga ttataaaaga tccaacttct ctaagatatc aattaaaaaa agatgaacaa 120

ctcatagaac agggaatatt aagtaaagct actactcacc catatacacg tgaggaggat 180

tatttttgtg acctcagtca tgtgaaagta gaaggtgttt atcaattaat gatagaagat 240

atggcgggat actttccttt tgtagttaag aaaaactgct acgaagattt attattaaat 300

accctgcgct ttttttatct tcagagatgc ggagaaaacc ttccagaaga atttgctaat 360

gagtttcagc atagaagttg tcacgatcag catgctcgta tttatggaac aaatcaaagg 420

atttctgtaa acggtggttg gcatgatgct ggtgattatg gtcgttatat cgttgccgca 480

gcggtgacag ttgctgattt attgttagca tttgaagaaa cgcacaaaat ttcaactctg 540

aatttaagaa tacctgaaag caaattacag attccagatt tgttgagtga gattcgctat 600

gaattggaat ggatgctttc catgcaaaat cagaataacg gacaagttta tcataaagta 660

acctgtgcca gtttttgtgg gtttattatg ccggaagaag agcaggaaga attagttgtt 720

acggagcctt cgattacagc aaccgcaacc tttgcagcta cgactgctat ggcagttgca 780

ttttatgaat cttttgacaa agatttttcg gaacgtttaa aacaagcttc gaaagcggct 840

tatgatgcat tgaaggacat gcatatgcca gaagggttta aaaatccaga tggagttgta 900

acaggagagt atggtgatgg aaaggatatt gacgaaagat actgggctgc agcggcatta 960

tataaggctt ttggagaatc aaagtatcga gaagactttg aaacattggc caaaaaagaa 1020

gttcttcatg gctatggatg ggaggaagtt ggaagttttg ggaatcaggc ttatctcaca 1080

acagaaaatt tcccgataga tgaaaattta cgggaagaaa ttcaaaaaca aatgatcaaa 1140

aaagcagatg aacttgagga aaaaatagcg atagaacctt atggagtttc gttttctgaa 1200

agcgattata tttggggcag taatatgtat gcggcagaaa atggcaatca tttatttgat 1260

gcttatagaa tcacaaagaa tgtcgcatat ttaaatcatg caagaagcca gctacattat 1320

ttgctaggga aaaatccatg cggatattgt tatgtaactg gatttggttt tttatcacca 1380

aagtacccac atcacagacc gtcttcggcc gtagggaaac caatggaagg tatgttggtt 1440

ggtggaccgg atcgtggtct gaatgatccc gcagcggtag aatttcttaa ggatcagtca 1500

gccccatgtt gctatgtaga tgatgaggga agttattcta caaatgaagt taccatttac 1560

tggaactctg cactggtgta tttgttgtct gtgctcattt aa 1602

<210> 2

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Thr Ile Asn Lys Lys Ile Arg Gly Asn Gln Val Gly Tyr Asp

1 5 10 15

Pro Glu Phe Glu Lys Ile Leu Ile Ile Lys Asp Pro Thr Ser Leu Arg

20 25 30

Tyr Gln Leu Lys Lys Asp Glu Gln Leu Ile Glu Gln Gly Ile Leu Ser

35 40 45

Lys Ala Thr Thr His Pro Tyr Thr Arg Glu Glu Asp Tyr Phe Cys Asp

50 55 60

Leu Ser His Val Lys Val Glu Gly Val Tyr Gln Leu Met Ile Glu Asp

65 70 75 80

Met Ala Gly Tyr Phe Pro Phe Val Val Lys Lys Asn Cys Tyr Glu Asp

85 90 95

Leu Leu Leu Asn Thr Leu Arg Phe Phe Tyr Leu Gln Arg Cys Gly Glu

100 105 110

Asn Leu Pro Glu Glu Phe Ala Asn Glu Phe Gln His Arg Ser Cys His

115 120 125

Asp Gln His Ala Arg Ile Tyr Gly Thr Asn Gln Arg Ile Ser Val Asn

130 135 140

Gly Gly Trp His Asp Ala Gly Asp Tyr Gly Arg Tyr Ile Val Ala Ala

145 150 155 160

Ala Val Thr Val Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Glu Glu Thr His Lys

165 170 175

Ile Ser Thr Leu Asn Leu Arg Ile Pro Glu Ser Lys Leu Gln Ile Pro

180 185 190

Asp Leu Leu Ser Glu Ile Arg Tyr Glu Leu Glu Trp Met Leu Ser Met

195 200 205

Gln Asn Gln Asn Asn Gly Gln Val Tyr His Lys Val Thr Cys Ala Ser

210 215 220

Phe Cys Gly Phe Ile Met Pro Glu Glu Glu Gln Glu Glu Leu Val Val

225 230 235 240

Thr Glu Pro Ser Ile Thr Ala Thr Ala Thr Phe Ala Ala Thr Thr Ala

245 250 255

Met Ala Val Ala Phe Tyr Glu Ser Phe Asp Lys Asp Phe Ser Glu Arg

260 265 270

Leu Lys Gln Ala Ser Lys Ala Ala Tyr Asp Ala Leu Lys Asp Met His

275 280 285

Met Pro Glu Gly Phe Lys Asn Pro Asp Gly Val Val Thr Gly Glu Tyr

290 295 300

Gly Asp Gly Lys Asp Ile Asp Glu Arg Tyr Trp Ala Ala Ala Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Lys Ala Phe Gly Glu Ser Lys Tyr Arg Glu Asp Phe Glu Thr Leu

325 330 335

Ala Lys Lys Glu Val Leu His Gly Tyr Gly Trp Glu Glu Val Gly Ser

340 345 350

Phe Gly Asn Gln Ala Tyr Leu Thr Thr Glu Asn Phe Pro Ile Asp Glu

355 360 365

Asn Leu Arg Glu Glu Ile Gln Lys Gln Met Ile Lys Lys Ala Asp Glu

370 375 380

Leu Glu Glu Lys Ile Ala Ile Glu Pro Tyr Gly Val Ser Phe Ser Glu

385 390 395 400

Ser Asp Tyr Ile Trp Gly Ser Asn Met Tyr Ala Ala Glu Asn Gly Asn

405 410 415

His Leu Phe Asp Ala Tyr Arg Ile Thr Lys Asn Val Ala Tyr Leu Asn

420 425 430

His Ala Arg Ser Gln Leu His Tyr Leu Leu Gly Lys Asn Pro Cys Gly

435 440 445

Tyr Cys Tyr Val Thr Gly Phe Gly Phe Leu Ser Pro Lys Tyr Pro His

450 455 460

His Arg Pro Ser Ser Ala Val Gly Lys Pro Met Glu Gly Met Leu Val

465 470 475 480

Gly Gly Pro Asp Arg Gly Leu Asn Asp Pro Ala Ala Val Glu Phe Leu

485 490 495

Lys Asp Gln Ser Ala Pro Cys Cys Tyr Val Asp Asp Glu Gly Ser Tyr

500 505 510

Ser Thr Asn Glu Val Thr Ile Tyr Trp Asn Ser Ala Leu Val Tyr Leu

515 520 525

Leu Ser Val Leu Ile

530

<210> 3

<211> 10866

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccgcgaat taattcgcct tagacatgac tgttcctcag ttcaagttgg gcacttacga 60

gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag aggatgtcag aatgccattt gcctgagaga 120

tgcaggcttc atttttgata cttttttatt tgtaacctat atagtatagg attttttttg 180

tcattttgtt tcttctcgta cgagcttgct cctgatcagc ctatctcgca gctgatgaat 240

atcttgtggt aggggtttgg gaaaatcatt cgagtttgat gtttttcttg gtatttccca 300

ctcctcttca gagtacagaa gattaagtga gaagttcgtt tgtgcaagct tatcgataag 360

ctttaatgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcaggcacc gtgtatgaaa 420

tctaacaatg cgctcatcgt catcctcggc accgtcaccc tggatgctgt aggcataggc 480

ttggttatgc cggtactgcc gggcctcttg cgggatatcg tccattccga cagcatcgcc 540

agtcactatg gcgtgctgct agcgctatat gcgttgatgc aatttctatg cgcacccgtt 600

ctcggagcac tgtccgaccg ctttggccgc cgcccagtcc tgctcgcttc gctacttgga 660

gccactatcg actacgcgat catggcgacc acacccgtcc tgtggatcta tcgaatctaa 720

atgtaagtta aaatctctaa ataattaaat aagtcccagt ttctccatac gaaccttaac 780

agcattgcgg tgagcatcta gaccttcaac agcagccaga tccatcactg cttggccaat 840

atgtttcagt ccctcaggag ttacgtcttg tgaagtgatg aacttctgga aggttgcagt 900

gttaactccg ctgtattgac gggcatatcc gtacgttggc aaagtgtggt tggtaccgga 960

ggagtaatct ccacaactct ctggagagta ggcaccaaca aacacagatc cagcgtgttg 1020

tacttgatca acataagaag aagcattctc gatttgcagg atcaagtgtt caggagcgta 1080

ctgattggac atttccaaag cctgctcgta ggttgcaacc gatagggttg tagagtgtgc 1140

aatacacttg cgtacaattt caacccttgg caactgcaca gcttggttgt gaacagcatc 1200

ttcaattctg gcaagctcct tgtctgtcat atcgacagcc aacagaatca cctgggaatc 1260

aataccatgt tcagcttgag cagaaggtct gaggcaacga aatctggatc agcgtattta 1320

tcagcaataa ctagaacttc agaaggccca gcaggcatgt caatactaca cagggctgat 1380

gtgtcatttt gaaccatcat cttggcagca gtaacgaact ggtttcctgg accaaatatt 1440

ttgtcacact taggaacagt ttctgttccg taagccatag cagctactgc ctgggcgcct 1500

cctgctagca cgatacactt agcaccaacc ttgtgggcaa cgtagatgac ttctggggta 1560

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gcaggaacac ccagcatcag ggaagtggaa ggcagaattg cggttccacc aggaatatag 1680

aggccaactt tctcaatagg tcttgcaaaa cgagagcaga ctacaccagg gcaagtctca 1740

acttgcaacg tctccgttag ttgagcttca tggaatttcc tgacgttatc tatagagaga 1800

tcaatggctc tcttaacgtt atctggcaat tgcataagtt cctctgggaa aggagcttct 1860

aacacaggtg tcttcaaagc gactccatca aacttggcag ttagttctaa aagggctttg 1920

tcaccatttt gacgaacatt gtcgacaatt ggtttgacta attccataat ctgttccgtt 1980

ttctggatag gacgacgaag ggcatcttca atttcttgtg aggaggcctt agaaacgtca 2040

attttgcaca attcaatacg accttcagaa gggacttctt taggtttgga ttcttcttta 2100

ggttgttcct tggtgtatcc tggcttggca tctcctttcc ttctagtgac ctttagggac 2160

ttcatatcca ggtttctctc cacctcgtcc aacgtcacac cgtacttggc acatctaact 2220

aatgcaaaat aaaataagtc agcacattcc caggctatat cttccttgga tttagcttct 2280

gcaagttcat cagcttcctc cctaatttta gcgttcaaac aaaacttcgt cgtcaaataa 2340

ccgtttggta taagaacctt ctggagcatt gctcttacga tcccacaagg tgcttccatg 2400

gctctaagac cctttgattg gccaaaacag gaagtgcgtt ccaagtgaca gaaaccaaca 2460

cctgtttgtt caaccacaaa tttcaagcag tctccatcac aatccaattc gatacccagc 2520

aacttttgag ttcgtccaga tgtagcacct ttataccaca aaccgtgacg acgagattgg 2580

tagactccag tttgtgtcct tatagcctcc ggaatagact ttttggacga gtacaccagg 2640

cccaacgagt aattagaaga gtcagccacc aaagtagtga atagaccatc ggggcggtca 2700

gtagtcaaag acgccaacaa aatttcactg acagggaact ttttgacatc ttcagaaagt 2760

tcgtattcag tagtcaattg ccgagcatca ataatgggga ttataccaga agcaacagtg 2820

gaagtcacat ctaccaactt tgcggtctca gaaaaagcat aaacagttct actaccgcca 2880

ttagtgaaac ttttcaaatc gcccagtgga gaagaaaaag gcacagcgat actagcatta 2940

gcgggcaagg atgcaacttt atcaaccagg gtcctataga taaccctagc gcctgggatc 3000

atcctttgga caactctttc tgccaaatct aggtccaaaa tcacttcatt gataccatta 3060

ttgtacaact tgagcaagtt gtcgatcagc tcctcaaatt ggtcctctgt aacggatgac 3120

tcaacttgca cattaacttg aagctcagtc gattgagtga acttgatcag gttgtgcagc 3180

tggtcagcag catagggaaa cacggctttt cctaccaaac tcaaggaatt atcaaactct 3240

gcaacacttg cgtatgcagg tagcaaggga aatgtcatac ttgaagtcgg acagtgagtg 3300

tagtcttgag aaattctgaa gccgtatttt tattatcagt gagtcagtca tcaggagatc 3360

ctctacgccg gacgcatcgt ggccgacctg cagggggggg gggggcgctg aggtctgcct 3420

cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa 3480

gtgagggagc cacggttgat gagagctttg ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac 3540

ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac 3600

tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct 3660

gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 3720

actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 3780

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cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 3900

tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat 3960

gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 4020

catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc 4080

tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 4140

catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 4200

cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 4260

tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 4320

tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 4380

atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 4440

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ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg 4560

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ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg 4740

gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg 4800

caccattcct tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa 4860

tgcaggagtc gcataaggga gagcgtcgag tatctatgat tggaagtatg ggaatggtga 4920

tacccgcatt cttcagtgtc ttgaggtctc ctatcagatt atgcccaact aaagcaaccg 4980

gaggaggaga tttcatggta aatttctctg acttttggtc atcagtagac tcgaactgtg 5040

agactatctc ggttatgaca gcagaaatgt ccttcttgga gacagtaaat gaagtcccac 5100

caataaagaa atccttgtta tcaggaacaa acttcttgtt tcgaactttt tcggtgcctt 5160

gaactataaa atgtagagtg gatatgtcgg gtaggaatgg agcgggcaaa tgcttacctt 5220

ctggaccttc aagaggtatg tagggtttgt agatactgat gccaacttca gtgacaacgt 5280

tgctatttcg ttcaaaccat tccgaatcca gagaaatcaa agttgtttgt ctactattga 5340

tccaagccag tgcggtcttg aaactgacaa tagtgtgctc gtgttttgag gtcatctttg 5400

tatgaataaa tctagtcttt gatctaaata atcttgacga gccaaggcga taaataccca 5460

aatctaaaac tcttttaaaa cgttaaaagg acaagtatgt ctgcctgtat taaaccccaa 5520

atcagctcgt agtctgatcc tcatcaactt gaggggcact atcttgtttt agagaaattt 5580

gcggagatgc gatatcgaga aaaaggtacg ctgattttaa acgtgaaatt tatctcaaga 5640

tctctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga 5700

gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc 5760

agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt 5820

gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg 5880

tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 5940

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 6000

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6060

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 6120

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 6180

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 6240

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 6300

tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 6360

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 6420

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 6480

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 6540

tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 6600

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 6660

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 6720

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 6780

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 6840

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 6900

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 6960

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 7020

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 7080

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 7140

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg 7200

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 7260

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 7320

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 7380

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 7440

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc 7500

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 7560

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 7620

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 7680

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tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 7800

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 7860

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 7920

ccctttcgtc ttcaagaatt aattctcatg tttgacagct tatcatcgat aagctgactc 7980

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agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 8100

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acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 8340

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 8400

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gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 8520

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 8580

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 8640

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 8700

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 8760

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 8820

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actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 8940

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcct 9000

tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact 9060

acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 9120

gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg 9180

tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tcgagaaaag 9240

agaggctgaa gcttacgtag aattcagtac gataaacaag aagattagag gaaatcaagt 9300

agggtatgat ccagaatttg agaagatatt gattataaaa gatccaactt ctctaagata 9360

tcaattaaaa aaagatgaac aactcataga acagggaata ttaagtaaag ctactactca 9420

cccatataca cgtgaggagg attatttttg tgacctcagt catgtgaaag tagaaggtgt 9480

ttatcaatta atgatagaag atatggcggg atactttcct tttgtagtta agaaaaactg 9540

ctacgaagat ttattattaa ataccctgcg ctttttttat cttcagagat gcggagaaaa 9600

ccttccagaa gaatttgcta atgagtttca gcatagaagt tgtcacgatc agcatgctcg 9660

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tggtcgttat atcgttgccg cagcggtgac agttgctgat ttattgttag catttgaaga 9780

aacgcacaaa atttcaactc tgaatttaag aatacctgaa agcaaattac agattccaga 9840

tttgttgagt gagattcgct atgaattgga atggatgctt tccatgcaaa atcagaataa 9900

cggacaagtt tatcataaag taacctgtgc cagtttttgt gggtttatta tgccggaaga 9960

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atactgggct gcagcggcat tatataaggc ttttggagaa tcaaagtatc gagaagactt 10260

tgaaacattg gccaaaaaag aagttcttca tggctatgga tgggaggaag ttggaagttt 10320

tgggaatcag gcttatctca caacagaaaa tttcccgata gatgaaaatt tacgggaaga 10380

aattcaaaaa caaatgatca aaaaagcaga tgaacttgag gaaaaaatag cgatagaacc 10440

ttatggagtt tcgttttctg aaagcgatta tatttggggc agtaatatgt atgcggcaga 10500

aaatggcaat catttatttg atgcttatag aatcacaaag aatgtcgcat atttaaatca 10560

tgcaagaagc cagctacatt atttgctagg gaaaaatcca tgcggatatt gttatgtaac 10620

tggatttggt tttttatcac caaagtaccc acatcacaga ccgtcttcgg ccgtagggaa 10680

accaatggaa ggtatgttgg ttggtggacc ggatcgtggt ctgaatgatc ccgcagcggt 10740

agaatttctt aaggatcagt cagccccatg ttgctatgta gatgatgagg gaagttattc 10800

tacaaatgaa gttaccattt actggaactc tgcactggtg tatttgttgt ctgtgctcat 10860

ttaagc 10866

Claims (3)

1.一种碱性纤维素酶，其特征在于，所述碱性纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的碱性纤维素酶，其特征在于，所述碱性纤维素酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

3.权利要求1或2所述的碱性纤维素酶在纺织布抛光中的应用。

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