CN108060169B - 疏水蛋白mHFBI基因及表达的蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了疏水蛋白mHFBI基因及表达的蛋白及应用，所述基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2表示，本发明采用大肠杆菌的表达系统，利用基因工程的方法对原有的瑞氏木酶(Trichoderma reesei)HFBI基因中半胱氨酸进行突变为丝氨酸，获得高表达、表达的疏水蛋白溶解性好以及生产周期短的疏水蛋白mHFBI基因，实验表明，1L的TB培养基可以得到2mg目的蛋白mHFBI。疏水蛋白mHFBI基因表达的蛋白具有与真菌疏水蛋白HFBI相近的双亲性及应用性质。仍然可以作为乳化剂使小油滴在水中稳定存在，并且可以作为分散剂分散石墨烯及碳纳米管，解决疏水性材料分散问题。

Description

疏水蛋白mHFBI基因及表达的蛋白及应用

技术领域

本发明属于蛋白的基因工程及其性质研究，具体地涉及疏水蛋白突变体生产工艺及其应用。

背景技术

疏水蛋白是高等丝状真菌在特定生理时期分泌产生的一类小分子量蛋白质。经研究分析发现这类蛋白质具有很高的表面活性，能够通过自组装在两相界面处形成两性蛋白膜，从而改变原介质表面的亲/疏水性，这类蛋白由于其特殊的理化性质和双亲性，双亲性使得疏水蛋白像表面活性剂一样,可以在两相界面处通过自我装配,形成纳米级厚度的两性蛋白膜。此纳米级蛋白膜可以高效地改变几乎任何界面的表面性质,使疏水性表面的亲水性增强,而亲水性表面的疏水性增强，具有重要的理论价值和应用价值。近些年真菌疏水蛋白在国际上得到了广泛的应用，其中主要包括在蛋白的固定化、分离技术、乳化剂、生物活性包被材料、生物传感器和生物芯片等领域，从而改变原介质表面的亲/疏水性。

根据水缘性图谱和自组装成蛋白膜后溶解度的不同，真菌疏水蛋白被分为I型和II型两类。与I型疏水蛋白相比，由于通过II型真菌疏水蛋白进行了结晶并衍射得到三维空间结构，进而从分子结构层面解释了II型真菌疏水蛋白折叠后双亲性分子的原理，为在不同界面的自组装成膜性质提供了全新的理论基础。至今尚未有I型真菌疏水蛋白晶体结构的报道。与I类相反，在疏水性/亲水性界面形成的II类疏水蛋白单层不是纤维状的，并且与淀粉样蛋白结构的形成没有关系，也没有大的构象变化。但高分辨率原子力显微镜研究揭示了II类疏水蛋白HBFI包被的表面上形成显着的六角形重复图案，表明这些蛋白质还能够在表面膜中形成有序网络。I类疏水蛋白形成的单层具有高度有序的结构，并且由于单层组装涉及单体的大的结构重排，导致其自我装配形成的蛋白膜具有高度的不溶解性，而II型疏水蛋白膜溶解性较为温和，其组装后也较易洗脱下来。基于其双亲性机理，II型疏水蛋白已得到广泛的应用(1)在双水相系统(ATPS)中II型真菌疏水蛋白表现出比其他任何己知蛋白都强的极端分离行为，疏水蛋白HFBI、HFBII与非离子表面活性剂混合后被很好的分离到了非离子表面活性剂层；(2)在乳状液中的气泡表面形成蛋白膜，提高其表面粘弹性，有望取代乳状食品结构中的脂肪；(3)疏水蛋白HFBI能够使溶液中的小油滴稳定，可以用作食品加工过程中的乳化剂；(4)改善食品对抗相变能力；可以用于石油泄漏后的回收石油过程中。

尽管对于疏水蛋白而言具有许多重要的理论和应用价值，但对于大规模生产表达及纯化仍存在困难。HFBI作为一种常见的II型疏水蛋白，目前被广泛接受的方法是利用毕赤酵母真菌表达系统进行表达，但真菌生产周期长，最多达三周，使得生产成本大大增大。由于其疏水蛋白本身的双亲性质，对后续的分离纯化增大了难度，有报道其基于其在双水相系统(ATPS)中真菌疏水蛋白表现出比其他任何己知蛋白都强的极端分离行为。HFBI与非离子表面活性剂混合后，被很好的分离到了非离子表面活性剂层。但其分离过程成本较高，难以实现大规模生产；也有报道利用操作简单，表达量高的原核系统(例如大肠杆菌)表达疏水蛋白，但表达过程中由于蛋白折叠修饰等过程使得形成包涵体，进而涉及到包涵体的变性和复性操作，更加的加大了生产成本，增长了生产周期，使得疏水蛋白的大规模生产纯化存在困难。

因此，亟需一种可以作为融合蛋白生产周期短，分离方法简单的表达疏水蛋白的II型疏水蛋白同时保持其双亲性性质的基因。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种II型疏水蛋白mHFBI基因。

本发明的第二个目的是提供疏水蛋白mHFBI基因表达的疏水蛋白mHFBI。

本发明的第三个目的是提供疏水蛋白mHFBI的应用。

本发明的技术方案概述如下：

疏水蛋白mHFBI基因，该基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2表示。

疏水蛋白mHFBI基因表达的蛋白，该蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.4表示。

疏水蛋白mHFBI基因表达的蛋白作为修饰疏水性物质的应用。

本发明的优点：

本发明采用大肠杆菌的表达系统，利用基因工程的方法对原有的瑞氏木酶(Trichoderma reesei)HFBI基因中半胱氨酸进行突变为丝氨酸，获得高表达、表达的疏水蛋白溶解性好以及生产周期短的疏水蛋白mHFBI基因，实验表明，1L的TB培养基可以得到2mg目的蛋白mHFBI。疏水蛋白mHFBI基因表达的蛋白具有与真菌疏水蛋白HFBI相近的双亲性及应用性质。仍然可以作为乳化剂使小油滴在水中稳定存在，并且可以作为分散剂分散石墨烯及碳纳米管，解决疏水性材料分散问题。

附图说明

图1为mHFBI蛋白凝胶色谱层析检测实验。

图2为mHFBI蛋白SDS-page胶检测实验。

图3为HFBI及mHFBI蛋白乳化实验。

图4为HFBI及mHFBI蛋白分散碳纳米管材料实验。

图5为HFBI及mHFBI蛋白分散石墨烯材料实验。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

pET-28a为市售。

实验材料：

(1)LB培养基：配制每1000mL培养基，在800mL的一次蒸馏水中加入蛋白胨8g，酵母粉4g，NaCl 8g，溶解后，121℃、0.1MPa灭菌20min。配置固体LB培养基时向培养基内补加1.5％的琼脂粉。

(2)TB培养基：配制每900mL培养基，在900mL的一次蒸馏水中加入蛋白胨12g，酵母粉24g，NaCl 8g，甘油4ml，溶解于2L锥形瓶，121℃、0.1MPa灭菌20min。用90ml去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K 2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至100ml，121℃、0.1MPa灭菌20min。等待其两者温度降低到常温，在超净台中将两者混匀至上述2L锥形瓶。

(3)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)

30％丙烯酰胺溶液(100mL)：将30g丙烯酰胺与0.8g的甲叉双丙烯酰胺溶解在100mL的双蒸水中，溶解后放置于4℃棕色瓶内。

1.5M Tris-HCl pH＝8.8缓冲液(1L)：称取181.71g Tris溶解在800mL纯水中，调pH至8.8，定容至1L，室温保存。

0.5M Tris-HCl pH＝6.8缓冲液(500mL)：称取60.57g Tris溶解在400mL纯水中，调pH至6.8，定容至500mL，室温保存。

10％十二烷基硫酸钠(10％SDS)溶液(50mL)：称取5g SDS，加纯水至50mL，室温保存。

10％过硫酸铵(10％APS)溶液(20mL)：称取2g过硫酸铵，加纯水至20mL，每管500μL分装，-20℃保存备用。

表1 12％SDS-PAGE分离胶配制(10mL)

表2 SDS-PAGE浓缩胶配制(5mL)

(4)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5L)：称取75.5g Tris，470g甘氨酸，25g SDS，加纯水溶解，定容至5L。

(5)6×蛋白上样缓冲液：0.35M pH＝6.8Tris-HCl，10.28％W/V SDS，36％甘油，5％β-巯基乙醇，0.012g/mL溴酚蓝，1mL每管分装，-20℃保存备用。

(6)SDS-PAGE染色液(1L)：考马斯亮蓝R-250 5g，无水乙醇450mL，冰醋酸100mL，水450mL，混匀备用。

(7)SDS-PAGE脱色液：水、无水乙醇、冰醋酸按照6:3:1的比例混合均匀，备用。

(8)1M DTT：首先配制pH5.2、0.01M的乙酸钠溶液20mL，称取3.09g DTT，将其溶解于乙酸钠溶液中，过滤除菌，每管分装成1mL，保存于-20℃备用。

(9)卡那霉素(100mg/mL)：量取250mL双蒸水，121℃高压灭菌20min，25g卡那霉素加入双蒸水中，混匀，每管850μL分装，保存于-20℃。使用时将其稀释1000倍，终浓度为100μg/mL。

(10)异丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG(1M)：IPTG分子量为238.31，以5g/瓶规格为例。配制1M的IPTG需要的双蒸水的量为21mL，于超净工作台中，将5g的IPTG粉末全部溶解在121℃高压灭菌20min的21mL双蒸水中，混合均匀，每管1000μL分装，保存于-80℃。

(11)5×PBS：700mM NaCl，13.5mM KCl，50mM Na₂HPO₄，9mM KH₂PO₄(pH 7.3)，0.22μm滤膜抽滤，4℃保存备用。

(12)悬菌buffer：1×PBS，0.22μm滤膜抽滤，4℃保存备用。

(13)A液：20mM Tris-HCl pH8.0，0.22μm滤膜抽滤，4℃保存备用。

(14)B液：20mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl，0.22μm滤膜抽滤，4℃保存备用。

实施例1pET-28a-mHFBI的构建：

(1)通过化学合成方法将原有的瑞氏木酶菌丝HFBI基因(SEQ ID NO.1)中所有的半胱氨酸突变为丝氨酸，得到mHFBI基因(SEQ ID NO.2)，将mHFBI基因插到pMV中得到含mHFBI基因的pMV-mHFBI质粒模板，所述pMV-mHFBI的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示。

(2)从pMV-mHFBI核苷酸序列上剪下如SEQ ID NO.2所示的mHFBI基因：

a)酶切体系

b)条件

i.目的基因酶切1h，37℃。

ii.质粒酶切了2h，37℃。

iii.酶切后80℃灭活5min。

(3)将如SEQ ID NO.2所示的mHFBI基因连接在pET-28a中,得到pET-28a-mHFBI；得到pET-28a-mHFBI经测序，验证结果表明突变成功，HFBI突变体基因为mHFBI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(4)将质粒pET-28a-mHFBI转入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中并涂布于LB(含50μg/mL的Kana)平板。37℃培养8h后，挑单菌落放入含有1μL/mL Kana的LB培养液中培养4h，取出600μL菌液加入400μL 50％甘油中，放入-80℃冰箱中保存。

得到mHFBI表达菌株。

(5)将mHFBI的表达菌株进行传代培养，诱导其产生如SEQ ID NO.4所示目的蛋白(mHFBI)，并分离提纯目的蛋白。

(6)取5μL pET-28a-mHFBI表达菌株于含有5mL LB培养液的试管中，加入5μL Kana(50mg/ml)。摇床中37℃，220rpm培养10h。将菌液倒入含有1L TB培养液的2L锥形瓶中，加入500μL Kana(50mg/ml)。37℃，220rpm在摇床中培养5h，待菌液变浑浊后16℃，220rpm降温1h，然后加入700μL IPTG(1mol/L)诱导大肠杆菌产生目的蛋白。16℃，220rpm过夜培养12h。将菌液4000rpm，16℃离心20min，弃上清，将沉淀的大肠杆菌用药匙转移到烧杯中。并用1×PBS重悬。

(6)将大肠杆菌用高压破菌机破碎，再用超声破菌机破碎15min，用高速离心机4℃，18000rpm离心30min，取上清倒入镍柱，孵育1.5h后加入300mL咪唑20mM洗去杂蛋白，用20mL咪唑350mM洗脱目的蛋白。

(7)用3kDa的浓缩管盛装洗脱下来的蛋白质溶液，在离心机中4℃，3400rpm离心，并用pH8.0的缓冲液进行换液。得到含50mM氯化钠的tris缓冲体系的5ml蛋白溶液。

(8)5ml蛋白溶液经过Akta HiTrap Q阴离子交换层析系统纯化，收集洗脱峰至3kD的浓缩管，再次浓缩至500ml，经过Akta Hiload 75凝胶过滤层析系统纯化得到蛋白性质均一的溶液(证明溶解性好)。结果如图1，横坐标为A液流经柱子的体积ml，纵坐标为215nm吸收值，在67.2ml出现一个高度对称的单峰，其出峰位置与分子量吻合。

通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳对收集的蛋白液体进行，按照收集的出峰位置，依次在上样孔中注入16μL的蛋白样品，电压设为140V，进行浓缩胶和分离胶的电泳，当显示溴酚蓝指示剂跑到分离胶的底部时，停止电泳；电泳结束后，将胶置于干净的盒子中，用双蒸水冲洗，然后加入考马斯亮蓝染液，染色10min，染色完毕后，然后加入双蒸水，置于微波炉中，中火微波15-20s，清洗数次，直至退去凝胶的考马斯亮蓝蓝色背景，观察到清晰的蛋白质条带；

(9)由电泳图(图2)可知：经离子交换和凝胶过滤系统纯化后，在10kDa-15kDa之间，出现一条纯净的特异性蛋白条带，其分子量与疏水蛋白mHFBI的分子量相吻合，表明mHFBI疏水蛋白纯化成功。

(10)再次将收集洗脱后的蛋白溶液进行浓缩至500ml进行脱盐处理得到水溶液下的目的蛋白，再次浓缩到500ml装置5ml塑料管，放置冷冻干燥机干燥8h，称重。1L的TB培养基可以得到2mg目的蛋白mHFBI。

(11)称取1mg野生型HFBI(SEQ ID NO.5)和mHFBI蛋白，用灭菌的ddH2O配置成1mg/ml的蛋白溶液(避免任何形式的气泡与震荡，防止蛋白聚集)。水浴超声30s，若发现蛋白溶液有白色膜状物质，说明蛋白聚集。

蛋白形成母液后，长时间不用可放于-80℃冻存，短时间使用可放于4℃保存，并用封口膜封住。

(12)分别配制HFBI及mHFBI溶液0.1mg/ml，加入食品级豆油，使得最终油水混合物比例为8：100，同时取超纯水及0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的油水混合物作为对照，经过2min涡旋混合后，在超声清洗仪中最大功率条件下超声30min，将超声处理后的油水混合物在室温放置观察3小时及3天后分散稳定情况，对不同蛋白溶液形成的乳状液进行拍照，结果如图3所示。

通过乳化结果可知，观察3小时及3天后的油水界面，HFBI及mHFBI分散液仍处于稳定的混合均一状态，然而对照组水及BSA均出现明显的分层状态。说明突变后的mHFBI与野生型的HFBI保持同样的改变油水界面性质的能力，将疏水性界面包装后稳定分散在亲水环境中。

(13)分别称量碳纳米管及石墨烯0.33mg、1mg，蛋白溶液稀释为1ml，浓度为0.2mg/ml，将碳纳米管与石墨烯分别溶解于上述稀释的溶液中至1.5ml EP管中，并取水溶解的碳纳米管及石墨烯作为对照。冰浴超声6小时，并且每个20min上下颠倒，使之混匀。静置观察3小时及3天后分散稳定情况，结果如图4(碳纳米管)、图5(石墨烯)所示。

通过分散结果可知，观察3小时及3天后的分散体系，HFBI及mHFBI仍处于稳定的混合均一状态，并且溶液呈现稳定柔滑状态，然而对照组水已经在3小时出现明显的分层状态。说明突变后的mHFBI与野生型的HFBI保持同样的改变材料等疏水性物质界面性质的能力，将疏水性界面包装后稳定分散在亲水环境中。

序列表

<110> 天津大学

<120> 疏水蛋白mHFBI基因及表达的蛋白及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 228

<212> DNA

<213> 瑞氏木酶(Trichoderma reesei)

<400> 1

agcaacggca acggcaatgt ttgccctccc ggcctcttca gcaaccccca gtgctgtgcc 60

acccaagtcc ttggcctcat cggccttgac tgcaaagtcc cctcccagaa cgtttacgac 120

ggcaccgact tccgcaacgt ctgcgccaaa accggcgccc agcctctctg ctgcgtggcc 180

cccgttgccg gccaggctct tctgtgccag accgccgtcg gtgcttga 228

<210> 2

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcaacggca acggcaatgt ttctcctccc ggcctcttca gcaaccccca gtcttctgcc 60

acccaagtcc ttggcctcat cggccttgac tctaaagtcc cctcccagaa cgtttacgac 120

ggcaccgact tccgcaacgt ctctgccaaa accggcgccc agcctctctc ttctgtggcc 180

cccgttgccg gccaggctct tctgtctcag accgccgtcg gtgcttga 228

<210> 3

<211> 2359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 60

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 120

tgtaaaacga cggccagtcg aaccacgcaa tgcgtctcga tccgcagtgt cttgcgtctc 180

tcaacagtct accactggcc agctccagtc ttctgagtct acctccactg cgaacgaccc 240

ggccaccagc gagctcctcg gtctgatcgg cgtcgtcatc tctgatgtcg acgcactcgt 300

cggtctcacc tcttcgccga tctccgtcat cggcgttggc agtggctctg cgtctaccgc 360

gaacccagtg tcttctgact cgtcgcccat tggtggactc gtctccatcg gatctgttcc 420

ggttaacgtc tgaagagacg gagtcactgc caaccgagac ggtcatagct gtttcctgtg 480

tgccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 540

agctcactca aaggcggtaa tacggttacc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 600

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 660

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 720

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 780

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 840

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 900

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 960

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 1020

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 1080

taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 1140

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 1200

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 1260

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 1320

catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 1380

atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 1440

ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 1500

gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa taataccgcg 1560

ggacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 1620

gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 1680

agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca tcgctacagg 1740

catcgtggta tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 1800

aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgcg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 1860

gatcgttgtc agaagtaagt tggccgccgt gttatcactc atggttatgg cagcactaca 1920

taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 1980

caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 2040

ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 2100

ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 2160

tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 2220

aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 2280

actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 2340

catatttgaa tgtatttag 2359

<210> 4

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Asn Gly Asn Gly Asn Val Ser Pro Pro Gly Leu Phe Ser Asn Pro

1 5 10 15

Gln Ser Ser Ala Thr Gln Val Leu Gly Leu Ile Gly Leu Asp Ser Lys

20 25 30

Val Pro Ser Gln Asn Val Tyr Asp Gly Thr Asp Phe Arg Asn Val Ser

35 40 45

Ala Lys Thr Gly Ala Gln Pro Leu Ser Ser Val Ala Pro Val Ala Gly

50 55 60

Gln Ala Leu Leu Ser Gln Thr Ala Val Gly Ala

65 70 75

<210> 5

<211> 75

<212> PRT

<213> 瑞氏木酶(Trichoderma reesei)

<400> 5

Ser Asn Gly Asn Gly Asn Val Cys Pro Pro Gly Leu Phe Ser Asn Pro

1 5 10 15

Gln Cys Cys Ala Thr Gln Val Leu Gly Leu Ile Gly Leu Asp Cys Lys

20 25 30

Val Pro Ser Gln Asn Val Tyr Asp Gly Thr Asp Phe Arg Asn Val Cys

35 40 45

Ala Lys Thr Gly Ala Gln Pro Leu Cys Cys Val Ala Pro Val Ala Gly

50 55 60

Gln Ala Leu Leu Cys Gln Thr Ala Val Gly Ala

65 70 75

Claims (3)

1.疏水蛋白mHFBI基因，其特征是所述基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2表示。

2.疏水蛋白mHFBI基因表达的蛋白，其特征是所述蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.4表示。

3.权利要求2所述的疏水蛋白mHFBI基因表达的蛋白作为修饰疏水性物质的应用。

Images