KR20160108540A - 증가된 효소 활성을 갖는 신규한 시토크롬 p450 폴리펩티드 - Google Patents

증가된 효소 활성을 갖는 신규한 시토크롬 p450 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 분리된 P450 효소에 관한 것으로, 상기 서열은 위치 225에 해당하는 위치에 트레오닌 및/또는 위치 289에 해당하는 위치에 아스파르트산 돌연변이를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 효소를 인코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 핵산 또는 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 효소를 제조하기 위한 방법 및 본 발명의 특징을 이루는 효소 또는 숙주 세포를 이용하여 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 방법이 또한 제공된다.

Description

증가된 효소 활성을 갖는 신규한 시토크롬 P450 폴리펩티드{NOVEL CYTOCHROME P450 POLYPEPTIDE WITH INCREASED ENZYMATIC ACTIVITY}
본 발명은 증가된 효소 활성을 갖는 시토크롬 P450 모노옥시게나제에 관한 것이다.
포유류 미토콘드리아 P450은 작은 과의 시토크롬을 구성하며, 미토콘드리아 내에서 특정 반응을 수행하고, 다양한 소수성 화합물의 대사에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, P450c11베타 및 P450c11AS(CYP11B1 및 CYP11B2 유전자에 의해 인코딩됨)는 각각 글루코코르티코이드 및 광물코르티코이드 생합성의 최종 단계를 수행한다. P450c11베타는 11데옥시코르티솔을 하이드로코르티손으로 전환시키는 고전적인 스테로이드 11베타-하이드록실라제인 반면, P450c11AS는 3개의 연속적 단계에 의한 데옥시코르티코스테론의 알도스테론으로의 전환을 촉매한다. CYP27A1은 스테롤 27-하이드록실라제 및 비타민 D25 하이드록실라제인 내부 미토콘드리아 P450의 또 다른 예이다. 최종적으로, 가장 상징적인 미토콘드리아 P450은 CYP11A1 유전자에 의해 인코딩되는 P450scc(측쇄 분해 효소)이며, 이는 콜레스테롤 측쇄를 분해하고, 이에 따라 2개의 연속적인 하이드록실화 및 최종 분해에 의해 콜레스테롤을 프레그네놀론으로 전환시킨다. P450scc는 스테롤을 스테로이드로 전환시킴으로써 스테로이드 생합성의 첫번째 주요 단계를 수행한다.
광범위한 수의 기질의 위치특이적, 화학특이적 및 입체특이적 산화를 촉매 작용하는 P450 능력은 이들의 생물학적 역할을 반영하며, 이들을 생물공학적 적용을 위한 중요한 후보로 만든다. 특히, 스테로이드 호르몬은 항염증성, 피임 및 항증식 약물로 널리 사용된다. 포유동물에서, 이들 스테로이드의 합성은 콜레스테롤의 프레그네놀론으로의 측쇄 분해 반응으로 시작한다. 프레그네놀론은 추가의 스테로이드 호르몬, 예를 들어, 하이드로코르티손의 생성을 위한 기초로 제공되며, 큰 이익이 저렴한 기질, 예를 들어, 콜레스테롤 및 이의 식물-유래 유사체로부터의 프레그네놀론의 산업적 대규모 전환과 관련되어 있다. 그러나, 콜레스테롤의 프레그네놀론으로의 측쇄 분해 반응은 스테로이드 전체 과정에서 제한적인 단계이다. 포유동물에서, 이는 막-결합된 CYP11A1 효소에 의해 촉매 작용된다.
그러나, 다수의 이유로, P450의 생물공학적 및 산업적 이용은 실행하기에 어렵고, 만족스럽지 않다. 미토콘드리아 P450은 아드레노독신 환원효소(AdR) 및 아드레노독신(Adx)으로도 언급되는 2개의 단백질, 즉, 페레독신 환원효소(FdxR) 및 페레독신(Fdx1)으로 구성된 전자 전달체의 특정 사슬을 이용한다. 생체 내 천연 상황에서, FdxR은 NADPH로부터 전자를 얻으며, Fdx1은 FdxR로부터 미토콘드리아 P450으로 전자를 운반한다. FdxR이 촉매 농도(0.5 μM)로 존재하고, Fdx1이 포화 농도(10 μM)로 존재하는 시험관 내 시스템이 개발되었다. 이러한 시험관 내 시스템이 효과적이 되도록 하기 위해, 전자는 P450으로 적절히 유출되어야 한다.
이들 난점을 극복하기 위해, 일부 저자는 다양한 힌지 또는 링커 서열을 이용하여 3개의 펩티드 P450scc(또는 P450c11베타), Fdx1 및 FdxR을 융합시켰다. 이러한 삼중 융합은 기능성 단백질을 발생시키나, 이의 효능은 "진정한(bona fide)" 폴리펩티드에 비해 낮으며, 이는 산업적 규모로 사용될 수 없다. 또한, 미토콘드리아 환경은 미생물 재조합 시스템에서 모방하기가 어렵다. 예를 들어, P450scc 폴리펩티드는 효모 미토콘드리아로 적절히 표적화될 수 있다. 그러나, 표적화된 폴리펩티드는 미토콘드리아 내 기질의 부재 및/또는 P450scc의 부적절한 폴딩 또는 표적화로 인해 스테롤을 프레그네놀론으로 전환시킬 수 없다.
식물 스테롤로부터 생합성 프레그네놀론을 생성시키기 위해 다양한 재조합 시스템이 이용된다. 예를 들어, 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 생합성 시스템이 개발되었다. 이러한 시스템에서, P450scc는 FdxR 및 Fdx1과 함께 형질막에서 미토콘드리아 외부로 표적화되고, 스테롤 경로는 상기 막에서 스테롤을 생성시키도록 경로화된다. 또한, P450c11베타는 Fdx 및 FdxR1과 함께 미토콘드리아로 표적화될 수 있고, 여기서 이는 11-데옥시코르티솔을 코르티솔로 전환시킬 수 있다. 생물전환 시스템이 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 개발되었다. 이러한 시스템에서, 콜레스테롤은 P450scc, Fdx1 및 FdxR1의 성숙 형태에 의해 프레그네놀론으로 전환될 수 있다. 생합성은 산업적 규모에서 가장 매력적인 기술로 남아 있는데, 이는 기질이 숙주에 의해 간단한 탄소원으로부터 가용성 분자로서 제조되어 이에 따라 세제를 이용할 부담을 피하기 때문이다.
최근에, 개선된 특성을 갖는 새로운 P450scc 폴리펩티드를 생성시키려는 노력이 이루어져 왔다. 예를 들어, K193E 돌연변이를 갖는 재조합 P450scc 돌연변이가 생성되었다. 이러한 돌연변이는 더욱 가용성이고, 이에 따라 재조합 야생형 폴리펩티드보다 응집의 경향이 덜하다. 따라서, 효소적 특징을 변경시킴이 없이 상기 돌연변이로 더 높은 발현 수준이 획득된다. 그러나, 산업 공정에 특히 적합한 스테로이드 호르몬의 최적화된 생성을 가능케 하는 증가된 효소 활성을 갖는 개선된 P450scc 폴리펩티드가 여전히 필요하다.
본 발명자는 특정 돌연변이를 갖는 새로운 P450scc 폴리펩티드를 개발하였다. 이러한 돌연변이는 스테로이드 호르몬으로의 기질 전환과 관련하여 개선된 효소 활성을 예기치 않게 나타낸다.
따라서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 새로운 분리된 P450 효소에 관한 것으로, 상기 서열은 위치 225에 해당하는 위치에 트레오닌 및/또는 위치 289에 해당하는 위치에 아스파르트산 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 새로운 P450 효소는 SEQ ID NO:1과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다.
본 발명은 또한 상기 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 분리된 핵산, 발현 조절 서열과 작동 가능하게 회합된 상기 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 핵산 또는 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것으로, 상기 숙주 세포는, 예를 들어, 미생물이다.
한 구현예에서, 본 발명은 기질을 스테로이드 호르몬 전구체로 전환시킬 수 있는 유전학적으로 조작된 미생물을 제공한다. 기질은, 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 다환식 불포화 모노 알콜, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 또는 콜레스테롤 유도체일 수 있다. 유전학적으로 조작된 미생물은, 예를 들어, 본 발명의 특징을 이루는 새로운 P450 효소를 인코딩하는 핵산, 및 임의로 아드레노독신(Adx)을 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 아드레노독신 환원효소(AdR)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소를 제조하기 위한 시험관 내 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) P450 효소의 발현을 획득하기에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 b) 발현된 효소를 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소는 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위해 이용된다.
본 발명은 추가로 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소를 발현하는 미생물을 제공하는 단계, b) P450 효소의 발현을 가능케 하는 조건하에서 상기 미생물을 배양하는 단계, c) 미생물에 의한 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 콜레스테롤 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 기질로부터 스테로이드 호르몬 전구체의 생성을 가능케 하는 조건하에서 단계 b)에서 획득된 미생물 배양물과 상기 기질을 접촉시키는 단계, 및 d) 생성된 스테로이드 호르몬 전구체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 방법, 예를 들어, 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 기질의 스테로이드 호르몬 전구체로의 전환을 가능케 하는 조건하에서 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소와 분리된 아드레노독신(Adx) 폴리펩티드, 분리된 아드레노독신 환원효소(AdR) 폴리펩티드 및 상기 기질을 접촉시키는 단계, 및 b) 획득된 스테로이드 호르몬 전구체를 회수하는 단계를 포함한다.
스테로이드 호르몬은 항-염증성, 피임 및 항증식 약물로 널리 사용된다. 본 발명은 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키고, 인간에서 사용하기 위한 스테로이드 호르몬의 합성을 돕는데 유용하다. 스테로이드 호르몬 전구체, 예를 들어, 프레그넬로논은 추가의 스테로이드 호르몬, 예를 들어, 하이드로코르티손의 생성을 위한 기초로서 제공되며, 큰 이익이 프레그넬로논의 산업적 대규모 전환과 관련되어 있다.
발명의 설명
효소
"분리된" 효소 또는 폴리펩티드는 효소 또는 폴리펩티드가 본래 발현되는 유기체 내의 이의 천연 환경 내에 더이상 존재하지 않는 것으로 의도된다. 효소 또는 폴리펩티드를 언급하는 경우, "정제된"은 동일 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적 부재하에서 지정된 분자가 존재하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된"은 동일 유형의 생물학적 거대분자의 적어도 75 중량%, 적어도 85 중량%, 적어도 95 중량%, 또는 적어도 98 중량%가 존재하는 것을 의미한다.
용어 "시토크롬 P450 효소" 또는 "P450 효소"는 문헌[Van Bogaert et al, 2011, FEBS J. 278(2): 206-221] 또는 문헌[Urlacher and Girhard, 2011, Trends in Biotechnology 30(1): 26-36], 또는 웹사이트 dmelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html에 개관된 것과 같은 특정 반응을 촉매 작용할 수 있는 모노옥시게나제를 나타낸다. 상기 야생형 P450 효소의 예로서, 서열 SEQ ID NO:4는 보스 타우루스(Bos taurus) CYP11A1의 성숙 형태를 나타낸다. 통과 펩티드를 포함하는 보스 타우루스 CYP11A1의 완전 서열은 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스(마지막 서열 업데이트: 1986년 7월 21일)에서 P00189로 참조된다.
본 발명의 특징을 이루는 시토크롬 P450 효소는 이들의 각각의 본래의 숙주에서 막-결합(불용성) 효소 또는 세포질(가용성) 효소일 수 있다. 예를 들어, P450scc(SEQ ID NO:4)는, 비제한적인 예로서, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 이의 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜의 프레그네놀론 또는 다른 스테로이드 호르몬 전구체 및 유도체로의 측쇄 분해 반응을 촉매한다.
본 발명자는 개선된 효소 활성을 갖는 서열 SEQ ID NO:1의 새로운 P450 효소를 개발하였다. SEQ ID NO:4(위치 225에 R 및 위치 289에 N을 갖는 야생형 scc 효소)와 비교하여, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1은 서열 SEQ ID NO:4의 위치 225에 해당하는 위치에서 아르기닌으로부터 트레오닌으로의 돌연변이 및 서열 SEQ ID NO:4의 위치 289에 해당하는 위치에서 아스파라긴으로부터 아스파르트산으로의 돌연변이의 2개의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 특징을 이루는 새로운 P450 효소는 콜레스테롤로부터 프레그네놀론으로의 전환을 촉매 작용하는 모노옥시게나제 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 새로운 P450 효소는 서열 SEQ ID NO:4의 P450 효소의 모노옥시게나제 활성의 적어도 80% 이상, 상세하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 더욱 상세하게는 적어도 300% 이상을 나타낸다.
본 발명의 특징을 이루는 분리된 P450 효소는 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 상기 서열은 위치 225에 해당하는 위치에 트레오닌 및/또는 위치 289에 해당하는 위치에 아스파르트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 새로운 P450 효소는 SEQ ID NO:1과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다.
아미노산 서열에서의 변화는 효소의 아미노산 서열에서의 변화를 발생시키는 효소를 인코딩하는 핵산 서열로의 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 도입될 수 있다. 아미노산 치환은 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 일부 구현예에서, 치환은 한 아미노산이 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체되는 보존성 치환이다.
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미노-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 보존성 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다.
예를 들어, SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열은 특정 아미노산 잔기에서 적어도 하나의 치환을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열은 서열 SEQ ID NO:1과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 아미노산 서열 동일성은 서열을 정렬시키고, 필요시 서열 동일성의 최대 백분율을 달성하기 위해 갭을 도입시키고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환을 고려하지 않은 후에 참조 서열 SEQ ID NO:1 내의 아미노산 잔기와 동일한 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 서열 동일성은 적어도 80% 동일한 서열의 전장, 참조 서열의 전장, 또는 둘 모두에 걸쳐 결정될 수 있다. 아미노산 서열에 대한 동일성의 백분율은, 예를 들어, 니들(Needle), 및 10의 갭 개시 페널티 및 0.5의 갭 확장 페널티를 갖는 BLOSUM62 행렬을 이용하여 2개의 서열의 전장을 따라 2개 서열의 최적 정렬(갭을 포함함)를 찾기 위해 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 정렬 알고리즘에 기초한 쌍을 이룬 전역 정렬을 수행함으로써 계산될 수 있다.
SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 P450 효소에서, SEQ ID NO:1에 비한 아미노산 변형은 통상적으로 이들이 효소의 생물학적 활성을 유의하게 훼손시키지 않는 위치에 위치된다. 확실히, SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 동일성이 존재하는 시토크롬 P450 아미노산 서열은 서열 SEQ ID NO:1의 폴리펩티드와 적어도 동일한 생물학적 활성을 나타낸다.
"동일한 생물학적 활성"은 동일한 생물학적 기능을 나타낼 수 있다. 따라서, 서열 SEQ ID NO:1의 폴리펩티드와 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드는, 예를 들어, 모노옥시게나제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 효소의 모노옥시게나제 활성을 결정하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 SEQ ID NO:1의 폴리펩티드와 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드는, 비제한적인 예로서, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜의 프레그네놀론 또는 다른 스테로이드 호르몬 전구체 및 유도체로의 측쇄 분해 반응을 촉매 작용할 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 경우에, 화합물의 촉매작용 활성은 당업자에 의해, 예를 들어, 실시예 1에 기재된 프로토콜에 의해 시험관 내(문헌[Woods, S. T., J. Sadleir, et al. (1998) "Expression of catalytically active human cytochrome p450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462."; Arch Biochem Biophys 353(1): 109-15]에 제시된 바와 같음) 또는 생체 내(문헌[Duport, C., R. Spagnoli, et al. (1998) "Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast."; Nat Biotechnol 16(2): 186-9]에 제시된 바와 같음)에서 용이하게 평가될 수 있다.
통상적으로, 촉매작용 활성은 0.05% Tween-20 및 1 mM MgCl2를 함유하는 pH 7.4로 조정된 150 mM의 HEPES 완충액이 반응 완충액으로 적용될 수 있는 시험관 내 전환 검정에서 시험될 수 있다. 기질로서 5 mM 글루코스-6-포스페이트와 함께 1 유닛의 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제가 NADPH-재생 시스템으로 제공될 수 있다. 통상적으로, CYP11A1, Adx 및 AdR의 농도는 각각 1 μM, 20 μM 및 0.5 μM, 또는 0.25 μM, 5 μM 및 0.125 μM일 수 있다. 45% 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린에 용해된 20 μM의 콜레스테롤이 CYP11A1에 대한 기질로 제공될 수 있다. 통상적으로, 샘플은 37℃로 예비-가온되고, NADPH의 100 μM의 최종 농도로의 첨가에 의해 반응이 시작되었다. 혼합물은 30초 동안 진탕과 함께 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 반응은 30초 동안 물 중에서 샘플을 비등시킴으로써 정지될 수 있다. 240 nm에서의 광도계 검출을 가능케 하기 위해, 스테로이드는 노카르디아 종(Nocardia spec)으로부터의 콜레스테롤 옥시다제를 이용하여 이들의 3-케토-Δ4 유도체로 전환될 수 있다. 통상적으로, 20 ㎕의 콜레스테롤 옥시다제 용액(0.05% Tween-20을 함유하는 5 ㎖의 50 mM HEPES 완충액 pH 7에 용해된 5 ㎎ 콜레스테롤 옥시다제 및 5 ㎎ Na-콜레이트)이 샘플에 첨가된다. 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션 후, 내부 표준으로서 11-데옥시코르티코스테론(DOC)이 반응 혼합물에 첨가될 수 있고, 이후 동일 부피의 에틸아세테이트로 2회 추출된다. 증발 후, 추출물은 아세토니트릴/물에 용해될 수 있다.
촉매작용 활성은 또한 300 μM 콜레스테롤의 프로게스테론으로의 전환이 통상적으로 24시간 후에 HPLC에 의해 평가되는 생체 내 전환 검정으로 시험될 수 있다. 바실러스 메가테리움은 180 rpm 진탕과 함께 37℃에서 10 ㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 TB-배지에서 배양될 수 있다. 단백질 발현은 1 ㎖ 물에 용해된 0.25 g의 자일로스를 첨가한 후, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린에 용해된 기질의 이후의 첨가에 의해 유도될 수 있다.
서열 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열의 정렬이 수행될 수 있다. 이들 2개의 서열은 높은 백분율의 동일성을 가지므로, 이들의 아미노산 대부분은 동일하다. 따라서, 아미노산 넘버링은 둘 모두의 서열 내의 동일한 번호를 갖는 위치에 존재하는 아미노산의 적어도 80%가 동일(필요시, 서열 동일성의 최대 백분율을 달성하기 위해 갭을 도입시킴에 의함)하도록 하는 방식으로 둘 모두의 서열에 대해 규정될 수 있다. 이러한 상황에서, 서열 SEQ ID NO:1의 "위치 X에 해당하는 위치"는 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 서열 내의 상기 번호 X를 갖는 위치를 나타낸다. 따라서, 서열 SEQ ID NO:1은 둘 모두의 정렬된 서열 내의 "해당 위치"에 존재하는 아미노산의 적어도 80%가 동일하도록 하는 방식의 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열과의 정렬에서 아미노산 위치의 넘버링을 위한 "참조 서열"로 취해질 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 특징을 이루는 분리된 P450 효소는 SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 상기 서열은 위치 225에 해당하는 위치에 트레오닌 및 위치 289에 해당하는 위치에 아스파르트산을 모두 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소는 서열 SEQ ID NO:1로 구성된다.
본 발명의 특징을 이루는 효소는 효소의 정제를 촉진할 수 있는 하나 이상의 태그(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 태그는 폴리-히스티딘(폴리-His) 태그일 수 있다.
효소를 생성시키는 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 방법
한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 구성되는 분리된 핵산을 특징으로 한다.
폴리뉴클레오티드로도 언급되는 본 발명의 특징을 이루는 분리된 핵산은 유전 부호의 축퇴성(degeneracy)을 고려한 섹션 "효소"에 정의된 P450 효소를 인코딩하는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 분리된 핵산은 당업자에게 널리 공지된 표준 기술, 예를 들어, 시험관 내 DNA 증폭 또는 중합, 시험관 내 유전자 합성, 올리고뉴클레오티드 라이게이션, 또는 이들 기술의 조합에 의해 획득될 수 있다.
본 발명의 특징을 이루는 핵산은 유리하게는 분리된 형태 또는 정제된 형태로 존재한다. 용어 "정제된" 및 "분리된"은 상기 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 일부 예에서 천연 뉴클레오티드 분자 내에서 비-천연 발생하는 코돈을 갖는 폴리펩티드-인코딩 뉴클레오티드 분자를 생성시키는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 재조합 폴리펩티드 발현의 비율을 증가시키기 위해 특정 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에 의해 선호되는 코돈이 선택될 수 있다.
본 발명의 특징을 이루는 핵산은 또한 분자의 발현 또는 안정성을 증가시키는 태그, 담체 단백질, 신호 펩티드를 인코딩하는 서열, 또는 전사되지 않는 서열 또는 번역된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 특징을 이루는 핵산은 적합한 발현 시스템에서 재조합 P450 효소를 생성시키기 위해 이용될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은, 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포로 도입된 외래 핵산에 의해 인코딩되는 단백질의 발현에 적합한 조건 하의 숙주 세포 및 양립되는 벡터를 의미한다.
통상적으로, 핵산은 임의의 적합한 벡터 내에 포함될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 발현 조절 요소와 작동 가능하게 회합된 상기 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 핵산 또는 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 특징으로 한다.
용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질전환시키고, 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진하기 위해 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포로 도입될 수 있도록 하는 비히클을 의미한다.
임의의 발현 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 플라스미드의 예는 복제 기점을 포함하는 복제 플라스미드, 또는 통합 플라스미드, 예를 들어, pUC, pcDNA, pBR 등을 포함한다.
벡터의 다른 예는 동물 세포에 대한 벡터, 예를 들어, pAGE107(Miyaji H et al. 1990), pAGE103(Mizukami T et al. 1987), pHSG274(Brady G et al. 1984), pKCR(O'Hare K et al. 1981), pSG1 베타 d2-4-(Miyaji H et al. 1990) 등을 포함한다.
바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 재조합 바이러스는 당 분야에 공지된 기술, 예를 들어, 패키징 세포 트랜스펙션 또는 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스를 이용한 일시적 트랜스펙션에 의해 생성될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 통상적인 예는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등을 포함한다. 상기 복제-결손 재조합 바이러스를 생성시키기 위한 상세한 프로토콜은, 예를 들어, WO 95/14785호, WO 96/22378호, US 5,882,877호, US 6,013,516호, US 4,861,719호, US 5,278,056호 및 WO 94/19478호에서 발견될 수 있다.
발현 벡터는 기능성 발현 카세트, 예를 들어, 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 특징을 이루는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다.
"발현 조절 서열(들)"은 폴리펩티드의 발현, 및 임의로 폴리펩티드 발현의 조절에 필요한 요소(들)를 나타낸다. 발현 조절 서열(들)은, 예를 들어, 프로모터 서열, 번역의 개시 및 종료를 위한 신호, 뿐만 아니라 번역의 조절을 위한 적절한 영역, 예를 들어, 상기 폴리펩티드의 발현을 야기시키거나 유도하기 위한 프로모터, 인핸서, 종료자 등을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 특징을 이루는 벡터는 또한 마커 유전자, 예를 들어, 형질전환된 유기체와 트랜스펙션된 외래 DNA를 함유하지 않는 유기체 사이를 선택하는 것을 가능케 하는 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자일 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 특징을 이루는 벡터는 아드레노독신(Adx)을 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 아드레노독신 환원효소(AdR)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. Adx 및 AdR은 P450 효소의 산화-환원 파트너이다.
"AdR"은 미토콘드리아 시토크롬 P450 전자 전달체 시스템의 첫번째 구성요소로 공지되어 있으며, 모든 스테로이드 호르몬의 생합성과 연관된 효소인 아드레노독신 환원효소(EC: 1.18.1.6) 또는 아드레노독신-NADP+ 환원효소를 나타낸다.
특정 구현예에서, 상기 AdR 효소는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 또는 사카로마이세스 세레비시애로부터의 AR(arh1 유전자에 의해 인코딩되는 NADPH:아드레노독신 산화환원효소(EC=1.18.1.6)) 및 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)로부터의 FNR(fpr 유전자에 의해 인코딩되는 페레독신-NADP 환원효소(EC=1.18.1.2))로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, AdR 효소는 보스 타우루스로부터의 AdR(UniProtKB/Swiss-Prot에서 P08165로 참조됨, 마지막 서열 업데이트: 1998년 7월 15일)이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 AdR의 단백질 서열은 SEQ ID NO:7이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 AdR의 단백질 서열은 SEQ ID NO:7의 변이체이나, 단, 이는 이의 생물학적 활성을 보유해야 한다.
"Adx"는 아드레노독신 환원효소로부터 CYP11A1으로 전자를 전달하는 활성에 대해 공지된 단백질인 아드레노독신 또는 페레독신 1을 의미한다.
특정 구현예에서, 상기 Adx 단백질은 포유동물 기원으로부터의 Fdx, 스키조사카로마이세스 폼베로부터의 Etp1fd 및 사카로마이세스 세레비시애로부터의 Yah1으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, Adx 단백질은 보스 타우루스로부터의 Adx(UniProtKB/Swiss-Prot에서 P00257로 참조됨, 마지막 서열 업데이트: 1989년 7월 1일)이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 Adx의 단백질 서열은 SEQ ID NO:8이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 Adx의 단백질 서열은 SEQ ID NO:8의 변이체이나, 단, 이는 이의 생물학적 활성을 보유해야 한다.
본 발명의 특징을 이루는 벡터 또는 핵산은 당업자에게 일반적으로 공지된 기술에 따라 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 이용될 수 있다. 상기 벡터의 숙주 세포로의 삽입은 일시적 또는 안정적 삽입일 수 있다.
벡터는 또한 번역된 단백질의 분비 또는 세포 구획 또는 소기관으로의 이의 표적화를 촉발시키는 특정 신호를 인코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 이들 다양한 조절 신호는 숙주 세포에 따라 선택되며, 숙주 세포 내에서 자가-복제하는 벡터, 또는 상기 숙주의 유전체로 통합되는 벡터로 삽입될 수 있다.
숙주 세포는 상업적으로 이용 가능한 세포주를 포함하는 박테리아, 효모, 식물 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 숙주 세포는 에스케리키아 콜리, 락토바실리(Lactobacilli), 바실러스, 상세하게는 바실러스 메가테리움, 프로바이오틱(probiotic) 박테리아, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비시애, 곤충 세포, 식물 세포, COS 세포 및 CHO 세포이다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포, 상세하게는 박테리아 세포이다. 또 다른 특정 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애의 세포이다.
일반적인 발현 시스템은 박테리아 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 배큘로바이러스 벡터, 및 포유류 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 특정 예로는 E. 콜리(E. coli), B. 메가테리움(B. megaterium), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스 효모, 포유류 세포주(예를 들어, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등) 뿐만 아니라 일차 또는 확립된 포유류 세포 배양물(예를 들어, 림프모세포, 섬유모세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방세포 등으로부터 생성됨)을 포함한다. 예로는 또한 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자("DHFR 유전자"로도 언급됨)가 결손된 CHO 세포(Urlaub G et al; 1980), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL1662, "YB2/0 세포"로도 언급됨) 등을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 핵산 및/또는 벡터에 의해 트랜스펙션되거나, 감염되거나, 형질전환된 세포를 특징으로 한다. 결과로서, 본 발명은 추가로 본원에 기재된 핵산 및/또는 벡터를 함유하는 숙주 세포, 뿐만 아니라 상기 숙주 세포의 프로제니 및/또는 유도체에 관한 것이다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 유전학적으로 조작된 미생물이다.
본원에서 사용되는 "미생물"은 에스케리키아 콜리, 바실러스 리키니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 세레비시애 또는 스키조사카로마이세스 폼베일 수 있다.
문헌[Woods, S. T., J. Sadleir, et al. (1998) (Expression of catalytically active human cytochrome p450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462. Arch Biochem Biophys 353(1): 109-15)]에 제시된 바와 같이, 인간 P450scc의 성숙 형태가 인간 효소의 더욱 편리한 공급원을 제공하고, 부위-특이적 돌연변이유발을 이용하여 구조-기능연구가 수행되는 것을 가능케 하기 위해 에스케리키아 콜리에서 발현되었다. 이러한 발현 시스템은 태반 미토콘드리아로부터 이전에 분리된 것보다 더 많은 양의 활성 시토크롬을 생성시키는 것을 가능케 하였다. 발현된 P450scc는 거의 균질하게 정제되었고, 인간 태반으로부터 정제된 효소와 동등한 촉매 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 인간 아드레노독신의 성숙 형태가 또한 E. 콜리에서 발현되었고, 소 아드레노독신을 이용하여 관찰된 것과 동일한 Vmax를 갖지만, 더 높은 Km을 갖는 콜레스테롤 측쇄 분해 활성이 뒷받침되었다. 인간 P450scc에서의 Ile-462의 Leu로의 돌연변이는 기질로서 콜레스테롤을 이용하여 촉매 속도 상수(kcat)에서의 감소를 야기시켰고, 22R-하이드록시콜레스테롤에 대한 Km을 증가시켰으나, 20 알파-하이드록시콜레스테롤에 대한 반응속도 상수에는 영향을 미치지 않았다.
문헌[Duport, C., R. Spagnoli, et al. (1998) (Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast. Nat Biotechnol 16(2): 186-9)]에 제시된 바와 같이, 스테로이드 생산 경로의 처음 2개의 단계가 사카로마이세스 세레비시애에서 재현되었다. 델타 22-디새츄라제(22-desaturase) 유전자의 파괴 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 델타 7-환원효소 활성의 도입 및 소 측쇄 분해 시토크롬 P450, 아드레노독신, 및 아드레노독신 환원효소의 공동발현에 의한 스테롤 생합성의 공학 처리는 간단한 탄소원으로부터 프레그네놀론 생합성을 발생시켰다. 인간 3 베타-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제/이소머라제의 추가 공동발현 후, 프레그네놀론은 프로게스테론으로 추가로 대사되었다. 스테로이드 형성은 효모 스테롤 생합성과 커플링된 것으로 보였다.
문헌[Szczebara, F. M., C. Chandelier, et al. (2003) (Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast; Nat Biotechnol 21(2): 143-9)]에서, 포유동물의 주요 부신 글루코코르티코이드이자 스테로이드성 약물 합성의 중요한 중간체인 하이드로코르티손의 생성이 재조합 사카로마이세스 세레비시애 균주에 의해 간단한 탄소원으로부터 보고되었다. 13개의 공학 처리된 유전자를 수반하는 인공 및 완전한 자급 자족 생합성 경로가 단일 효모 균주에서 어셈블리되고 발현되었다. 내인성 스테롤 생합성이 경로의 이종 부분에 대한 기질로서 제공하기 위한 양립되는 스테롤을 생성시키도록 재경로화되었다. 생합성은 8개의 포유류 단백질(CYP11A1의 성숙 형태, 아드레노독신(ADX), 및 아드레노독신 환원효소(ADR); ADX 및 CYP11B1의 미토콘드리아 형태; 3베타-HSD, CYP17A1, 및 CYP21A1)을 수반하였다. 최적화는 2개의 미토콘드리아 시스템을 조절하고, ATF2, GCY1, 및 YPR1 유전자 생성물과 관련된 원치 않는 부작용을 붕괴시키는 것을 수반하였다. 하이드로코르티손이 생성된 주요 스테로이드였다. 상기 작업은 더 고등한 진핵생물로부터 미생물로 복잡한 생합성 경로를 이동시키는 것의 실행 가능성을 입증하였다.
특정 구현예에서, 미생물은 상세하게는 바실러스 메가테리움 MS941로 언급되는 균주인 바실러스 메가테리움이다. 표현 "바실러스 메가테리움 MS941 균주"는 문헌[Wittchen and Meinhardt, 1995, Appl Microbiol Biotechnol. 42: 871-877]에 참조된 균주를 나타내며, 이는 DSM319 균주(Deutsche Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)로부터 유래되었다.
E. 콜리를 이용한 이전에 기재된 시스템 및 B. 메가테리움을 이용한 시스템은 E. 콜리를 이용하여 시험관 내에서 또는 B. 메가테리움을 이용하여 세포 내에서 스테롤 및 스테롤 유도체 전환을 실현시킬 수 있는 두 시스템이다. 이들 기술은 함께 작용하는 P450scc 및 기질의 능력을 평가할 수 있다. 둘 모두의 기술은 이들이 효소에 접근 가능하도록 하기 위해 기질을 가용화시킬 효과적인 방법을 필요로 한다. 이러한 가용화는 재정적 및 과학적 조건 둘 모두에서 산업적 수준(큰 부피)에서 난제일 수 있다.
세번째 유기체 S. 세레비시아는 하기와 관련하여 특히 유리한 유기체이다; 이의 대규모 발효는 입방 미터 또는 이보다 높은 수준에서 잘 숙달되어 있고, 이는 간단한 탄소원, 예를 들어, 글루코스 및/또는 에탄올로부터 스테로이드, 예를 들어, 프레그네놀론을 생성시키는 효능 있는 능력을 가져, 이에 따라 세제 또는 가용화 화학물질, 예를 들어, 베타-사이클로덱스트린을 피한다(상기 참조된 바와 같음: 문헌[Duport, C., R. Spagnoli, et al. (1998); Szczebara, F. M., C. Chandelier, et al. (2003)]). 생체 내 스테로이드 합성을 가능케 하기 위해, P450scc 양립성 스테롤을 생성시키도록 스테롤 생합성이 경로화되었다.
S. 세레비시아 발효는 대규모에서 잘 숙달되어 있음에 따라, 적절한 전자 운반체의 존재하에서 기질로서 기재된 캄페스테롤, 또는 다른 스테롤에 대해 경로화된 적합한 S. 세레비시아로의 새로이 기재된 P450scc cDNA의 도입은 스테로이드의 생성에 대해 가치가 있다. 본원에 기재된 바와 같은 새로운 P450scc cDNA를 평가하기 위해 상기 재조합 유기체가 이용될 수 있다.
따라서, 또 다른 특정 구현예에서, 미생물은 사카로마이세스 세레비시애이다.
용어 "유전학적으로 조작된" 미생물은 당업자에 의해 당 분야에 공지된 유전공학 기술에 의해 변형된 임의의 미생물을 나타낸다. 특정 미생물과 관련된 방법에 대해, 당업자는 참조 매뉴얼, 예를 들어, 효모에 대해 문헌["Methods in yeast genetics" ― A laboratory course manual by M Rose, F Winston and P Hieter. pp 198. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1990. ISBN 0-87969-354-1]을 참조할 수 있다.
이들 기술은 달리 표시하지 않는 한 당 분야의 기술 범위 내인 생물정보학, 세포생물학, 세포 배양, 분자생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학 분야의 통상적인 기술이다. 상기 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
본원에서 사용되는 "유전공학 기술"은 당업자에 의한 당 분야에 공지된 유전자 발현의 발현 또는 과발현을 가능케 하는 기술을 나타낸다. 관심 유전자의 발현 또는 과발현은 당업자에 의해 공지된 임의의 형질전환 기술에 의해 상기 관심 유전자를 포함하는 외인성 핵산 서열을 세포 또는 미생물로 도입시킴으로써 달성될 수 있다.
용어 "형질전환" 또는 "트랜스펙션"은 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 요망되는 물질, 통상적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 효소를 생성시키도록 하는 숙주 세포로의 "외래"(즉, 이종성) 유전자, DNA 또는 RNA 서열의 도입을 의미한다. 숙주 세포의 트랜스펙션은 임의의 표준 기술, 예를 들어, 화학적 형질전환, 전기천공, 포스페이트 칼슘 침전 또는 리포펙션을 이용하여 수행될 수 있다. 형질전환 기술은 또한, 예를 들어, PEG-매개 원형질체 형질전환 기술을 포함한다(Barg et al, 2005, Microbial Processes and Products 165-184).
"외인성 핵산 서열(들)"은 고려된 미생물에서 본래 발현되지 않고/않거나 천연적으로 발현되지 않거나, 미생물의 천연 균주에서의 방식이 아니고(예를 들어, 발현 수준 관련), 상기 언급된 바와 같은 유전학적으로 조작된 미생물을 획득하기 위해 상기 미생물을 형질전환시키는데 사용된 핵산 서열(들)을 나타낸다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 고려된 미생물이 아닌 또 다른 종(예를 들어, 미생물 또는 유기체의 또 다른 종)으로부터 유래된다. 또 다른 특정 구현예에서, 외인성 서열은 동일 미생물로부터 유래된다.
상기 외인성 핵산 서열(들)은 관심 단백질, 예를 들어, 시토크롬 P450 및 산화-환원 파트너 AdR 및 Adx를 인코딩할 수 있으며, 표현 "외인성 DNA"는 각각의 개별적 서열을 나타낼 수 있거나, 각각의 개별적 서열을 포함하는 전체 서열을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 외인성 핵산 서열은 당 분야에 공지된 기술, 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 상기 미생물의 유전체로 통합된다.
한 양태에서, 본 발명은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 기질을 스테로이드 호르몬 전구체로 전환시킬 수 있는 유전학적으로 조작된 미생물을 제공하며, 상기 미생물은 본 발명의 특징을 이루는 핵산, 및 임의로 Adx를 인코딩하는 외인성 핵산 서열 및/또는 AdR을 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 유전학적으로 조작된 미생물은 사카로마이세스 세레비시애이다.
또 다른 특정 구현예에서, 유전학적으로 조작된 미생물은 바실러스 메가테리움, 상세하게는 바실러스 메가테리움 MS941 균주이다.
본 발명은 또한 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소를 제조하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) P450 효소의 발현을 획득하기에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 b) 발현된 효소를 회수하는 단계를 포함한다.
"P450 효소의 발현을 획득하기에 적합한 조건"은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 통상적으로, 숙주 세포의 배양에 LB-(25 g/ℓ), TB-(24 g/ℓ 효모 추출물, 12 g/ℓ 트립톤, 0.4% 글리세롤, 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액) 또는 EnPresso™ Tablet 배지가 이용된다. 10 ㎍/㎖ 테트라사이클린을 함유하는 50 ㎖ 배지에 플레이트 또는 글리세롤 스톡으로부터의 세포를 접종시킴으로써 예비-배양이 수행될 수 있다. 이후, 주요 배양은 10 ㎍/㎖ 테트라사이클린을 함유하는 50 ㎖ 배지에 예비-배양물의 500 ㎕ 샘플을 접종시킴으로써 수행될 수 있다. 주요 배양물은 통상적으로 약 0.4의 광학 밀도에 도달할 때까지 성장된다. 단백질 발현은 1 ㎖ 증류수에 용해된 0.25 g 자일로스 첨가 후에 유도될 수 있다.
이후, P450 효소는 정제를 위한 널리 공지된 절차에 의해 정제될 수 있고; 이는 HPLC 크로마토그래피, 특정 항체를 이용한 면역친화성 기술 등과 같은 방법에 의해 용해질 또는 세포 추출물, 봉입체 또는 배양 상층액으로부터 정제될 수 있다.
대안적으로, P450 효소는 세포 용해질 또는 재구성 시스템(예를 들어, Rapid Translation System®, Roche Diagnostics 또는 Retic Lysate IVT™, Ambion)에서 상기 효소의 발현에 필요한 요소를 함유하는 DNA 또는 RNA 매트릭스로부터 세포 비함유 전사 및 번역 시스템을 이용하여 시험관 내에서 발현될 수 있다.
스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키는 방법
실시예 2 내지 4에 제시된 바와 같이, 본 발명자는 스테로이드 호르몬 전구체로의 기질 전환과 관련하여 개선된 효소 활성을 나타내는 특정 돌연변이를 갖는 새로운 P450scc 효소를 개발하였다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하기 기재되는 바와 같은 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 방법을 추가로 제공한다.
스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 첫번째 방법은 a) 상기 기재된 바와 같은 미생물을 제공하는 단계, b) 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소의 발현을 가능케 하는 조건하에서 상기 미생물을 배양하는 단계, c) 미생물에 의한 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 콜레스테롤 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 기질로부터 스테로이드 호르몬 전구체의 생성을 가능케 하는 조건하에서 단계 b)에서 획득된 미생물 배양물과 상기 기질을 접촉시키는 단계, 및 d) 생성된 스테로이드 호르몬 전구체를 회수하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 단계 b) 및 c)는 동시에 수행된다. 이러한 경우에서, 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 방법은 a) 상기 기재된 바와 같은 미생물을 제공하는 단계, b) 미생물에 의한 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 콜레스테롤 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 기질로부터 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소의 발현 및 스테로이드 호르몬 전구체의 생성을 가능케 하는 조건하에서 상기 기질의 존재하에서 상기 미생물을 배양하는 단계, 및 c) 생성된 스테로이드 호르몬 전구체를 회수하는 단계를 포함한다.
스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 두번째 방법은 a) 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 콜레스테롤 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 기질의 스테로이드 호르몬 전구체로의 전환을 가능케 하는 조건하에서 본 발명의 특징을 이루는 P450 효소와 분리된 Adx 폴리펩티드, 분리된 AdR 폴리펩티드 및 상기 기질을 접촉시키는 단계, 및 b) 획득된 스테로이드 호르몬 전구체를 회수하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "기질"은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜, 예를 들어, 사이클로아르테놀 및 라노스테롤로부터 유래된 파이토스테롤을 포함한다. 이들 기질 중에서, "콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 이의 유도체"는 콜레스테롤, 브라씨카스테롤(brassicasterol), 캄페스테롤(campesterol), 에르고스타디에놀(ergostadienol), 예를 들어, 에르고스타 5, 22 디에놀, 에르고스타 5, 24 (28) 디에놀, 에르고스타 5, 24(28) 디엔 3베타 올, 에르고스타 5, 24 (25) 디에놀, 에르고스타트리에놀, 예를 들어, 에르고스타 5, 22, 24 (25) 트리에놀, 에르고스타 5, 22, 24 (28) 트리에놀, 에르고스타 5, 7, 22 트리에놀, 에르고스타테트레놀, 예를 들어, 에르고스타 5, 7, 22, 24 (25) 또는 에르고스타 5, 7, 22, 24 (28), 데스모스테롤(desmosterol), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 제네롤(generol), 옥시스테롤(oxysterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 비타민 D, 7-데하이드로콜레스테롤 및 에르고스테롤의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 기질의 목록을 나타낸다. 제네롤 100(generol 100) 및 ADM90(다양한 비의 브라씨카스테롤 + 캄페스테롤 + 스티그마스테롤 + 베타-시토스테롤을 포함함)과 같은 산업 공정에서 현재 사용되는 스테롤 혼합물이 또한 기질의 정의에 포함된다.
특정 구현예에서, 기질은 콜레스테롤, 캄페스테롤, 데스모스테롤 및 에르고스타 5, 24(28) 디엔 3베타 올로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 기질은 에르고스테롤이다.
특정 구현예에서, "스테로이드 호르몬 전구체"는 프레그네놀론, 7-데하이드로프레그네놀론, 하이드록시에르고스테롤, 및 하이드록시스티그마스테롤로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 스테로이드 호르몬 전구체는 하이드록실화 콜레스테롤 유사체 및 세코스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤 유사체 7-데하이드로콜레스테롤 및 에르고스테롤의 유도체로서의 비타민 D2 및 D3)의 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 스테로이드 호르몬 전구체는 프레그네놀론이다.
"기질의 존재하에서의 미생물 배양"은 상기 미생물과 상기 정의된 바와 같은 기질을 물리적으로 상호작용시키는 것을 의미한다. 상기 상호작용은 배양 배지 내에서 달성되거나 그렇지 않을 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 배양 배지는 본 발명에 따른 미생물의 투과화 및/또는 본 발명에 따른 기질의 가용화를 위한 작용제를 함유한다. 이들 작용제에서의 기질의 용해는 미생물 배양물로의 첨가 전에 이루어질 수 있다.
"P450 효소와 기질의 접촉"은 상기 P450 효소와 상기 정의된 바와 같은 기질을 물리적으로 상호작용시키는 것을 의미한다. 상기 상호작용은 배지 내에서 달성되거나 그렇지 않을 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 배지는 본 발명에 따른 기질의 가용화를 위한 작용제를 함유한다. 이들 작용제에서의 기질의 용해는 상기 배지로의 첨가 전에 이루어질 수 있다.
기질의 용해에 사용되는 작용제는 에탄올, Tween-80, 터지톨(tergitol), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 사포닌(예를 들어, 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria)의 솝 바크(soap bark) 나무의 미정제 추출물 내에 함유되어 있는 퀼라자 사포닌(Quillaja saponin)), 사이클로덱스트린 및 이의 유도체(예를 들어, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 이들 작용제의 혼합물, 예를 들어, 비제한적인 예로서, 에탄올 및 Tween-80의 혼합물, 터지톨 및 에탄올의 혼합물, 사포닌(예를 들어, 퀼라자 사포닌) 및 사이클로덱스트린의 혼합물이 이용될 수 있다. 사이클로덱스트린 유도체, 예를 들어, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린이 이용될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 기질은 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 공동 결정화된다.
또 다른 구현예에서, 기질은 먼저 미생물 배지로의 첨가 전에 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린에 용해되며, 상기 배지는 퀼라자 사포닌을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 기질은 10 내지 60%, 예를 들어, 20 내지 50%, 예를 들어, 40 내지 50% 범위의 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린의 백분율, 및 1 내지 10%, 예를 들어, 2 내지 8%, 예를 들어, 3 내지 6% 범위의 퀼라자 사포닌의 백분율을 포함하는 용액에 용해된다. 또 다른 구현예에서, 기질은 45%의 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 및 4%의 퀼라자 사포닌을 포함하는 용액에 용해된다.
또 다른 구현예에서, 미생물 배지 내 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린의 최종 농도는 실시예 2에 예시된 바와 같이 1 내지 4%, 예를 들어, 2 내지 3%, 예를 들어, 2.25%이다. 또 다른 구현예에서, 미생물 배지 내 퀼라자 사포닌의 최종 농도는 0.05 내지 0.25%, 예를 들어, 0.075 내지 0.225%, 예를 들어, 0.1 내지 0.2%이다.
"상기 외인성 핵산 서열의 발현을 가능케 하는 조건 하에서의 상기 미생물의 배양"은 문헌[Bleif et al. (Appl Microbiol Biotechnol (2012) 93:1135-1146) 또는 Korneli et al.(Journal of Biotechnology 163 (2013) 87-96)]에 기재된 바와 같은 생물공학 분야에서 임의의 널리 공지된 배양 및 유도 방법에 따라 수행될 수 있다.
"상기 기질의 스테로이드 호르몬 전구체로의 전환을 가능케 하는 조건"은 상기 기질의 스테로이드 호르몬 전구체로의 전환을 촉진시키는 시험관 내 조건, 예를 들어, 사용되는 시약, 시약 농도, 온도, 진탕의 이용, 반응 또는 인큐베이션의 기간 등을 포함한다. 이들 조건은 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정되고 조정될 수 있다.
비제한적인 예로서, 반응은 0.05 % Tween-20 및 1 mM MgCl2를 통상적으로 함유하는, 예를 들어, pH 7.4로 조정된 통상적으로 150 mM의 HEPES 완충액 중 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 및 글루코스-6-포스페이트의 존재하에서 수행될 수 있다. P450 효소, Adx 및 AdR의 농도는, 예를 들어, 각각 1 μM, 20 μM 및 0.5 μM, 또는 0.25 μM, 5 μM 및 0.125 μM일 수 있다. 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 또는 콜레스테롤 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜은 45% 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린에 용해될 수 있다. 샘플은 37℃로 예비-가온될 수 있고, NADPH는 100 μM의 최종 농도로 첨가될 수 있다. 혼합물은 진탕과 함께 37℃에서 인큐베이션될 수 있다.
특정 구현예에서, 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 임의의 방법에서 사용되는 스테로이드 호르몬 전구체는 프레그네놀론이다. 본원에서 사용되는 "프레그네놀론"은 3β-하이드록시프레근-5-엔-20-온으로도 언급되는 스테로이드 호르몬을 나타낸다.
서열의 간단한 설명
SEQ ID NO:1은 위치 225에 트레오닌 및 위치 289에 아스파르트 산을 포함하는 CYP11A1(폴리펩티드 SA1)의 아미노산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:2는 위치 225에 트레오닌을 포함하는 CYP11A1의 아미노산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:3은 위치 289에 아스파르트산을 포함하는 CYP11A1의 아미노산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:4는 WT 보스 타우루스 CYP11A1(폴리펩티드 SA4; WT P450scc)의 아미노산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:5는 SEQ ID NO:1의 SA1을 인코딩하는 플라스미드 pSMF2.1_CYP11A1BYM의 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:6은 폴리펩티드 SA6(P450scc-I1A-K193E)의 아미노산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:7은 AdR의 아미노산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:8은 Adx의 아미노산 서열을 제시한다.
도면의 간단한 설명
도 1: 시토크롬 P450 폴리펩티드 SA1(SEQ ID NO:1) 및 SA4(서열 SEQ ID NO:4를 갖는 대조군)에 의한 20 μM 콜레스테롤의 시험관 내 전환을 나타내는 HPLC-크로마토그램. 설명: S: 기질, P: 주요 생성물, DOC: 11-데옥시코르티코스테론.
도 2 : 시토크롬 P450 폴리펩티드 SA1(SEQ ID NO:1)에 의한 다양한 기질의 프레그네놀론으로의 생체 내 전환을 나타내는 HPLC-크로마토그램으로부터의 프레그넬로논 정량.
도 3: 24시간 후의 시토크롬 P450 폴리펩티드 SA1(SEQ ID NO:1) 및 SA6(서열 SEQ ID NO:6을 갖는 대조군)에 의한 300 μM 콜레스테롤의 생체 내 전환을 나타내는 HPLC-크로마토그램. 설명: Chol.: 콜레스테롤, Prog.: 프레그네놀론.
도 4: 시토크롬 P450 폴리펩티드 SA1(SEQ ID NO:1) 및 SA6(서열 SEQ ID NO:6을 갖는 대조군)에 의한 300 μM 콜레스테롤의 생체 내 전환에 대한 시간 경과.
도 5: SA1(SEQ ID NO:1)을 인코딩하는 pSMF2.1_CYP11A1BYM의 벡터 맵.
실시예
실시예 1 : 재료 및 방법
단백질 합성
유전자 합성에 의해 CYP11A1 변이체를 획득하고, 폴리-His 태그에 융합된 pTRC99A로 클로닝하였다. C43DE3- E. 콜리 세포를 각각의 벡터 및 샤페론-인코딩 pGro12로 공동 형질전환시켰다. 정제를 문헌[Janocha et al. (Biochim Biophys Acta. (2011) Jan;1814(1):126-31)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 순도를 SDS-PAGE에 의해 평가하였다. 정제된 단백질의 농도를 소듐 디티오나이트를 이용한 처리 및 CO에 대한 노출 후에 CO-차 스펙트럼(CO-difference spectra)에 의해 결정하였다.
Adx 및 AdR을 각각 문헌[Uhlmann et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 188 (1992), pp. 1131-1138) 및 Sagara et al. (Biol. Pharm. Bull., 16 (1993), pp. 627-630)]에 따라 정제하였다.
시험관 내 전환 검정
시험관 내 효소 검정을 위해, 0.05% Tween-20 및 1 mM MgCl2를 함유하는 pH 7.4로 조정된 150 mM의 HEPES 완충액을 반응 완충액으로서 적용시켰다. 기질로서 5 mM 글루코스-6-포스페이트와 함께 1 유닛의 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제를 NADPH-재생 시스템으로 제공하였다.
WT P450scc("SA4"로 기재됨, SEQ ID NO:4) 및 P450scc-I1A-K193E("SA6"로 기재됨, SEQ ID NO:6)에 대해, CYP11A1, Adx 및 AdR의 농도는 각각 1 μM, 20 μM 및 0.5　μM였고, P450scc-R225T-N289D("SA1"으로 기재됨, SEQ ID NO:1)에 대해, CYP11A1, Adx 및 AdR의 농도는 각각 0.25 μM, 5 μM 및 0.125 μM이었다.
45% 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린에 용해된 20 μM의 콜레스테롤을 CYP11A1에 대한 기질로 제공하였다.
샘플을 37℃로 예비-가온시키고, 100 μM의 최종 농도로의 NADPH의 첨가에 의해 반응을 개시시켰다. 혼합물을 30초 동안 진탕과 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 30초 동안 물 중에서 샘플을 비등시킴으로써 반응을 중지시켰다.
240 nm에서 광도계 검출을 가능케 하기 위해, 노카르디아 종(Nocardia spec)으로부터의 콜레스테롤 옥시다제를 이용하여 스테로이드를 이의 3-케토-Δ4 유도체로 전환시켰다.
20 ㎕의 콜레스테롤 옥시다제 용액(0.05% Tween-20을 함유하는 5 ㎖의 50 mM HEPES 완충액 pH 7에 용해된 5 ㎎의 콜레스테롤 옥시다제 및 5 ㎎의 Na-콜레이트)을 샘플에 첨가하였다. 1시간 동안 37℃에서의 인큐베이션 후, 11-데옥시코르티코스테론(DOC)을 내부 표준으로서 반응 혼합물에 첨가한 후, 동일 부피의 에틸아세테이트로 2회 추출하였다. 증발 후, 추출물을 아세토니트릴/물에 용해시켰다.
생체 내 전환 검정
300 μM 콜레스테롤의 프레그넬로논으로의 생체 내 전환을 24시간 후에 HPLC에 의해 평가하였다. 바실러스 메가테리움을 180 rpm 진탕과 함께 37℃에서 10 ㎍/㎖ 테트라사이클린을 함유하는 TB-배지에서 배양하였다. 1 ㎖ 물에 용해된 0.25 g의 자일로스를 첨가한 후, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린에 용해된 기질의 이후의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도하였다.
실시예 2 : 시토크롬 P450 폴리펩티드 SA1( SEQ ID NO:1 ) 및 SA4(WT 대조군, SEQ ID NO:4)에 의한 콜레스테롤의 시험관 내 전환
각각의 P450scc 제조물의 농도의 급성 평가 후, SA1, SA4 및 SA6를 하기 시험관 내 검정에서 이용하였다. 이들 아이소형(isoform) 각각을 포화량의 Adx 및 AdR 중 기질로서 콜레스테롤(20 μM)의 존재하에서 1 μM의 농도로 재구성시켰다.
SA4 및 SA6는 동일한 활성을 나타낸 한편, SA1은 SA4 및 SA6에 비해 2 내지 3배 더 높은 활성을 나타내었다(도 1). 기질은 인큐베이션 시간 후에 이미 고갈되므로, 더 긴 인큐베이션 시간에서 SA1과 SA1/SA4 폴리펩티드 사이의 차이를 평가하는 것은 어렵다.
실시예 3 : 시토크롬 P450 폴리펩티드 SA1( SEQ ID NO:1 ) 및 SA6(대조군, SEQ ID NO:6)에 의한 콜레스테롤의 생체 내 전환
SA4와 SA6 사이에 측정 가능한 차이가 관찰되지 않았으므로, 본 발명자는 SA1 및 SA6 폴리펩티드를 비교하는데 관심을 집중시켰다. 콜레스테롤이 가용화된 콜레스테롤의 존재하에서 P450scc, Fdx1 및 FdxR을 발현하는 재조합 바실러스 메가테리움에 의해 프레그네놀론으로 대사되는 새로운 시스템이 최근에 개발되었다. SA1 및 SA6 해당 cDNA를 바실러스 메가테리움 코돈 BIAS에 대해 최적화시키고, 적절한 제한 부위를 이용하여 플라스미드 pSFM2.1로 전달하였다. 코돈 최적화된 SA1 및 SA6를 각각 갖는 둘 모두의 PSFM2.1 플라스미드를 고전적인 원형질체 형질전환 프로토콜을 이용하여 바실러스 메가테리움 MS941으로 전달하였다.
바실러스 메가테리움에서 발현된 SA1 및 SA6 폴리펩티드에 대해 24시간 및 48시간 후에 생체 내 콜레스테롤 전환 활성을 평가하였다.
시험관 내 실험에 따라, SA1은 바야흐로 SA6에 비해 2배 더 높은 활성을 나타내었다(도 3 및 4).
실시예 4 : 시토크롬 P450 폴리펩티드 SA1( SEQ ID NO:1)에 의한 다양한 기질의 프레그네놀론으로의 생체 내 전환
최종적으로, 다양한 생물공학적 관심 기질인 캄페스테롤, 데스모스테롤, 에르고스타-5,24(28)-디엔-3β-올 및 다양한 20, 22-OH 옥시스테롤의 혼합물을 이용하여 SA1 폴리펩티드 전환 능력을 시험하기 위해 개선된 시스템을 이용하였다.
각각의 기질은 프로게스테론과 동일한 체류 시간을 갖는 한 주요 생성물로 전환되었고, 이는 CYP11A1이 이들 기질 각각의 측쇄를 분해하여 프레그네놀론을 생성시킬 수 있음을 나타낸다.
프레그네놀론 형성을 각각의 기질에 대해 정량하였다(도 2). 극성 옥시스테롤은 콜레스테롤과 동등한 속도로 전환되었다(48시간 후 약 35 ㎎/ℓ). 더욱 소수성 스테롤인 캄페스테롤, 데스모스테롤 및 에르고스타디에놀의 전환은 콜레스테롤에 비해 48시간 후에 약 19%의 속도로만 발생하였다.
종합적으로, 결과는 시험된 스테로이드 모두가 바실러스 메가테리움의 세포막을 통해 투과할 수 있었고, CYP11A1 SA1 돌연변이에 의해 프레그네놀론으로 전환된 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명자는 본원에서 콜레스테롤을 포함하는 다양한 스테롤을 향한 증가된 전환 활성을 나타내는 SA1으로 언급되는 새로운 P450scc 단백질을 보고한다.
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI S.A. <120> NOVEL CYTOCHROME P450 POLYPEPTIDE WITH INCREASED ENZYMATIC ACTIVITY <130> BET 13P3205 <150> EP 14305071.4 <151> 2014-01-20 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated amino acid sequence of CYP11A1 <400> 1 Ile Ser Thr Lys Thr Pro Arg Pro Tyr Ser Glu Ile Pro Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Asn Gly Trp Leu Asn Leu Tyr His Phe Trp Arg Glu Lys Gly Ser 20 25 30 Gln Arg Ile His Phe Arg His Ile Glu Asn Phe Gln Lys Tyr Gly Pro 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Leu Gly Asn Leu Glu Ser Val Tyr Ile Ile His 50 55 60 Pro Glu Asp Val Ala His Leu Phe Lys Phe Glu Gly Ser Tyr Pro Glu 65 70 75 80 Arg Tyr Asp Ile Pro Pro Trp Leu Ala Tyr His Arg Tyr Tyr Gln Lys 85 90 95 Pro Ile Gly Val Leu Phe Lys Lys Ser Gly Thr Trp Lys Lys Asp Arg 100 105 110 Val Val Leu Asn Thr Glu Val Met Ala Pro Glu Ala Ile Lys Asn Phe 115 120 125 Ile Pro Leu Leu Asn Pro Val Ser Gln Asp Phe Val Ser Leu Leu His 130 135 140 Lys Arg Ile Lys 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Gly Asp Ile Ser Lys Met Leu Gln Met Val Pro Leu 325 330 335 Leu Lys Ala Ser Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Ile Ser Val 340 345 350 Thr Leu Gln Arg Tyr Pro Glu Ser Asp Leu Val Leu Gln Asp Tyr Leu 355 360 365 Ile Pro Ala Lys Thr Leu Val Gln Val Ala Ile Tyr Ala Met Gly Arg 370 375 380 Asp Pro Ala Phe Phe Ser Ser Pro Asp Lys Phe Asp Pro Thr Arg Trp 385 390 395 400 Leu Ser Lys Asp Lys Asp Leu Ile His Phe Arg Asn Leu Gly Phe Gly 405 410 415 Trp Gly Val Arg Gln Cys Val Gly Arg Arg Ile Ala Glu Leu Glu Met 420 425 430 Thr Leu Phe Leu Ile His Ile Leu Glu Asn Phe Lys Val Glu Met Gln 435 440 445 His Ile Gly Asp Val Asp Thr Ile Phe Asn Leu Ile Leu Thr Pro Asp 450 455 460 Lys Pro Ile Phe Leu Val Phe Arg Pro Phe Asn Gln Asp Pro Pro Gln 465 470 475 480 Ala <210> 5 <211> 9745 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid <400> 5 catggtctca cttttccact ttttgtcttg tccactaaaa cccttgattt ttcatctgaa 60 taaatgctac tattaggaca cataatatta aaagaaaccc ccatctattt agttatttgt 120 ttggtcactt ataactttaa cagatggggt ttttctgtgc aaccaatttt aagggttttc 180 aatactttaa aacacataca taccaacact tcaacgcacc tttcagcaac taaaataaaa 240 atgacgttat ttctatatgt atcaagataa gaaagaacaa gttcaaaacc atcaaaaaaa 300 gacacctttt caggtgcttt ttttatttta taaactcatt ccctgatctc gacttcgttc 360 tttttttacc tctcggttat gagttagttc aaattcgttc tttttaggtt ctaaatcgtg 420 tttttcttgg aattgtgctg ttttatcctt taccttgtct acaaacccct taaaaacgtt 480 tttaaaggct tttaagccgt ctgtacgttc cttaagatca acgtgatata ggtttgctaa 540 cctttgcgtt cacttaacta acttataggg gtaacactta aaaaagaatc aataacgata 600 gaaaccgctc ctaaagcagg tgcatttttt cctaacgaag aaggcaatag ttcacattta 660 ttgtctaaat gagaatggac tctagaagaa acttcgtttt taatcgtatt taaaacaatg 720 ggatgagatt caattatatg atttctcaag ataacagctt ctatatcaaa tgtattaagg 780 atattggtta atccaattcc gatataaaag ccaaagtttt gaagtgcatt taacatttct 840 acatcatttt tatttgcgcg ttccacaatc tcttttcgag aaatattctt ttcttcttta 900 gagagcgaag ccagtaacgc tttttcagaa gcatataatt cccaacagcc tcgatttcca 960 cagctgcatt tgggtccatt aaaatctatc gtcatatgac ccatttcccc agaaaaaccc 1020 tgaacacctt tatacaattc gttgttaata acaagtccag ttccaattcc gatattaata 1080 ctgatgtaaa cgatgttttc atagtttttt gtcataccaa atactttttc accgtatgct 1140 cctgcattag cttcattttc aacaaaaacc ggaacattaa actcactctc aattaaaaac 1200 tgcaaatctt tgatattcca atttaagtta ggcatgaaaa taatttgctg atgacgatct 1260 acaaggcctg gaacacaaat tcctattccg actagaccat aaggggactc aggcatatgg 1320 gttacaaaac catgaataag tgcaaataaa atctctttta cttcactagc ggaagaacta 1380 gacaagtcag aagtcttctc gagaataata tttccttcta agtcggttag aattccgtta 1440 agatagtcga ctcctatatc aataccaatc gagtagcctg cattcttatt aaaaacaagc 1500 attacaggtc ttctgccgcc tctagattgc cctgccccaa tttcaaaaat aaaatctttt 1560 tcaagcagtg tatttacttg agaggagaca gtagacttgt ttaatcctgt aatctcagag 1620 agagttgccc tggagacagg ggagttcttc aaaatttcat ctaatattaa tttttgattc 1680 atttttttta ctaaagcttg atctgcaatt tgaataataa ccactccttt gtttatccac 1740 cgaactaagt tggtgttttt tgaagcttga attagatatt taaaagtatc atatctaata 1800 ttataactaa attttctaaa aaaaacattg 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tacagctcaa catcttttaa aacatcattc 3540 tcgcgctcat gtagatattt atgaaaaaca acttgtacct tttggattag ttcgttttgg 3600 agtagctcct gatcatcctg aagtaaaaaa cgtaattaac acatttacac agacagctcg 3660 ttctgatcgt tgtgcttttt atggaaatgt agaagtagga cgtgatgtaa cagtacaaga 3720 acttcaagat gcttatcatg ctgtagtatt atcttatggt gctgaagatc atcaagcttt 3780 agatattcca ggtgaagaat tacctggtgt attttctgct cgtgcttttg taggatggta 3840 taatggatta cctgaaaatc gtgaattagc tcctgattta tcttgtgata cagctgtaat 3900 tttaggacaa ggcaacgtag ctttagatgt agctcgtatt ttattaacac ctccggatca 3960 tttagaaaaa acggatatta cagaagctgc tcttggagct ttacgtcaat ctcgtgtaaa 4020 aacagtatgg attgtaggac gtcgtggacc tttacaagta gcttttacga ttaaagaact 4080 tcgcgaaatg attcaattac ctggaacacg tcctatgtta gatcctgctg attttttagg 4140 acttcaggat cgtattaaag aagctgcacg tcctcgtaaa cgtttaatgg aattattatt 4200 acgtacagct acagaaaaac ctggtgtaga agaagctgct cgtagagcat ctgcttctcg 4260 tgcttgggga ttacgttttt ttcgtagccc tcaacaagta ttaccttctc ctgatggacg 4320 tcgtgctgct ggaattcgtt tagctgtaac acgtttagaa ggtattggag aagctacacg 4380 tgctgtacct acaggtgatg tagaagattt accttgtgga cttgtattaa gctctattgg 4440 atataaatct cgtcctattg atccttctgt accttttgat cctaaattag gtgtagtacc 4500 taatatggaa ggacgtgtag tagatgtacc tggattatat tgttctggat gggtaaaacg 4560 tggacctaca ggtgtaatta caacaacaat gacagatagc tttttaacag gccaaattct 4620 tttacaagat cttaaagctg gacatttacc ttcaggacct cgtcctggat ctgcttttat 4680 taaagcttta cttgattctc gtggagtatg gcctgtatct ttttctgatt gggaaaaatt 4740 agatgctgaa gaagtatcta gaggacaagc ttctggaaaa cctcgtgaaa aattattaga 4800 tcctcaagaa atgcttcgtt tacttggcca ctaataagag ctctgtacaa atcaaggagg 4860 tgaatataca atgtcttctt ctgaagataa aataacagtc cactttataa accgtgatgg 4920 tgaaacatta acaaccaaag gaaaaattgg tgactctctg ctagatgttg tggttcaaaa 4980 taatctagat attgatggtt ttggtgcatg tgagggaacc ttggcttgtt ctacctgtca 5040 cctcatcttt gaacagcaca tatttgagaa attggaagca atcactgatg aggagaatga 5100 catgcttgat ctggcatatg gactaacaga tagatcgcgg ttgggctgcc agatctgttt 5160 gacaaaggct atggacaata tgactgttcg agtaccatag catgcgcggc cgccatgccg 5220 gctaaacctc gcgaacggat tcaccggtcc aagaattgga gctaattaat tcttgcggag 5280 aactgtgaat gcgcaaacca acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag 5340 cagccgcacg cggcgcatct cgggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 5400 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 5460 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 5520 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 5580 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 5640 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 5700 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 5760 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 5820 ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 5880 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 5940 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 6000 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 6060 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 6120 agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 6180 gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 6240 agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 6300 cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 6360 ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 6420 cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt 6480 cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 6540 ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 6600 tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 6660 catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 6720 gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata 6780 gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 6840 tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 6900 catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 6960 aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 7020 attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 7080 aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 7140 aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 7200 ttcaagaatt cctgttataa aaaaaggatc aattttgaac tctctcccaa agttgatccc 7260 ttaacgattt agaaatccct ttgagaatgt ttatatacat tcaaggtaac cagccaacta 7320 atgacaatga ttcctgaaaa aagtaataac aaattactat acagataagt tgactgatca 7380 acttccatag gtaacaacct ttgatcaagt aagggtatgg ataataaacc acctacaatt 7440 gcaatacctg ttccctctga taaaaagctg gtaaagttaa gcaaactcat tccagcacca 7500 gcttcctgct gtttcaagct acttgaaaca attgttgata taactgtttt ggtgaacgaa 7560 agcccaccta aaacaaatac gattataatt gtcatgaacc atgatgttgt ttctaaaaga 7620 aaggaagcag ttaaaaagct aacagaaaga aatgtaactc cgatgtttaa cacgtataaa 7680 ggacctcttc tatcaacaag tatcccacca atgtagccga aaataatgac actcattgtt 7740 ccagggaaaa taattacact tccgatttcg gcagtactta gctggtgaac atctttcatc 7800 atataaggaa ccatagagac aaaccctgct actgttccaa atataattcc cccacaaaga 7860 actccaatca taaaaggtat atttttccct aatccgggat caacaaaagg atctgttact 7920 ttcctgatat gttttacaaa tatcaggaat gacagcacgc taacgataag aaaagaaatg 7980 ctatatgatg ttgtaaacaa cataaaaaat acaatgccta cagacattag tataattcct 8040 ttgatatcaa aatgaccttt tatccttact tctttcttta ataatttcat aagaaacgga 8100 acagtgataa ttgttatcat aggaatgagt agaagatagg accaatgaat ataatgggct 8160 atcattccac caatcgctgg accgactcct tctcccatgg ctactatcga tccaataaga 8220 ccaaatgctt tacccctatt ttcctttgga atatagcgcg caactacaac cattacgagt 8280 gctggaaatg cagctgcacc agccccttga ataaaacgag ccataataag taaggaaaag 8340 aaagaatggc caacaaaccc aattaccgac ccgaaacaat ttattataat tccaaatagg 8400 agtaaccttt tgatgcctaa ttgatcagat agctttccat atacagctgt tccaatggaa 8460 aaggttaaca taaaggctgt gttcacccag tttgtactcg caggtggttt attaaaatca 8520 tttgcaatat caggtaatga gacgttcaaa accatttcat ttaatacgct aaaaaaagat 8580 aaaatgcaaa gccaaattaa aatttggttg tgtcgtaaat tcgattgtga ataggatgta 8640 ttcacatttc accctccaat aatgagggca gacgtagttt atagggttaa tgatacgctt 8700 ccctctttta attgaaccct gttacattca ttacacttca taattaattc ctcctaaact 8760 tgattaaaac attttaccac atataaacta agttttaaat tcagtatttc atcacttata 8820 caacaatatg gcccgtttgt tgaactactc tttaataaaa taatttttcc gttcccaatt 8880 ccacattgca ataatagaaa atccatcttc atcggctttt tcgtcatcat ctgtatgaat 8940 caaatcgcct tcttctgtgt catcaaggtt taatttttta tgtatttctt ttaacaaacc 9000 accataggag attaaccttt tacggtgtaa accttcctcc aaatcagaca aacgtttcaa 9060 attcttttct tcatcatcgg tcataaaatc cgtatccttt acaggatatt ttgcagtttc 9120 gtcaattgcc gattgtatat ccgatttata tttatttttc ggtcgaatca tttgaacttt 9180 tacatttgga tcatagtcta atttcattgc ctttttccaa aattgaatcc attgtttttg 9240 attcacgtag ttttctgtat tcttaaaata agttggttcc acacatacca atacatgcat 9300 gtgctgatta taagaattat ctttattatt tattgtcact tccgttgcac gcataaaacc 9360 aacaagattt ttattaattt ttttatattg catcattcgg cgaaatcctt gagccatatc 9420 tgacaaactc ttatttaatt cttcgccatc ataaacattt ttaactgtta atgtgagaaa 9480 caaccaacga actgttggct tttgtttaat aacttcagca acaacctttt gtgactgaat 9540 gccatgtttc attgctctcc tccagttgca cattggacaa agcctggatt tacaaaacca 9600 cactcgatac aactttcttt cgcctgtttc acgattttgt ttatactcta atatttcagc 9660 acaatctttt actctttcag cctttttaaa ttcaagaata tgcagaagtt caaagtaatc 9720 aacattagcg attttctttt ctctc 9745 <210> 6 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated amino acid sequence of CYP11A1 <400> 6 Ala Ser Thr Lys Thr Pro Arg Pro Tyr Ser Glu Ile Pro Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Asn Gly Trp Leu Asn Leu Tyr His Phe Trp Arg Glu Lys Gly Ser 20 25 30 Gln Arg Ile His Phe Arg His Ile Glu Asn Phe Gln Lys Tyr Gly Pro 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Leu Gly Asn Leu Glu Ser Val Tyr Ile Ile His 50 55 60 Pro Glu Asp Val Ala His Leu Phe Lys Phe Glu Gly Ser Tyr Pro Glu 65 70 75 80 Arg Tyr Asp Ile Pro Pro Trp Leu Ala Tyr His Arg Tyr Tyr Gln Lys 85 90 95 Pro Ile Gly Val Leu Phe Lys Lys Ser Gly Thr Trp Lys Lys Asp Arg 100 105 110 Val Val Leu Asn Thr Glu Val Met Ala Pro Glu Ala Ile Lys Asn Phe 115 120 125 Ile Pro Leu Leu Asn Pro Val Ser Gln Asp Phe Val Ser Leu Leu His 130 135 140 Lys Arg Ile Lys Gln Gln Gly Ser Gly Glu Phe Val Gly Asp Ile Lys 145 150 155 160 Glu Asp Leu Phe His Phe Ala Phe Glu Ser Ile Thr Asn Val Met Phe 165 170 175 Gly Glu Arg Leu Gly Met Leu Glu Glu Thr Val Asn Pro Glu Ala Gln 180 185 190 Lys Phe Ile Asp Ala Val Tyr Lys Met Phe His Thr Ser Val Pro Leu 195 200 205 Leu Asn Val Pro Pro Glu Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Thr Lys Thr Trp 210 215 220 Arg Asp His Val Ala Ala Trp Asp Thr Ile Phe Asn Lys Ala Glu Lys 225 230 235 240 Tyr Thr Glu Ile Phe Tyr Gln Asp Leu Arg Arg Lys Thr Glu Phe Arg 245 250 255 Asn Tyr Pro Gly Ile Leu Tyr Cys Leu Leu Lys Ser Glu Lys Met Leu 260 265 270 Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Ile Thr Glu Met Leu Ala Gly Gly Val 275 280 285 Asn Thr Thr Ser Met Thr Leu Gln Trp His Leu Tyr Glu Met Ala Arg 290 295 300 Ser Leu Asn Val Gln Glu Met Leu Arg Glu Glu Val Leu Asn Ala Arg 305 310 315 320 Arg Gln Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Met Leu Gln Met Val Pro Leu 325 330 335 Leu Lys Ala Ser Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Ile Ser Val 340 345 350 Thr Leu Gln Arg Tyr Pro Glu Ser Asp Leu Val Leu Gln Asp Tyr Leu 355 360 365 Ile Pro Ala Lys Thr Leu Val Gln Val Ala Ile Tyr Ala Met Gly Arg 370 375 380 Asp Pro Ala Phe Phe Ser Ser Pro Asp Lys Phe Asp Pro Thr Arg Trp 385 390 395 400 Leu Ser Lys Asp Lys Asp Leu Ile His Phe Arg Asn Leu Gly Phe Gly 405 410 415 Trp Gly Val Arg Gln Cys Val Gly Arg Arg Ile Ala Glu Leu Glu Met 420 425 430 Thr Leu Phe Leu Ile His Ile Leu Glu Asn Phe Lys Val Glu Met Gln 435 440 445 His Ile Gly Asp Val Asp Thr Ile Phe Asn Leu Ile Leu Thr Pro Asp 450 455 460 Lys Pro Ile Phe Leu Val Phe Arg Pro Phe Asn Gln Asp Pro Pro Gln 465 470 475 480 Ala <210> 7 <211> 461 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 7 Met Ser Thr Gln Glu Gln Thr Pro Gln Ile Cys Val Val Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro Ala Gly Phe Tyr Thr Ala Gln His Leu Leu Lys His His Ser Arg 20 25 30 Ala His Val Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Leu Val Pro Phe Gly Leu Val 35 40 45 Arg Phe Gly Val Ala Pro Asp His Pro Glu Val Lys Asn Val Ile Asn 50 55 60 Thr Phe Thr Gln Thr Ala Arg Ser Asp Arg Cys Ala Phe Tyr Gly Asn 65 70 75 80 Val Glu Val Gly Arg Asp Val Thr Val Gln Glu Leu Gln Asp Ala Tyr 85 90 95 His Ala Val Val Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Asp His Gln Ala Leu Asp 100 105 110 Ile Pro Gly Glu Glu Leu Pro Gly Val Phe Ser Ala Arg Ala Phe Val 115 120 125 Gly Trp Tyr Asn Gly Leu Pro Glu Asn Arg Glu Leu Ala Pro Asp Leu 130 135 140 Ser Cys Asp Thr Ala Val Ile Leu Gly Gln Gly Asn Val Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Ala Arg Ile Leu Leu Thr Pro Pro Asp His Leu Glu Lys Thr Asp 165 170 175 Ile Thr Glu Ala Ala Leu Gly Ala Leu Arg Gln Ser Arg Val Lys Thr 180 185 190 Val Trp Ile Val Gly Arg Arg Gly Pro Leu Gln Val Ala Phe Thr Ile 195 200 205 Lys Glu Leu Arg Glu Met Ile Gln Leu Pro Gly Thr Arg Pro Met Leu 210 215 220 Asp Pro Ala Asp Phe Leu Gly Leu Gln Asp Arg Ile Lys Glu Ala Ala 225 230 235 240 Arg Pro Arg Lys Arg Leu Met Glu Leu Leu Leu Arg Thr Ala Thr Glu 245 250 255 Lys Pro Gly Val Glu Glu Ala Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ser Arg Ala 260 265 270 Trp Gly Leu Arg Phe Phe Arg Ser Pro Gln Gln Val Leu Pro Ser Pro 275 280 285 Asp Gly Arg Arg Ala Ala Gly Ile Arg Leu Ala Val Thr Arg Leu Glu 290 295 300 Gly Ile Gly Glu Ala Thr Arg Ala Val Pro Thr Gly Asp Val Glu Asp 305 310 315 320 Leu Pro Cys Gly Leu Val Leu Ser Ser Ile Gly Tyr Lys Ser Arg Pro 325 330 335 Ile Asp Pro Ser Val Pro Phe Asp Pro Lys Leu Gly Val Val Pro Asn 340 345 350 Met Glu Gly Arg Val Val Asp Val Pro Gly Leu Tyr Cys Ser Gly Trp 355 360 365 Val Lys Arg Gly Pro Thr Gly Val Ile Thr Thr Thr Met Thr Asp Ser 370 375 380 Phe Leu Thr Gly Gln Ile Leu Leu Gln Asp Leu Lys Ala Gly His Leu 385 390 395 400 Pro Ser Gly Pro Arg Pro Gly Ser Ala Phe Ile Lys Ala Leu Leu Asp 405 410 415 Ser Arg Gly Val Trp Pro Val Ser Phe Ser Asp Trp Glu Lys Leu Asp 420 425 430 Ala Glu Glu Val Ser Arg Gly Gln Ala Ser Gly Lys Pro Arg Glu Lys 435 440 445 Leu Leu Asp Pro Gln Glu Met Leu Arg Leu Leu Gly His 450 455 460 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 8 Met Ser Ser Ser Glu Asp Lys Ile Thr Val His Phe Ile Asn Arg Asp 1 5 10 15 Gly Glu Thr Leu Thr Thr Lys Gly Lys Ile Gly Asp Ser Leu Leu Asp 20 25 30 Val Val Val Gln Asn Asn Leu Asp Ile Asp Gly Phe Gly Ala Cys Glu 35 40 45 Gly Thr Leu Ala Cys Ser Thr Cys His Leu Ile Phe Glu Gln His Ile 50 55 60 Phe Glu Lys Leu Glu Ala Ile Thr Asp Glu Glu Asn Asp Met Leu Asp 65 70 75 80 Leu Ala Tyr Gly Leu Thr Asp Arg Ser Arg Leu Gly Cys Gln Ile Cys 85 90 95 Leu Thr Lys Ala Met Asp Asn Met Thr Val Arg Val Pro 100 105

Claims (15)

  1. SEQ ID NO:1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 분리된 P450 효소로서, 상기 서열이 위치 225에 해당하는 위치에 트레오닌 및/또는 위치 289에 해당하는 위치에 아스파르트산을 포함하는, 분리된 P450 효소.
  2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성되는 효소.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 SEQ ID NO:1으로 구성되는 효소.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 분리된 핵산.
  5. 발현 조절 서열과 작동 가능하게 회합된, 제4항에 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 아드레노독신(Adx)을 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 아드레노독신 환원효소(AdR)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  7. 제4항에 정의된 바와 같은 핵산 또는 제5항 또는 제6항에 정의된 바와 같은 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 유전학적으로 조작된 미생물인 숙주 세포.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)인 숙주 세포.
  10. 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 콜레스테롤 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 기질을 스테로이드 호르몬 전구체로 전환시킬 수 있는 유전학적으로 조작된 미생물로서, 상기 미생물이 제4항에 정의된 바와 같은 핵산, 및 임의로 아드레노독신(Adx)을 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 아드레노독신 환원효소(AdR)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 유전학적으로 조작된 미생물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 효소를 제조하기 위한 시험관 내 방법으로서, 상기 방법이
    a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 효소의 발현을 획득하기에 적합한 조건하에서 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 발현된 효소를 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  12. 스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 효소의 용도.
  13. a) 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 미생물을 제공하는 단계,
    b) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 효소의 발현을 가능케 하는 조건하에서 상기 미생물을 배양하는 단계,
    c) 미생물에 의한 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 콜레스테롤 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 기질로부터 스테로이드 호르몬 전구체의 생성을 가능케 하는 조건하에서 단계 b)에서 획득된 미생물 배양물과 상기 기질을 접촉시키는 단계, 및
    d) 생성된 스테로이드 호르몬 전구체를 회수하는 단계를 포함하는,
    스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 방법.
  14. a) 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및 콜레스테롤 유도체와 같은 지방족 측쇄를 갖는 다환식 및 불포화 모노 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 기질의 스테로이드 호르몬 전구체로의 전환을 가능케 하는 조건하에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 효소와 분리된 아드레노독신(Adx) 폴리펩티드, 분리된 아드레노독신 환원효소(AdR) 폴리펩티드 및 상기 기질을 접촉시키는 단계, 및
    b) 획득된 스테로이드 호르몬 전구체를 회수하는 단계를 포함하는,
    스테로이드 호르몬 전구체를 생성시키기 위한 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 스테로이드 호르몬 전구체가 프레그네놀론인 방법.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019913B (zh) * 2019-12-30 2023-07-07 苏州汇桢生物技术有限公司 一种p450scc突变体及核苷酸、表达载体、宿主细胞
CN112457412B (zh) * 2020-11-26 2022-10-14 浙江工业大学 一种人工电子传递系统及其在促进p450酶羟基化反应中的应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
IL90207A (en) * 1988-05-06 1994-07-31 Roussel Uclaf Biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
AU6248994A (en) 1993-02-22 1994-09-14 Rockefeller University, The Production of high titer helper-free retroviruses by transient transfection
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
CN1343779A (zh) * 2000-09-19 2002-04-10 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——含有过氧化物酶特征的蛋白12.21和编码这种多肽的多核苷酸
CN1283800C (zh) * 2004-11-29 2006-11-08 浙江大学 能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Glu435Asp变体基因及其用途
CN101333521B (zh) * 2008-04-25 2010-12-15 浙江大学 细胞色素p450bm-3d168w变体酶以及应用其制备靛玉红的方法
US20140011206A1 (en) * 2011-02-09 2014-01-09 The Regents Of The University Of California Determination of oocyte quality

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