CN100422308C - 一种高发酵速率的重组酒精酵母及其构建和所用的表达载体 - Google Patents

Abstract

一种高发酵速率的重组酒精酵母及其构建和所用的表达载体，属于微生物发酵工程领域。本发明提供了一种在酒精酵母中整合表达外源酸性蛋白酶基因的表达载体pYEI-222及其在酒精酵母中表达外源酸性蛋白酶基因的重组质粒pYEI-ap，提供了一种具有高酒精发酵速率的重组酒精酵母CCTCC M206009和重组酒精酵母CCTCC M206009的构建方法。本发明可用于对酒精酵母的遗传改良研究和用于酒精工业的技术进步。

Description

一种高发酵速率的重组酒精酵母及其构建和所用的表达载体

技术领域

一种高发酵速率的重组酒精酵母及其构建和所用的表达载体，涉及酸性蛋白酶基因通过酵母的整合型表达载体转化到工业酒精酵母中及其在工业酒精菌酿酒酵母中的应用，获得具有高发酵速率的重组酒精酵母，属于微生物发酵工程领域。

背景技术

在工业生产上，可用发酵法或合成法来制取酒精，而我国有95％以上的工厂，都是采用发酵法生产酒精。酒精生产常用的淀粉质原料有薯类、粮谷类、野生植物类和农产品加工的副产品等。各种淀粉质原料的化学组成见下表1。

表1淀粉质原料化学组成参考表

由上表可见在主要的酒精生产原料中，蛋白质的含量均不可忽视，在大米，高粱，小麦等原料中蛋白质含量均在8％-10％左右。玉米是一种比较理想的酒精生产原料，2004年全国酒精的总产量在305万吨左右，其中，玉米酒精就占了总产量的48％。玉米原料含有较丰富的蛋白质(9％-10％)，但在糖化发酵中只能产生少量的酵母可吸收氮：氨基酸，二肽或三肽，大多数转变为酵母菌无法利用的可溶性蛋白，残留于糟液中，这不但造成蛋白质资源的浪费，也妨碍酵母菌进行高效率酒精发酵。

近年来，酸性蛋白酶作为酒精发酵的促进剂得到了广泛的关注，有报道酸性蛋白酶对淀粉质原料的酒精发酵过程都有一定的促进作用，并且从原料出酒率提高的幅度看，其效果是玉米＞高粱＞薯干。酸性蛋白酶是适合在酸性条件下(pH 1.9-4.0)分解蛋白质的一类酶，其代表性特征是能够在酸性环境条件下水解动植物蛋白质，将两个疏水氨基酸打断，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。酸性蛋白酶属于内肽酶，其催化活性是依靠活性位点的天冬氨酸残基。酸性蛋白酶总的代谢机理是酸碱催化作用，由活性位点的天冬氨酸在酸性或碱性条件下交替发挥作用。

酸性蛋白酶促进酒精发酵的原因是应用酸性蛋白酶能有利于原料中蛋白质的水解，增加醪液中酵母可吸收性氮，促进酵母菌生长繁殖，提高酒精发酵速率，并减少菌体用于合成氨基酸等造成的底物流失和能耗，提高原料出酒率。随着优良菌种的选育和酶制剂生产技术的不断发展，酸性蛋白酶作为发酵促进剂，应用于高效率酒精发酵将会得到广泛采用。尤其是采用糟水回用发酵工艺，醪液初始pH值在4.0-4.5之间，更有利于酸性蛋白酶水解原料中的蛋白质，增加醪液中的α-氨基氮水平，提高酵母菌抵抗或忍耐氨基糖等有害物质的能力，不仅能促进酒精发酵，而且能增加糟水回用批次，减少酒糟处理的设备投资和能耗，具有广泛的应用价值。

在国内已有的相关报道中肖冬光等在淀粉质原料的酒精发酵中加入14u/g的酸性蛋白酶后，发酵周期缩短了20％，原料出酒率提高5.73％。吕伟民在酒精发酵中于发酵开始时加入酸性蛋白酶，当添加量为每克原料15个单位时，淀粉出酒率可提高1.6个百分点。发酵周期提前约4小时。宋书玉等在料水比为1∶2.8-3.2的酒精浓醪发酵中，添加适量的酸性蛋白酶，可缩短发酵周期至48小时，原料出酒率提高约1.04％。这是因为在以淀粉质为原料生产酒精的过程中，添加适量的酸性蛋白酶会对原料中所含的蛋白质起到水解作用，一方面破坏原料颗粒间质细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用的碳源增加，从而提高原料的出酒率；另一方面，在蛋白酶的水解作用下生成大量的L-氨基酸，提供丰富的氮源，促进酵母菌的生长与繁殖，增加主发酵时酵母菌的浓度，提高发酵速率，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。同时，由于蛋白质的分解，蒸馏时产生的泡沫减少，使蒸馏变得容易操作。发酵时间的缩短不仅提高了设备利用率，扩大了产量，而且提高了酒精的质量。由于酵母繁殖旺盛，发酵速率提高，一方面抑制了杂菌繁殖，同时又减少了杂菌生长的时间，减少了酸、酯、杂醇油、甲醇等副产物的产生几率。杂质的减少，提高了酒精纯度，对于食用酒精的生产是十分有利的。

酸性蛋白酶的研究开发大致有两条途径：一、通过传统的遗传学方法对已有的菌株进行改良以获得性能更优良的菌株；二、通过基因工程手段克隆各种酸性蛋白酶基因，研究其功能与特点，并构建各种重组菌使其得到更好的应用。如章剑林等(1995)以黑曲霉为出发菌株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高温酸性蛋白酶的菌株S_3-15，其所产酸性蛋白酶最适pH值为2.5，最适温度为50℃，90℃下恒温4h的酶活比出发菌株高64.2％；稀释100倍的酶溶液60℃下保温30min酶存活率为72.8％。黄遵锡等(1999)以黑曲霉YM3019为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍诱变处理，获得高产酶菌株A-1-1，产酶活力约是原始出发菌株的4倍。李永泉等(1999)以宇佐美曲霉白色突变株B1为出发菌株，通过微波诱变和亚硝基胍、硫酸锂复合诱变剂点试平板法诱变，选育到一株酸性蛋白酶的高产菌-L336，遗传性状非常稳定。近年来国内在酸性蛋白酶的研究中大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的菌种主要有黑曲霉和宇佐美曲霉及它们的突变株，其发酵酶活力一般在6000-7000u/mL。Horiuchi等在1990年将雪白根霉酸性蛋白酶(RNAP)的序列去掉内含子后在3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子控制下在酿酒酵母中得到高效表达。Shimut等(2000)利用转基因技术将Scytalidium lignicolum中的酸性蛋白酶基因导入到酵母中，获得分泌该种酸性蛋白酶的酵母突变体酿酒酵母AH22，所产酸性蛋白酶最适pH为2.3，在pH 2.0～5.0之间稳定。此酶在pH 4.0，50℃条件下，15min内酶活保持不变，并且对DNA和胃蛋白酶抑制剂不敏感，其酶动力学特性与野生型酶的动力学特性非常相似。

尽管酸性蛋白酶在酒精发酵工艺中的应用具有如上优点，但外加酸性蛋白酶到酒精发酵工艺中仍不能被接受，其主要原因是酸性蛋白酶的自身降解要求在发酵过程中不断添加酸性蛋白酶，这增加了酒精发酵工艺操作的复杂性。

发明内容

本发明目的是提供一种高发酵速率的重组酒精酵母及其构建和所用的表达载体，本发明构建了一种在酒精酵母中整合表达外源酸性蛋白酶基因的表达载体pYEI-222及其在酒精酵母中表达外源酸性蛋白酶的重组质粒pYEI-ap，创建一种具有高酒精发酵速率的重组酒精酵母CCTCC M206009，应用于酒精工业中缩短了酒精的发酵时间、改善了产品质量及提高淀粉质原料的利用率。

本发明的技术方案：一种高发酵速率的重组酒精酵母Saccharomycescerevisiae CICIM-MMY0034，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M206009，实现了酸性蛋白酶基因ap在其中的表达。重组酒精酵母CCTCCM206009的制备方法是在表达载体pYEI-222的下游克隆入酸性蛋白酶基因ap，获得能在酒精酵母中表达酸性蛋白酶基因的重组质粒pYEI-ap，将重组表达质粒pYEI-ap依据同源重组原理，通过电转化的方法，将酸性蛋白酶基因ap整合到酒精酵母染色体中，获得重组酒精酵母CCTCC M206009。重组酒精酵母CCTCCM206009中表达的酸性蛋白酶基因ap的获得方法是采用PCR技术克隆出来源于丝状真菌的酸性蛋白酶基因ap的染色体DNA或总RNA为模板，以一对特异性引物介导，扩增出酸性蛋白酶基因ap；人工设计并合成的用于酸性蛋白酶基因ap克隆和表达的引物，其特征序列为：

An-Ap1：acatgaattc atggtcgtct tcagcaaaac cgctgccctc

An-Ap2：gtgagaattc tttttttttt ttttt

Af-Ap1：acatgaattc atggctccat tcacgtttct ggtagggata

Af-Ap2：gtgagaattc tcatggggta cttgaaacac tcgtggccaa t

Ao-Ap1：acatgaattc atgatgcggg gcgcatctct cctaccagtt

Ao-Ap2：gtgagaattc ttacaaagca agaagaagac cagcacccgc a

Mp-Ap1：acatgaattc atggtcgtct tcagcaagat caccgccgtt

Mp-Ap2：gtgagaat tc t tacaaagca agaagaagac cagcacccg

Nc-Ap1：acatgaattc atgtcttcga ttctttgtca agatgaagac

Nc-Ap2：gtgagaattc tcacaacccc aaaaccacc

Rm-Ap1：acatgaattc atgctcttct ctcagattac ttctgcgatc

Rm-Ap2：gtgagaattc ttactcgttt tcataagccg aggccaaagg tgc

所述的丝状真菌为黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉、红曲霉、粗糙脉孢霉或雪白根霉。

能在酵母中分泌表达外源基因的表达载体pYEI-222，其核苷酸序列为：

gatccctatt ttcgaggacc ttgtcacctt gagcccaaga gagccaagat ttaaattttc  60

ctatgacttg atgcaaattc ccaaagctaa taacatgcaa gacacgtacg gtcaagaaga  120

catatttgac ctcttaacag gttcagacgc gactgcctca tcagtaagac ccgttgaaaa  180

gaacttacct gaaaaaaacg aatatatact agcgttgaat gttagcgtca acaacaagaa  240

gtttaatgac gcggaggcca aggcaaaaag attccttgat tacgtaaggg agttagaatc  300

attttgaata aaaaacacgc tttttcagtt cgagtttatc attatcaata ctgccatttc  360

aaagaatacg taaataatta atagtagtga ttttcctaac tttatttagt caaaaaatta  420

gccttttaat tctgctgtaa cccgtacatg cccaaaatag ggggcgggtt acacagaata  480

tataacatcg taggtgtctg ggtgaacagt ttattcctgg catccactaa atataatgga  540

gcccgctttt taagctggca tccagaaaaa aaaagaatcc cagcaccaaa atattgtttt  600

cttcaccaac catcagttca taggtccatt ctcttagcgc aactacagag aacaggggca  660

caaacaggca aaaaacgggc acaacctcaa tggagtgatg caacctgcct ggagtaaatg  720

atgacacaag gcaattgacc cacgcatgta tctatctcat tttcttacac cttctattac  780

cttctgctct ctctgatttg gaaaaagctg aaaaaaaagg ttgaaaccag ttccctgaaa  840

ttattcccct acttgactaa taagtatata aagacggtag gtattgattg taattctgta  900

aatctatttc ttaaacttct taaattctac ttttatagtt agtctttttt ttagttttaa  960

aacaccaaga acttagtttc gaataaacac acataaacaa acaaaggatccaaacgatga  1020

gatttccttc aatttttact gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta gctgctccag 1080

tcaacactac aacagaagat gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc atcggttact 1140

cagatttaga aggggatttc gatgttgctg ttttgccatt ttccaacagc acaaataacg 1200

ggttattgtt tataaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa ggggtatctc 1260

tagaattcga gctcccgggt accatggcat gctaattaga tagagcagag aggacggatt 1320

tcctgaagga aatccgtttt tttattttgc ccgtcttata ataaccaatt ctgattagaa 1380

aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata 1440

tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat 1500

ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa 1560

tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc 1620

cggtgagaat ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt 1680

acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg 1740

agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa 1800

ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc 1860

taatacctgg aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg 1920

agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct 1980

gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc 2040

tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc 2100

gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga 2160

gcaagacgtt tcccgttgga tctctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 2220

tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 2280

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 2340

tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 2400

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 2460

tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 2520

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 2580

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 2640

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 2700

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 2760

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 2820

cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 2880

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 2940

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 3000

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 3060

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 3120

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 3180

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 3240

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 3300

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 3360

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 3420

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 3480

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 3540

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 3600

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 3660

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 3720

ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 3780

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 3840

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 3900

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 3960

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 4020

cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 4080

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 4140

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 4200

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 4260

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 4320

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 4380

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 4440

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcaagaatt aattctcatg tttgacagct 4500

tatcatcgat aagctgactc atgttggtat tgtgaaatag acgcagatcg ggaacactga 4560

aaaataacag ttattattcg 4580。

表达载体pYEI-222，含有一个在酵母中具有功能的启动子序列P_GPO，此序列同时具有外源基因在酵母染色体DNA中进行整合和基因拷贝数扩增的功能，含有一个在酵母中具有功能的信号肽序列S_MFα，及含有一个供外源基因克隆的多克隆位点，含有一个人工转录终止序列T_art，含有一个在酵母中进行克隆选择的遗传标记Km^R。

启动子序列P_GPD及外源基因在酵母染色体DNA中进行整合和基因拷贝数扩增序列，从6位到1005位。

信号肽序列S_MFα，从1006位到1258位。

多克隆位点，从1259位到1284位，其中安排有Xbal，EcoRI，SacI，SmaI，KpnI酶切位点，相对应的序列分别为tctaga、gaattc、gagctc、cccggg、ggtacc。

人工转录终止序列T_art，从1289位到1357位，其核苷酸序列如下：1289 ta attagataga gcagagagga

tttttta ttttgcccgt cttataa 1357。

其中，单下划线核苷酸序列为终止密码子，双下划线和波浪线核苷酸序列为镜像互补序列。

克隆选择的遗传标记卡那霉素抗性Km^R，从1358位到2173位。表达载体

pYEI-222的构建方法所使用的引物序列如下：

引物P1：cg

引物P2：

tttgtttgtt tatgtgtgtt

引物P3：

ttataagacg ggcaaaata

引物P4：

taaccaa ttctgattag aaa

引物P5：tttagatcta acgggaaacg tcttgct

引物P6：aacagatctc tgcctcgcgc gtttcggtga t

引物P7：tcgagatctc gaataataac tgttattttt ca

单下划线部分为人工引入的限制性酶切位点；双划线部分为人工引入的便于片断与片断拼接的序列。

人工合成S_MFα，在合成的过程中同时引入多克隆位点和转录终止序列T_art及与编码G418抗性基因同源的部分序列。以酿酒酵母染色体DNA为模板，P1和P2为引物，PCR扩增出1.0kb的DNA片段P_GPD，并通过P1和P2在扩增出的DNA片段的一端引入Bg1II酶切位点，另一端引入与S_MFα部分便于以下的操作。以扩增出的DNA片段P_GPD及合成的DNA片段S_MFα模板，P1和P3为引物，通过这两段DNA片段两端人工引入的同源序列经cross-over PCR将这两段DNA片段拼接起来，获得DNA片段P_GPD-S_MFα。再以载体pSKsymΩKm(Overhage，J.，Priefert，H.，Rabenhorst，J.andSteinbuche，A.(1999)Appl.Microbiol.Biotechol.52，820-828)DNA为模板，P4和P5为引物PCR扩增出编码G418抗性基因的DNA片段Km^R，其片段一端引入与人工合成的S_MFα部分同源序列，另一端引入Bg1II酶切位点。以扩增出的编码G418抗性基因的DNA片段Km^R和P_GPD-S_MFα为模板，P1和P5为引物，通过这两段DNA片段两端同源序列经cross-over PCR将这两段DNA片段拼接起来，获得DNA片段P_GPD-S_MFα-Km^R。再以pBR322为模板，P6和P7为引物，反向聚合酶链反应扩增得到2.4kb的DNA片段pBR322’，pBR322’含有大肠杆菌的复制原点及氨苄青霉素抗性，并在其两端设计有Bg1II的酶切位点。扩增产物P_GPD-S_MFα-Km^R和pBR322’分别用Bg1II酶切，在T₄连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，获得在酵母中能表达的载体pYEI-222。以上所述的各次扩增，扩增条件详见实施例1。

本发明的有益效果：

1提高淀粉质原料酒精发酵时的原料利用率。

2重组酒精酵母的构建有效缩短酒精的发酵周期。

附图说明

图1酵母表达载体pYEI-222。

图2在工业酒精生产酵母中整合表达酸性蛋白酶的重组质粒pYEI-ap。生物材料样品保藏

高发酵速率的重组酒精酵母Saccharomyces cerevisiae CICIM-MMY0034，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2006年1月14日，保藏编号为CCTCC M206009。

具体实施方式

实施例1：酵母表达载体的构建

酵母表达载体构建所使用的引物由DNA合成仪合成。使用的引物如下：

引物P1：cgagatctct attttcgagg accttgtcac

引物P2：

tttgtttgtt tatgtgtgtt

引物P3：

ttataagacg ggcaaaata

引物P4：

taaccaa ttctgattag aaa

引物P5：tttagatcta acgggaaacg tcttgct

引物P6：aacagatctc tgcctcgcgc gtttcggtga t

引物P7：tcgagatctc gaataataac tgttattttt ca

单下划线部分为人工引入的限制性酶切位点；双划线部分为人工引入的便于片断与片断拼接的序列。

表达载体的构建过程为：

人工合成S_MFα并在合成的过程中同时引入多克隆位点和转录终止序列T_art及与编码G418抗性基因同源的部分序列。以酿酒酵母染色体DNA为模板，P1和P2为引物，PCR扩增出1.0kb的DNA片段P_GPD，扩增出的DNA片段是编码三磷酸甘油醛脱氢酶的基因，并通过P1和P2在扩增出的DNA片段的一端引入Bg1II酶切位点，另一端引入与S_MFα部分同源的序列便于以下的操作，其PCR扩增条件为1×(95℃ 5min)；35×(94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min)；1×(72℃ 10min)。以扩增出的DNA片段P_GPD及合成的DNA片段S_MFα为模板，P1和P3为引物，通过这两段DNA片段两端人工引入的同源序列经cross-over PCR将这两段DNA片段拼接起来，获得DNA片段P_GPD-S_MFα，其PCR拼接条件是1×(95℃5min)；35×(94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min 30s)；1×(72℃ 10min)。再以pSKsymΩKm(Overhage，J.，Priefert，H.，Rabenhorst，J.andSteinbuche，A.(1999)Appl.Microbiol.Biotechol.52，820-828)的DNA为模板，P4和P5为引物PCR扩增出编码G418抗性基因的DNA片段Km^R，其片段一端引入与人工合成的S_MFα部分同源序列，另一端引入Bg1II酶切位点，其PCR扩增条件是1×(95℃5min)；35×(94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min)；1×(72℃ 10min)。以扩增出的编码G418抗性基因的DNA片段Km^R和P_GPD-S_MFα为模板，P1和P5为引物，通过这两段DNA片段两端同源序列经cross-over PCR将这两段DNA片段拼接起来，获得DNA片段P_GPD-S_MFα-Km^R，其PCR扩增拼接条件是1×(95℃ 5min)；35×(94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min)；1×(72℃ 10min)。再以pBR322为模板，P6和P7为引物，反向聚合酶链反应扩增得到2.4kb的DNA片段pBR322’，pBR322’的PCR扩增条件是1×(95℃ 5min)；35×(94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min30s)；1×(72℃ 10min)；pBR322’含有大肠杆菌的复制原点及氨苄青霉素抗性，并在其两端设计有BgII的酶切位点。扩增产物P_GPD-S_MFα-Km^R和pBR322’分别用BglII酶切，在T4连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，获得在酵母中能表达的载体pYEI-222。(图1)。

实施例2：酒精酵母表达酸性蛋白酶基因ap重组质粒的构建

采用PCR技术，以丝状真菌的染色体DNA或总RNA为模板，以一对特异性引物介导，克隆出酸性蛋白酶基因ap。人工设计并合成的用于酸性蛋白酶基因克隆和表达的引物，其特征序列为：

An-Ap1：acatgaattc atggtcgtct tcagcaaaac cgctgccctc

An-Ap2：gtgagaattc tttttttttt ttttt

Af-Ap1：acatgaattc atggctccat tcacgtttct ggtagggata

Af-Ap2：gtgagaattc tcatggggta cttgaaacac tcgtggccaa t

Ao-Ap1：acatgaattc atgatgcggg gcgcatctct cctaccagtt

Ao-Ap2：gtgagaattc ttacaaagca agaagaagac cagcacccgc a

Mp-Ap1：acatgaattc atggtcgtct tcagcaagat caccgccgtt

Mp-Ap2：gtgagaattc ttacaaagca agaagaagac cagcacccg

Nc-Ap1：acatgaattc atgtcttcga ttctttgtca agatgaagac

Nc-Ap2：gtgagaattc tcacaacccc aaaaccacc

Rm-Ap1：acatgaattc atgctcttct ctcagattac ttctgcgatc

Rm-Ap2：gtgagaattc ttactcgttt tcataagccg aggccaaagg tgc

其中单划线为人工引入的EcoRI限制性酶切位点。

在扩增酸性蛋白酶基因ap片断两端引入EcoRI酶切位点，EcoRI酶切所扩增的酸性蛋白酶基因片段，插入上述酵母表达载体pYEI-222多克隆位点的EcoRI位点，获得能在酒精酵母中表达酸性蛋白酶基因的重组质粒pYEI-ap(图2)。

实施例3：重组工业酒精生产酵母的构建CICIM MMY0034(CCTCC M206009)

将活化的工业酒精生产菌酿酒酵母825于500mL YPD(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中30℃培养18h，至OD₆₀₀＝1.7，5000r/min离心收集菌体，先后用500mL，250mL预冷的无菌水洗菌体，离心去上清液，用20mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5mL预冷的山梨醇悬浮，作为感受态细胞用于电击转化。

大量抽提工业酒精生产酵母整合表达载体pYEI-ap，加入5g纯化的pYEI-ap于50μl工业酒精生产酿酒酵母825感受态细胞中，冰浴5min，用Bio-Rad GenePulser电击仪电击，参数为2.5Kv，25μF。电击结束后立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YNBG-G418(YNBG培养基中补加2.5mg/mL抗生素G418(购自Sigma公司)，良好生长的菌落通过酵母菌落PCR的方法鉴定转化子，阳性重组工业酒精生产酵母用于酸性蛋白酶发酵试验和酒精发酵试验。

重组工业酒精生产酵母的酸性蛋白酶发酵CICIM MMY0034(CCTCC M206009)：将获得的重组菌与酿酒酵母825 CICIMY0070分别接种于50mL YPD培养基中，30℃、220r/min剧烈振荡培养48-60h，离心取上清测定酸性蛋白酶酶活，测得重组菌表达酸性蛋白酶活性为6.5U/ml，而酿酒酵母825CICIMY0070在此条件下不表达酸性蛋白酶活性。

重组工业酒精生产酵母的酒精发酵CICIM MMY0034(CCTCC M206009)：接一环菌于10mL YPD中，220r/min，30℃，2h；30℃静止培养24h。按10％接种量接种于玉米粉培养基(玉米粉过40-60目筛，按1∶4料水比加入自来水，按6-8u/g加入中温α-淀粉酶，80-85℃保温40min-1h，降温至50-60℃，HCl调酸至pH 4.5，加糖化酶150-200u/g)。30℃，静止培养60h，从12小时开始取样测定酒精度(取100mL醪液加100mL水混合均匀，在500mL蒸馏瓶中蒸馏，接馏出液80mL左右，自来水补足100mL后，用酒精计和温度计同时测酒精度和温度，查表并换算成20℃时的酒精度)。重组工业酒精生产酵母CICIM MMY0034(CCTCC M206009)在相同时段均比对照酿酒酵母825CICIMY0070的酒精度要高，在20h左右时，酒精度比对照高出1.6％，相对提高20％以上，发酵周期缩短38％。

Claims (6)

1. 一种高发酵速率的重组酒精酵母，其命名为Saccharomyces cerevisiaeCICIM MMYOO34，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M206009，实现了酸性蛋白酶基因ap在其中的表达。

2. 如权利要求1所述的重组酒精酵母CCTCC M206009的制备方法，其特征是在表达载体pYEI-222的下游克隆入酸性蛋白酶基因ap，获得能在酒精酵母中表达酸性蛋白酶基因的重组质粒pYEI-ap，将重组表达质粒pYEI-ap依据同源重组原理，通过电转化的方法，将酸性蛋白酶基因ap整合到酒精酵母染色体中，获得重组酒精酵母CCTCC M206009。

3. 如权利要求1或2中所述的重组酒精酵母CCTCC M206009中表达的酸性蛋白酶基因ap的获得方法，其特征是，以丝状真菌染色体DNA或总RNA为模板，以一对特异性引物介导，采用PCR技术克隆出其中的酸性蛋白酶基因；人工设计并合成的用于酸性蛋白酶基因ap克隆和表达的引物，引物的特征序列为：

An-Ap1：acatgaattc atggtcgtct tcagcaaaac cgctgccctc

An-Ap2：gtgagaattc tttttttttt ttttt

Af-Ap1：acatgaattc atggctccat tcacgtttct ggtagggata

Af-Ap2：gtgagaattc tcatggggta cttgaaacac tcgtggccaa t

Ao-Ap1：acatgaattc atgatgcggg gcgcatctct cctaccagtt

Ao-Ap2：gtgagaattc ttacaaagca agaagaagac cagcacccgc a

Mp-Ap1：acatgaattc atggtcgtct tcagcaagat caccgccgtt

Mp-Ap2：gtgagaattc ttacaaagca agaagaagac cagcacccg

Nc-Ap1：acatgaattc atgtcttcga ttctttgtca agatgaagac

Nc-Ap2：gtgagaattc tcacaacccc aaaaccacc

Rm-Ap1：acatgaattc atgctcttct ctcagattac ttctgcgatc

Rm-Ap2：gtgagaattc ttactcgttt tcataagccg aggccaaagg tgc

其中单划线为人工引入的EcoR I限制性酶切位点；

所述的丝状真菌为黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉、红曲霉、粗糙脉孢霉或雪白根霉。

4. 如权利要求2中所述的能在酵母中分泌表达外源基因的表达载体pYEI-222，其核甘酸序列为：

gatccctatt ttcgaggacc ttgtcacctt gagcccaaga gagccaagat ttaaattttc   60

ctatgacttg atgcaaattc ccaaagctaa taacatgcaa gacacgtacg gtcaagaaga  120

catatttgac ctcttaacag gttcagacgc gactgcctca tcagtaagac ccgttgaaaa  180

gaacttacct gaaaaaaacg aatatatact agcgttgaat gttagcgtca acaacaagaa   240

gtttaatgac gcggaggcca aggcaaaaag attccttgat tacgtaaggg agttagaatc   300

attttgaata aaaaacacgc tttttcagtt cgagtttatc attatcaata ctgccatttc   360

aaagaatacg taaataatta atagtagtga ttttcctaac tttatttagt caaaaaatta   420

gccttttaat tctgctgtaa cccgtacatg cccaaaatag ggggcgggtt acacagaata   480

tataacatcg taggtgtctg ggtgaacagt ttattcctgg catccactaa atataatgga   540

gcccgctttt taagctggca tccagaaaaa aaaagaatcc cagcaccaaa atattgtttt   600

cttcaccaac catcagttca taggtccatt ctcttagcgc aactacagag aacaggggca   660

caaacaggca aaaaacgggc acaacctcaa tggagtgatg caacctgcct ggagtaaatg   720

atgacacaag gcaattgacc cacgcatgta tctatctcat tttcttacac cttctattac   780

cttctgctct ctctgatttg gaaaaagctg aaaaaaaagg ttgaaaccag ttccctgaaa   840

ttattcccct acttgactaa taagtatata aagacggtag gtattgattg taattctgta   900

aatctatttc ttaaacttct taaattctac ttttatagtt agtctttttt ttagttttaa   960

aacaccaaga acttagtttc gaataaacac acataaacaa acaaaggatccaaacgatga   1020

gatttccttc aatttttact gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta gctgctccag  1080

tcaacactac aacagaagat gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc atcggttact  1140

cagatttaga aggggatttc gatgttgctg ttttgccatt ttccaacagc acaaataacg  1200

ggttattgtt tataaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa ggggtatctc  1260

tagaattcga gctcccgggt accatggcat gctaattaga tagagcagag aggacggatt  1320

tcctgaagga aatccgtttt tttattttgc ccgtcttata ataaccaatt ctgattagaa  1380

aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata  1440

tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat  1500

ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa  1560

tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc  1620

cggtgagaat ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt  1680

acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg  1740

agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa  1800

ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc  1860

taatacctgg aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg  1920

agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct  1980

gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc  2040

tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc  2100

gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga  2160

gcaagacgtt tcccgttgga tctctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc  2220

tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga  2280

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag  2340

tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac  2400

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca  2460

tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc  2520

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg  2580

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt  2640

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa  2700

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct  2760

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc  2820

cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg  2880

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct  2940

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag  3000

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga  3060

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga  3120

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg  3180

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag  3240

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag  3300

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat  3360

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct  3420

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac  3480

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa  3540

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg  3600

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt  3660

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca  3720

ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt  3780

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct  3840

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg  3900

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg  3960

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg  4020

cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa  4080

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt  4140

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt  4200

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt  4260

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca  4320

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat  4380

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 4440

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcaagaatt aattctcatg tttgacagct 4500

tatcatcgat aagctgactc atgttggtat tgtgaaatag acgcagatcg ggaacactga 4560

aaaataacag ttattattcg                                            4580。

5. 根据权利要求4所述的表达载体pYEI-222，其特征在于：

含有一个在酵母中具有功能的启动子序列P_GPD，此序列同时具有外源基因在酵母染色体DNA中进行整合和基因拷贝数扩增的功能，含有一个在酵母中具有功能的信号肽序列S_MFα，及含有一个供外源基因克隆的多克隆位点，含有一个人工转录终止序列T_art，含有一个在酵母中进行克隆选择的遗传标记Km^R；

启动子序列P_GPD及外源基因在酵母染色体DNA中进行整合和基因拷贝数扩增序列，从6位到1005位；

信号肽序列S_MFα，从1006位到1258位；

多克隆位点，从1259位到1284位，其中安排有Xbal，EcoRI，SacI，SmaI，KpnI酶切位点，相对应的序列分别为tctaga、gaattc、gagctc、cccggg、ggtacc；

人工转录终止序列T_art，从1289位到1357位，其核苷酸序列如下：1289 ta attagataga gcagagagg

ga

tttttta ttttgcccgt cttataa 1357；

其中，单下划线核苷酸序列为终止密码子，双下划线和波浪线核苷酸序列为镜像互补序列；

克隆选择的遗传标记卡那霉素抗性Km^R，从1358位到2173位。

6. 如权利要求4所述的表达载体pYEI-222的构建方法，其特征是：

A)所使用的引物序列如下：

引物P1：cgagatctct attttcgagg accttgtcac

引物P2：

tttgtttgtt tatgtgtgtt

引物P3：

ttataagacg ggcaaaata

引物P4：

taaccaa ttctgattag aaa

引物P5：tttagatcta acgggaaacg tcttgct

引物P6：aacagatctc tgcctcgcgc gtttcggtga t

引物P7：tcgagatctc gaataataac tgttattttt ca

单下划线部分为人工引入的限制性酶切位点；双划线部分为人工引入的便于片段与片段拼接的序列；

B)人工合成S_MFα，在合成的过程中同时引入多克隆位点和转录终止序列T_art及与编码G418抗性基因同源的部分序列；

C)以酿酒酵母染色体DNA为模板，P1和P2为引物，PCR扩增出1.0kb的DNA片段P_GPD，并通过P1和P2在扩增出的DNA片段的一端引入BglII酶切位点，另一端引入与S_MFα部分同源序列便于以下的操作；其PCR扩增条件为95℃5min；再94℃30s，56℃30s，72℃1min经35次循环；72℃10min；

D)以C)扩增出的DNA片段P_GPD及B)合成的S_MFα为模板，P1和P3为引物，通过这两段DNA片段两端人工引入的同源序列经cross-over PCR将这两段DNA片段拼接起来，获得DNA片段P_GPD-S_MF；PCR拼接条件是95℃5min；再94℃30s，56℃30s，72℃1min 30s经35次循环；72℃10min；

E)以载体pSKsymΩKm为模板，P4和P5为引物PCR扩增出编码G418抗性基因Km^R，其片段一端引入与人工合成的S_MFα部分同源序列，另一端引入BglII酶切位点；其PCR扩增条件是95℃5min；再94℃30s，56℃30s，72℃1min经35次循环；72℃10min；

F)以扩增出的DNA片段Km^R和P_GPD-S_MFα为模板，P1和P5为引物，通过这两段DNA片段两端同源序列经cross-over PCR将这两段DNA片段拼接起来，获得DNA片段P_GPD-S_MFα-Km^R；其PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min经35次循环；72℃10min；

G)以pBR322为模板，P6和P7为引物，反向聚合酶链反应扩增得到2.4kb的DNA片段pBR322’，pBR322’的PCR扩增条件是95℃5min；再94℃30s，58℃30s，72℃2min30s经35次循环；72℃10min；pBR322’含有大肠杆菌的复制原点及氨苄青霉素抗性，并在其两端设计有BglII的酶切位点；

H)将F)及G)扩增产物P_GPD-S_MFα-Km^R和pBR322’分别用BglII酶切，在T₄连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，获得在酵母中能表达的载体pYEI-222。

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