CN102286389A

CN102286389A - 一种直接从淀粉酿制啤酒的方法及其专用酵母

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Publication number: CN102286389A
Application number: CN2011102157583A
Authority: CN
Inventors: 王正祥; 左志锐; 石贵阳; 樊游; 杨华
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2011-07-29
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-07-29
Also published as: CN102286389B

Abstract

本发明涉及一种直接从淀粉酿制啤酒的方法及其专用啤酒酵母的构建。以10%~12%淀粉为主料，经淀粉糊化液化、脱色后添加0.03%~0.07%酒花，煮沸后添加0~2%大麦麦芽接入专用啤酒酵母，10~11℃、pH5.5~6.0，保温发酵1~2周后出酒。其所用的专用啤酒酵母是通过细胞表面工程方法将来源于米根霉的真菌α-淀粉酶基因与酿酒酵母α凝集素基因融合转化啤酒酵母所得的，其表达的淀粉酶基因不向培养介质分泌，而是与α凝集素形成异源融合蛋白附着在酵母细胞表面，运用此专用啤酒酵母减少了原料糖化环节，极大程度上改善了传统糖化过程不足、降低了啤酒生产的成本。

Description

一种直接从淀粉酿制啤酒的方法及其专用酵母

技术领域

本发明涉及一种用液化淀粉直接酿制啤酒的方法及其专用酵母细胞，属于基因工程和啤酒酿造技术领域。

背景技术

传统啤酒是以大麦芽为主要原料，添加啤酒花，用啤酒纯种酵母进行发酵而生产的一种低酒精度的饮料，之所以用大麦芽为主要原料是因为大麦芽含有供酵母进行新陈代谢所需要的营养成分；且大麦芽含有复杂而又丰富的酶体系可将原料中的淀粉转化为能被酵母利用的可发酵糖类。由于世界啤酒生产量的连年攀升，麦芽需求量急剧增加。选择大麦以外的其他原料作为啤酒生产辅料或主要原料来代替大麦具有重要意义，而淀粉作为啤酒行业的主要辅料，价格低廉，是一种很有潜力的生物资源。

啤酒酵母缺少淀粉水解酶类活力，在生长过程中不能利用淀粉，所以在传统的发酵过程中需要添加麦芽（含有丰富的β-淀粉酶和α-淀粉酶）和/或α-淀粉酶和糖化酶对淀粉质原料（包括麦芽中的淀粉）进行预处理，处理后的麦芽糖/葡萄糖浆方可被酿酒酵母利用。因此，在啤酒酵母中导入外源淀粉酶水解酶类编码基因，赋予其淀粉水解能力对实现酿酒酵母的同步液化-糖化-发酵、增加底物利用率具有重要意义。

细胞表面工程是一种利用细胞内蛋白转运到膜表面的机制和原理，把异源蛋白展示在细胞表面的生物工程技术，在保持被展示蛋白或多肽的生物活性的基础上，将其固定于细胞表面，其原理是将目的蛋白基因序列与定位序列融合后导入微生物宿主细胞，通过定位序列使目标蛋白定位于细胞表面进行表达。本发明所用的定位序列为酿酒酵母细胞α凝集素序列，该表面展示技术具有对环境无不良影响、能使真核蛋白进行有效的分泌和折叠、发酵过程不再需要添加相关外源酶制剂等优点。

本发明用淀粉基本代替或完全代替大麦生产啤酒，淀粉类型不受限制，可以大大节约原料及工艺成本，有着无限的发展前景。本发明构建了稳定的含外源淀粉酶基因的啤酒酵母菌株，且淀粉酶活位于啤酒酵母细胞表面，采用液化淀粉为主要原料，接种该专用的啤酒酵母利用淀粉生产啤酒。

发明内容

本发明目的之一是提供利用专用啤酒酵母基因工程菌直接从液化淀粉发酵生产啤酒的制备方法。

本发明目的之二是提供具有米根霉来源的真菌α-淀粉酶酶活的专用啤酒酵母的构建方法。

将来源于米根霉的真菌α-淀粉酶克隆入表达载体pMGK，将来源于酿酒酵母的α凝集素片段置于真菌α淀粉酶基因下游构建重组表达载体，然后导入啤酒酵母S26中，通过G418抗性平板筛选阳性克隆；将重组菌分别在摇瓶、1 L、15 L罐直接利用淀粉发酵生产啤酒。

本发明的技术方案：

1.构建细胞表面具有米根霉真菌α-淀粉酶酶活的专用啤酒酵母

将来源于米根霉的α-淀粉酶编码基因，命名为rRoamy，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，来源于酿酒酵母的α凝集素编码基因，命名为AG，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4，分别与克隆载体pMGK组成的重组质粒pAA-AG转化入啤酒酵母S26，使其细胞表面具有真菌α-淀粉酶的酶活。该专用啤酒酵母已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2011219。

专用啤酒酵母CCTCC NO：M 2011219的构建，按如下步骤进行：

（1）以米根霉为原料，提取其总RNA，以此为模板，在逆转录酶的作用下，合成一链cDNA。根据已公布的米根霉α-淀粉酶基因序列设计一对引物，以一链cDNA为模板PCR扩增含自身信号肽的完整α-淀粉酶基因rRoamy，其基因编码为：SEQ ID NO: 1（Li S, etal. Appl Biochem Biotechnol.2011.）。

所述PCR扩增所用引物为：

AA-F：5’-GCGGGATCCATGAAGTCTTTCTTAAGTCT-3’ ，

AA-R：5’-CACGTCGACTTAGTTCTTTTGGAATATGG-3’ ；

其中在上游引物AA-F的5’端具有BamHI限制性内切酶识别位点，下游引物的AA-R 5’端具有SalI限制性内切酶识别位点。

（2）以酿酒酵母S26染色体为模板，根据已公布的α凝集素序列设计一对引物，通过PCR扩增获得α凝集素基因AG，其基因编码为：SEQ ID NO: 4。

所述PCR扩增所用的引物为：

AG-F：5’-CCGGTCGACAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3’ ，

AG-R：5’-CCGGTCGACTTTGATTATGTTCTTTCTAT-3’ ；

（3）将质粒pMGK (Zhong-Peng Guo,Gui-Yang Shi. Yeast. 2010)和片段rRoamy分别用限制酶BamHI和SalI进行双酶切，36~38℃反应过夜，然后分别将酶切产物纯化；再将两者混合，用T₄DNA连接酶在3~5℃反应14~16 h，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组质粒pMGK-rRoamy，将该重组质粒和片段AG分别用限制性内切酶SalI进行酶切，将酶切产物纯化，混合，连接；转化大肠杆菌JM109获得重组质粒pAA-AG。

（4）将重组质粒pAA-AG用SacII线性化后用醋酸锂完整细胞转化方法转化入啤酒酵母S26，转化后的菌液涂布于G418抗性浓度为30 μg/mL的选择培养基平板，30℃培养3~5 d，筛选获得含有重组质粒pAA-AG的专用啤酒酵母，即CCTCC NO：M 2011219。

所述的啤酒酵母S26醋酸锂完整细胞转化用试剂：TE溶液(10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA，pH 8.0)；1.0 mol/L醋酸锂；50% w/v PEG(聚乙二醇)3350；10×TE(100 mM Tris-HCl，pH 8.0；10 mM EDTA，pH 8.0)；鲑鱼精单链DNA(2 mg/mL)；无菌水。

所述的醋酸锂完整细胞转化法如下：

① 接种啤酒酵母S26的单菌落于2 mL液体YPD培养基（酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%）中，于28℃恒温摇床，培养过夜；转接至2 mL液体YPD培养基中28℃培养14~20 h。

② 5000 r/min离心5 min收集菌体；加入500 μL 0.1 mol/L LiAc(1体积10×TE，1体积1.0 mol/L LiAc，8体积无菌超纯水)洗涤，离心，弃上清。

③ 按下列顺序加入“转化混合液”：

240 μL PEG3350，

36 μL 1.0 mol/L LiAc，

25 μL 鲑鱼精单链DNA，

50 μL 无菌水和质粒pAA-AG，

剧烈振荡反应管直到细胞完全混均，置28℃温育1~1.5 h；

所述鲑鱼精单链DNA购自sigma公司。

④ 置42℃水浴热激20~25 min；待降至室温后离心，除去转化混合液，加200 μL无菌水悬浮；将悬浮液涂布于G418抗性浓度为30 μg/mL的YPD固体平板（2%蛋白胨，2%葡萄糖，1%酵母粉，1.5%琼脂粉）， 30℃培养3~5 d，筛选获得含有重组质粒pAA-AG的重组酵母。

（5）将所得的重组酵母接种5 mL YPD培养收集菌体，测定全细胞酶活，结果如图2所示，重组菌直接利用淀粉产生的还原糖与DNS（3,5-二硝基水杨酸）反应，在碱性环境中由黄色变为桔红色。

2、利用所述的重组专用啤酒酵母利用液化淀粉直接发酵生产啤酒的方法：

（1）所述专用啤酒酵母在11~20℃时具有的真菌α-淀粉酶活力。

在pH 5.0条件下，分别在4~70℃温度下测定酶活力，以最高酶活力为100%计算相对酶活力（见附图3）。结果显示，11~20℃时专用啤酒酵母CCTCC NO：M 2011219酶活力仍保留40%~60%，可以用于啤酒生产。

（2）所述专用啤酒酵母在11~20℃时利用淀粉能力。

接种一定量的种子于YPS培养基（YNB（无氨基酵母氮源） 0.34%，硫酸铵1%，可溶性淀粉2%），考察其淀粉利用能力。结果如图4所示，啤酒酵母S26不能利用淀粉，而专用啤酒酵母4 d可以消耗约87.5%的淀粉，说明该专用啤酒酵母能很好的利用淀粉。

（3）所述专用啤酒酵母CCTCC NO：M 2011219用于以淀粉为主要原料的啤酒发酵。

①种子培养：将4℃保藏的CCTCC NO：M 2011219菌活化后，逐级放大培养：原种进行斜面活化，为一级种子；一级种子再次斜面活化，25℃，3~4 d作为二级种子；二级种子在10 mL液体试管25℃培养3~4 d，作为三级种子；三级种子在100 mL培养瓶中25℃培养24~36 h，作为四级种子；四级种子在1 L培养瓶20℃培养24~36 h作为种子。

所述斜面培养时培养基为YPD固体，用液体试管、培养瓶培养时所用培养基均为12°麦汁。

②原料处理：配制质量分数为12%~30%的淀粉乳，用碳酸钠调pH至6.2~6.5，加入氯化钙（淀粉干重的0.2%），加入高温α-淀粉酶（12~20 U/g淀粉）。剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15 min，再加热至90℃，维持30 min，控制 DE值为15~18，碘试反应呈棕红色。液化后的醪液经活性炭脱色脱味、静置过滤、添加使体系质量分数0.03%~0.07%酒花后100℃煮沸60 min后输送至发酵罐中。

③发酵培养：按照6%~10%的体积比将步骤①获得的四级种子液接种到装有10 L发酵培养基的15 L发酵罐中，在10~11℃、pH 5.5~6.0，保温发酵1~2周后出酒。

所述的发酵培养基的组成以质量浓度计为：步骤②中获得的淀粉醪液，同时添加0~2%大麦麦芽。

本发明的有益效果：本发明获得的专用啤酒酵母可直接利用液化淀粉转化为酵母可利用的麦芽糖，再发酵生产啤酒。本发明将真菌α-淀粉酶固定于啤酒酵母S26细胞表面，酶活稳定性好，可重复利用。本发明用淀粉代替了麦芽用量，可以大大节约啤酒生产成本，同时在啤酒酿造过程中省去了糖化步骤，在工艺上都节约了生产成本。

本发明的另一个有益效果：本专用啤酒酵母的构建方法同样适用于具有β-淀粉酶的重组啤酒酵母的构建，并且该分泌β-淀粉酶的重组啤酒酵母可以完全替代分泌真菌α-淀粉酶的重组啤酒酵母。

生物材料样品保藏：将基因rRoamy，AG与克隆载体pMGK组成的重组质粒pAA-AG转化啤酒酵母，得到啤酒酵母转化子，分类命名为酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）HH20110601，已保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2010年6月26日，保藏编号CCTCC NO：M 2011219。

附图说明

图1重组质粒的pAA-AG物理图谱。

图2重组啤酒酵母的细胞表面酶活力测定。

图3重组啤酒酵母随温度变化的相对酶活。

图4重组啤酒酵母利用淀粉能力。

图5 利用淀粉生产啤酒的工艺流程图。

具体实施方式

实施例1真菌α-淀粉酶的提取

用十六烷基三甲基溴化铵法提取的米根霉RNA，以此为模板，在逆转录酶的作用下，合成一链cDNA。根据米根霉α-淀粉酶基因序列（GenBank登录号：H M 234170）设计引物，以一链cDNA为模板PCR扩增含自身信号肽的完整α-淀粉酶基因rRoamy，其基因编码为：SEQ ID NO: 1。

所述PCR扩增所用的引物为：

AA-F：5’-GCGGGATCCATGAAGTCTTTCTTAAGTCT-3’，

AA-R：5’-CACGTCGACTTAGTTCTTTTGGAATATGG-3’ ；

其中在上游引物AA-F的5’端具有BamHI限制性内切酶识别位点，下游引物AA-R的 5’端具有SalI限制性内切酶识别位点。

PCR扩增程序为：94℃ 5 min和30轮94℃变性30 s、54℃退火1 min、并在72℃延伸2 min，然后是72℃最后延伸10 min。

PCR扩增采用50 μL体系：聚合酶pfu 0.5 μL，聚合酶缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，引物AA-F和AA-R（25 μmol）各0.5 μL，模板cDNA 0.2 μL，用双蒸H₂O 补足至50 μL。

所述逆转录酶、限制性内切酶BamHI、SalI均购自大连宝生物公司。

实施例2 酿酒酵母α凝集素的提取

用酶裂解法提取啤酒酵母S26染色体，以此为模板，根据酿酒酵母α凝集素（GenBank登录号：X16861）设计引物，经过PCR克隆扩增获得α凝集素基因AG，其基因编码为：SEQ ID NO: 4。

所述PCR扩增所用引物为：

AG-F：5’-CCGGTCGACAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3’，

AG-R：5’-CCGGTCGACTTTGATTATGTTCTTTCTAT -3’；

上下游引物均引入SalI酶切位点。

PCR扩增程序为：94℃ 5 min和30轮94℃变性30 s、56℃退火1 min、并在72℃延伸2 min，然后是72℃最后延伸10 min。

PCR扩增采用50 μL体系：聚合酶pfu 0.5 μL，聚合酶缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，引物AG-F和AG-R（25 μmol）各0.5 μL，模板染色体 0.2 μL，用双蒸H₂O 补足至50 μL。

实施例3 专用啤酒酵母的构建

将质粒pMGK用BamHI和SalI双酶切后与同样酶切的基因rRoamy连接，转化大肠杆菌JM109获得重组质粒pMGK-rRoamy；将该重组质粒用SalI酶切后与同样酶切的基因AG连接，转化大肠杆菌JM109获得重组质粒pAA-AG。

用醋酸锂完整细胞转化法将所得的重组质粒pAA-AG转入啤酒酵母S26，用G418抗性30 μg/mL的YPD平板筛选转化子。为研究淀粉酶基因是否锚定在啤酒酵母表面，将所得的重组酵母接种于50 mL YPD，28~30℃静置培养2 d，离心收集菌体，用所得的全细胞测量酶活如图2所示，重组菌直接利用淀粉产生的还原糖与DNS（3,5-二硝基水杨酸）反应，在碱性环境中由黄色变为桔红色。

实施例4 重组专用啤酒酵母性能

将重组专用啤酒酵母接种于5 mL YPD培养收集菌体，在pH 5.0条件下，分别在4~70℃温度下测定酶活力，以最高酶活力为100%计算相对酶活力（见附图3）。结果显示真菌α-淀粉酶的酶活力在11~20℃时，专用啤酒酵母仍保留40%~60%的最高酶活力，适合用于啤酒生产。

将重组专用啤酒酵母和出发菌株接种于YPS培养基，至10~11℃静置培养，考察菌株淀粉残存。结果如图4所示，啤酒酵母S26不能利用淀粉，而专用啤酒酵母4 d可以消耗约87.5%的淀粉，说明该专用啤酒酵母能很好的利用淀粉，在此温度下可直接用于淀粉啤酒发酵。

实施例5 利用重组专用啤酒酵母直接发酵液化淀粉生产啤酒

传统啤酒生产以麦芽为主要原料，生产须经原料粉碎，糊化，液化，糖化等生产过程，将原料中的淀粉转化为酵母可利用的发酵糖。本发明利用重组专用啤酒酵母可直接将液化淀粉转化为麦芽糖，继而被酵母利用发酵生产啤酒，省去了糖化过程。生产工艺见附图5。

淀粉生产所用原料是以液化淀粉为主料进行啤酒生产。

（1) 将淀粉原料进行糊化液化

配制12%~30%的淀粉乳，用碳酸钠调pH至6.2~6.5，加入氯化钙（淀粉干重的0.2%），加入高温α-淀粉酶（12~20 U/g淀粉）。剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15 min，再加热至90℃，维持30 min，控制 DE值为15~18，碘试反应呈棕红色。液化后的醪液经静置（或过滤）、添加0.03%~0.07%酒花后100℃煮沸60 min后输送至发酵罐中。

所述高温α-淀粉酶购自江苏奥谷生物科技有限公司。

（2）专用啤酒酵母种子液的制备

将4℃保藏的CCTCC NO：M 2011219菌活化后，逐级放大培养：原种进行斜面活化，为一级种子；一级种子再次斜面活化，25℃，3~4 d作为二级种子；二级种子在10 mL液体试管25℃培养3~4 d，作为三级种子；三级种子在100 mL培养瓶中25℃培养24~36 h，作为四级种子；四级种子在1 L培养瓶20℃培养24~36 h作为种子。

所述斜面培养时培养基为固体YPD，用液体试管、培养瓶培养时所用培养基均为12°麦汁。

（3）利用专用啤酒酵母发酵生产啤酒

在1~15 L发酵罐中加入液化淀粉0~2%大麦麦芽，pH5.5。按6%~10%接种量将酵母种子接入以液化淀粉为主要原料的发酵醪中，自然发酵7~14 d，发酵主酵温度为10~11℃，发酵结束后过滤，取样测定相应参数。

经以上工序生产的啤酒，其理化指标为：酒精含量（重量计）3.5%；淀粉原料实际发酵（重量计）56%；总酸度2.5。

经以上工序生产的啤酒，经标准的三杯评比试验，本发明制备的啤酒具有典型的啤酒风味；啤酒泡沫细腻，泡持性适中。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他在任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 江南大学

<120> 一种直接从淀粉酿制啤酒的方法及其专用酵母

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> α-淀粉酶基因（rRoamy）

<400> 1

atgaagtctt tcttaagtct cctttgcagc gtcttccttt tacccttagt cgtacaatct 60

gtgcctgtca tcaagcgagc ctcggccagc gactgggaga acagagtcat ttaccaattg 120

ttaactgatc gatttgcaaa atcgactgat gataccaatg gctgctctaa cctgagtgat 180

tactgtggcg gaacatttca aggaatcatt aatcacttgg attacattgc cggaatggga 240

tttgatgcta tctggatatc acctatcccc aaaaatgtga atggaggtta ccatggctat 300

tgggcttctg acttttctca aataaatgag cattttggaa ctgctgatga cttgaaaaag 360

ttggttgcgg ctgctcatgc aaagaacatg tacgttatgc tggacgttgt tgctaatcat 420

gctggcactc cttcatcagg cggcgactat tctggctaca cgttcggtca aagctctgaa 480

taccacagag cctgtgatat caattacaac gaccagaact ctattgaaca gtgctggatt 540

tctggtttgc ctgatatcaa cactgaagac tcggccattg ttagcaaatt gaattcgatt 600

gtttctggtt gggtatctga ctatggcttt gatggtcttc gaatcgatac tgtgaagcac 660

gttcgtaaag atttctggga tggttatgtc tctgctgctg gtgtatttgc taccggagaa 720

gtgcttagcg gcgatgtttc ttatgtctca ccctatcagc agcatgttcc ttctttaatc 780

aactatccat tgtattatcc agtctatgat gtattcacca aatcccgtac catgagccgt 840

ttaagttctg gcttttctga tattaaaaat ggaaacttta aaaacattga tgtcttggtc 900

aactttattg acaatcacga tcaacctcgc ttgttatcca aagctgatca aagtctcgtc 960

aagaatgctc ttgcttattc tttcatggtc caaggtatcc ctgtcttgta ctatggtaca 1020

gagcaatctt tcaagggtgg taacgatcca aacaacagag aggtcttatg gaccactggt 1080

tactcgacca cgtctgatat gtacaagttt gtcactactc ttgtcaaggc acgcaagggc 1140

tcaaactcca cagtaaatat gggaattgct caaaccgata acgtctatgt gttccaaaga 1200

ggcggctctc tggttgttgt caacaactat ggtcaaggat caacaaacac aattactgta 1260

aaggctggct cgttctctaa tggagatact ttgactgatg tgttctccaa caaatctgtt 1320

actgttcaaa ataatcagat cacattccaa ttgcagaatg gaaaccctgc catattccaa 1380

aagaactaa 1389

<210> 2

<211> 29

<212> 人工序列

<213> AA-F

<400> 2

5’-GCGGGATCCATGAAGTCTTTCTTAAGTCT-3’

<210> 3

<211> 29

<212> 人工序列

<213> AA-R

<400> 3

5’-CACGTCGACTTAGTTCTTTTGGAATATGG-3’

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 1409

<212> DNA

<213> α凝集素基因（AG）

<400> 4

agcgccaaaa gctcttttat ctcaaccact actactgatt taacaagtat aaacactagt 60

gcgtattcca ctggatccat ttccacagta gaaacaggca atcgaactac atcagaagtg 120

atcagtcatg tggtgactac cagcacaaaa ctgtctccaa ctgctactac cagcctgaca 180

attgcacaaa ccagtatcta ttctactgac tcaaatatca cagtaggaac agatattcac 240

accacatcag aagtgattag tgatgtggaa accattagca gagaaacagc ttcgaccgtt 300

gtagccgctc caacctcaac aactggatgg acaggcgcta tgaatactta catcccgcaa 360

tttacatcct cttctttcgc aacaatcaac agcacaccaa taatctcttc atcagcagta 420

tttgaaacct cagatgcttc aattgtcaat gtgcacactg aaaatatcac gaatactgct 480

gctgttccat ctgaagagcc cacttttgta aatgccacga gaaactcctt aaattccttc 540

tgcagcagca aacagccatc cagtccctca tcttatacgt cttccccact cgtatcgtcc 600

ctctccgtaa gcaaaacatt actaagcacc agttttacgc cttctgtgcc aacatctaat 660

acatatatca aaacggaaaa tacgggttac tttgagcaca cggctttgac aacatcttca 720

gttggcctta attcttttag tgaaacagca ctctcatctc agggaacgaa aattgacacc 780

tttttagtgt catccttgat cgcatatcct tcttctgcat caggaagcca attgtccggt 840

atccaacaga atttcacatc aacttctctc atgatttcaa cctatgaagg taaagcgtct 900

atatttttct cagctgagct cggttcgatc atttttctgc ttttgtcgta cctgctattc 960

taaaacgggt actgtacagt tagtacattg agtcgaaata tacgaaatta ttgttcataa 1020

ttttcatcct ggctcttttt ttcttcaacc atagttaaat ggacagttca tatcttaaac 1080

tctaataata cttttctagt tcttatcctt ttccgtctca ccgcagattt tatcatagta 1140

ttaaatttat attttgttcg taaaaagaaa aatttgtgag cgttaccgct cgtttcatta 1200

cccgaaggct gtttcagtag accactgatt aagtaagtag atgaaaaaat ttcatcacca 1260

tgaaagagtt cgatgagagc tactttttca aatgcttaac agctaaccgc cattcaataa 1320

tgttacgttc tcttcattct gcggctacgt tatctaacaa gaggttttac tctctcatat 1380

ctcattcaaa tagaaagaac ataatcaaa 1409

<210> 5

<211> 30

<212> 人工序列

<213> AG-F

<400> 5

5’-CCGGTCGACAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3’

<210> 6

<211> 29

<212> 人工序列

<213> AG-F

<400> 6

5’-CCGGTCGACTTTGATTATGTTCTTTCTAT-3’

Claims

1.一种专用啤酒酵母，命名为酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）HH20110601，已保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2011219。

2.根据权利要求1所述的专用啤酒酵母，其特征在于所具有的米根霉真菌α-淀粉酶酶活位于啤酒酵母S26细胞的表面，是通过基因工程技术实现的。

3.权利要求1所述的专用啤酒酵母的制备方法，其步骤为：

（1）以米根霉为原料，提取其总RNA，以此为模板，在逆转录酶的作用下，合成一链cDNA，根据已公布的米根霉真菌α-淀粉酶基因序列设计一对引物，以一链cDNA为模板PCR扩增含自身信号肽的完整α-淀粉酶基因rRoamy，其基因编码为：SEQ ID NO: 1；

所述PCR扩增所用的引物为：

AA-F：5’-GCGGGATCCATGAAGTCTTTCTTAAGTCT-3’ ，

AA-R：5’-CACGTCGACTTAGTTCTTTTGGAATATGG-3’ ；

其中在上游引物AA-F的5’端具有BamHI限制酶识别位点，下游引物AA-R的5’端具有SalI限制酶识别位点；

（2）以酿酒酵母S26染色体为模板，根据已公布的α凝集素序列设计一对引物，通过PCR扩增获得α凝集素基因AG，其基因编码为：SEQ ID NO: 4；

所述PCR扩增所用的引物为：

AG-F：5’-CCGGTCGACAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3’，

AG-R：5’-CCGGTCGACTTTGATTATGTTCTTTCTAT-3’ ；

其中在上下游引物的5’端均具有SalI限制酶识别位点；

（3）将质粒pMGK和片段rRoamy分别用限制酶BamHI和SalI进行双酶切，36~38℃反应过夜，然后分别将酶切产物纯化；再将两者混合，用T₄DNA连接酶在3~5℃反应14~16 h，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组质粒pMGK- rRoamy，将该重组质粒和片段AG分别用限制性内切酶SalI进行酶切，将酶切产物纯化，混合，连接；转化大肠杆菌JM109获得重组质粒pAA-AG；

（4）将重组质粒pAA-AG用SacII线性化后用醋酸锂完整细胞转化法转化入啤酒酵母S26，转化后的菌液涂布于G418抗性浓度为30 μg/mL的YPD平板，30℃培养3~5 d，筛选获得含有重组质粒pAA-AG的专用啤酒酵母，即CCTCC NO：M 2011219。

4.用权利要求1所述的专用啤酒酵母酿制啤酒的方法，其特征在于啤酒酿制主要原料为淀粉，少用或不用麦芽；原料溶液中淀粉质量浓度为10%~12%，液化后添加酒花使其体系质量分数为0.03%~0.07%，大麦麦芽质量分数为0~2%，然后接入6%-10%专用啤酒酵母CCTCC NO：M 2011219，通过该专用啤酒酵母直接转化为麦芽糖，最终发酵形成啤酒。