CN111662933B - 一种利用重组酵母进行高支链淀粉酒精发酵的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用重组酵母进行高支链淀粉酒精发酵的方法，属于发酵工程技术领域。本发明以高支链淀粉为原料，以酿酒酵母CCTCC NO:2011219为菌种进行酒精发酵。本发明发酵完毕后残糖接近于0.2%以下，发酵过程不需要添加普鲁兰酶等淀粉支链水解酶，采用该方法可以缩短发酵时间并降低发酵终点的残糖。

Description

一种利用重组酵母进行高支链淀粉酒精发酵的方法

技术领域

本发明涉及一种利用重组酵母进行高支链淀粉酒精发酵的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

以酵母发酵生产酒精时，由于酵母一般只能利用单糖或二糖，因此往往首先用淀粉酶将淀粉水解为短链糊精，随后接种酵母进行发酵，在发酵液中一般需要加入糖化酶以水解糊精为葡萄糖供酵母发酵利用。以玉米淀粉等支链度低的淀粉为原料时一般只要使用糖化酶就可以将原料绝大部分水解供酵母利用，最终残糖接近于零。在使用支链度较高的淀粉，如木薯淀粉等为原料时一般还需要添加普鲁兰酶等淀粉支链水解酶以充分水解原料，或者增加糖化酶的用量，利用糖化酶本身具有的较弱的水解a-1,6-糖苷键的能力以充分水解原料，否则发酵终点时会留下大量残糖，导致原料利用不充分，影响酒精产量，也带来环境问题。

酿酒酵母CCTCC NO: 2011219是前期工作中构建的一株重组酵母，具有产淀粉酶的能力，但并未发现这种淀粉酶具有水解支链淀粉中的a-1,6 糖苷键的能力，而且这种酵母的酒精发酵时间很长。研究中发现，以酿酒酵母CCTCC NO: 2011219进行酒精发酵时如果采用特殊的工艺条件，仍可以在不使用支链水解酶的情况下使残糖降低到0.2%以下，发酵时间控制在48小时以内。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种利用重组酵母进行高支链淀粉酒精发酵的方法，以酿酒酵母CCTCC NO: 2011219为菌种以高支链淀粉为原料发酵酒精时加快发酵进程。

本发明的技术方案，一种利用重组酵母进行高支链淀粉酒精发酵的方法，以高支链淀粉为原料，以酿酒酵母CCTCC NO: 2011219为菌种进行酒精发酵时加快发酵进程。

以高支链淀粉为原料，首先用中温淀粉酶将淀粉液化，控制DE在5%~6%，接种菌种酿酒酵母CCTCC NO: 2011219，0~16 h发酵温度控制在38℃，16 h后发酵温度控制在32℃。其具体工艺为：

（1）发酵液的制备：为便于实际应用时进行换算，以下以制备1 L发酵液进行叙述。在2L大烧杯中加入高支链淀粉200g，加水至总体积约为0.9L，用HCl或NaOH调整pH至6.0-6.5，加中温淀粉酶200 U，搅拌混合。上述装有淀粉悬液的烧杯放入沸水浴中加热，持续快速搅拌，加热同时检测淀粉悬液温度，当温度达到65 ℃左右时淀粉开始糊化，淀粉液变得粘稠，迅速将烧杯取出放入另一个70℃的水浴锅中保温并搅拌，一般保温4-6min左右淀粉液粘度开始下降，再保温4-6min左右淀粉液的粘度应该有比较明显的下降。取出烧杯，加入盐酸调整pH至3.8-4.2，在沸水浴中加热至接近100℃维持30min灭活淀粉酶。检测淀粉液DE值，这时的DE值一般在5%以下，用NaOH调整pH至5.8-6.2，再添加中温淀粉酶10 U，在65℃保温，间隔10min检测还原糖计算DE值，当DE值达到5%-6%时加入玉米浆干粉15g，尿素0.5-2g，混匀，再用盐酸调整pH至4.0-4.3，加入糖化酶0.1mL(共计10000U)。以上为配制完成的发酵液，由于操作过程水分蒸发，总体积一般在0.8-0.85 L，转入发酵罐中。

转入预先培养成熟的酵母种子液100 mL，根据实际体积适当补水至总体积为1 L。在上一步骤加入糖化酶后需要在1 h内开始发酵过程。

（2）酵母种子液采用如下方法制备：发酵液的制备方法同上，但液化时控制液化液DE值在20%左右﹙18%-22%﹚。在500mL三角瓶中加入发酵液100mL，接种斜面培养活化的酿酒酵母CCTCC NO: 2011219一环，用铝箔封口，摇瓶机转速控制在60-100r/min左右，以保证菌体悬浮。一般培养36h，以酒精含量达到2%左右为种子成熟的标志。

（3）酒精发酵过程：发酵温度控制在38℃，搅拌转速65 r/min，打开发酵罐出气口，不开进气，主要依靠发酵产生的CO₂维持罐压在0.1 MPa。维持发酵16 h。16 h后改变发酵温度为32℃，整个发酵过程间隔12 h检测酒精变化。

采用上述方法进行酒精发酵，一般在发酵48 h时，酒精达到最高水平，一般在11.6%左右，残糖在0.2%以下。

所述酿酒酵母CCTCC NO: 2011219已经公开（王正祥, 左志锐, 石贵阳, 樊游,杨华. 一种直接从淀粉酿制啤酒的方法及其专用酵母. 发明方法: ZL201110215758.3），在该方法申请时，上述菌种已经保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO: 2011219。该菌种在中国高校工业微生物资源信息中心（http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn）也进行了保藏，保藏编号：CICIM Y7079。

活化菌种用的斜面培养基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂粉1.5%，自然pH。

淀粉液化液DE值检测方法同文献(孟悦,王英哲, 田志刚 等. 玉米粉制备葡萄糖的糖化工艺优化. 食品研究与开发,2019, 40(18): 97-101 )

高支链淀粉为保龄宝生物股份有限公司生产的蜡质玉米淀粉，玉米浆干粉为山东无棣波皓生物科技有限公司产品，中温淀粉酶购自江苏锐阳生物技术有限公司，为10000U/mL产品。糖化酶购自江苏锐阳生物技术有限公司，为100000 U/mL产品。其余均为普通化学或生化试剂购自国药集团上海化学试剂公司。

本发明的有益效果：本发明是针对以重组酿酒酵母CCTCC NO: 2011219为菌种以高支链淀粉为原料发酵制备酒精建立的发酵方法，采用该方法可以缩短发酵时间并降低发酵终点的残糖。

具体实施方式

通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1： 5L发酵罐发酵

（1）发酵液的制备：在2L大烧杯中加入蜡质玉米淀粉200g，加水至总体积约为0.9L，用HCl或NaOH调整pH至6.0-6.5，加中温淀粉酶200 U，搅拌混合。上述装有淀粉悬液的烧杯放入沸水浴中加热，持续快速搅拌，加热同时检测淀粉悬液温度，当温度达到65℃左右时淀粉开始糊化，淀粉液变得粘稠，迅速将烧杯取出放入另一个70℃的水浴锅中保温并搅拌，一般保温5min左右淀粉液粘度开始下降，再保温5min左右淀粉液的粘度应该有比较明显的下降。取出烧杯，加入盐酸调整pH至4.0左右，在沸水浴中加热至接近100 ℃维持30min灭活淀粉酶。检测淀粉液DE值，这时的DE值一般在5%以下，用NaOH调整pH至6.0左右，再添加中温淀粉酶10 U，在65℃保温，间隔10 min检测还原糖计算DE值，当DE值达到5%-6%时加入玉米浆干粉15 g，尿素2 g，混匀再用盐酸调整pH至4.0-4.3，加入糖化酶0.1 mL(10000U)。以上为配制完成的发酵液，配制发酵液时如果采用手工配制，由于淀粉液化前期液体的粘度很大，因此单份体积以1 L为比较合适，体积过大时搅拌有困难。一般共计准备三份，由于操作过程水分蒸发，总体积一般在2.5-2.6 L，转入发酵罐中。

转入预先培养成熟的酵母种子液300 mL，根据实际体积适当补水至总体积为3 L。

（2）酵母种子液采用如下方法制备：发酵液的制备方法同上，但液化时间延长，一般控制液化液DE值在20%左右。在500 mL三角瓶中加入发酵液100 mL，接种斜面培养活化的酿酒酵母CCTCC NO: 2011219一环，用铝箔封口，摇瓶机转速控制在80转/min左右，以保证菌体悬浮。一般培养36 h，以酒精含量达到2%左右为种子成熟。实际操作时一般先培养酵母种子液，在种子液即将成熟时准备发酵罐发酵液。

（3）酒精发酵过程：发酵温度控制在38 ℃，搅拌转速65 r/min，打开发酵罐出气口，不开进气，主要依靠发酵产生的CO₂维持罐压在0.1 MPa。维持发酵16 h。16 h后改变发酵温度为32 ℃，整个发酵过程间隔12 h检测酒精变化。

采用上述方法进行酒精发酵，共计进行3次发酵，发酵终点均为48 h时，酒精达到最高水平，酒分分别为11.6%、11.8%、11.4%，平均为11.6%，残糖约为0.2%。

实施例2 以其它酵母为菌种的发酵

分别以酒精工业生产菌酿酒酵母CICIM Y0086（简写为86#）和构建本发明使用的菌种酿酒酵母CCTCC NO: 2011219的宿主菌啤酒酵母S26（简写为S26）为菌种按本发明方法发酵，结果如表1所示。

表1 其它菌种用本发明方法的发酵结果

注：下文中酒精酒分，酒精产量均指发酵液中酒精的体积百分比%V/V。整个发酵过程间隔12 h检测酒精，酒精最高点为发酵终点。

由表1可见，以其它非重组酵母按本发明方法进行发酵会形成大量的残糖，酒精最终产量也不高。由于蜡质玉米淀粉含有很高的直链度，因此会留下大量无法分解的极限糊精，酵母无法利用导致酒精产量较低。

酵母的酒精发酵温度一般以30 ℃为合适，进一步全程采用28 ℃、30 ℃和32℃进行发酵，结果显示，到达发酵终点的时间均为60 h，酒分有所提高但均为超过9%，残糖均在4g/L以上。全长采用酵母最适温度有利于酒精度的提高，但原料利用率依然很低。

进一步采用提高液化程度的方法进行试验，即延长淀粉酶作用时间，使液化液的DE值分别达到20%，30%和40%。其中液化程度为DE值达到20%和30%的样品其发酵时间在56h，酒分分别为9.3%和9.4%，残糖在2.5%左右。DE值为40%的样品其发酵时间为56小时，酒分分别达到10.2%和9.6%，残糖大约为2%左右，可见提高液化程度有利于降低残糖，但发酵时间延长。

所述啤酒酵母S26是构建重组酵母CCTCC NO: 2011219时使用的宿主菌，有关信息已经公开（王正祥, 左志锐, 石贵阳, 樊游, 杨华. 一种直接从淀粉酿制啤酒的方法及其专用酵母. 发明发明: ZL201110215758.3），该菌种在中国高校工业微生物资源信息中心也进行了保藏，保藏编号：CICIM Y7080。

酒精工业生产菌酿酒酵母 CICIM Y0086（简写为86#），由中国高校工业微生物资源信息中心提供，相关信息已经公开（陈献忠, 肖艳, 沈微, 樊游. 表面展示表达果胶酶的重组酿酒酵母构建及乙醇发酵. 微生物学报, 2016, 56(6): 922-931）。

实施例3 采用其它工艺的发酵

表2 酵母CCTCC NO: 2011219采用不同方法的发酵结果

由表2可见，采用28 ℃、30 ℃、32 ℃和38 ℃进行发酵均会留下比较多的残糖，酒精产量也不高。进一步改变淀粉液化程度进行试验，结果显示，当液化DE达到30%全程发酵温度为28、30、32℃时，终点酒分最高可以达到10.2-10.6%，残糖1.5%以上。当液化DE值达到40%，则残糖可以达到1.3%-1.6%，酒精产量在10.5%以下，发酵时间延长至56小时。采用本发明所述先用38 ℃发酵再用32 ℃则酒精产量均低于28 ℃、30 ℃和32 ℃的情况，本实施例方法残糖均在2%以上。

综上所述，以高支链淀粉为原料、以酿酒酵母CCTCC NO: 2011219为菌种进行酒精发酵，如果以本发明的方法进行发酵液制备和发酵，则发酵终点残糖较低、酒精产量较高。同时发酵液制备不需要添加淀粉支链水解酶、也不需要增加糖化酶的使用量。

Claims (3)

1.一种利用重组酵母进行高支链淀粉酒精发酵的方法，其特征在于：以20%的高支链淀粉为原料，以酿酒酵母CCTCC NO: 2011219为菌种进行酒精发酵；淀粉液化液DE值控制在5%~6%，发酵48h；当0-16h发酵温度控制在38℃，16h后发酵温度控制在32℃；以制备1L发酵液为例，具体步骤如下：

（1）在2L大烧杯中加入高支链淀粉200g，加水至总体积为0.9L，用HCl或NaOH调整pH至6.0-6.5，加中温淀粉酶200U，搅拌混合；

（2）步骤（1）所得装有淀粉悬液的烧杯放入沸水浴中加热，持续快速搅拌，加热同时检测淀粉悬液温度，当温度达到65 ℃时淀粉开始糊化，淀粉液变得粘稠，迅速将烧杯取出放入70℃的水浴锅中保温并搅拌，保温8-12min；

（3）取出烧杯，加入盐酸调整pH至3.8-4.2，在沸水浴中加热，维持30min灭活淀粉酶；

（4）检测淀粉液DE值，用NaOH调整pH至5.8-6.2；再添加中温淀粉酶10U，在65℃保温，间隔10min检测还原糖计算DE值；当DE值达到5%-6%时加入玉米浆干粉15g，尿素0.5-2g，混匀，再用盐酸调整pH至4.0-4.3，加入糖化酶0.1mL共计10000U；转入发酵罐中；

（5）转入预先培养成熟的酵母种子液100mL，根据实际体积适当补水至总体积为1 L；加入糖化酶后需要在1 h内开始发酵过程。

2.根据权利要求1所述利用重组酵母进行高支链淀粉酒精发酵的方法，其特征在于所述酵母种子液制备方法如下：

（1）制备发酵液，液化时控制液化液DE值在18%-22%；

（2）在500mL三角瓶中加入步骤（1）制备所得发酵液100mL，接种斜面培养活化的酿酒酵母CCTCC NO: 2011219一环，用铝箔封口，摇瓶机转速控制在60-100r/min，以保证菌体悬浮；培养36h，以酒精含量达到2%为种子成熟的标志；

（3）酒精发酵：发酵温度控制在38℃，搅拌转速65r/min，打开发酵罐出气口，不开进气，依靠发酵产生的CO₂维持罐压在0.1 MPa，维持发酵16 h；16 h后改变发酵温度为32℃，整个发酵过程间隔12h检测酒精变化。

3.根据权利要求2所述利用重组酵母进行高支链淀粉酒精发酵的方法，其特征在于：所述活化菌种用的斜面培养基具体组成为：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂粉1.5%，自然pH。