CN113278536A - 低产正丙醇马克斯克鲁维酵母及其在清香型小曲白酒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株低产正丙醇酵母，其分类命名为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Y245，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年3月15日，保藏编号为CCTCC NO：M2021225；将该酵母应用于清香型小曲原酒生产中，其中酒体中正丙醇含量比生产对照组降低39.85％，且生产出的小曲原酒清香纯正，入口爽净，香味协调，风格典型。

Description

低产正丙醇马克斯克鲁维酵母及其在清香型小曲白酒中的 应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，是低产正丙醇马克斯克鲁维酵母及其在清香型小曲白酒中的应用。

背景技术

正丙醇为含有三个碳原子的一元醇，属于高级醇的一种，是白酒中含量较高的风味物质。其适度的含量对于提升白酒的风味和口感具有重要的贡献，但较高浓度的正丙醇会导致原酒味苦，口感不协调。因此，在各香型白酒国标中都对正丙醇的含量作了严格限制，杜绝超标。目前国内外对于白酒中正丙醇产生的代谢机制开展了较多研究，初步得知正丙醇主要通过发酵菌种的苏氨酸代谢、丙酸代谢和2-甲基苹果酸代谢途径产生，参与代谢的微生物主要包括酵母菌、乳杆菌和芽孢杆菌等。这为白酒行业控制正丙醇含量奠定了理论基础。

结合酿造实践，在清香型小曲白酒生产中随着发酵时间的延长，原酒中正丙醇生成量越多，这在因春节放假导致发酵期延长的原酒中得到证实。为了降低长时间发酵原酒中正丙醇含量，研究人员从工艺方面开展了较多工作，包括调节配糟酸度、降低入池温度、减少酒曲用量以及“掐头去尾”等，但效果往往不稳定。刘念等通过在传统小曲酒生产加曲环节添加当归、苍术和熟地来降低发酵过程中正丙醇的生成，具有一定降低正丙醇效果(专利申请号： 201310113341.5)，但添加的中草药具有一定成本，且中草药的添加可能会对小曲白酒的整体风格产生一定影响。肖冬光等采用基因工程手段敲除酿酒酵母高丝氨酸脱氢酶基因THR6来实现低产正丙醇的目的(专利申请号： 202010933724.7)，在液态发酵法白酒中具有明显的效果，但在固态白酒中效果未知。且采用基因工程手段获得的菌种应用于白酒生产中，目前市场消费者不容易接受。因此，从自然界筛选低产正丙醇酵母菌株是一个安全、有效的解决策略。是降低清香型小曲白酒正丙醇含量的一个重要途径，对于提升清香型白酒品质具有重要的意义。

发明内容

本发明旨在为降低清香型小曲原酒中正丙醇的含量而提供一株低产正丙醇酵母，同时将该酵母应用于清香型小曲原酒生产工艺过程中，从而降低小曲原酒中正丙醇含量，提升原酒品质。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：低产正丙醇酵母马克斯克鲁维酵母，其分类命名为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Y245，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2021年3月15日，保藏编号为CCTCC NO：M2021225。

低产正丙醇酵母在清香型小曲原酒生产中的应用，其特征在于：包括以下步骤：

种曲的制备：将糯米浸泡后磨浆，与糯米粉、米糠及上一轮种曲混合均匀后，手工制成曲坯，将曲坯放入培养室充分培养后烘干，即得种曲；

酵母培养基的制备：使用80℃-90℃的热水溶解糖蜜，并向其中加热浓硫酸，静置12h后取上层清液加入发酵罐中，并调节糖度至10-15BX；之后称取营养盐、酵母浸粉和消泡剂倒入发酵罐中，加水至罐容积的60％-80％，开启搅拌使其完全溶解，灭菌冷却，即得酵母培养基；

纯种麸皮酵母的制备：称取麦芽浸粉加水溶解制成麦芽浸粉溶液，将保藏编号为CCTCC NO.M2021225的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus) Y245投入麦芽浸粉溶液中，在摇床中培养20-36h；之后将马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus)Y245接入装有酵母培养基的发酵罐中，设置发酵罐的培养参数，培养22-24h，再接种到经过灭菌的麸皮培养基中，培养34-40 h，干燥后制成纯种麸皮酵母；

土曲的制备：将土粉碎后过筛，与米糠、种曲及根霉混合，加水搅拌均匀后制成球形曲坯，在培养室中培养后烘干至含水量≤5％，即得土曲；

桂花曲的制备：将纯种麸皮酵母与土曲以及根霉混合均匀，即得桂花曲；

清香型小曲原酒的制备：糯高粱经70℃-80℃水浸泡16-18h后，采用球锅带压蒸粮，熟粮摊凉降温至22℃-26℃，按重量比1％的接种量加入桂花曲，将桂花曲与粮食搅拌均匀，而后输送至密封糖化间进行培菌糖化，控制温度为22℃ -24℃，上中下粮层温差不超过2℃，经培菌糖化22-24h，按照粮:糟重量比为 1:2添加配糟，混匀后即得入池醅，入池醅温度为10℃-14℃，将入池醅运至恒温发酵间，发酵间温度为20℃-23℃，发酵周期为15天，蒸馏，即得清香型小曲原酒。

优选的是，所述酵母培养基的制备步骤中，糖蜜与热水的比例为糖蜜:热水＝1:2。

优选的是，所述酵母培养基的制备步骤中，营养盐包括硫酸铵、尿素、磷酸二氢铵和硫酸镁。

优选的是，所述纯种麸皮酵母的制备步骤中,麦芽浸粉溶液浓度为10g/L。

优选的是，所述纯种麸皮酵母的制备步骤中，发酵罐的培养参数为，溶氧量40％-50％、pH＝3-5、转速100-500rpm、温度32℃-37℃。

优选的是，所述土曲的制备步骤中，各组分比例为：土:米糠:种曲:根霉＝290:50:5:1。

优选的是，所述桂花曲的制备步骤中，各组分比例为：纯种麸皮酵母:土曲: 根霉＝3:1:6。

本发明产生的有益效果是：采用低产正丙醇的马克斯克鲁维酵母进行清香型小曲原酒的生产，有效降低了清香型小曲原酒中的正丙醇含量，减少酒的苦味，是最终生产出的小曲原酒清香纯正，入口爽净，香味协调，风格典型。并且采用传统人工手段选育相应酵母，无需通过基因工程方式进行酵母改造，技术难度低，便于操作；选育出的酵母在合适的培育环境下可以长期使用，大大降低了生产成本。

附图说明

图1为马克思克鲁维酵母的形态示意图。

具体实施方式

本发明提供的低产正丙醇酵母，其分类命名为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)Y245，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年3月15日，保藏编号为CCTCC NO：M2021225。

在使用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Y245前首先要对酵母菌株进行分离及鉴定。

分离时使用的YPD琼脂培养基组分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉20g/L；混合后进行121℃灭菌20min后即得YPD琼脂培养基。

称取发酵车间采集的发酵中期酒醅5g，放入盛有95mL无菌水并带有玻璃珠的250mL三角瓶中，200rpm振摇30min，使酒醅与水充分混合，制成菌悬液。从三角瓶中吸取1mL菌悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，制成10^-1稀释度的酒醅菌悬液，按照同样的方法以此类推分别制成10^-2、10^-3和10^-4稀释度的酒醅菌悬液。然后分别从10^-1、10^-2、10^-3和10^-4稀释度试管中吸取0.2mL酒醅溶液放入制备好的无菌YPD平板中，每个梯度设置两个平行，用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，静置20-30min，使菌液渗入培养基表层内，然后将平板倒置于30℃培养箱中培养。培养24-48h后，用无菌接种环把平板上的单个菌落挑出，划线接种于另一个空白YPD平板上，继续培养。经过2-3次平板划线后得到初步纯化的菌落转入YPD斜面试管低温保存，最终共挑出Y241、Y242 及Y245三种菌株。

把挑出的三种菌株纯菌落以及对照酒曲分别接种在盛有10mL YPD液态培养基的无菌试管中，30℃、140rpm震荡培养两天制成酵母菌液备用。称取2kg 的高粱，润洗三遍后，进行泡粮，设置培养箱温度为60℃，泡粮时间24h。第二天泡粮结束后，将高粱放入蒸汽灭菌锅内进行初蒸，设置温度为121℃，时间为30min。初蒸完，进行焖粮，水温85℃，时间30min，然后再对高粱进行复蒸，温度为115℃，时间为15min。蒸粮完毕后，把粮食放在无菌操作间进行降温，待降到合适温度后，取灭过菌的10L发酵袋进行高粱分装。完成每袋分装1050g后，每袋添加酵母菌液10mL及5g根霉，摇匀后放置在30℃培养箱中进行糖化。糖化24h后，称取2kg配糟进行高压灭菌，灭菌条件采取121℃， 30min。灭菌后采用自然冷却的方式进行降温。配糟温度降到30℃左右时即可与糖化样品按照重量比1:1进行混合发酵。发酵7天后，采用小型蒸馏装置蒸馏发酵酒醅，取前100mL蒸馏液进行气相色谱法测定正丙醇含量。色谱检测条件为：Agilent 780A气相色谱仪，检测器FID，CP-WAX毛细管色谱柱(50m*0.2 μm*0.25mm)。升温程序：柱温40℃保持8min，以5℃/min升至150℃。进样口温度250℃，检测器温度260℃，空气:氢气流速比300:30，载气为氮气，分流比30:1，柱流量1.0mL/min，进样方式：自动进样器。检测结果如表1。

表1

从表1可知，菌株Y245参与发酵原酒中产正丙醇最低，为0.29g/L，远低于目前车间实际生产的原酒正丙醇含量。也低于优级酒标准限量(优级酒正丙醇指标≤1.5g/L)。因此菌株Y245初步判定为筛选的目的菌株。

筛选到的编号为Y245酵母菌落特征为：白色，表面光滑，呈圆形突起，菌落较大，菌落直径d＝3.5mm，形态如图1。

将筛选出的低产正丙醇酵母Y245进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物扩增菌株的ITS序列，经凝胶电泳检测与进一步测序对比，确定菌种的种属，结果种名为马克斯克鲁维酵母。

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Y245的ITS序列为

AATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTCCTTTACTACATGGATATCTG TGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTTAAAATCTCGACCCTTTGGAAGAGATGTATTTATT AGATAAAAAATCAATGTCTTCGGACTCCTTGATGATTCATAATAACTTTTCGAATCGCATG GCCTTGTGCTGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAG TGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGC CTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTAA TTCAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACGATACAGGGCCCATTCGGGTCTTGTAATTGGAA TGAGTACAATGTAAATACCTTAACGAGGAACAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCA GCCGCGGTAATTCCAGCTCCAGTAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTA GTTGAACTTTGGGTCTGGTTGGCCGGTCCGATTTTATGTCGCGCACTGGTTTTCAACCGG ATCTTTCCTTCTGGCTAACCTGTACTCCTTGT

实施例

种曲的制备

将60kg糯米浸泡5-8h，磨浆，在米浆中加入过20目筛的糯米粉30kg、米糠2kg和上一轮母曲0.5kg，搅拌均匀后，再手工制成直径为6-8cm的半球形曲坯，将曲坯排列于培养室内的木箱上，曲坯间距为2cm，盖上竹垫；培养室温度控制在30℃-32℃，当曲坯品温升至35℃，揭去竹垫子；继续培养至曲坯品温至25℃-28℃，然后将其在35℃下烘干，此曲坯即为种曲；

酵母培养基的制备

称取糖蜜50kg，加入85℃的热水100L，搅拌至糖蜜溶解得到溶液，再加入0.1L的浓硫酸，搅拌均匀后静置12小时，将上层清液加至1000L发酵罐中，并补水调节糖蜜培养基的糖度为10-15BX；分别称取硫酸铵0.3kg、尿素 0.15kg、磷酸二氢铵0.15kg、硫酸镁0.15kg、酵母浸粉0.3kg和消泡剂1.5 kg倒入发酵罐中，加水至罐容积的60％-80％，开启搅拌使营养盐完全溶解，灭菌冷却，即得酵母培养基；

纯种麸皮酵母的制备

称取麦芽浸粉20g，用2L水溶解后，分装至1000mL的三角瓶中，每瓶装液量500mL，灭菌备用；将保藏编号为CCTCC NO.M2021225的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)Y245试管纯培养物接入三角瓶中，30℃、140 rpm摇床培养20-36h；将培养Y245的三角瓶接入装有的酵母培养基的发酵罐中，设置发酵罐的溶氧量45％、pH＝3-5、转速为100-500rpm、35℃培养22h，再接种到经过灭菌的麸皮培养基中，30℃培养36h，干燥后即制得纯种麸皮酵母；

土曲的制备

将土粉碎后过14目筛，所述土产地为湖北大冶，米糠过16目筛，将种曲碾碎后过20目筛，先将种曲与米糠混合搅拌均匀，加入土和根霉搅匀，所述土、米糠、种曲与根霉的重量分别为145kg、50kg、5kg与0.5kg，得混合料；加水至混合料中，使混合料中的含水量为50％；搅匀后将混合料制成直径为7-9 cm的球形曲坯，将制好的曲坯整齐摆放置于培养室内的培养箱中，在曲坯上铺竹垫，控制培养室的温度为28℃-30℃之间，培养16-20h后；检查培养箱内曲坯的温度，当曲坯品温升至30℃-35℃时，揭开竹垫，撑起培养箱；待曲坯品温降至室温时，将曲坯捡出，曲坯相互之间不能挤压，继续培养7天；培养结束后，将曲坯置于烘房内于35℃-40℃下烘干至含水量≤5％，即制得土曲；

桂花曲的制备

称取步骤(2)制备的纯种麸皮酵母30kg，步骤(3)制备的土曲10kg，以及根霉60kg混合均匀，制成桂花曲；

清香型小曲原酒的制备

将1000kg糯高粱经70℃-80℃水浸泡16-18h后，采用球锅带压蒸粮，熟粮经摊凉机降温至22℃-26℃，采用加曲机按重量比1％的接种量加入桂花曲10 kg，经绞龙将曲与粮食搅拌均匀，而后经板链输送至密封糖化间进行培菌糖化，控制入箱温度为22℃-24℃，上中下粮层温差不超过2℃，经培菌糖化22-24h，按照粮：糟重量比为1:2添加配糟2000kg，混匀后即得入池醅，入池醅温度为 10℃-14℃，以1m³不锈钢槽车作为入池醅发酵容器，经叉车转运至恒温发酵间，发酵间温度为20℃-23℃，发酵周期为15天，蒸馏，即得清香型小曲原酒；对比例

使用同期生产的未使用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Y245 制作的桂花曲生产的清香型小曲原酒。

对实施例及对比例中制作的清香型小曲原酒中的组分含量进行检测，最终检测结果如表2

表2

样品	得酒率	乙醛(g/L)	甲醇(g/L)	正丙醇(g/L)
					实施例	61.17％	0.29	0.16	0.80
对比例	60.84％	0.26	0.17	1.33

由图表中的检测数据可以看出，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Y245参与发酵进行制作的清香型小曲原酒的得酒率、乙醛及甲醇含量与现有酒曲制作的清香型小曲原酒差别较小，但最终酒体中的正丙醇含量比现有酒曲制作的清香型小曲原酒降低39.85％，有效解决了原酒味苦，口感不协调的问题；使原酒清香纯正，入口爽净，香味协调，风格典型。

综上所述，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，但上述优选实施例并非用以限制本发明，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求界定的范围为准。

Claims (8)

1.低产正丙醇酵母马克斯克鲁维酵母，其分类命名为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Y245，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年3月15日，保藏编号为CCTCC NO：M2021225。

2.如权利要求1所述的低产正丙醇酵母在清香型小曲原酒生产中的应用，其特征在于：包括以下步骤：

种曲的制备：将糯米浸泡后磨浆，与糯米粉、米糠及上一轮种曲混合均匀后，手工制成曲坯，将曲坯放入培养室充分培养后烘干，即得种曲；

酵母培养基的制备：使用80℃-90℃的热水溶解糖蜜，并向其中加热浓硫酸，静置12h后取上层清液加入发酵罐中，并调节糖度至10-15BX；之后称取营养盐、酵母浸粉和消泡剂倒入发酵罐中，加水至罐容积的60％-80％，开启搅拌使其完全溶解，灭菌冷却，即得酵母培养基；

纯种麸皮酵母的制备：称取麦芽浸粉加水溶解制成麦芽浸粉溶液，将保藏编号为CCTCCNO.M2021225的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Y245投入麦芽浸粉溶液中，在摇床中培养20-36h；之后将马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Y245接入装有酵母培养基的发酵罐中，设置发酵罐的培养参数，培养22-24h，再接种到经过灭菌的麸皮培养基中，培养34-40h，干燥后制成纯种麸皮酵母；

土曲的制备：将土粉碎后过筛，与米糠、种曲及根霉混合，加水搅拌均匀后制成球形曲坯，在培养室中培养后烘干至含水量≤5％，即得土曲；

桂花曲的制备：将纯种麸皮酵母与土曲以及根霉混合均匀，即得桂花曲

清香型小曲原酒的制备：糯高粱经70℃-80℃水浸泡16-18h后，采用球锅带压蒸粮，熟粮摊凉降温至22℃-26℃，按1％的接种量加入桂花曲，将桂花曲与粮食搅拌均匀，而后输送至密封糖化间进行培菌糖化，控制温度为22℃-24℃，上中下粮层温差不超过2℃，经培菌糖化22-24h，按照粮:糟重量比为1:2添加配糟，混匀后即得入池醅，入池醅温度为10℃-14℃，将入池醅运至恒温发酵间，发酵间温度为20℃-23℃，发酵周期为15天，蒸馏，即得清香型小曲原酒。

3.根据权利要求2所述低产正丙醇马克斯克鲁维酵母及其在清香型小曲白酒中的应用，其特征在于：所述酵母培养基的制备步骤中，糖蜜与热水的比例为糖蜜:热水＝1:2。

4.根据权利要求1所述所述低产正丙醇马克斯克鲁维酵母及其在清香型小曲白酒中的应用，其特征在于：所述酵母培养基的制备步骤中，营养盐包括硫酸铵、尿素、磷酸二氢铵和硫酸镁。

5.根据权利要求1所述所述低产正丙醇马克斯克鲁维酵母及其在清香型小曲白酒中的应用，其特征在于：所述纯种麸皮酵母的制备步骤中,麦芽浸粉溶液浓度为10g/L。

6.根据权利要求1所述低产正丙醇马克斯克鲁维酵母及其在清香型小曲白酒中的应用，其特征在于：所述纯种麸皮酵母的制备步骤中，发酵罐的培养参数为，溶氧量40％-50％、pH＝3-5、转速100-500rpm、温度32℃-37℃。

7.根据权利要求1所述低产正丙醇马克斯克鲁维酵母及其在清香型小曲白酒中的应用，其特征在于：所述土曲的制备步骤中，各组分比例为：土:米糠:种曲:根霉＝290:100:10:1。

8.根据权利要求1所述低产正丙醇马克斯克鲁维酵母及其在清香型小曲白酒中的应用，其特征在于：所述桂花曲的制备步骤中，各组分比例为：纯种麸皮酵母:土曲:根霉＝3:1:6。

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