CN105524850A - 酵母菌株的扩培方法以及生产乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酵母菌株的扩培方法，该方法包括：在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行至少一级培养，得到酵母培养液A，然后再将酵母培养液A在作物秸秆液化液中进行至少一级培养，得到酵母种子扩培液。本发明还提供了一种利用酵母发酵生产乙醇的方法，该方法包括：将酵母种子活化液按照如上所述的方法进行扩培；将得到的扩培液接入到乙醇发酵培养基中进行发酵。通过上述技术方案，所得到的酵母种子扩培液的活性得到了明显的提高，另外，采用本发明的方法，即使酵母种子活化液分别在淀粉质原料糖化液和作物秸秆液化液中进行多级扩培后，所得酵母种子的活性仍然能够保持在较高的水平，从而有效地提高了乙醇的发酵水平。

Description

酵母菌株的扩培方法以及生产乙醇的方法
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体地，涉及一种酵母菌株的扩培方法，以及利用酵母发酵生产乙醇的方法。
背景技术
目前，诸多如石油等不可再生的化石能源日益枯竭，使得可再生能源特别是生物燃料受到越来越多的关注，并带来了巨大的商机和社会意义。
乙醇是清洁的可再生液体燃料，许多国家已经开始使用添加了一定比例乙醇的汽油—汽油醇，以代替汽油的消耗。这种新型燃料既能缓解石油的消耗速率，又可以减少汽车尾气污染，具有极大的应用和发展潜力。我国从2001年起开始推广使用汽油醇，目前汽油醇占汽油类燃料总消耗量的约20％，并处于逐年增长的势头。
目前国内外生产乙醇所使用的主要原料是玉米等粮食作物。随着世界人口的不断增长，粮食日益短缺，因此从长远来看，粮食作物不是生产乙醇的理想原料。
生物质能源是未来能源领域中一种重要的可再生能源。近年来，世界各国都在大力开发综合利用生物质的相关技术，并在利用生物质生产燃料乙醇、生物柴油、生物氢气、生物沼气等方面取得了一定的成果，今后生物质能源的相关技术仍是各国研究与开发的热点。我国具有丰富的生物质资源，据统计，我国每年仅秸秆的产量即可达7亿吨，这之中蕴藏了极为可观的生物质能源，仍需进一步的开发与利用。
目前，采用生物质发酵的方式生产乙醇的相关技术，即将生物质中的木质纤维素发酵，进而生产乙醇的相关技术，已形成了一定的产业化规模。但普遍存在以下问题：1)现有方法扩培的酵母菌株的方法生产成本高，得到的酵母扩培液的酵母活性较差，从而使得乙醇的发酵水平较差；2)现有扩培方法对酵母菌株进行多级扩培后酵母的活性会大大降低。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种能够提高扩培后酵母活性并且能够进行多级扩培的酵母菌株的扩培方法，以及由此能够提高乙醇发酵水平的利用酵母生产乙醇的方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种酵母菌株的扩培方法，该方法包括：在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行至少一级培养，得到酵母培养液A，然后再将酵母培养液A在作物秸秆液化液中进行至少一级培养，得到酵母种子扩培液。
优选地，在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行培养的条件包括：以淀粉质原料糖化液的总体积为基准，上一级培养所得培养液的接种量为3-10体积％；培养的温度为28-33℃，pH值为4.5-5.5，通气量为0.5-0.7体积:体积·分钟，转速为250-350rpm，时间为10-14小时；
其中，在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行一级培养时，接种的为所述酵母种子活化液。
优选地，在作物秸秆液化液中对酵母培养液A进行培养的条件包括：以作物秸秆液化液的总体积为基准，上一级培养所得培养液的接种量为3-10体积％；培养的温度为28-33℃，通气量为0.08-0.12体积:体积·分钟，转速为200-300rpm，时间为10-20小时；
其中，在进行一级培养时，接种的为所述酵母培养液A。
优选地，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株424A(LNH—ST)。
另一方面，本发明提供了一种利用酵母发酵生产乙醇的方法，该方法包括：(1)将酵母种子活化液按照如上所述方法进行扩培；(2)将步骤(1)中得到的扩培液接入到乙醇发酵培养基中进行发酵。
通过上述技术方案，先将酵母菌株在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行至少一级培养，然后再在作物秸秆液化液中进行至少一级培培，所得到的酵母种子扩培液的活性得到了明显的提高。另外，采用本发明的方法，即使对酵母种子活化液分别在淀粉质原料糖化液和作物秸秆液化液中进行多级扩培后，所得酵母种子的活性仍然能够保持在较高的水平，从而有效地提高了乙醇的发酵水平。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种酵母菌株的扩培方法，该方法包括：在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行至少一级培养，得到酵母培养液A，然后再将酵母培养液A在作物秸秆液化液中进行至少一级培养，得到酵母种子扩培液。
本发明主要在于淀粉质原料糖化液和作物秸秆液化液的结合使用，从而有效地进行菌株的增殖以及强化，不但提高了酵母的繁殖速度，还缩短了扩培周期，并且相比于现有技术，还有效地降低了扩培培养基中乙酸(酵母的抑制物)的浓度，降低了乙酸对酵母的毒害作用。将如此扩培后的酵母种子接种至乙醇发酵培养基中，能够大大提高乙醇的发酵水平。
根据本发明，所述淀粉质原料糖化液中葡萄糖的浓度的可选范围较宽，可以为常规的用于酵母扩培的葡萄糖浓度，只要不影响酵母的生长繁殖以及正常的代谢活动即可。优选的，在本发明的淀粉质原料糖化液中，葡萄糖的含量为15-25g/L。
根据本发明，所述淀粉质原料糖化液的制备方法可以采用本领域公知的淀粉质原料糖化液中的制备方法，例如，可以包括将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。优选地，所述粉碎使淀粉质原料过30目筛的通过率大于75％，更优选过30目筛的通过率为100％。所述调浆的方法为本领域技术人员所熟知，但优选地，所述调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为9-17Bé°。术语“波美度”是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数。
根据本发明，所述第一次水解中，以每克粉碎后的产物的干重计，所述淀粉酶的用量可以为10-30酶活力单位，所述酶解的温度可以为88-92℃，所述酶解的时间可以为90-120分钟，所述酶解的pH值可以为5.5-6.0。所述固液分离的条件没有特别的限定，优选地，所述固液分离的条件使得到的液相组分中的固含量为19-22重量％，更优选为20-21重量％。
根据本发明，所述第二次水解中，以每克液相组分计，所述糖化酶的用量可以为110-130酶活力单位，所述酶解的温度为可以55-65℃，所述酶解的时间可以为420-600分钟，所述酶解的pH值可以为4.0-4.5。
本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原性糖所需的酶量为一个酶活力单位。
淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶。
α-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。
β-淀粉酶又称淀粉1,4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1,4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。
根据本发明，优选使用α-淀粉酶。
根据本发明，所述糖化酶优选为α-1,4-葡萄糖水解酶。
按照本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种。
根据本发明，所述作物秸秆液化液中葡萄糖和木糖的浓度的选择范围较宽，只要它们的含量不影响酵母的生长繁殖以及正常的代谢活动即可。优选地，所述作物秸秆液化液中葡萄糖的含量为60-80g/L，木糖的含量为25-35g/L。
所述作物秸秆液化液的制备方法可以采用本领域公知的作物秸秆液化液中的制备方法，例如，可以包括：将作物秸秆清洗去杂并粉碎、稀酸喷淋浸润、挤压脱水后进入汽爆设备内进行蒸汽爆破预处理，然后加入适量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.5-5.5)以及纤维素酶(例如，购自诺维信，货号为Ctec2(VDN1002)的纤维素酶，以每克干燥粉碎后的秸秆为基准，酶的用量为8-15U)，在pH4.5-5.5、温度为45-55℃的条件下酶解70-75小时，得到本发明的作物秸秆液化液。
根据本发明，所述作物秸秆可以为各种作物的秸秆，例如，玉米、小麦、水稻，甚至是杂草等的秸秆。
根据本发明，为了保证酵母能够充分地增殖以及能够保持较高的活性，优选地，在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行2-6级培养，将酵母培养液A在作物秸秆液化液中进行1-6级培养。更优选地，在淀粉质原料糖化液中和作物秸秆液化液中培养的级数总共不超过6级。采用本发明的扩培方法，在淀粉质原料糖化液和作物秸秆液化液中分别进行6级扩培后，不但能够保证酵母种子的数量保持在较高的水平，并且其活性也未受到明显的影响。
根据本发明，所述酵母种子在淀粉质原料糖化液中的培养条件可以为常规的酵母种子的培养条件，但本发明的发明人经过研究发现，按照以下的培养条件对酵母种子活化液进行培养能够使酵母的数量以及活力得到进一步提升：以淀粉质原料糖化液的总体积为基准，上一级培养所得培养液的接种量为3-10体积％；培养的温度为28-33℃，pH值为4.5-5.5，通气量为0.5-0.7体积:体积·分钟，转速为250-350rpm，时间为10-14小时；其中，在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行一级培养时，接种的为所述酵母种子活化液。
另外，在作物秸秆液化液中进行培养的条件也可以根据本领域的常规手段在较宽的范围内选择，但本发明的发明人发现通过结合上述在淀粉质原料糖化液中的培养条件，并且将在作物秸秆液化液中的培养条件控制在以下范围内，所得到的最终的酵母种子的数量或活力能够得到有效地提高，其中，在作物秸秆液化液中对酵母培养液A进行培养的条件包括：以作物秸秆液化液的总体积为基准，上一级培养所得培养液的接种量为3-10体积％；培养的温度为28-33℃，通气量为0.08-0.12体积:体积·分钟，转速为200-300rpmHz，时间为10-20小时；其中，在作物秸秆液化液中对酵母培养液A进行一级培养时，接种的为所述酵母培养液A。
术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液(发酵液)的空气体积比来表示(V/V·min)，例如通气比为1:0.1-1，简称通气量为0.01-1体积:体积·分钟。
根据本发明，所述酵母种子活化液中酵母的浓度没有特别的限制，只要其中的酵母菌株能够得到复苏即可，其浓度例如，可以为1.5×109-2.5×109CFU/ml。其中，对酵母种子进行活化的方法可以为本领域常规的活化方法，本发明在此不再详细赘述。
根据本发明，所述酵母可以为本领域公知的能够发酵作物秸秆生成乙醇的酵母菌株，优选地，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株424A(LNH—ST)。
另一方面，本发明还提供了一种利用酵母发酵生产乙醇的方法，该方法包括：(1)将酵母种子活化液按照如上所述的方法进行扩培；(2)将步骤(1)中得到的扩培液接入到乙醇发酵培养基中进行发酵。
根据本发明，优选地，所述乙醇发酵培养基含有作物秸秆液化液。其中，所述发酵生产乙醇的条件可以按照本领域公知的发酵生产乙醇的条件。本发明在此不再详细赘述。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
玉米糖化液取自中粮生化(肇东)有限公司，葡萄糖浓度为240g/L，稀释至20g/L备用；
玉米秸秆的酶解：在pH4.5-5.5、温度为45-55℃的条件下酶解72小时，所用酶由诺维信提供，货号为Ctec2(VDN1002)，以每克干燥的秸秆为基准，酶的用量为12U。将所得液化液稀释至葡萄糖含量为70-80g/L，木糖含量为25-35g/L，备用。
酿酒酵母菌株424A(LNH—ST)购自美国绿色科技公司(GreenTechAmerica，Inc)，活化后的酵母的浓度为2×109CFU/ml。其中，活化的方法包括：将甘油冻存管菌体转接到YEPX中(菌种扩培YEPX保存培养基：1％的酵母膏，2％的蛋白栋，1％的木糖，121C灭菌20min，糖与YEP分开灭菌)进行培养(培养的条件包括：转速200rpm，温度30℃，pH5.0，培养14h)，然后将培养的YEPX菌悬液接入YEPD培养基(1％的酵母膏，2％的蛋白栋，2％的葡萄糖，121C灭菌20min，糖与YEP分开灭菌)中培养(培养的条件包括：转速200rpm，温度30℃，pH5.0，培养12h)。
实施例1
本实施例用于说明本发明的酵母菌株的扩培方法。
将酵母种子活化液接种至玉米糖化液中进行一级培养，一级培养的条件包括：以玉米糖化液的总体积为基准，酵母种子活化液的接种量为5体积％；培养的温度为30℃，pH值为5.0，通气量为0.6体积:体积·分钟，搅拌转速为300rpm，时间为13小时；得到一级培养液。
将一级培养液以5体积％的接种量接入新的玉米糖化液中，培养条件包括：培养的温度为30℃，pH值为5.0，通气量为0.6体积:体积·分钟，搅拌转速为300rpm，时间为11小时，得到二级培养液。
将二级培养液以5体积％的接种量接入到玉米秸秆液化液中进行一级培养，培养条件包括：培养的温度为30℃，通气量为0.1体积:体积·分钟，转速为200rmp时间为14小时，得到酵母种子扩培液A1。
实施例2
本实施例用于说明本发明的酵母菌株的扩培方法。
将酵母种子活化液接种至玉米糖化液中进行一级培养，一级培养的条件包括：以玉米糖化液的总体积为基准，酵母种子活化液的接种量为10体积％；培养的温度为28℃，pH值为4.5，通气量为0.5体积:体积·分钟，搅拌转速为250rpm，时间为14小时；得到一级培养液。
将一级培养液以3体积％的接种量接入新的玉米糖化液中，培养条件包括：培养的温度为32℃，pH值为5.0，通气量为0.7体积:体积·分钟，搅拌转速为350rpm，时间为12小时，得到二级培养液。
将二级培养液以8体积％的接种量接入到玉米秸秆液化液中进行一级培养，培养条件包括：培养的温度为28℃，通气量为0.12体积:体积·分钟，转速为300rpm，时间为10小时，得到酵母种子扩培液A2。
实施例3
本实施例用于说明本发明的酵母菌株的扩培方法。
将酵母种子活化液接种至玉米糖化液中进行一级培养，一级培养的条件包括：以玉米糖化液的总体积为基准，酵母种子活化液的接种量为3体积％；培养的温度为28℃，pH值为5.5，通气量为0.7体积:体积·分钟，搅拌转速为350rpm，时间为10小时；得到一级培养液。
将一级培养液以10体积％的接种量接入新的玉米糖化液中，培养条件包括：培养的温度为30℃，pH值为4.5，通气量为0.5体积:体积·分钟，搅拌转速为300rpm，时间为11小时，得到二级培养液。
将二级培养液以10体积％的接种量接入到玉米秸秆液化液中进行一级培养，培养条件包括：培养的温度为33℃，通气量为0.08体积:体积·分钟，转速为200rpm，时间为20小时，得到酵母种子扩培液A3。
实施例4
本实施例用于说明本发明的酵母菌株的扩培方法。
按照实施例1的方法进行酵母的扩培，不同的是，在玉米糖化液中仅进行一级培养，得到酵母种子扩培液A4。
实施例5
本实施例用于说明本发明的酵母菌株的扩培方法。
按照实施例1的方法进行酵母的扩培，不同的是，在玉米秸秆液化液中仅进行二级培养，其中，第二级培养的条件与在玉米秸秆液化液中进行第一级培养的条件相同，得到酵母种子扩培液A5。
对比例1-6
本对比例用于说明参比的酵母菌株的扩培方法。
按照实施例1中在玉米糖化液中的第一级培养的条件将酵母种子活化液在玉米糖化液中分别进行1-6级培养，不在玉米秸秆液化液中进行培养，得到酵母种子扩培养D1-D6。
对比例7-12
本对比例用于说明参比的酵母菌株的扩培方法。
按照实施例1中在玉米秸秆液化液中的第一级扩培养的条件将酵母种子活化液在玉米秸秆液化液中分别进行1-6级扩培，不在玉米糖化液中进行扩陪，得到酵母种子扩培液D7-D12。
对比例13
按照实施例4的方法对酵母种子活化液进行两级培养，不同的是，两级扩培均在配制的4重量％的葡萄糖液(含有40g/L的葡萄糖，15g/L的玉米浆，1.5g/L的KH2PO4，1.5g/L(NH4)2HPO4，3g/L的尿素；0.05g/L的青霉素(40万酶活力单位)，调pH至6.0)中进行，分别得到1级葡萄糖酵母种子扩培液D13，和二级葡萄糖酵母种子扩培液D14。
实验实施例
将实施例1-5以及对比例1-13的酵母种子扩培液分别接种至不同的含有玉米秸秆液化液的发酵罐中进行发酵生产乙醇，接种量均为5体积％，发酵的条件包括的温度为30℃，pH值为5.0，通气量为0.06-0.1体积:体积·分钟，搅拌转速为200rpm，时间为72小时，分别得到实施例1-5的发酵液A1-A5，以及对比例1-13的发酵液D1-D14。另外，在发酵的24、32、40、48、56、64和72小时分别取发酵液按照如下的方法使用HPLC进行木糖和乳酸的含量的分析，计算木糖的消耗率。
结果显示，发酵液A1-A5以及发酵液D1-D12中乙酸的浓度要显著低于发酵液D13-D14中的，可以看出，在淀粉质原料糖化液中和/或作物秸秆液化液中活化酵母菌株，并用于乙醇的生产，能够显著降低发酵液中乙酸的含量。另外，结果还显示，通过本发明提供在淀粉质原料糖化液中和作物秸秆液化液联合培养酵母菌株，并用于乙醇的生产，得到的发酵液中乙酸的浓度要显著低于发酵液D1-D12中的。
另外，木糖的消耗率也有所提高，由此可以证明，菌株的活力经过多级扩培后也未受到影响，还意料不到的增高了。而如果采用对比例13中的方法进行酵母的三级或以上的扩培，酵母的活力将大大降低。
发酵结束后，取发酵料液的离心液，并使用0.02μm的滤膜进行过滤得到滤液，将滤液稀释10倍后进行HPLC分析，结果见表1。
相关参数如下：
液相色谱仪：Agilent1260(1200)；
色谱柱：HPX-87P柱(HPX-87P柱)；
柱温：常温；
流动相：0.05mol/LH2SO4；
流速：0.6mL/min。
表1
由表1可以看出，相比于单独采用淀粉质原料液化液或单独采用作物秸秆液化液或是使用化学合成培养基对酵母菌株进行扩培，采用本发明的方法，将淀粉质原料糖化液和作物秸秆液化液联合对酵母菌株进行扩培，能够最大程度地降低乙酸的浓度，从而有效地降低了乙酸对发酵的抑制作用。另外，分别使用淀粉质原料糖化液对酵母进行多级扩培后，其乙醇的产量也未见降低，并且木糖的消耗率也未见降低，从而可以说明对酵母进行多级扩培后，其活性也未受到明显的影响。因此，采用本发明的方法对酵母种子进行扩培能够有效地提高的乙醇的发酵水平
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (11)

1.一种酵母菌株的扩培方法，该方法包扩：在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行至少一级培养，得到酵母培养液A，然后再将酵母培养液A在作物秸秆液化液中进行至少一级培养，得到酵母种子扩培液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述淀粉质原料糖化液中葡萄糖的含量为15-25g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述作物秸秆液化液中葡萄糖的含量为60-80g/L，木糖的含量为25-35g/L。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行2-6级培养。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，将酵母培养液A在作物秸秆液化液中进行1-6级培养。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行培养的条件包扩：以淀粉质原料糖化液的总体积为基准，上一级培养所得培养液的接种量为3-10体积％；培养的温度为28-33℃，pH值为4.5-5.5，通气量为0.5-0.7体积:体积·分钟，搅拌转速为250-350rpm，时间为10-14小时；
其中，在淀粉质原料糖化液中对酵母种子活化液进行一级培养时，接种的为所述酵母种子活化液。
7.根据权利要求1、3-6中任意一项所述的方法，其中，在作物秸秆液化液中对酵母培养液A进行培养的条件包括：以作物秸秆液化液的总体积为基准，上一级培养所得培养液的接种量为3-10体积％；培养的温度为28-33℃，通气量为0.08-0.12体积:体积·分钟，转速为200-300rpm，时间为10-20小时；
其中，在在作物秸秆液化液中对酵母培养液A进行一级培养时，接种的为所述酵母培养液A。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母种子活化液中酵母的浓度为1.5×109-2.5×109CFU/ml。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株424A(LNH—ST)。
10.一种利用酵母发酵生产乙醇的方法，该方法包括：
(1)将酵母种子活化液按照权利要求1-9中任意一项所述的方法进行扩培；
(2)将步骤(1)中得到的扩培液接入到乙醇发酵培养基中进行发酵。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述乙醇发酵培养基含有作物秸秆液化液。
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