CN106893683A - 一种扩培酵母菌的方法及其应用和发酵乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物菌株扩培和乙醇发酵技术领域，公开了一种扩培酵母菌的方法及其应用和发酵乙醇的方法，其中，该方法包括：在无菌条件下，以液化醪液为原料，对活化的酵母菌依次进行间歇扩培和连续扩培，其中，连续扩培的实施方式包括：间歇扩培结束后，以相同的体积流量同时流入液化醪液和流出培养液，所述体积流量为(0.1-0.6)V/h，所述V为间歇扩培结束时得到的培养液的体积。本发明的方法不仅能够有效控制酵母菌的数量，而且得到的酵母菌的活力较高，能够明显提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率。

Description

一种扩培酵母菌的方法及其应用和发酵乙醇的方法
技术领域
本发明涉及微生物菌株扩培和乙醇发酵技术领域，具体地，涉及一种扩培酵母菌的方法及其应用和发酵乙醇的方法。
背景技术
由于化石能源的不可再生性，且面临资源日益枯竭的现状，利用可再生材料(例如含纤维素的生物质原料)进行液体燃料的开发越来越受到关注。在将含纤维素的原料进行预处理和酶解获得可利用的发酵糖后，如何将这些糖类转化为液体燃料(如乙醇)是整个转化路线上的关键点。
现有的技术中，主要通过微生物发酵的方法，将可利用的糖，如木糖、葡萄糖、纤维二糖、甘露糖等转化为乙醇。其中，这样的微生物包括：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、酒香酵母(Brettanomyces naardenensis)、纤细假丝酵母(Candida tenuis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、赛沟毕赤酵母(Pichia segobiensis)、多动拟杆菌(Bacteroides polypragmatus)、菊欧文氏杆菌(Erwinia chrysanthem)、植物克雷伯杆菌(Klebsiella planticola)、嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、球状螺旋体(Spirochaeta coccoides sp.)、植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentas sp.)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)以及重组酿酒酵母(S.cerevisiae)、重组运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、重组大肠杆菌(Escherichia coli)等。
其中，较常用的是采用酿酒酵母将含纤维素原料的酶解液转化为乙醇。从葡萄糖转化成乙醇的生化过程是简单的，通过酿酒酵母，使反应在30℃条件下进行，就可以将葡萄糖发酵为燃料乙醇。但半纤维素水解产物是以木糖为主的五碳糖，故木糖的发酵效率是决定过程经济性的重要因素，木糖的存在对纤维素酶水解有抑制作用，将木糖及时转化为乙醇对木质纤维素原料的高效率乙醇发酵是非常重要的。在此过程中，酵母菌株的扩培对木糖转化为乙醇的效率有重要影响。
酵母生长一般有延滞期、对数生长期和生长停滞期三个时期，发酵接种时间应最好控制在酵母细胞对数生长期的后期、生长停滞期前期，此时酵母细胞数量可达最大，且酵母出芽率最高、死亡率最低，接种后能够迅速增殖并有利于发酵进程。
在现有方法中，进行酵母菌扩培时均采用糖化醪液为原料，且通常采取的方法包括间歇扩培或连续扩培。但是，前述的扩培方法存在如下缺陷：第一方面，扩培中容易造成杂菌污染，且设备投资强度大；第二方面，难以有效控制得到的酵母菌的数量，往往导致过培养(扩培的培养液中酵母菌数至少为3亿/ml)，造成发酵时相当量的糖类用于酵母菌体本身代谢，从而导致用于乙醇发酵的糖类利用率较低；第三方面，由此得到的酵母菌的活力(主要体现为发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率)较低。因此，针对现有的五碳糖发酵菌株，如何选用扩培方式、培养条件以适应大生产条件、并能高效利用五碳糖(主要为木糖)发酵乙醇是一个重要问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种扩培酵母菌的方法及其应用和发酵乙醇的方法，本发明的扩培酵母菌的方法，不仅能够有效控制酵母菌的数量，而且得到的酵母菌的活力较高，能够明显提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种扩培酵母菌的方法，所述方法包括：在无菌条件下，以液化醪液为原料，对活化的酵母菌依次进行间歇扩培和连续扩培，其中，连续扩培的实施方式包括：间歇扩培结束后，以相同的体积流量同时流入液化醪液和流出培养液，所述体积流量为(0.1-0.6)V/h，所述V为间歇扩培结束时得到的培养液的体积。
第二方面，本发明提供了上述方法在乙醇发酵中的应用。
第三方面，本发明提供了一种发酵乙醇的方法，所述方法包括：利用扩培的酵母菌进行发酵，其中，在发酵前，采用本发明的上述方法进行酵母菌的扩培。
本发明的扩培酵母菌的方法，一方面，避免了传统扩大培养中杂菌污染、设备投资强度大的缺陷；另一方面，能够获得足够量的菌体以转化糖产生乙醇，且从微观上来看，扩培得到的酵母具有足够的活性从而保证单个细胞转化糖的效率，从宏观上来看，酵母种群中绝大部分的酵母具有足够活力，或者不具有活力的酵母占比较低。其中，经本发明的扩培酵母菌的方法得到的培养液中酵母数为1.8-2.4亿/ml，酵母出芽率为25-40％，死亡率为0-5％，而且得到的酵母菌的活力较高，能够明显提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种扩培酵母菌的方法，所述方法包括：在无菌条件下，以液化醪液为原料，对活化的酵母菌依次进行间歇扩培和连续扩培，其中，连续扩培的实施方式包括：间歇扩培结束后，以相同的体积流量同时流入液化醪液和流出培养液，所述体积流量为(0.1-0.6)V/h，所述V为间歇扩培结束时得到的培养液的体积。
本发明中，本领域技术人员应该理解的是，(0.1-0.6)V/h是指每小时流入的液化醪液和流出的培养液的体积为间歇扩培结束时得到的培养液的体积的10-60％。
本发明中，对于液化醪液没有特别的限定，可以为本领域常用的各种液化醪液，为了能够更加有效地控制酵母菌的数量，并进一步提高得到的酵母菌的活力，优选情况下，液化醪液的DE值为50-120，进一步优选为50-80。更进一步优选地，液化醪液中含有0.2-1g/L的磷酸二氢钾和0.2-1g/L的氮源，氮源再更进一步优选为氨水、碳酸氢铵、花生饼粉、黄豆饼粉和尿素中的一种或多种。
本发明中，优选情况下，液化醪液为玉米液化醪液和/或木薯液化醪液。
本发明中，对于制备上述液化醪液的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，优选情况下，液化醪液的制备方法包括：将淀粉原料粉碎后依次进行水热处理和固液分离处理，其中，水热处理的条件包括：温度为75-85℃，pH值为4.5-5，时间为3-4h。本领域技术人员应该理解的是，水热处理能够使淀粉糊化-液化，并破坏细胞，形成均一的液化醪液。
本发明中，优选情况下，淀粉原料为玉米和/或木薯。
本发明中，优选情况下，液化醪液的制备方法还包括：向固液分离处理得到的产物中加入液化酶进行液化处理，其中，以制备液化醪液用的淀粉原料的重量为基准，液化酶的加入量为0.1-0.3重量‰；进一步优选地，液化醪液的制备方法还包括向液化处理得到的产物中加入磷酸二氢钾和氮源，其中，以液化处理得到的产物的体积为基准，磷酸二氢钾的加入量为0.2-1g/L，氮源的加入量为0.2-1g/L。其中，对于液化处理的条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种条件，优选情况下，液化处理的条件包括：温度为90-110℃、pH值为5-7，时间为0.2-2h。
本发明中，对于活化酵母菌的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为：先将实验室在YPDA平板上保存的酵母菌接种至装有YPDA液体培养基的摇瓶中，28-32℃、100-200rpm下培养至酵母数为1.6-1.8亿/ml，然后以5-10体积％的接种量将培养液接种至装有新鲜的YPDA液体培养基的摇瓶中，28-32℃、200-300rpm下培养至酵母数为1.8-2.4亿/ml，得到活化的酵母菌液。
本发明中，优选情况下，间歇扩培的实施方式包括：以在间歇扩培过程中待加入的液化醪液的总体积为基准，先加入40-60体积％的液化醪液，然后以4-10体积％的接种量接种酵母数为1.8-2.4亿/ml的活化的酵母菌液，待将培养液中的酵母数培养至1.8-2亿/ml时，加入剩余体积的液化醪液并将培养液中的酵母数培养至1.8-2.2亿/ml。
优选地，剩余体积的液化醪液的加入方式包括：在5min-6h内以流加方式加入剩余体积的液化醪液，进一步优选地，向剩余体积的液化醪液中加入糖化酶，并在5min-6h内加入含有糖化酶的剩余体积的液化醪液，其中，以制备间歇扩培过程中待加入的全部液化醪液用的淀粉原料的重量为基准，糖化酶的加入量为0.1-0.3重量‰。
本发明中，优选情况下，在间歇扩培过程中，培养条件包括：温度为28-32℃，进一步优选为28-30℃；通气量为0.08-0.2VVM，进一步优选为0.1-0.15VVM；pH自然，进一步优选为5-6。本领域技术人员应该理解的是，通气量的单位VVM是指以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积(V/V·min)，pH自然为在培养过程中可以不需要调节pH。
本发明中，为了能够更加有效地控制酵母菌的数量，并进一步提高得到的酵母菌的活力，优选情况下，体积流量为(0.1-0.4)V/h，进一步优选为(0.2-0.4)V/h。
本发明中，优选情况下，连续扩培的培养条件包括：温度为28-32℃，进一步优选为28-30℃；通气量为0.08-0.2VVM，进一步优选为0.1-0.15VVM；pH自然，进一步优选为5-6。
本发明的方法不仅可以为发酵提供大量的酵母菌株，而且能够有效地控制酵母的生长时期，保持酵母数最多，出芽率最高。在加入剩余体积的液化醪液前，培养液中的酵母数为1.8-2亿/ml，酵母出芽率为35-38％，死亡率为5％以下。经本发明的扩培酵母菌的方法得到的培养液中酵母数为1.8-2.4亿/ml，酵母出芽率为25-40％，死亡率为0-5％。
第二方面，本发明提供了上述方法在乙醇发酵中的应用。
第三方面，本发明提供了一种发酵乙醇的方法，所述方法包括：利用扩培的酵母菌进行发酵，其中，在发酵前，采用本发明的上述方法进行酵母菌的扩培。本发明的方法适用于以含纤维素的生物质原料的酶解液为发酵培养基进行的乙醇发酵过程，尤其适用于以木质纤维素的酶解液为发酵培养基进行的乙醇发酵过程，因此，优选情况下，发酵的培养基为含纤维素的生物质原料的酶解液，进一步优选为木质纤维素的酶解液。为了提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率，优选地，酶解液中含有0.1-0.5g/L的尿素和0.2-0.8g/L的磷酸二氢钾。
本发明中，优选情况下，发酵的条件包括：温度为28-32℃，进一步优选为28-30℃；pH为4.5-6，进一步优选为5-5.5；时间为36-72小时，进一步优选为40-60小时。
为了进一步提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率，优选地，在发酵的前24h内通入空气，通气量为0.01-0.08VVM，更进一步优选为0.02-0.05VVM。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，如为特别说明，使用的试剂或材料均可商购获得，使用的方法均为本领域常用的方法。
酵母为普渡大学的改造后酿酒酵母，具有同时代谢五碳糖和六碳糖的能力，酵母具体改造的方法详见参考文献Ho NW,Chen Z,Brainard AP(1998)Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effective cofermentationof glucose and xylose.Appl Environ Microbiol 64:1852–1859。
糖化酶、液化酶均购自诺维信公司。
活化酵母菌的方法为：先将酵母菌接种至装有100ml YPDA液体培养基的500ml摇瓶中，30℃、200rpm下培养至酵母数为1.6亿/ml，然后以5体积％的接种量将培养液接种至装有100ml新鲜的YPDA液体培养基的500ml摇瓶中，30℃、200rpm下培养至酵母数为2.0亿/ml，得到活化的酵母菌液。
木质纤维素原料的酶解方法为：木质纤维素经预处理后进行酶解，酶解条件包括：温度为50℃，pH为5.0，时间为72h，以预处理得到的产物中含有的纤维素的重量为基准，每克纤维素对应加入的纤维素酶的量为10酶活力单位，得到酶解液，其中，纤维素酶购自诺维信公司。然后以酶解液的体积为基准，向酶解液中加入0.4g/L的尿素和0.6g/L的磷酸二氢钾，混合均匀，得到实验用木质纤维素的酶解液。
糖醇转化率的计算公式为：糖醇转化率＝[(C乙-C乙0时刻)/0.511/(C葡+C木)]*100％，其中，C乙为发酵液中的乙醇含量，C乙0时刻为发酵原料木质纤维素的酶解液中的乙醇含量，C葡为发酵原料木质纤维素的酶解液中的葡萄糖含量，C木为发酵原料木质纤维素的酶解液中的木糖含量。
木糖消耗率的计算公式为：木糖消耗率＝[(C木0时刻-C木)/C木0时刻]*100％，其中，C木0时刻为发酵原料木质纤维素的酶解液中的木糖含量，C木为发酵液中的木糖含量。
实施例1
(1)制备玉米液化醪液：以2.5kg玉米为原料，进行粉碎，然后在80℃、pH值为4.8的条件下水热处理3h，再进行过滤，得到10L玉米液化醪滤液，然后以粉碎的玉米原料的重量(2.5kg)为基准，向玉米液化醪滤液中加入0.2重量‰的液化酶进行液化处理，液化处理的条件包括：温度为105℃、pH值为6.5，时间为0.5h。最后以液化处理得到的产物的体积为基准，向液化处理得到的产物中加入0.5g/L的磷酸二氢钾和0.5g/L尿素，混合均匀，得到10L玉米液化醪液，经测定，玉米液化醪液的DE值为75。
(2)无菌条件下，先在10L种子罐中加入3L玉米液化醪液，然后以5体积％的接种量将活化的酵母菌液接种至种子罐中进行培养，将种子液中酵母数培养为1.9亿/ml时(经检测，此时酵母出芽率为36％，死亡率为0)，在6h内以流加方式向种子罐中加入添加有糖化酶的3L玉米液化醪液(相对于制备6L玉米液化醪液用的玉米原料的重量，糖化酶的加入量为0.2重量‰)，进行培养，待将种子液中酵母数培养为2亿/ml时停止培养(经检测，此时酵母出芽率为38％，死亡率为0)，此时种子罐中种子液的体积为6L。
其中，步骤(2)中，所有的培养条件包括：温度为30℃，通气量为0.1VVM，用氨水将pH调节为5.5。
(3)在间歇培养结束进行连续扩培，包括：在间歇培养结束后的种子罐中以1.8L/h的体积流量同时流入新鲜的玉米液化醪液和流出种子液至30L发酵罐中，其中，连续扩培的培养条件包括：温度为30℃，pH值为5.5，通气量为0.1VVM。经检测，在整个连续扩培过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数约为2.0亿/ml，酵母出芽率约为38％，死亡率为0。
(4)在装有18L木质纤维素的酶解液的30L发酵罐中，利用流入的扩培的酵母菌进行发酵，其中，发酵的条件包括：在发酵的前24h内通入空气，通气量为0.04VVM，温度为30℃，pH为5.0，搅拌桨的转速为200rpm，发酵60小时结束，发酵结束时发酵液的体积为19.8L。
通过液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。其中，液相色谱仪(型号为Aglient1260，购自安捷伦科技有限公司)，色谱柱为伯乐HPX-87H(300mm×7.8mm×9μm)，流动相为0.005mol/L H2SO4，流速为0.6ml/min，柱温箱为65℃。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为32g/L，葡萄糖含量为104g/L，乙醇含量为0g/L；发酵液中乙醇含量为64g/L，木糖含量为3g/L，葡萄糖含量为0g/L。经计算可知，糖醇转化率为92.09％，木糖消耗率为90.625％。
实施例2
(1)制备玉米液化醪液：以2.5kg玉米为原料，进行粉碎，然后在85℃、pH值为4.5的条件下水热处理3.5h，再进行过滤，得到10L玉米液化醪滤液，然后以粉碎的玉米原料的重量(2.5kg)为基准，向玉米液化醪滤液中加入0.1重量‰的液化酶进行液化处理，液化处理的条件包括：温度为95℃、pH值为6.5，时间为1.5h。最后以液化处理得到的产物的体积为基准，向液化处理得到的产物中加入0.8g/L的磷酸二氢钾和0.3g/L碳酸氢铵，混合均匀，得到10L玉米液化醪液，经测定，玉米液化醪液的DE值为70。
(2)无菌条件下，先在10L种子罐中加入2.4L玉米液化醪液，然后以8体积％的接种量将活化的酵母菌液接种至种子罐中进行培养，将种子液中酵母数培养为1.8亿/ml时(经检测，此时酵母出芽率为37％，死亡率为0)，在6h内以流加方式向种子罐中加入添加有糖化酶的3.6L玉米液化醪液(相对于制备6L玉米液化醪液用的玉米原料的重量，糖化酶的加入量为0.1重量‰)，进行培养，待将种子液中酵母数培养为2.1亿/ml时停止培养(经检测，此时酵母出芽率为36％，死亡率为0)，此时种子罐中种子液的体积为6L。
其中，步骤(2)中，所有的培养条件包括：温度为29℃，通气量为0.12VVM，用氨水将pH调节为5.2。
(3)在间歇培养结束进行连续扩培，包括：在间歇培养结束后的种子罐中以1.2L/h的体积流量同时流入新鲜的玉米液化醪液和流出种子液至30L发酵罐中，其中，连续扩培的培养条件包括：温度为29℃，pH值为5.3，通气量为0.12VVM。经检测，在整个连续扩培过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数约为2.0亿/ml，酵母出芽率约为35％，死亡率约为0.02％。
(4)在装有18L木质纤维素的酶解液的30L发酵罐中，利用流入的扩培的酵母菌进行发酵，其中，发酵的条件包括：在发酵的前24h内通入空气，通气量为0.05VVM，温度为29℃，pH为5.3，搅拌桨的转速为200rpm，发酵48小时结束，发酵结束时发酵液的体积为19.1L。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为32g/L，葡萄糖含量为104g/L，乙醇含量为0g/L；发酵液中乙醇含量为63.6g/L，木糖含量为3.47g/L，葡萄糖含量为0g/L。经计算可知，糖醇转化率为91.52％，木糖消耗率为89.16％。
实施例3
(1)制备玉米液化醪液：以2.5kg玉米为原料，进行粉碎，然后在75℃、pH值为4.8的条件下水热处理3.2h，再进行过滤，得到10L玉米液化醪滤液，然后以粉碎的玉米原料的重量(2.5kg)为基准，向玉米液化醪滤液中加入0.3重量‰的液化酶进行液化处理，液化处理的条件包括：温度为105℃、pH值为5.5，时间为1h。最后以液化处理得到的产物的体积为基准，向液化处理得到的产物中加入0.3g/L的磷酸二氢钾和0.8g/L尿素，混合均匀，得到10L玉米液化醪液，经测定，玉米液化醪液的DE值为66。
(2)无菌条件下，先在10L种子罐中加入3.6L玉米液化醪液，然后以6体积％的接种量将活化的酵母菌液接种至种子罐中进行培养，将种子液中酵母数培养为1.95亿/ml时(经检测，此时酵母出芽率为35.6％，死亡率为0)，在6h内以流加方式向种子罐中加入添加有糖化酶的2.4L玉米液化醪液(相对于制备6L玉米液化醪液用的玉米原料的重量，糖化酶的加入量为0.3重量‰)，进行培养，待将种子液中酵母数培养为2.0亿/ml时停止培养(经检测，此时酵母出芽率为34％，死亡率为0)，此时种子罐中种子液的体积为6L。
其中，步骤(2)中，所有的培养条件包括：温度为28℃，通气量为0.15VVM，用氨水将pH调节为5.7。
(3)在间歇培养结束进行连续扩培，包括：在间歇培养结束后的种子罐中以2.4L/h的体积流量同时流入新鲜的玉米液化醪液和流出种子液至30L发酵罐中，其中，连续扩培的培养条件包括：温度为28℃，pH值为5.7，通气量为0.15VVM。经检测，在整个连续扩培过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数约为2.1亿/ml，酵母出芽率约为33％，死亡率约为0.025％。
(4)在装有18L木质纤维素的酶解液的30L发酵罐中，利用流入的扩培的酵母菌进行发酵，其中，发酵的条件包括：在发酵的前24h内通入空气，通气量为0.02VVM，温度为28℃，pH为5.7，搅拌桨的转速为200rpm，发酵54小时结束，发酵结束时发酵液的体积为20.1L。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为32g/L，葡萄糖含量为104g/L，乙醇含量为0g/L；发酵液中乙醇含量为62.7g/L，木糖含量为3.6g/L，葡萄糖含量为0g/L。经计算可知，糖醇转化率为90.22％，木糖消耗率为88.75％。
实施例4
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(3)中，在间歇培养结束后的种子罐中以0.6L/h的体积流量同时流入新鲜的玉米液化醪液和流出种子液至30L发酵罐中。经检测，在整个连续扩培过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数约为2.1亿/ml，酵母出芽率约为32％，死亡率约为0.06％。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为32g/L，葡萄糖含量为104g/L，乙醇含量为0g/L；发酵液中乙醇含量为61.2g/L，木糖含量为4.7g/L，葡萄糖含量为0g/L。经计算可知，糖醇转化率为88.06％，木糖消耗率为85.31％。
实施例5
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(3)中，在间歇培养结束后的种子罐中3.6L/h的体积流量同时流入新鲜的玉米液化醪液和流出种子液至30L发酵罐中。经检测，在整个连续扩培过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数约为1.8亿/ml，酵母出芽率约为30％，死亡率约为0.08％。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为32g/L，葡萄糖含量为104g/L，乙醇含量为0g/L；发酵液中乙醇含量为57.31/L，木糖含量为6.15g/L，葡萄糖含量为0g/L。经计算可知，糖醇转化率为82.46％，木糖消耗率为80.78％。
实施例6
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(1)中，得到玉米液化醪滤液后，并不加入液化酶，而是以玉米液化醪滤液的体积为基准，向玉米液化醪滤液中加入0.5g/L的磷酸二氢钾和0.5g/L尿素。经测定，玉米液化醪液的DE值为48。
步骤(2)中经先后两次检测，酵母出芽率分别为35.2％和33.4％，死亡率分别为0％和0.01％。步骤(3)中经检测，在整个连续扩培过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数约为2.0亿/ml，酵母出芽率约为33％，死亡率约为0.03％。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为32g/L，葡萄糖含量为104g/L，乙醇含量为0g/L；发酵液中乙醇含量为60.28g/L，木糖含量为5.22g/L，葡萄糖含量为0g/L。经计算可知，糖醇转化率为86.74％，木糖消耗率为83.69％。
实施例7
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，在6h内以流加方式向种子罐中加入的3L玉米液化醪液中不含有糖化酶。
步骤(2)中间歇扩培最终得到的培养液中，酵母出芽率为30.8％，死亡率为0.05％。步骤(3)中经检测，在整个连续扩培过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数约为2.0亿/ml，酵母出芽率约为31％，死亡率约为0.06％。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为32g/L，葡萄糖含量为104g/L，乙醇含量为0g/L；发酵液中乙醇含量为59.6g/L，木糖含量为5.6g/L，葡萄糖含量为0g/L。经计算可知，糖醇转化率为85.76％，木糖消耗率为82.5％。
实施例8
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(4)中，在发酵的前24h内不通入空气，整个发酵过程为厌氧发酵。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为32g/L，葡萄糖含量为104g/L，乙醇含量为0g/L；发酵液中乙醇含量为61.4g/L，木糖含量为4.7g/L，葡萄糖含量为0g/L。经计算可知，糖醇转化率为88.35％，木糖消耗率为85.31％。
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是，不进行步骤(3)，在步骤(4)中，直接将等量的步骤(2)得到的种子液加入到发酵罐中进行发酵。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为32g/L，葡萄糖含量为104g/L，乙醇含量为0g/L；发酵液中乙醇含量为41.8g/L，木糖含量为15.3g/L，葡萄糖含量为0g/L。经计算可知，糖醇转化率为60.15％，木糖消耗率为52.19％。
将实施例1与对比例1的结果比较可知，利用本发明的扩培酵母菌的方法得到的酵母菌进行发酵，能够明显提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率。
将实施例1与实施例4-5的结果比较可知，在扩培酵母菌时，间歇扩培结束后，以(0.2-0.4)V/h(V为间歇扩培结束时得到的培养液的体积)的体积流量同时流入液化醪液和流出培养液，利用由此得到的扩培酵母菌进行发酵，能够进一步提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率。
将实施例1与实施例6的结果比较可知，在扩培酵母菌时，在制备液化醪液时，通过加入液化酶进行液化处理，利用由此得到的扩培酵母菌进行发酵，能够进一步提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率。
将实施例1与实施例7的结果比较可知，在扩培酵母菌时，在加入剩余体积的液化醪液时，若剩余体积的液化醪液中含有糖化酶，利用由此得到的扩培酵母菌进行发酵，能够进一步提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率。
将实施例1与实施例8的结果比较可知，在发酵的前24h内通入一定通气量的空气，能够进一步提高发酵时的糖醇转化率和木糖消耗率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种扩培酵母菌的方法，其特征在于，所述方法包括：在无菌条件下，以液化醪液为原料，对活化的酵母菌依次进行间歇扩培和连续扩培，其中，连续扩培的实施方式包括：间歇扩培结束后，以相同的体积流量同时流入液化醪液和流出培养液，所述体积流量为(0.1-0.6)V/h，所述V为间歇扩培结束时得到的培养液的体积。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，间歇扩培的实施方式包括：以在间歇扩培过程中待加入的液化醪液的总体积为基准，先加入40-60体积％的液化醪液，然后以4-10体积％的接种量接种酵母数为1.8-2.4亿/ml的活化的酵母菌液，待将培养液中的酵母数培养至1.8-2亿/ml时，加入剩余体积的液化醪液并将培养液中的酵母数培养至1.8-2.2亿/ml；
优选地，剩余体积的液化醪液的加入方式包括：在5min-6h内以流加方式加入剩余体积的液化醪液，进一步优选地，向剩余体积的液化醪液中加入糖化酶，并在5min-6h内加入含有糖化酶的剩余体积的液化醪液，其中，以制备间歇扩培过程中待加入的全部液化醪液用的淀粉原料的重量为基准，糖化酶的加入量为0.1-0.3重量‰；
优选地，在间歇扩培过程中，培养条件包括：温度为28-32℃，进一步优选为28-30℃；通气量为0.08-0.2VVM，进一步优选为0.1-0.15VVM；pH为5-6。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积流量为(0.1-0.4)V/h，优选为(0.2-0.4)V/h。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，连续扩培的培养条件包括：温度为28-32℃，优选为28-30℃；通气量为0.08-0.2VVM，优选为0.1-0.15VVM；pH为5-6。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述液化醪液的DE值为50-120，优选为50-80；进一步优选地，所述液化醪液中含有0.2-1g/L的磷酸二氢钾和0.2-1g/L的氮源，所述氮源更进一步优选为尿素、氨水和碳酸氢铵中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述液化醪液的制备方法包括：将淀粉原料粉碎后依次进行水热处理和固液分离处理，所述淀粉原料优选为玉米和/或木薯；
优选地，液化醪液的制备方法还包括：向固液分离处理得到的产物中加入液化酶进行液化处理，其中，以制备液化醪液用的淀粉原料的重量为基准，液化酶的加入量为0.1-0.3重量‰；
进一步优选地，液化醪液的制备方法还包括向液化处理得到的产物中加入磷酸二氢钾和氮源，其中，以液化处理得到的产物的体积为基准，磷酸二氢钾的加入量为0.2-1g/L，氮源的加入量为0.2-1g/L。
7.权利要求1-6中任意一项所述方法在乙醇发酵中的应用。
8.一种发酵乙醇的方法，所述方法包括：利用扩培的酵母菌进行发酵，其特征在于，在发酵前，采用权利要求1-6中任意一项所述方法进行酵母菌的扩培。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，发酵的培养基为含纤维素的生物质原料的酶解液，优选地，所述酶解液中含有0.1-0.5g/L的尿素和0.2-0.8g/L的磷酸二氢钾。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为28-32℃，优选为28-30℃；pH为4.5-6，优选为5-5.5；时间为36-72小时，优选为40-60小时；
进一步优选地，在发酵的前24h内通入空气，通气量为0.01-0.08VVM，更进一步优选为0.02-0.05VVM。
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