CN109628503A - 一种使用玉米和玉米秸秆作为原料综合生产乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使用玉米和玉米秸秆作为原料综合生产乙醇的方法，所述方法充分利用玉米糖化醪中的葡萄糖来提高纤维素乙醇发酵液中的乙醇浓度。通过根据本发明所述的方法，不但提高了玉米中淀粉的利用率，还可提高以玉米秸秆为主要原料的纤维素乙醇发酵液中的乙醇浓度，降低蒸馏能耗。

Description

一种使用玉米和玉米秸秆作为原料综合生产乙醇的方法

技术领域

本发明涉及一种使用玉米和玉米秸秆作为原料综合生产乙醇的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

现有工业化燃料乙醇生产主要以糖或粮食为原料，其优点是工业成熟，但是产量受到原料的限制，难以长期满足能源需求；而从长远考虑，以包括农作物秸秆在内的木质纤维素类物质为原料生产燃料乙醇则是解决原料来源和进行规模化工业生产的主要途径之一。

我国黄河以北是玉米主产区，玉米总面积达到2400hm²左右，玉米秸秆总产量大约为1.6亿吨。玉米是目前工业乙醇发酵中常用的淀粉质原料。相比而言，玉米秸秆作为玉米作物的重要副产品，其产量很大，目前只有极少部分被用作造纸原料、饲料和制备化学品。

同时，木糖发酵问题一直是纤维素燃料乙醇工业化生产的技术瓶颈之一。木质纤维素主要包含纤维素(质量分数40％～50％)、半纤维素(质量分数25％～35％)和木质素(质量分数15％～20％)等3种物质，其余还含有少量的矿物质、植物油等其他成分。纤维素的主要组成单元是葡萄糖(C6)，半纤维素的主要组成单元是木糖(C5)。因此，纤维素乙醇发酵所用的菌株是复合菌株，例如C5/C6共发酵产乙醇酵母菌株。将此类C5/C6共发酵产乙醇酵母菌株应用于纤维素乙醇酶解液发酵，需经过 4级扩培增殖100万倍后以1:10的比例接种于酶解液中进行发酵，经过 48h-56h完成发酵。但是，目前对纤维素乙醇酵母菌进行扩大培养就存在不少问题。例如，通常此类菌株的扩培采用以下两种培养基有两种：一种是以工业葡萄糖粉、玉米浆、无机盐为主要营养成分加水配制而成的培养基；另一种是取纤维素乙醇生产线上的酶解醪液作为培养基。前一种培养基由于玉米浆在常温存储过程中容易变质、滋生杂菌等，因此营养物质存储条件苛刻(例如需要建设冷库)、用量大、易染菌；在扩大培养过程中，也容易发生染菌现象，且各级扩培过程灭菌要求高，常因灭菌不彻底，导致扩大培养的种子液中杂菌超标。后一种培养基由于采用的是酶解液，其中缺少酵母繁殖增长的营养物质，而且原料在预处理过程会产生一些抑制菌株生长的物质，不利菌株的扩培增长，因此需要在扩培时额外添加无机盐作为菌株繁殖的营养；另外，使用此类培养基还会使扩培时间延长，生产过程设备使用率降低，使整个生产成本增加。

因此，如果能够提供更经济有效的玉米和玉米秸秆发酵乙醇的方法，势必能够成为解决玉米秸秆利用问题的一种有效途径。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种使用玉米和玉米秸秆作为原料综合生产乙醇的方法，所述方法通过充分利用玉米糖化醪中的葡萄糖来提高纤维素乙醇发酵液中的乙醇浓度，同时也改善了玉米粉中的葡萄糖的利用率。

因此，本发明提供了一种使用玉米和玉米秸秆作为原料综合生产乙醇的方法，所述方法包括：(1)将玉米粉和水混合并进行液化，获得玉米液化醪；(2)使步骤(1)中获得的玉米液化醪降温至60℃-65℃，添加糖化酶，经糖化获得糖化率为60％-70％的玉米糖化醪；(3)将C5/C6 共发酵酵母菌株的种子液接种至步骤(2)中获得的所述玉米糖化醪中，经至少一级的扩大培养得到所述酵母菌株的扩培液；以及(4)将步骤(3) 中获得的扩培液与玉米秸秆酶解液混合并进行发酵，得到作为发酵产物的乙醇。

本发明的有益技术效果如下：

在本发明的方法中，通过将由玉米液化醪制备得到的扩培液直接加入玉米秸秆酶解液进行混合，使得玉米液化醪中的淀粉的利用率提高，同时使最终发酵液的乙醇浓度得到改善，乙醇浓度提升幅度可达到 17-20％，降低蒸馏能耗。

相比工业葡萄糖粉培养基，本发明的方法添加的营养物(如玉米浆等)大幅度减少。相比其它发酵方法，本发明的方法操作简单未增加设备投资，尤其是扩培步骤，仅需在玉米液化醪制备中增加一步降温至60-65℃进行糖化的过程。相比酶解液扩培和/或工业葡萄糖粉培养基中的营养盐添加以及扩培时间延长，本发明的方法可提高设备利用率，减少水、电、汽能耗。

附图说明

图1为本发明所述的乙醇发酵方法的工艺流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的使用玉米和玉米秸秆作为原料综合发酵生产乙醇的方法包括：(1)将玉米粉和水混合并进行液化，获得玉米液化醪；(2)使步骤 (1)中获得的玉米液化醪降温至60℃-65℃，添加糖化酶，经糖化获得糖化率为60％-70％的玉米糖化醪；(3)将C5/C6共发酵酵母菌株的种子液接种至步骤(2)中获得的所述玉米糖化醪中，经至少一级的扩大培养得到所述酵母菌株的扩培液；以及(4)将步骤(3)中获得的扩培液与玉米秸秆酶解液混合并进行发酵，得到作为发酵产物的乙醇。

玉米液化醪的制备可根据本领域的已知的方法进行。相应地，淀粉质生物质来源的液化醪也可根据本领域中所公开的方法来制备。例如，将玉米粉和水以1:1.7-1:2.1的质量比混合，加入淀粉酶，升温至80-98℃，至淀粉溶液变成流动性醪液，得到玉米液化醪。其中，淀粉酶的添加量为每吨玉米粉0.2kg-0.5kg、优选0.3kg-0.4kg。

在步骤(2)中，所述糖化酶的添加量为每吨玉米粉0.1kg-0.5kg、优选0.2kg-0.4kg。将步骤(1)中制备的玉米液化醪直接降温至60℃-65℃，糖化时间约为1h-1.5h，pH为4.0-5.0，将短链糊精进一步转化为葡糖糖形成的均一醪液，得到玉米糖化醪。其中，所述玉米糖化醪的糖化率为 60％-70％。

本发明中所使用的术语“C5/C6共发酵酵母菌株”是指能够同时利用C5糖(五碳糖，例如木糖)和C6糖(六碳糖，例如葡萄糖)作为底物进行发酵来生产乙醇的酵母菌株。本领域技术人员知晓此类C5/C6共发酵酵母菌株并可在本发明基础之上对其进行适当选择。例如，中国专利CN201110042170.2公开了一种编码木糖异构酶突变体的基因，该基因可在酵母中表达，从而使酵母获得木糖代谢能力；PCT国际公开WO2010/ 074577A1公开了一种木糖异构酶基因，其赋予真核细胞将木糖直接转化为木酮糖的能力；中国专利申请CN106554924A中也公开了一种能够高效地进行木糖代谢，从而实现C5糖和C6糖共发酵的生产乙醇的重组酿酒酵母菌株。另外，也可以直接利用现有基因对酿酒酵母进行改造。例如，Zhou H等，Xyloseisomerase overexpression along with engineering of the pentose phosphatepathway and evolutionary engineering enable rapid xylose utilization andethanol production by Saccharomyces cerevisiae， Metab Eng.，2012Nov；14(6)：611-22中描述了使现有的木糖异构酶在酿酒酵母中表达，从而获得了能够直接将木糖代谢为木酮糖的酿酒酵母。

在本发明一些优选的实施方式中，对于发酵步骤，进行发酵处理时使用的C5/C6共发酵酵母菌株为2017年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)、保藏编号为CGMCCNo.15103、分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的重组酿酒酵母菌株0918MUT，然而，本发明并不限于此。

所述种子液为将所述共发酵酵母菌株接种至种子培养基中，经 12-24h培养至所述微生物数量达到1.5-2.0×10⁸/mL以上、优选为 2.0×10⁸/mL以上；芽生率≥20％。优选地，所述种子培养基包含酵母粉 1-15g/L、蛋白胨1-25g/L、葡萄糖15-25g/L。所述种子培养基可为用于酵母菌株的各种合适的液体培养基，例如YPD或YEPD液体培养基。

在一个实施方式中，种子液培养优选在摇床中进行，培养条件为：培养温度为28-30℃；摇床转速为100-200rpm、优选为150rpm；培养时间为12-24h；杂菌≤1个/视野。

在步骤(3)中，对所述C5/C6共发酵酵母菌株的扩大培养通过以下步骤进行：

初级扩培：将所述酵母菌株的种子液接种至含有初级扩培培养基的扩培罐中进行扩培，其中，所述初级扩培培养基含有20vol％-40vol％、优选25vol％-30vol％的所述糖化醪；

二级扩培：将初级扩培得到的培养液以2vol％-10vol％、优选2vol％-5vol％的接种量接种至含有所述玉米糖化醪的扩培罐中进行扩培；以及

三级扩培：将二级扩培得到的培养液以2vol％-10vol％、优选 5vol％-10vol％的接种量接种至含有所述玉米糖化醪的扩培罐中进行扩培，以得到扩培液，其中，所述扩培液中所述酵母菌株的细胞数为(1-5) ×10⁸/mL、优选(2-4)×10⁸/mL；其中，菌株死亡率为≤15％，优选为≤10％；芽生率≥20％，优选为20％-35％。

在初级扩培培养基可包括20vol％-40vol％、优选25vol％-30vol％的所述玉米糖化醪，100ppm-500ppm、优选200ppm-400ppm尿素， 5ppm-20ppm、优选8ppm-15ppm、更优选10ppm青霉素，余量为水。所述水可为回收的工艺用水，例如回收的冷凝水(回收的冷凝水可为对扩培罐进行高压高温灭菌时，高压蒸汽冷凝所产生的水)。

在各个扩培步骤中，采用以下参数进行：温度28℃-35℃、优选30℃ -32℃、更优选为29℃，转速25rpm-40rpm、优选30rpm-40rpm，通气量 0.1-0.5vvm、优选0.4vvm，时间8-14h，在扩培过程中将pH控制在4.5-6.0，优选为4.9-5.1，更优选为5.0。

在各级扩大培养中，所述扩培培养基中任选地含有尿素和/或抑制剂。其中，尿素作为酵母菌株的氮源。所述抑制剂选自青霉素，用于抑制杂菌。在各扩培培养基中，尿素的添加浓度为100ppm-500ppm、优选 200ppm-400ppm，青霉素的添加浓度为5ppm-20ppm、优选8ppm-15ppm、更优选10ppm。

在二级扩培和三级扩培中，每级扩培中的扩培条件可以相同或不同；在优选的实施方式中，每级扩培中使用的扩培条件均相同。每级扩培中的扩培规模和每级接种量不做特别限定，并且每级之间的扩培规模和接种量可以相同也可以不同。

在一个优选实施方式中，所述初级扩大培养的扩培罐为50L扩培罐，二级扩大培养的扩培罐为300L扩培罐，以及三级扩大培养的扩培罐为 5m³扩培罐。

在进行扩培步骤时，使玉米糖化醪的温度降至28℃-34℃，优选28℃ -30℃，更优选29℃。

在扩培步骤中，由于糖化酶持续发挥作用，使得玉米糖化醪的糖化率继续增加。在扩培后，所述扩培液中玉米糖化醪的糖化率可达到 70％-85％、优选为75％-85％。

在本发明中，糖化醪的糖浓度通过山东省科学院生物研究所生产 SBA-40C型分析仪进行检测，近而折算糖化醪糖化率。其中，玉米液化醪的理论完全糖化还原糖浓度为248g/L。

在一个实施方式中，本发明的玉米秸秆酶解液通过以下方法制备：对玉米秸秆进行高温高压蒸汽爆破的预处理步骤以及用纤维素酶进行酶解处理的酶解步骤。

例如，本发明的玉米秸秆酶解液可通过以下方式获得：

预处理步骤：对所述玉米秸秆进行高温高压蒸汽爆破预处理，得到玉米秸秆预处理物料；以及

酶解步骤：用纤维素酶对所述玉米秸秆预处理物料进行酶解处理，得到含有可发酵性单糖的玉米秸秆酶解液。

在预处理步骤之前，还可对玉米皮进行稀酸喷淋处理，稀酸喷淋处理中使用的酸浓度可为2％-4％，使用的酸可为例如盐酸、硫酸、硝酸等本领域常用的酸，但本发明并不限于此。

通过在预处理步骤之前进行稀酸喷淋处理，可以破坏纤维素的结晶结构，使原料结构疏松，从而有利于提高纤维素的酶解性能。

对于预处理步骤，高温高压蒸汽爆破的压力可为0.35MPaG-0.7MPaG，温度可为148℃-170℃，处理时间可为10min-30min。

对于酶解步骤，可以通过本领域常用的方法完成。在本发明一些优选的实施方式中，例如可向经高温高压蒸汽爆破预处理的玉米皮预处理物料中添加纤维素酶，酶添加量可为5％-20％g/g纤维素。作为酶解处理的条件，可以适当地选取在纤维素酶有活力的温度以及pH值条件下完成。在本发明一些优选的实施方式中，酶解处理的温度可以为纤维素酶的任何最适作用温度，一般为45-55℃，更优选为48-52℃。在本发明一些优选的实施方式中，酶解处理的pH值可以为纤维素酶的任何最适作用 pH值，一般为4.5-5.5，更优选为4.8-5.2。在本发明一些优选的实施方式中，酶解处理的时间可以为纤维素酶充分发挥作用的任何最适时间，考虑到时间成本，酶解处理的时间优选为48-96小时，更优选为72-80小时。

玉米秸秆酶解液也可基于本领域已知的方法制备。例如，所述高温高压蒸汽爆破预处理以及所述酶解处理可按照专利号ZL 200710121557.0和/或专利号ZL200710121124.5中的相关记载进行。

对于发酵步骤，可通过在玉米秸秆酶解液中直接加入C5/C6共发酵酵母菌株的扩培液进行。在本发明一些优选的实施方式中，可在玉米秸秆酶解液中加入5-10％(v/v)的C5/C6共发酵酵母菌株扩培液。作为发酵处理的条件，可以适当地选取在C5/C6共发酵酵母菌株有活力的温度条件下完成。在本发明一些优选的实施方式中，发酵处理的温度为30-34℃，更优选为30℃。作为发酵处理的时间，可以适当地选取C5/C6共发酵酵母菌株充分发挥作用的任何最适时间。在本发明一些优选的实施方式中，发酵处理的时间为48-56小时。对于本发明的利用玉米秸秆作为原料生产乙醇的方法而言，在发酵步骤中可对pH进行控制，例如用氨水将pH 控制在4.5-5.5。也可无需调控pH值，同样可高效获得发酵产物乙醇。

实施例

接下来，通过以下实施例和对比例对本发明进行进一步详细的说明，但本发明不仅限于这些实施例和对比例。

在以下实施例和对比例中，玉米秸秆酶解液按照如下方法制备：取 1000kg玉米秸秆原料，粉碎到粒度为2-4cm，经过3.5％浓度的稀酸喷淋，并对其进行高温高压蒸汽爆破预处理(条件为0.55MPa，160℃，20min)；将得到的玉米秸秆预处理物料输送到含水的酶解反应器中，采用工业氨水喷淋混合，调节pH值至5.0，加入纤维素酶(10％g/g纤维素)，在50℃下酶解处理72h，获得玉米秸秆酶解液。

实施例1根据本发明的乙醇发酵方法

将700kg玉米粉和1400L水混合，按每吨玉米粉0.4kg的比例加入淀粉酶(购自诺维信(中国)生物技术有限公司)，升温至98℃并保持，直到玉米粉溶液变成流动性醪液，从而得到玉米液化醪。

将1.5吨上述玉米液化醪降温至65℃，以每吨玉米粉0.3kg的量添加糖化酶(购自诺维信(中国)生物技术有限公司)并均匀混合，在pH为4.3 下糖化1h-1.5h，以将短链糊精进一步转化为葡萄糖并形成均一醪液，从而得到、糖化率为65％±5％的玉米糖化醪(玉米液化醪的理论完全糖化还原糖浓度为248g/L，因此所制备的玉米糖化醪中还原糖浓度为161.2g/L)。将所述玉米糖化醪冷却至30℃，以用于下述扩培程序。

将重组酿酒酵母菌株0918MUT(该重组酿酒酵母菌株0918MUT于 2017年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.15103)按1％活化后，以接种量2％ (v/v)对接至1L YEPD液体培养基(表1)中进行培养(摇床培养温度 30℃、摇床转速200rpm、培养时间12h)，使酵母细胞数达到2亿/mL(其中，杂菌≤1个/视野、芽生率≥20％)，从而获得种子液。

注：菌种活化条件：35℃，20分钟。

表1 YEPD液体培养基的配制

初级扩培

将1L种子液以5vol％的接种量接种至含有20L初级扩培培养基(表 2)的50L扩培罐中，以温度29±1℃、pH 5.0±0.1、持续通气量为0.40vvm，转速为40rpm扩培14h，从而得到初级扩培液。

表2初级扩培培养基的配制

二级扩培

将20L初级扩培液以10vol％的接种量接种至含有200L玉米糖化醪 (添加有10ppm青霉素和400ppm尿素，氨水调节pH为5.0)的300L 扩培罐中，以温度29±1℃、转速40rpm、通气量0.40vvm、pH 5.0±0.1(氨水调节)扩培10h，从而得到二级扩培液(杂菌数量≤2个/视野)。

三级扩培

将200L二级扩培液以10vol％的接种量接种至含有2000L玉米糖化醪(添加有10ppm青霉素和400ppm尿素，氨水调节pH为5.0)的5m³扩培罐中，按照二级扩培的条件扩大培养12h，从而得到成熟扩培液。在该成熟扩培液中，酵母细胞数为1.98×10⁸/mL，酵母芽生率为24.2％(杂菌数量≤2个/视野)。

乙醇发酵

按照10vol％的比例将成熟扩培液接种至含有17000L玉米秸秆酶解液(添加有50mg/L青霉素，pH为5.0±0.1)的20m³发酵罐中在温度30℃和转速40rpm(间歇搅拌：每8小时搅拌一次，每次搅拌10分钟以上，不超过15分钟)下发酵56h，发酵过程中用氨水将pH维持在5.0±0.1。

为对发酵过程的效果进行评估以及对乙醇得率进行计算，测量如下指标：发酵初始发酵液中的葡萄糖、木糖含量；以及发酵终点发酵成熟醪中的乙醇含量。

乙醇得率计算公式如下：

[式1]乙醇得率(％)＝(C₁-C₀)/0.511*(C_葡+C_木)

其中，C₁为发酵终点乙醇浓度，C₀为发酵初始乙醇浓度(本发明中将其设定为零)，C_葡为发酵初始葡萄糖浓度，C_木为发酵初始木糖浓度， 0.511为糖醇转化理论最大值。

实施例2根据本发明的乙醇发酵方法

二级扩培

将20L实施例1制备的初级扩培液以10vol％的接种量接种至含有200L玉米糖化醪(添加有10ppm青霉素和400ppm尿素，氨水调节pH 为5.0)的300L扩培罐中，以温度29±1℃、转速40rpm、通气量0.40vvm、 pH 5.0±0.1(氨水调节)扩培14h，从而得到二级扩培液(细胞数为 2.0×10⁸/mL，杂菌数量≤2个/视野)。

三级扩培

将20L二级扩培液以10vol％的接种量接种至含有2000L玉米糖化醪 (添加有10ppm青霉素和400ppm尿素，氨水调节pH为5.0)的5m³扩培罐中，按照二级扩培的条件扩大培养12h，从而得到成熟扩培液。在该成熟扩培液中，酵母细胞数为2.58×10⁸/mL，酵母芽生率为22.1％(杂菌数量≤2个/视野)。

乙醇发酵

除了将成熟扩培液按照5vol％的比例进行接种外，按照实施例1中的乙醇发酵方式进行乙醇发酵生产。

对比例1

基于待发酵的玉米秸秆酶解液的体积，以10vol％的比例取实施例2 所制备的成熟扩培液，并将成熟扩培液在8000rpm转速下离心5min，将上层清液弃去，用生理盐水对离心后的沉淀进行清洗，清洗后再次以 8000rpm转速离心5min，用与成熟扩培液相同体积的玉米秸秆酶解液将酵母细胞悬浮；将其接种至含有17000L玉米秸秆酶解液(添加有50mg/L青霉素，pH为5.0，0.15wt‰尿素)的20m³发酵罐中在温度30℃和转速40rpm (间歇搅拌，每8小时搅拌一次，每次搅拌10分钟以上，不超过15分钟)下发酵56h，发酵过程中pH用氨水维持在5.0±0.1。

以与实施例1相同的方式测量各项指标。实验结果见表4。

对比例2

二级扩培

将20L的实施例1中制备的初级扩培液以10vol％的接种量接种至含有200L二级培养基(包含5wt％葡萄糖溶液、15g/L玉米浆、1.5g/L KH₂PO₄、 1.5g/L(NH₄)₂HPO₄、0.3g/L尿素、50mg/L青霉素，余量为水)的300L扩培罐中，以温度29±1℃、转速40rpm、通气量0.40vvm、pH 5.0±0.1(氨水调节) 扩培12h，从而得到二级扩培液(杂菌数量≤2个/视野)。

三级扩培

将200L二级扩培液以10vol％的接种量接种至含有2000L上述二级培养基的5m³扩培罐中，按照二级扩培的条件扩大培养10h，从而得到成熟扩培液。在该成熟扩培液中，酵母细胞数为1.86×10⁸/mL，酵母芽生率为26.6％(杂菌数量≤2个/视野)。

乙醇发酵

除了使用对比例2制备的成熟扩培液外，按照对比例1中的乙醇发酵方式进行乙醇发酵生产。以与实施例1相同的方式测量各项指标。实验结果见表4。

对比例3

二级扩培

将20L的实施例1中制备的初级扩培液以10vol％的接种量接种至含有200L二级培养基(包含50vol％玉米秸秆酶解液、15g/L玉米浆、1.5g/L KH₂PO₄、1.5g/L(NH₄)₂HPO₄、0.3g/L尿素、50mg/L青霉素，余量为水，该二级培养基中的葡萄糖含量在3-5g/100mL)的300L扩培罐中，以温度29±1℃、转速40rpm、通气量0.40vvm、pH 5.0±0.1(氨水调节)扩培14h，从而得到二级扩培液(杂菌数量≤2个/视野)。

三级扩培

将200L二级扩培液以10vol％的接种量接种至含有2000L上述二级培养基的5m³扩培罐中，按照二级扩培的条件扩大培养12h，从而得到成熟扩培液。在该成熟扩培液中，酵母细胞数为1.38×10⁸/mL，酵母芽生率为17.3％(杂菌数量≤2个/视野)。

乙醇发酵

除了使用对比例3制备的成熟扩培液外，按照实施例1中乙醇发酵方式进行乙醇发酵生产。

以与实施例1相同的方式测量各项指标。实验结果见表4。

对比例4

二级扩培

将10L的实施例1中制备的初级扩培液以5vol％的接种量接种至含有200L二级培养基(包含5wt％葡萄糖溶液、15g/L玉米浆、1.5g/L KH₂PO₄、 1.5g/L(NH₄)₂HPO₄、0.3g/L尿素、50mg/L青霉素，余量为水)的300L扩培罐中，以温度29±1℃、转速40rpm、通气量0.40vvm、pH 5.0±0.1(氨水调节) 扩培14h，从而得到二级扩培液(杂菌数量≤2个/视野)。

三级扩培

将200L二级扩培液以10vol％的接种量接种至含有2000L上述二级培养基的5m³扩培罐中，按照二级扩培的条件扩大培养10h，从而得到成熟扩培液。在该成熟扩培液中，酵母细胞数为1.95×10⁸/mL，酵母芽生率为24.3％(杂菌数量≤2个/视野)。

乙醇发酵

除了使用对比例4制备的成熟扩培液外，按照实施例1中的乙醇发酵方式进行乙醇发酵生产。

以与实施例1相同的方式测量各项指标。实验结果见表4。

对比例5

二级扩培

将10L的实施例1中制备的初级扩培液以5vol％的接种量接种至含有200L二级培养基(包含50vol％玉米秸秆酶解液、15g/L玉米浆、1.5g/L KH₂PO₄、1.5g/L(NH₄)₂HPO₄、0.3g/L尿素、50mg/L青霉素，余量为水，该二级培养基中的葡萄糖含量在3-5g/100mL)的300L扩培罐中，以温度29±1℃、转速40rpm、通气量0.40vvm、pH 5.0±0.1(氨水调节)扩培14h，从而得到二级扩培液(杂菌数量≤2个/视野)。

三级扩培

将200L二级扩培液以10vol％的接种量接种至含有2000L上述二级培养基的5m³扩培罐中，按照二级扩培的条件扩大培养12h，从而得到成熟扩培液。在该成熟扩培液中，酵母细胞数为1.56×10⁸/mL，酵母芽生率为20.2％(杂菌数量≤2个/视野)。

乙醇发酵

除了使用对比例5制备的成熟扩培液外，按照对比例1中的乙醇发酵方式进行乙醇发酵生产。

以与实施例1相同的方式测量各项指标。实验结果见表4。

表3实施例1-2和比较例1-5所制备的成熟扩培液的测定结果

成熟扩培液	实施例1	实施例2	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4	对比例5
								酵母数(10<sup>8</sup>/ml)	1.98	2.58	2.58	1.86	1.38	1.95	1.56
芽生率(％)	24.2	22.1	22.1	26.6	17.3	24.3	20.2

表4实施例1-2和比较例1-5的乙醇发酵的测定结果

实验证明，相比使用由葡萄糖溶液等制备的培养基扩培和含玉米秸秆酶解液的培养基进行扩培然后进行乙醇发酵，玉米糖化醪扩培+酶解液自发酵(即在发酵体系中仅含有玉米秸秆酶解液，例如，将成熟扩培液中的菌体离心分离并用酶解液重悬，并接种进酶解液中进行发酵)的成熟醪中的乙醇浓度提升了17-20％，达到53.6g/L，同时降低辅料用量，节约成本；相比上述发酵方法，本发明的发酵方法(即将由玉米糖化醪制成的成熟扩培液直接接种进玉米秸秆酶解液中进行发酵)的成熟醪中乙醇浓度可达到57.7g/L，更进一步降低辅料用量，节约成本。

Claims (10)

1.一种使用玉米和玉米秸秆作为原料生产乙醇的方法，所述方法包括：

(1)将玉米粉和水混合并进行液化，获得玉米液化醪；

(2)使步骤(1)中获得的玉米液化醪降温至60℃-65℃，添加糖化酶，经糖化获得糖化率为60％-70％的玉米糖化醪；

(3)将C5/C6共发酵酵母菌株的种子液接种至步骤(2)中获得的所述玉米糖化醪中，经至少一级的扩大培养得到所述酵母菌株的扩培液；以及

(4)将步骤(3)中获得的扩培液与玉米秸秆酶解液混合并进行发酵，得到作为发酵产物的乙醇。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，将玉米粉和水混合，按每吨玉米粉0.2kg-0.5kg的比例添加淀粉酶，并将温度保持在80-98℃，以得到所述玉米液化醪。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述糖化酶的添加量为每吨玉米粉0.1kg-0.5kg。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在步骤(3)中，对所述C5/C6共发酵酵母菌株的扩大培养通过以下步骤进行：

初级扩培：将所述酵母菌株的种子液接种至含有初级扩培培养基的扩培罐中进行扩培，其中，所述初级扩培培养基含有20vol％-40vol％的所述玉米糖化醪；

二级扩培：将初级扩培得到的培养液接种至含有所述玉米糖化醪的扩培罐中进行扩培；以及

三级扩培：将二级扩培得到的培养液接种至含有所述玉米糖化醪的扩培罐中进行扩培，以得到扩培液，其中，所述扩培液中所述酵母菌株的细胞数为(1.0-5.0)×10⁸/mL。

5.如权利要求4所述的方法，其中，在各个扩培步骤中，采用以下参数进行：温度28℃-35℃，转速25rpm-40rpm，通气量0.1-0.5vvm，时间8-14h，在扩培过程中将pH控制在4.5-6.0。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中，在各个扩培步骤中，扩培培养基中还添加有尿素和青霉素；其中，所述尿素的添加量优选为100-500ppm、更优选200ppm-400ppm，所述青霉素的添加量优选为5ppm-20ppm、更优选8ppm-15ppm、进一步优选10ppm。

7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中，在二级扩培和三级扩培中，以2vol％-10vol％的接种量进行接种。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，在步骤(4)中，在所述玉米秸秆酶解液中加入5vol％-10vol％的步骤(3)中获得的所述扩培液。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述发酵处理的温度为30-34℃、优选为30℃；所述发酵处理的时间为48-56小时。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述玉米秸秆酶解液通过以下方式获得：

预处理步骤：对所述玉米秸秆进行高温高压蒸汽爆破预处理，得到玉米秸秆预处理物料；以及

酶解步骤：用纤维素酶对所述玉米秸秆预处理物料进行酶解处理，得到含有可发酵性单糖的玉米秸秆酶解液。