CN113322190B - 里氏木霉与酿酒酵母混合发酵白酒糟生产单细胞蛋白的方法 - Google Patents

里氏木霉与酿酒酵母混合发酵白酒糟生产单细胞蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种里氏木霉与酿酒酵母混合发酵白酒糟生产单细胞蛋白的方法，先将里氏木霉接种到含白酒糟的发酵培养基中进行发酵，间隔0‑36h后再将酿酒酵母接种到白酒糟中继续发酵，总发酵时间5‑6d里氏木霉和酿酒酵母总接种量为4‑10％，其中，里氏木霉和酿酒酵母接种生物量比例为1:3～5:1。里氏木霉与酿酒酵母组成的双真菌微生物菌落，协同作用明显，不存在明显的拮抗作用，调控简单，经过条件优化后，每33.3g酒糟可生产SCP26.7g，转化率高。

Description

里氏木霉与酿酒酵母混合发酵白酒糟生产单细胞蛋白的方法
技术领域
本发明属于发酵领域，具体涉及一种里氏木霉与酿酒酵母混合发酵白酒糟生产单细胞蛋白的方法。
背景技术
白酒糟是米、麦、高粱等酿酒后剩余的废弃物残渣，来源于我国独特的白酒酿造技艺，含有一定比例的营养成分，尤其是其含有的粗蛋白、赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸等以及多种微量元素和维生素，具有一定的再利用价值，可变废为宝作为动物饲料再利用从而节省喂养动物的精料而降低养殖投入。
采用微生物菌群混合发酵各种酒糟产单细胞蛋白(SCP)的相关专利与论文，已有很多相关的报道，但所采用的各种技术不尽相同，各有优势和缺点。
《一种混菌液态发酵黄酒加工废弃物生产单细胞蛋白的方法》，采用的技术是产朊假丝酵母和白地霉混合发酵黄酒糟产SCP；产朊假丝酵母和白地霉的蛋白含量高，但其纤维素酶降解活性弱，不能充分糖化酒糟中的纤维素，酒糟的利用率不高。
《一种白酒糟单细胞蛋白的加工工艺》，添加了糖化酶，固态发酵，加入糖化酶，虽然效果很好，但酶制剂成本高，造成生产成本上升。
《利用白酒糟生产蛋白饲料的研究》，采用热带假丝酵母菌发酵白酒糟；热带假丝酵母菌单菌发酵白酒糟，降解纤维素能力差，酒糟利用度低。
《白酒糟多菌发酵制取蛋白协同效应及工艺研究》，采用了热带假丝酵母(Candidatropicalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白地霉(Geotrichumcandidum)三菌混合发酵；热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌、白地霉三菌，存在纤维素降解活性弱的问题，三菌协同与拮抗，调控困难。
《白酒糟菌体蛋白饲料开发研究》，采用了白地霉、米曲霉、绿色木霉和枯草芽孢杆菌四菌混合发酵。白地霉、米曲霉、绿色木霉和枯草芽孢杆菌四菌混合发酵，利用利用效率高，蛋白产量高，但四菌的调控复杂，重复性差，用作饲料的适口性需要检验。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种转化率高、工艺简单稳定的利用白酒糟生产单细胞蛋白的方法。
本发明的技术方案为：一种里氏木霉与酿酒酵母混合发酵白酒糟生产单细胞蛋白的方法，先将里氏木霉接种到含白酒糟的发酵培养基中进行发酵，间隔0-36h后再将酿酒酵母接种到白酒糟中继续发酵，总发酵时间5-6d，里氏木霉和酿酒酵母总接种量为4-10％，其中，里氏木霉和酿酒酵母接种生物量比例为1:3～5:1。
进一步地，所述发酵培养基的组成为：酒糟33.3g/L、氮源12g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁0.6g/L、氯化钙0.6g/L、柠檬酸缓冲液0.05mol/L、Mandels微量元素0.17ml/L、葡萄糖1g/L、余量为水。
进一步地，所述氮源为硫酸铵、脲、硝酸铵或它们的任意组合。
进一步地，所述氮源为硫酸铵和硝酸铵等比混合。
进一步地，所述里氏木霉和酿酒酵母总接种量为4％。
进一步地，所述里氏木霉和酿酒酵母接种生物量比例为3:1。
进一步地，所述间隔时间为24h。
进一步地，所述里氏木霉(Trichoderma reesei)为Rut-C30，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为INVSc1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用里氏木霉与酿酒酵母混合发酵的技术，里氏木霉是目前已知的纤维素降解能力最强的工业菌株，且里氏木霉属于生物安全的菌株，可用于食品和制药；酿酒酵母是发酵技术成熟、营养丰富的工业菌株，在食品和制药工业有广泛的应用；里氏木霉产纤维素酶(分泌胞外蛋白)与酿酒酵母菌体生长(积累SCP)均在有氧条件下进行，发酵工艺简单，可采用液体深层发酵和固态发酵，有良好的工业应用潜力；里氏木霉与酿酒酵母组成的双真菌微生物菌落，协同作用明显，不存在明显的拮抗作用，调控简单，经过条件优化后，每33.3g酒糟可生产SCP 26.7g，转化率高。
附图说明
图1发酵时间与蛋白质含量关系；
图2菌种接种比例与蛋白质含量关系；
图3延迟接种时间与蛋白质含量关系；
图4接种量与蛋白质含量关系；
图5氮源种类与蛋白质含量关系；
图6氮源添加量与蛋白质含量关系。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
1实验材料与方法
1.1材料
白酒糟：来自西凤酒厂；菌种：里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut-C30，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1，市售现有菌株；试剂：均为市售分析纯。
1.2培养基
(1)PDA培养基
(2)YPD培养基：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％
(3)种子培养基：蛋白胨0.05g/瓶、硫酸铵0.07g/瓶、磷酸二氢钾0.1g/瓶、微量元素0.05ml/瓶、尿素0.015g/瓶、硫酸镁0.015g/瓶、氯化钙0.02g/瓶、柠檬酸2.5ml/瓶、吐温80 2滴/瓶、0.1g/ml葡萄糖5ml/瓶、蒸馏水42.5ml/瓶
(4)发酵培养基：酒糟33.3g/l、氮源12g/l、磷酸二氢钾4g/l、硫酸镁0.6g/l、氯化钙0.6g/l、柠檬酸缓冲液0.05M、Mandels微量元素0.03ml/瓶(Biotechnology andBioengineering 2016；23:2009-26)、葡萄糖1g/l、蒸馏水补足30ml(扣除接种种子液体积)。
1.3实验方法
先在PDA培养基培养里氏木霉，后将里氏木霉菌丝接种进种子培养基培养36h，再将YPD培养基中隔夜培养的酿酒酵母与里氏木霉接种进发酵培养基进行混合发酵，在固定时间段取2ml发酵培养基浊液于离心管中，6000rpm离心10min取得上清液后用双缩脲法测定发酵产物中蛋白质含量。改变实验条件进行多轮发酵，探究可使蛋白质含量最大化的发酵条件。
1.3.1发酵时间对蛋白质含量的影响
在相同的酒糟添加量、pH、接种量、菌种接种比例、氮源种类及添加量，发酵3d、4d、5d、6dh和7d，测定其蛋白含量，确定最佳发酵时间。
1.3.2菌种接种比例对蛋白质含量的影响
在相同的酒糟添加量、pH、接种量、氮源种类及添加量，在里氏木霉：酿酒酵母接种的生物量比例为1:1、1:3、1:5、3:1、5:1的条件下进行发酵，测定各时间段样品蛋白含量，确定最佳菌种接种比例。
1.3.3延迟接种时间对蛋白质含量的影响
先接种里氏木霉到装有酒糟的发酵培养基，间隔一段时间后再接种酿酒酵母，这段间隔的用里氏木霉糖化酒糟的时间即为延迟接种时间。在相同的酒糟添加量、pH、接种量、菌种接种比例、氮源种类及添加量，在延迟接种时间为0h、12h、24h、36h的条件下发酵，在发酵进行4d、5d、6d和7d后进行取样，发酵结束测定各时间段样品蛋白含量，确定最佳延迟接种时间。
1.3.4菌种接种量对蛋白质含量的影响
在相同的酒糟添加量、pH、菌种接种比例、氮源种类及添加量，在菌种接种量为4％、6％、8％、10％的条件下发酵，在发酵进行4d、5d、6d和7d后进行取样，发酵结束测定各时间段样品蛋白含量，确定最佳菌种接种量。
1.3.5不同氮源对蛋白质含量的影响
在相同的酒糟添加量、pH、接种量、菌种接种比例、氮源添加量，在添加的氮源为硫酸铵、尿素、硝酸铵、硫酸铵与尿素等比混合、硫酸铵与硝酸铵等比混合、尿素与硝酸铵等比混合的条件下发酵，在发酵进行4d、5d、6d和7d后进行取样，发酵结束测定各时间段样品蛋白含量，确定最佳氮源。
1.3.6氮源添加量对蛋白质含量的影响
在相同的酒糟添加量、pH、接种量、菌种接种比例、氮源种类，在氮源添加量为6.7g/l、10g/l、13.3g/l的条件下进行发酵，在发酵进行4d、5d、6d和7d后进行取样，发酵结束测定各时间段样品蛋白含量，确定最佳氮源添加量。
2结果与分析
2.1发酵时间对蛋白质含量的影响
按实验1.3.1的条件，设置1、2、3号三个平行培养基，发酵3d、4d、5d、6d和7d进行取样并利用双缩脲法测定蛋白质含量，各组蛋白质含量及变化趋势见图1。
由图1可知三个平行实验的结果有一定的差异，但总体的趋势是发酵6d后SCP达到最大值，随后不再增加，开始出现下降。因为微生物在生长过程中要经历迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期，菌种在混合发酵过程中达到稳定生长期时蛋白质含量最高，到达衰亡期时，其发酵能力大大下降且有菌体衰老死亡及自溶的情况。因此，发酵6d是SCP回收的合理时间点。
2.2菌种接种比例对蛋白质含量的影响
按照1.3.2确定的实验条件，进行菌种接种比例(里氏木霉：酿酒酵母)的实验探究，在发酵进行3d、4d、5d、6d和7d后进行取样并用双缩脲法测定蛋白质含量，各组蛋白质含量及变化趋势见图2。
由图2可看出里氏木霉与酿酒酵母接种比在3:1时SCP产量始终高于其他组，且该组SCP稳定时间较长，在6-7d仍有轻微上升。推测应是接种比为3:1的组里氏木霉对酒糟的糖化作用较充分，给酵母发酵提供了充足的葡萄糖，而且里氏木霉的生物量较适宜，没有过多消耗酵母用于自身生存及发酵需要的其他营养物质。观察到接种比为5:1的组蛋白质含量低于3:1组且在5d后SCP开始下降，原因可能是里氏木霉生物量过多而消耗了较多营养物质，与酵母的生长形成一定的竞争关系，从而影响了SCP产量。1:3组与1:5组蛋白质含量低的原因应是里氏木霉接种量较少，对酒糟的糖化不够充分，酵母后期可利用的葡萄糖较少。1:1组发酵效果最不理想，应该是两种菌的接种量均较少，对酒糟的糖化及后期的发酵都不够充分。
2.3延迟接种时间对蛋白质含量的影响
按照1.3.3及接种比3:1的条件进行实验，探究最佳延迟接种时间，在发酵进行4d、5d、6d和7d后进行取样并用双缩脲法测定SCP，各组SCP及变化趋势见图3。
由图3可观察到，延迟接种时间24h组蛋白质含量总体高于其他组，且该组蛋白质含量稳定时间较长，在发酵进行中后期蛋白质含量仍有轻微的上升。推测可能是里氏木霉对酒糟进行24h糖化使得酒糟中的纤维素被分解较充分，从而发酵前期培养基中可供酵母利用的葡萄糖含量较高，利于酵母的增殖。36h组与24h组在中后期蛋白质含量相近，但36h组略低，推测原因是里氏木霉对酒糟的分解水平是有限的，多分解出的葡萄糖不能弥补里氏木霉在单独对酒糟进行糖化时多利用的培养基中其他营养物质，从而对之后酵母的增殖略有不利影响。0h与12h组蛋白质含量较低的原因应是里氏木霉对酒糟分解不充分且与酵母竞争其他营养物质。
2.4菌种接种量对蛋白质含量的影响
按照1.3.4及接种比3:1，延迟接种时间24h的条件进行实验，探究最佳菌种接种量，在发酵进行4d、5d、6d和7d后时进行取样并用双缩脲法测定SCP，各组SCP变化趋势见图4。
由图4可看出，从整体看4％组发酵效果最理想，该组在7d达到峰值，其他组均是在6d到达峰值，之后便有明显的下降，推测应该是发酵培养基配方中其他营养物质较少，不足以支撑较多的真菌的生存，而4％组菌种接种量最少，个体间对营养物的竞争相对缓和，因此发酵可以较好的进行。
2.5不同氮源对蛋白质含量的影响
按照1.3.5及接种比3:1，延迟接种时间24h，接种量4％，氮源添加量10g/l(混合组每种氮源添加量为5g/l)的条件进行实验，探究最佳氮源，在发酵进行4d、5d、6d、7d时进行取样并用双缩脲法测定SCP含量，各组SCP变化趋势见图5。
由图5可知硝酸铵和硫酸铵等比混合组整体发酵效果最好，该组SCP含量在发酵进行6d达到峰值。细胞干物质中氮含量仅次于碳和氧，氮是组成酵母单细胞蛋白质的重要。元素，实验中的里氏木霉和酵母均可利用NH4 +，NO3 -和有机氮类物质作为氮源，但氮源的加入必须在微生物生长发育及代谢合适的碳氮比下才可很好的进行，这与氮源的种类选择及添加量均有关。实验先进行的是对氮源种类的探究，在氮源添加量均为10g/l的条件下，可判断出硝酸铵与硫酸铵等比混合组最佳。除此之外值得注意的是，添加有脲的几组在发酵进行6d便开始检测到其培养基pH有上升趋势，在发酵进行7d时pH已由初始的5.0上升到7.5左右，因此推测相关组蛋白质含量较低的原因与pH变化有关，脲在代谢过程中产生氨等物质可使其周围环境pH升高，而酵母增殖及生存的最佳pH在5.0-6.0，发酵进行中后期菌种生长逐渐进入衰亡期，对氨类的利用能力下降，因此可能造成含氮物堆积从而使培养基pH上升，继而影响发酵及蛋白质产量。
2.6氮源添加量对蛋白质含量的影响
按照1.3.6及接种比3:1，延迟接种时间24h，接种量4％，氮源种类为等比硝酸铵与硫酸铵的条件进行实验，探究最佳氮源添加量，在发酵4d、5d、6d、7d后进行取样并用双缩脲法测定SCP，各组SCP变化趋势见图6。
由图6可知，13.3g/l组蛋白质含量整体高于其他组，但因观察到10g/l组蛋白质含量明显高于6.7g/l组而13.3g/l组仅略高于10g/l组，因此从经济效率来看应选择10g/l的氮源添加量。与2.5原因相同，氮源添加量影响培养基的碳氮比，从而影响SCP产量。
3结论
因为生产条件要求相对简单，又能最大程度地利用原本废弃的酒糟产生高蛋白含量的饲料，使得利用微生物对白酒糟发酵成为目前白酒糟利用研究的主要趋势。实验利用里氏木霉与酿酒酵母对白酒糟进行发酵提高其单细胞蛋白含量，确定了发酵6dSCP达到峰值，里氏木霉与酿酒酵母的最佳接种比例为3:1，最佳延迟接种时间为24h，最佳菌种接种量为4％，最佳氮源种类为硝酸铵与硫酸铵等比混合，最适氮源添加量为10g/l。经过条件优化后，每33.3g酒糟可生产SCP 26.7g。

Claims (1)

1.一种里氏木霉与酿酒酵母混合发酵白酒糟生产单细胞蛋白的方法，其特征在于，先将里氏木霉接种到含白酒糟的发酵培养基中进行发酵，间隔24h后再将酿酒酵母接种到白酒糟中继续发酵，总发酵时间5-6d，里氏木霉和酿酒酵母总接种量为4%，其中，里氏木霉和酿酒酵母接种生物量比例为3:1；所述里氏木霉（Trichoderma reesei）为Rut-C30，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为INVSc1；所述发酵培养基的组成为：酒糟33.3g/L、氮源12g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁 0.6g/L、氯化钙 0.6g/L、柠檬酸缓冲液0.05mol/L、Mandels微量元素0.17ml/L、葡萄糖1g/L、余量为水，所述氮源为硫酸铵和硝酸铵等比混合。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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