CN116354520A - 丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水中的应用，具体是指，丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水UHS‑LW中的应用。本发明提供了丛毛红曲菌在提高超高浓度白酒废水发酵产物乙醇含量中的应用和提供了一株用于处理超高浓度白酒废水UHS‑LW的丛毛红曲菌，该丛毛红曲菌是从酱香白酒酿造环境中获得的，编号为YX‑1125，是一种极端丝状真菌，其保藏号为CGMCC 21938。本发明通过预处理、工艺和代谢三个维度的优化，得到不经过糖化直接发酵UHS‑LW生产短链脂肪酸的最佳条件，为高浓度酿酒废水的资源化利用提供理论依据和技术支持。

Description

丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水中的应用
本申请是申请日为2021年05月07日、申请号为202110493528.7、发明名称为《红曲霉菌在处理超高浓度白酒废水中的应用》的分案申请。
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水中的应用。
背景技术
酱香型白酒与苏格兰威士忌、法国科涅克白兰地并称世界三大名酒。这种蒸馏酒的生产源自精选本地有机作物，是传承数百年的传统酿造工艺与本地独有微生物菌群的精密结合。然而，这种独一无二的酿造工艺和独特的微生物菌群同样也导致了独特的代谢副产物累积。一种散发着刺鼻气味且高粘度的黑棕色废液是酱香酒的酿造过程中的主要副产物之一。这种废水又被称为酱香黄水、窖底水或渗滤废水，目前并没有正式统一名称。
通过前期研究，本发明解析了这种废水的主要构成与特征，探明其主要含有大量可溶性有机物，如多糖(＞60g/L，主要为淀粉和甘露聚糖)、有机酸(＞80g/L，主要为乳酸和乙酸)、乙醇(＞30g/L)和甘油(＞50g/L)等，这些高浓度的可溶性有机物导致其化学需氧量通常超过350000mg/L，因此命名为超高浓度白酒废水(Ultra-High-StrengthLiquorWastewater,UHS-LW)。UHS-LW的不恰当处理会导致严重的环境问题，如地下水与饮用水污染，地面植被破坏等。更为严重的是，环境的改变可能会导致酿酒产业赖以为生的独特微生物群落构成发生不可逆的改变，进而导致白酒质量的恶化，最终危及整个产业。
然而，目前处理这种废水的效率及其低下且成本及其高昂。依照2020年贵州省仁怀市白酒污水处理收费标准，UHS-LW属于废水浓度梯度4级，处理费用高达600元/吨，是普通城市污水处理费用的300倍以上。通过初步研究发现，其原因是除了极高的COD值以外，UHS-LW还具有高醇度(＞3％)、高酸度(pH＜3.5)和高盐度(大于3％)的多重极端环境特征，常规污水处理中的厌氧/好氧微生物难以在这种极端环境中存活，导致了高昂的成本与低下的处理效率。
最优的处理办法是将UHS-LW中蕴含的大量生物能和有机物转化为高价值的产品。通过这种办法，降低环境污染、减轻废水处理费用与回收宝贵生物资源能够同时实现。近年来，利用各种有机废水或者工农业废弃物生产短链脂肪酸(Short-Chain FattyAcids，SCFAs)已经成为国内外的研究热点。短链脂肪酸是一种碳原子在2-6之间的有机酸，广泛运用于食品，化工，饲料和医药领域，也是合成多种化工产品的前体。特别是近年来，关于短链脂肪酸与人类健康的相关研究方兴未艾，微生物发酵产生的短链脂肪酸被认为是一种能够治疗多种疾病的益生元，被认为具有极高的经济与健康价值。然而，由于同时存在高浓度的无机盐，有机酸和乙醇等发酵抑制物，极少有微生物能够在UHS-LW中存活。如果能够筛选出一种微生物，能够耐受UHS-LW中的多重环境压力，并将其中的高浓度有机物转化为短链脂肪酸，这将对UHS-LW的资源化利用具有重大的意义。
能够生长在极端环境中的微生物，统称为极端微生物。由于具有独特的基因类型、特殊的生理机制及特殊的代谢产物，极端微生物在工业、农业、环保等领域拥有巨大的应用潜力。然而，目前国内外相关报道大多局限于研究应对单因子环境胁迫下的极端微生物(如嗜热菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜盐菌等)，应对多因子环境胁迫的极端微生物罕见报道。酱香白酒独特的极端高温制曲、多轮次堆积发酵、高温厌氧发酵等酿酒环境长期对酿酒微生物进行驯化，各种微生物经过遗传、变异、消长和衍化等微生物群落的演替，促成了酿酒微生态环境中丰富的耐盐度、耐高酸度和耐高醇度等极端微生物的富集。
发明内容
本发明的目的是提供丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水中的应用及一株实现该应用的丛毛红曲菌YX-1125，以克服现有技术的不足。
本发明提供了丛毛红曲菌(Monascuspilosus)在提高超高浓度白酒废水发酵产物短链脂肪酸的转化率中的应用，丛毛红曲菌发酵处理超高浓度白酒废水时添加维生素C，所述丛毛红曲菌的保藏号为CGMCC21938。
本发明提供了一种缓解丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水时出现的代偿生长的方法，丛毛红曲菌处理超高浓度白酒废水时添加维生素C，所述丛毛红曲菌的保藏号为CGMCC21938。
本发明提供了丛毛红曲菌在提高超高浓度白酒废水发酵产物乙醇含量中的应用，丛毛红曲菌发酵超高浓度白酒废水时控制溶氧度，所述溶氧度为未控制前溶氧度的一半，所述丛毛红曲菌的保藏号为CGMCC21938。
本发明提供了丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水UHS-LW中的应用，该丛毛红曲菌是从酱香白酒酿造环境中获得的，编号为YX-1125，是一种极端丝状真菌，其保藏号为CGMCC21938。
本发明是这样实现的：
本发明提出红曲霉菌在处理超高浓度白酒废水中的应用。具体是指，丛毛红曲菌在处理超高浓度白酒废水UHS-LW中的应用。其中，这里的红曲霉菌包括Monascus ruberATCC 16246(AY498574)、Monascus aurantiacus CICC 5014(AY629435)、Monascuspurpureus ATCC 16379(AY498573)、Monascus pilosus ATCC 16363T(AY498581)、Monascus sanguineus ATCC 200613T(AY498586)、Monascus lunisporas ATCC 204397(AY498583)、Monascus eremophilus ATCC62925T(AY498584)、Monascus pallens ATCC200612T(AY498585)、Monascusflori danus IMI 282587(AY629418)之一。
最为一种最优方案，本发明提供了一株用于处理超高浓度白酒废水UHS-LW的丛毛红曲菌，该丛毛红曲菌是从酱香白酒酿造环境中获得的，编号为YX-1125，是一种极端丝状真菌，其保藏号为CGMCC 21938，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为：2021年03月29日。
在前期工作中，本发明通过筛选与纯化从酱香白酒酿造环境中获得了一株编号为YX-1125，能够在UHS-LW中生长良好的极端丝状真菌。经中国工业微生物保藏中心的真菌形态鉴定与ITS和BenA序列分析，确定其为丛毛红曲菌(Monascuspilosus)。使用GC-MS分析其代谢产物构成，发现主要为短链脂肪酸(80％以上)、与副产物醇类(丁醇、丙醇和乙醇)。
初步研究发现，相比其它文献报道的利用废水生产短链脂肪酸生产菌种或菌群，丛毛红曲菌YX-1125拥有三大主要优势：①多重极端环境耐受：能够耐受高盐、高酸和高醇等环境胁迫因子导致的多重极端环境；②广谱碳源利用：能够直接利用包括淀粉，葡萄糖，甘露聚糖，甘油，乳酸等在内的多种碳水化合物进行发酵；③高丁酸占比：短链脂肪酸的构成主要为丁酸和丙酸，其中丁酸的占比在85％以上。结果表明，利用菌种YX-1125，只需加入10g/L尿素，即可以在不进行预处理和没有外源添加的情况下直接将UHS-LW中的多种碳水化合物直接发酵为短链脂肪酸，其最终短链脂肪酸浓度可达19.8g/L，是目前文献报道的利用废水生产短链脂肪酸的最高值。且短链脂肪酸中附加值最高的丁酸占比85.3％，同时UHS-LW中的COD降低了85.1％，展示了良好的应用潜力。
然而，目前的最终短链脂肪酸浓度离工业化有机酸生产的要求仍有一定的距离。由于目前结果中短链脂肪酸的转化率仅为7％左右，利用菌种YX-1125发酵UHS-LW生产短链脂肪酸的效率仍有很大的提升空间。在前期工作中，申请人发现YX-1125对盐度，酸度和醇度等发酵环境胁迫因子对的耐受程度各不相同，而不同强度的环境胁迫能够影响到最终短链脂肪酸的构成。此外，本发明发现改变部分发酵条件，能够极大的影响最终的发酵结果。例如，将发酵过程中的溶氧度降低一半，其副产物乙醇的产量将会提高14倍，从0.77g/L提高到10.82g/L，而短链脂肪酸的产量将会降低50％以上。申请人还发现，虽然YX-1125能够耐受UHS-LW中的多重极端环境，但是也导致了大量的菌体累积(50g/L以上)，这表明该菌体为了应对极端环境进行了代偿性生长。而这种代偿生长将会导致更多的代谢流进入菌体构建相关代谢如蛋白质合成代谢和多糖合成代谢，更少的代谢流进入逆向脂肪酸β氧化循环(ReversedBeta-Oxidation,r-BOX)，该循环是生物生成短链脂肪酸的主要合成途径，最终导致较低的短链脂肪酸产量。而通过在预实验中添加外源维生素C，可以有效缓解YX-1125的代偿生长，提高短链脂肪酸的转化率，这似乎暗示了氧化还原失衡是菌体代偿性生长和较低短链脂肪酸产量的内在原因之一。以上结果表明，通过改变环境胁迫因子的强度、优化发酵工艺条件、和改善短链脂肪酸代谢中的氧化还原失衡，可以提高YX-1125发酵UHS-LW的短链脂肪酸产量和转化率。
该菌种能够耐受UHS-LW中的多重极端环境，并将废水中的复杂碳水化合物其转化为高丁酸占比的短链脂肪酸。但是，该菌种的发酵机理还有待进一步明确，发酵过程还需进一步优化。通过研究不同环境胁迫的去除和弱化与短链脂肪酸产生量的关系，得出最有利于短链脂肪酸产生的预处理策略；从发酵工艺的角度，分别研究氧气供给、菌体形态和发酵模式影响YX-1125发酵UHS-LW的机理；从转录组学，代谢组学和胞内氧化还原平衡角度出发，研究多重极端环境对短链脂肪酸的主要合成途径r-BOX的影响，在此基础上提出能够减轻代谢负担的理性外源添加策略，提高短链脂肪酸的转化率。最终，通过预处理、工艺和代谢三个维度的优化，得到不经过糖化直接发酵UHS-LW生产短链脂肪酸的最佳条件，为高浓度酿酒废水的资源化利用提供理论依据和技术支持。
生物保藏证明
丛毛红曲菌(Monascuspilosus)，编号为YX-1125，保藏号为CGMCC 21938，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为：2021年03月29日。
附图说明
图1为YX-1125的宏观形态图；
图2为YX-1125的微观形态图；
图3为菌种YX-1125对UHS-LW中主要碳水化合物利用情况图。A.乳酸、甘油、淀粉作为唯一碳源进行单独培养；B.乳酸、甘油、淀粉的混合培养；
图4为菌种YX-1125对UHS-LW中主要环境胁迫因子的耐受性图。A.乙醇；B.有机酸；C.无机盐；D.多重环境胁迫发酵；
图5为菌种YX-1125发酵条件优化。A.B.温度对短链脂肪酸产量和COD去除的影响图；C.D.尿素添加对短链脂肪酸产量和COD去除的影响；
图6为重复批次发酵模式中YX-1125的表现示意图；
图7为YX-1125与ITS rDNA序列系统发育树；
图8为YX-1125与相关种的BenA基因序列系统发育树。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的任何限制。
实施例1：
(1)极端微生物的筛选与鉴定
从与UHS-LW环境相似的酱香白酒酿造生产线中，筛选出了一株能够在UHS-LW中生长，并能耐受多重极端环境的短链脂肪酸生产菌种。经过中国工业微生物保藏中的真菌多相形态学鉴定(见图1和2)和丝状真菌BenA基因检测，丝状真菌ITS rDNA检测，最终通过系统发育学分析认定为从毛红曲霉(Monascus pilosus)。
2.1YX-1125的宏观形态如图1所示。MEA培养基上，25℃培养7天，菌落直径49-53mm，灰白色；表面平坦；质地丝绒状；反面周围浅黄色，中央灰色；无渗出液产生，无可溶性色素产生。
2.2YX-1125的微观形态如图2所示。菌丝不规律分枝，透明无色，壁平滑，有横隔，宽度为2.5-5.0μm；分生孢子着生在小梗上或菌丝顶端，单生或链生，无色，壁平滑，倒梨形或近球形，长轴直径4.5-10μm；闭囊壳近球形，直径26-30μm。
2.3菌株“YX-1125”与相关种的ITS rDNA序列系统发育树。采用MEGA5.0软件，邻位连接法显示菌株“YX-1125”与相关种的ITS rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于70％数值，上标“T”代表模式菌株，见图7。
2.4菌株“YX-1125”与相关种的BenA基因序列系统发育树。采用MEGA5.0软件，邻位连接法显示菌株“YX-1125”与相关种的BenA基因序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算检验，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于70％数值，上标的“T”表示模式菌株，见图8。
(2)预实验：菌种YX-1125对UHS-LW中主要碳水化合物利用情况
经检测，UHS-LWW中存在的主要碳化合物是乳酸、甘油和淀粉。如图3中A部分所示，YX-1125均能利用UHS-LW中的主要碳水化合物生产短链脂肪酸。其中，利用乳酸产的短链脂肪酸浓度最高，淀粉吸收最快，但是短链脂肪酸产量最低，甘油介于两者之间。值得注意的是，在将这三种碳水化合物进行混合培养时(图3中B部分)，发现了葡萄糖代谢阻遏效应，证明YX-1125在多种碳水化合物同时存在时会优先将淀粉水解为葡萄糖后作为优先碳源。
(3)预实验：菌种YX-1125对UHS-LW中主要环境胁迫因子的耐受性
经检测，UHS-LW中主要的环境胁迫因子为乙醇，有机酸(乳酸+乙酸)和无机盐(氯化钠+磷酸钾)。其中，乙醇被认为是一种会被细胞膜，线粒体，关键代谢酶造成不可逆损伤的微生物抑制剂；有机酸，特别是乙酸，被认为能够通过破坏微生物细胞膜通透性直接抑制微生物生长；高浓度的无机盐能够通过高渗透压让微生物失水，从而失去活性。通过在模拟废水中添加乙醇、有机酸和无机盐，评估了菌种YX-1125对这些环境胁迫因子的耐受能力。结果如图4所示，YX-1125能够分别耐受高浓度的乙醇、有机酸和无机盐，并在多重环境胁迫因子存在的情况下，短链脂肪酸和菌体干重均有上涨，表现出良好的多重极端环境耐受性。
(4)预实验：发酵条件优化
通过预实验调控发酵温度与尿素添加，考察其对YX-1125发酵真实UHS-LW废水生产短链脂肪酸和COD去除的影响，优化结果用于本发明中。结果如图5所示，由于菌种YX-1125筛选酱香白酒生产中的自高温堆积发酵中，因此能够适应较高的发酵温度，但是继续提高温度短链脂肪酸产量并没有显著上升，并且COD去除率还有一定下降，因此最适温度定为35℃。而氮源添加对YX—1125的短链脂肪酸产量和COD去除均有非常明显的影响，最终氮源添加量为6.0g/L，此时的COD去除率可达80.5％。
(5)发酵过程优化预实验：重复批次发酵
项目申请人首先试验了重复批次发酵模式，以考察发酵过程控制是否会对短链脂肪酸生产造成影响。结果如图6所示，当重复批次达到第5次时，短链脂肪酸产量达到了最高值19.8g/L，对应产率4.95g/L/d，其中丁酸占比高达89.5％。其产量和产率均达到了目前文献报道的废水生产短链脂肪酸的最高水平，显示出了巨大的优化潜力。
初步推测有三个原因导致了高浓度的短链脂肪酸生产，首先是高浓度的发酵底物，相比其它文献所报道的利用废水生产短链脂肪酸所用废水的中碳水化合物含量一般在30g/L以下，而我们的底物碳水化合物浓度达到了260g/L以上，这让YX-1125即使在较低的转化率(7％左右)的情况下，仍然得到了较高的短链脂肪酸最终浓度。第二个原因可能是因为采用的单菌种发酵策略，而大部分文献报道的实验中，均采用从污泥池或野外采集的混合菌种发酵，这种野生混合菌种中不但含有短链脂肪酸生产菌种，还含有短链脂肪酸消耗菌种(如甲烷菌)，使得发酵中的短链脂肪酸的浓度处于一个动态变化中。而本发明采用的单菌种发酵策略规避了短链脂肪酸消耗菌种的存在，使得短链脂肪酸能够累积到一个比较高的浓度，目前文献报道的较高短链脂肪酸最终浓度均采用单菌种发酵模式。第三个原因是有氧发酵策略。而大部分文献均使用厌氧发酵模式。而众所周知，因为三羧酸循环的存在，好氧微生物的代谢强度远大于厌氧微生物。相反的，当我们减少发酵过程中的氧气供给时，其副产物乙醇增加了14倍，而且短链脂肪酸的产量也明显下降，如图6中B部分所示。该结果暗示了YX-1125的短链脂肪酸合成对有氧呼吸依赖度较高，通过进行发酵过程控制优化可进一步提高短链脂肪酸产量。
以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.丛毛红曲菌(Monascuspilosus)在提高超高浓度白酒废水发酵产物短链脂肪酸的转化率中的应用，其特征在于，丛毛红曲菌发酵处理超高浓度白酒废水时添加维生素C，所述丛毛红曲菌的保藏号为CGMCC 21938。
2.一种缓解丛毛红曲菌(Monascuspilosus)在处理超高浓度白酒废水时出现的代偿生长的方法，其特征在于，丛毛红曲菌发酵处理超高浓度白酒废水时添加维生素C，所述丛毛红曲菌的保藏号为CGMCC 21938。
3.丛毛红曲菌(Monascuspilosus)在处理超高浓度白酒废水UHS-LW中的应用，其特征在于，该丛毛红曲菌是从酱香白酒酿造环境中获得的，编号为YX-1125，是一种极端丝状真菌，其保藏号为CGMCC 21938。
4.丛毛红曲菌(Monascuspilosus)在提高超高浓度白酒废水发酵产物乙醇含量中的应用，其特征在于，丛毛红曲菌发酵超高浓度白酒废水时控制溶氧度，所述溶氧度为未控制前溶氧度的一半，所述丛毛红曲菌的保藏号为CGMCC 21938。
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