CN104774879A

CN104774879A - 一种混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法

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Publication number: CN104774879A
Application number: CN201510212125.5A
Authority: CN
Inventors: 修志龙; 刘会芳; 陈洋; 姜莉莉; 孙亚琴
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN104774879B

Abstract

本发明提供了一种利用混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法，该方法将保藏号分别为CGMCC NO.10440、10439和10438的肺炎克雷伯氏菌W3、Y1和Y5，在以甘油为底物的发酵培养基中混合发酵生产1,3-丙二醇。本发明的混菌具有良好的底物耐受性，且发酵产物中副产物较少，尤其是不含2,3-丁二醇，有利于主产物1,3-丙二醇的分离。本发明方法克服了单一菌株底物耐受性差的缺点，提高了生产效率，产物不含2,3-丁二醇，避免了后期分离中的难题，混菌可耐受甘油浓度达到200g/L，1,3-丙二醇产量达到81.40g/L。该方法有望为微生物发酵法生产1,3-丙二醇的工业化提供简单经济的发酵工艺。

Description

一种混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种利用混菌发酵生产1,3-丙二醇的方法。

背景技术

1,3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，广泛应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，还可用作医药和有机合成的中间体。1,3-丙二醇还可作为聚合物单体合成高分子材料，特别是合成性能优异的新型聚酯纤维聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT被认为是一种兼具聚对苯二甲酸乙二酯(PET)的高性能和聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)的易加工性的新型聚酯材料，并且具有自然循环的可生物降解特性，是目前合成纤维新品种开发的热点。这些都表明1,3-丙二醇有着良好的应用前景，但价格偏高却阻碍了其广泛应用。

1,3-丙二醇的生产方法可分为化学合成法和微生物发酵法。化学法是用化工原料经过一系列化学催化反应，最终合成1,3-丙二醇；生物法是指微生物利用可再生的原料甘油或者葡萄糖转化为1,3-丙二醇，相对化学法工艺路线，微生物发酵法具有原料可再生、污染小和成本低等优点，故成为现在1,3-丙二醇生产研发的热点。至今所有被发现的1,3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有较高的1,3-丙二醇转化率和生产强度，而且对底物和产物具有较高的耐受性，因此具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。目前生产1,3-丙二醇的微生物法大致可分为三类：一是用肠道细菌将甘油歧化为1,3-丙二醇(USP5254467；EP0373230A1；ZL01117282.7)；二是以葡萄糖为底物利用基因工程菌生产1,3-丙二醇(PCT/US 96/06705；USP5599689；USP6025184；WO 96/35796；WO9821340；WO9821339；ZL96195288)；三是将生产甘油和生产1,3-丙二醇的两株菌混合培养(USP5599689)。这些方法各有优缺点，第一种方法的产物转化率较高，但菌种对甘油的耐受性较低，产物浓度有待提高；第二种方法可以降低原料成本，产物浓度较高，但基因工程菌的稳定性还有待进一步验证；第三种方法有助于减少两步发酵的时间，但由于两种菌的生长条件不尽相同，如产甘油菌通常在好氧条件下生长，而产1,3-丙二醇菌通常在厌氧条件下生长，前者的底物葡萄糖对后者有抑制作用，二者的最适pH和温度也存在差异，因此很难取得较为理想的效果。

以廉价的粗甘油(如生物柴油的副产物)为底物，通过从活性污泥中筛选出的混菌发酵生产1,3-丙二醇被证明是可行的。如Margarida F.Temudo等人(Biotechnology and Bioengineering,2008,100(6):1088-1098)利用从酒厂废水和土豆淀粉加工厂污泥中的混菌进行甘油发酵，其利用的甘油浓度仅为4～25g/L，且其主产物为乙醇，1,3-丙二醇的转化率相当低，仅为0.16mol/mol；Priscilla A.Selembo等人(Biotechnology and Bioengineering,2009,104(6):1098-1106)利用来自土壤、堆肥和污泥中的混菌来生产氢气和1,3-丙二醇，但其可利用的甘油浓度很低，仅为3g/L。另有学者将1,3-丙二醇菌和甲烷菌在一个发酵罐的两侧同步发酵(Bioprocess Biosyst Eng,2010,33:507-523)，利用甲烷菌解除有机酸对甘油发酵的抑制，有利于后续分离，但发酵效果并不显著。

目前，使用高浓度甘油发酵生产1,3-丙二醇也有了一些研究。CN102421907A公开了一种经遗传修饰的丙酮丁醇梭菌，以90-120g/L，优选约105g/L的初始甘油浓度连续发酵，产物中1,3-丙二醇仅为32.68g/L，生产强度为2g/(L.h)。Donna Dietz等人(Bioprocess Biosyst Eng,2014,37:225-233)利用选自沼气池污泥中的混菌进行高浓度甘油发酵，但其最高耐受甘油浓度仅为95g/L，且在24h左右仅能消耗约50g/L甘油，随后便不再消耗。马彬彬等考察了甘油浓度对克雷伯氏杆菌的生长及合成1,3-丙二醇的影响，经多次甘油耐受后消耗最高甘油浓度113.98g/L，产生1,3-丙二醇51.89g/L，摩尔转化率为0.55mol/mol，生产强度为0.72g/(L.h)，而副产物较多，乳酸11.19g/L，乙酸10.61g/L，丁二酸7.09g/L(食品与发酵工业,2008,34(3):37-39)。赵红英等也研究了初始甘油浓度对克雷伯氏杆菌发酵生产1,3-丙二醇的影响，其最高耐受甘油浓度仅为102.1g/L，且在长达64h后仅能消耗约36.8g/L甘油，随后便不再消耗。此文中克雷伯氏杆菌以11.7～102.1g/L，优选约59.1g/L的初始甘油浓度存在，此时1,3-丙二醇浓度和转化率分别可达19.8g/L和0.492mol/mol；在较高甘油初始浓度(72.6g/L)的情况下，经驯化培养获得的耐底物抑制菌株，可将最终1,3-丙二醇浓度和转化率分别提高到22.9g/L和0.530mol/mol；采用流加甘油发酵工艺，1,3-丙二醇浓度和转化率分别可提高到30.2g/L和0.625mol/mol(现代化工,2002,22(7):34-38)。

在克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇的过程中，细胞的生长受到底物甘油和多种产物的抑制作用。克雷伯氏肺炎杆菌在利用甘油合成1,3-丙二醇的同时还合成2,3-丁二醇、乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)、乙醇、琥珀酸、乙酸和乳酸等副产物，副产物的合成消耗大量的底物，降低了转化率，同时给1,3-丙二醇的分离提取带来沉重的负担(Applied microbiology and biotechnology,2008,78(6):917-926；生物技术,2014,24(1):92-96)。在副产物中，有机酸使得发酵过程中发酵液的pH值不断下降，影响菌体的生长(生物工程学报,2011,27(3):493-501)，其中以乳酸的产量最多，野生型克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇的过程中乳酸产量可达40g/L以上；副产物乙酸对发酵的抑制作用最强烈，6g/L的乙酸即能显著抑制细菌生长与发酵，研究报道7.6g/L乙酸能减少50％细菌生长，培养基中15g/L乙酸可完全抑制细菌生长。大量副产物的生成不但对细胞生长不利，还会造成底物甘油的浪费(CN 103146740A)。

需要特别提出的是2,3-丁二醇，因其与1,3-丙二醇的结构和性质相似，沸点比较接近，导致二者分离难度很大。Zhang等通过基因工程手段敲除2,3-丁二醇途径来增加1,3-丙二醇的转化率，但与野生菌株相比，其副产物也明显增加(Appl Biochem Biotechnol,2012,168:116-128)。Cui等也证明敲除2,3-丁二醇途径更趋于增加乳酸的产量，而过量的乳酸会阻止细胞利用敲除2,3-丁二醇途径得到的过量NADH，并且会抑制细胞生长，从而影响1,3-丙二醇的产生(Journal of Applied Microbiology,2014,117:690-698)。Wu等通过插入甲酸脱氢酶基因使乙偶姻还原酶失活，从而使2,3-丁二醇和甲酸减少，但并没有完全阻止其产生(Journal of Biotechnology,2013,168:194-200)。

综上所述，分离筛选底物耐受性好、副产物少、PDO发酵性能优、生产强度高的菌种，采用批式或连续发酵生产PDO仍然具有重要的实用价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法，该方法具有良好的底物耐受性，且发酵产物中副产物较少，尤其是不含2,3-丁二醇，有利于主产物1,3-丙二醇的分离等特点。

本发明所述的混菌是从大连海域采集的海泥样品中通过多次富集筛选得到的、含有肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)W3(保藏号为CGMCC NO.10440)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)Y1(保藏号为CGMCC NO.10439)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)Y5(保藏号为CGMCC NO.10438)的三种细菌，该三种细菌于2015年1月26日均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的：

一种利用混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法，该方法是将保藏号为CGMCC NO.10440的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)W3、保藏号为CGMCC NO.10439的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)Y1和保藏号为CGMCC NO.10438的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)Y5，在以甘油为底物的发酵培养基中混合发酵生产1,3-丙二醇。

进一步地，所述肺炎克雷伯氏菌W3、肺炎克雷伯氏菌Y1和肺炎克雷伯氏菌Y5的接种量比例为150～250:10～20:50～100，优选比例为208:17:82。

进一步地，混合发酵的甘油起始浓度为20～200g/L，优选为100～120g/L，更优选为120g/L。

本发明的利用混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法，优选的技术方案包括如下步骤：

(1)将斜面培养的肺炎克雷伯氏菌W3、肺炎克雷伯氏菌Y1和肺炎克雷伯氏菌Y5分别接种至种子培养基中，在37℃、200r/min下摇床培养10～15h，分别得所述三种菌的种子培养液；

(2)将三种菌的混合种子培养液按8～10％的体积比接种至发酵培养基中，在37℃、250r/min和氮气通量0.2vvm的条件下进行发酵；其中所述混合种子培养液中肺炎克雷伯氏菌W3、肺炎克雷伯氏菌Y1和肺炎克雷伯氏菌Y5的接种量比例为150～250:10～20:50～100。

上述利用混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法中所采用的培养基如下：

种子培养基：甘油20g，KH₂PO₄ 1.3g，K₂HPO₄·7H₂O 4.454g，(NH₄)₂SO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCO₃ 2.0g，1mL Fe²⁺溶液，1mL 20g/L的CaCl₂溶液，酵母粉1g，2.0mL微量元素A溶液，加自来水至1L，其中所述微量元素A溶液的组成为：饱和盐酸0.9mL/L，CuCl₂·2H₂O 20mg/L，ZnCl₂ 70mg/L，MnCl₂·4H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 60mg/L，CaCl₂·6H₂O 200mg/L，NiCl₂·6H₂O 25mg/L，NaMoO₄·2H₂O 35mg/L；所述Fe²⁺溶液的组成为：饱和盐酸4mL/L，FeSO₄·7H₂O 5g/L；

发酵培养基：甘油40g，KH₂PO₄ 1.36g，(NH₄)₂SO₄ 6.61g，MgCl₂·6H₂O 0.26g，CaCl₂ 0.29g，柠檬酸0.42g，酵母粉2g，5mL微量元素B溶液，加自来水至1L，其中所述微量元素B溶液的组成为ZnCl₂ 0.68g/L，MnCl₂·4H₂O 0.17g/L，H₃BO₃ 60mg/L，CuCl₂·2H₂O 0.47g/L，NaMoO₄·2H₂O 5mg/L，FeCl₂·4H₂O3.97g/L，CoCl₂·6H₂O 0.47g/L，HCl 10mL/L。

上述技术方案中所述的接种量的比例是指接种至发酵培养基中的三个细菌菌体数的比例。即本发明所述细菌分别在种子培养基中培养10～15h获得不同OD的种子液后，根据本领域常规方法测定得到培养基中的菌体浓度，并计算得到接种所需菌体数的种子培养液量，然后按照选定的比例将三种细菌共同接入发酵培养基中进行混菌发酵。

本发明中，将海泥样品经多次富集筛选得到1,3-丙二醇生产能力高的混菌NHN8，经进一步纯化分离，确定混菌NHN8含有菌株肺炎克雷伯氏菌W3、肺炎克雷伯氏菌Y1和肺炎克雷伯氏菌Y5，其在海泥中的自然菌体数的比例为208:17:82。经试验发现，三种菌具有不同的形态生长和发酵性能：其中肺炎克雷伯氏菌W3的菌落平滑呈乳白色，生长较快，主产物是1,3-丙二醇，产少量2,3-丁二醇；肺炎克雷伯氏菌Y1的菌落含大而单一的气泡，生长比较缓慢，主产物是乙醇；肺炎克雷伯氏菌Y5的菌落含小而致密的气泡，生长速度介于W3和Y1之间，主产物是1,3-丙二醇和乙醇；Y1和Y5均不产2,3-丁二醇。三种菌株，单独培养发酵时，生长缓慢、对底物的耐受性差、1,3-丙二醇产量低，可耐受甘油浓度仅为20～100g/L，但所述三种菌按一定的比例混合发酵时对底物的耐受能力大幅提高，可耐受甘油浓度高达200g/L，说明本发明所使用的三种菌之间有协同作用，可以提高菌株对底物的耐受性。

本发明涉及的三种菌的混菌在甘油含量为20～200g/L的培养基中生长，并产1,3-丙二醇，优选甘油浓度为120g/L，发酵液中1,3-丙二醇的最终浓度在10g/L～90g/L，而发酵液中未检测出2,3-丁二醇。

本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)混菌所包含的单菌生长条件相同，操作简便；

(2)混菌底物耐受性好，最高耐受甘油浓度为200g/L，间歇发酵能得到较高的产物浓度，具有较高的生产强度；

(3)发酵产物中不含2,3-丁二醇，便于后期产物分离，降低成本；

(4)混菌不易受噬菌体感染，利于工业化生产；

本发明方法克服了单一菌株底物耐受性差的缺点，提高了生产效率，避免了后期分离中的难题，为微生物发酵法生产1,3-丙二醇的工业化提供了简单经济的发酵工艺，是一种具有工业应用前景的生产1,3-丙二醇的方法。

附图说明

图1为三种单菌的菌落图；

图2为混菌批次发酵实验的发酵曲线；

图3为单菌W3批次发酵实验的发酵曲线；

图4为单菌Y1批次发酵实验的发酵曲线；

图5为单菌Y5批次发酵实验的发酵曲线；

图6为混菌在不同起始甘油浓度下的发酵曲线；

图7为单菌W3在不同起始甘油浓度下的发酵曲线；

图8为混菌在起始甘油浓度为120g/L时批次发酵的发酵曲线。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。

以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施方式。

1.下述实施例使用的培养基：

种子培养基(1L)：甘油20g，KH₂PO₄1.3g，K₂HPO₄·7H₂O 4.454g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCO₃ 2.0g，1mL Fe²⁺溶液(饱和盐酸4mL/L，FeSO₄·7H₂O 5g/L)，1mL CaCl₂溶液(20g/L)，酵母粉1g，2.0mL微量元素A溶液(饱和盐酸0.9mL/L，CuCl₂·2H₂O 20mg/L，ZnCl₂ 70mg/L，MnCl₂·4H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 60mg/L，CaCl₂·6H₂O 200mg/L，NiCl₂·6H₂O 25mg/L，NaMoO₄·2H₂O 35mg/L)，其余为自来水。

发酵培养基(1L)：甘油40g，KH₂PO₄ 1.36g，(NH₄)₂SO₄ 6.61g，MgCl₂·6H₂O0.26g，CaCl₂ 0.29g，柠檬酸0.42g，酵母粉2g，5mL微量元素B溶液(ZnCl₂0.68g/L，MnCl₂·4H₂O 0.17g/L，H₃BO₃ 60mg/L，CuCl₂·2H₂O 0.47g/L，NaMoO₄·2H₂O 5mg/L，FeCl₂·4H₂O 3.97g/L，CoCl₂·6H₂O 0.47g/L，HCl 10mL/L)，其余为自来水。

富集培养基(g/L)：酵母粉1.0，蛋白胨5.0，甘油10，NaCl 5.0，K₂HPO₄5.8，MgSO₄·7H₂O 0.2，CaCO₃ 2.0。

固体培养基(g/L)：在种子培养基中加入琼脂15。

2.本发明实施例中涉及的微生物包括：由大连海域海泥中分离得到的混菌NHN8，该混菌由保藏号为CGMCC NO.10440的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)W3；保藏号为CGMCC NO.10439的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)Y1；保藏号为CGMCC NO.10438的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)Y5组成。混菌NHN8中肺炎克雷伯氏菌W3、Y1和Y5的自然菌体数的比例为208:17:82。肺炎克雷伯氏菌W3、肺炎克雷伯氏菌Y1和肺炎克雷伯氏菌Y5三株菌于2015年1月26日均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

3.微生物培养和发酵：

种子培养：将装有100mL种子培养基的250mL三角瓶用纱布和牛皮纸封口，于121℃下灭菌20分钟，冷却后接入斜面所述微生物，于37℃、200r/min摇床中培养(约12小时)，以便获得种子培养液。

摇瓶发酵：将1mL培养12小时的种子培养液接种入含有100mL发酵培养基的250mL揺瓶中，37℃、200r/min摇床中培养24小时后进行产物分析。

发酵罐培养：将种子培养液按照体积比10％接种到含有2L发酵培养基的发酵罐(工作体积5L)中，于37℃、氮气通量0.2vvm、搅拌转速250r/min、流加5M NaOH、维持发酵液pH为7.0的条件下进行发酵。

4.分析方法：

(1)采用高效液相色谱定性和定量分析发酵液中的各种有机酸、糖类和醇类等代谢产物。

发酵液样品预处理：将发酵液利用小型离心机10000r/min离心10分钟，取上清液，将上清液与氯仿按体积比1:1混合，10000r/min再离心10分钟，再取上清，用高纯水稀释至合适的范围，即为液相色谱检测样品。

仪器参数：液相色谱柱为A minex HPX-87H柱，柱温65℃，流动相为5mmol/L H₂SO4，流速为0.6mL/min；检测器为CTO-10vp型折光示差检测器，进样量为20μL。

发酵液各组分含量通过标准曲线计算得到。

(2)甘油含量的测定：采用高碘酸钠氧化法。向1mL的发酵液中加入10mL水，滴加2～3滴酚酞指示剂，加入1M NaOH至粉红色，加入10mL高碘酸钠，于避光环境中反应5min后加入5mL乙二醇终止反应，滴加NaOH至变回原来的粉红色，记录NaOH的用量，据此计算甘油的浓度。

(3)菌体浓度测定：分光光度法测定650nm下的光密度，以浊度表征细胞浓度。

实施例1混菌筛选、菌株分离与鉴定

1.混菌筛选

在大连附近海域随机采集藤壶、海藻、海绵和海泥样品40份，在无菌超净台中，取2g每份样品(藤壶、海藻、海绵需先用无菌研钵研磨成浆状，海泥无需预处理)，分别加入装有50mL富集培养基的250mL三角瓶中，瓶口用纱布和牛皮纸封口。37℃、200r/min摇床培养24小时，获得一级培养物；然后将1mL一级培养物接种到另一个含有种子培养基的三角瓶中，同样条件培养24小时，获得二级培养物；同样条件下进行第三次富集。

采用摇瓶发酵对上述获得的各样品的富集菌液进行筛选，具体方法如下：将富集菌液分别接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，瓶口用纱布和牛皮纸封口，37℃、200r/min摇床中进行种子培养12小时，然后将种子培养液接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，同样条件培养24小时。用高效液相色谱分析检测发酵液中1,3-丙二醇的浓度，从中选出产量较高的16组混菌。

将上述16组混菌种子培养液分别进行三次重复发酵，选出来自海泥、发酵性能稳定、且产量最高的混菌，40g/L甘油浓度下培养24h的发酵液中1,3-丙二醇浓度为16.95g/L，质量转化率为46.70％，将此混菌命名为NHN8。

2.菌株分离与鉴定

将混菌NHN8用稀释涂布法涂布于固体种子培养基的平面皿上，37℃恒温培养24小时，得到3种不同形态的单菌落，菌落形态分别表现为无泡、平滑呈乳白色(图1A)；有泡、气泡大而单一(图1B)；有泡、气泡小而致密(图1C)。然后各挑取长势良好菌落5株，转入种子培养基中，37℃、200r/min摇床中进行种子培养12小时，再将种子培养液接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，同样条件进行发酵培养24小时，并分析检测发酵液中PDO浓度，从中选出产量最高的菌株。

5株菌落形态表现为无泡、平滑呈乳白色的菌株中产量最高的一株菌命名为W3，24h发酵液中PDO浓度为9.59g/L；5株菌落形态表现为有泡、气泡大而单一的菌株中产量最高的一株菌命名为Y1，24h发酵液中PDO浓度为1.58g/L；5株菌落形态表现为有泡、气泡小而致密的菌株中产量最高的一株菌命名为Y5，24h发酵液中PDO浓度为6.73g/L。

分别将W3、Y1和Y5进行染色镜检，均为杆状细菌，革兰氏阴性菌；接着对其进行16S rDNA测序鉴定，结果表明W3、Y1、Y5皆属于克雷伯氏菌属的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号分别为CGMCC NO.10440、CGMCC NO.10439和CGMCC NO.10438。W3、Y1和Y5的16S rDNA序列分别为序列表中的序列1、2和3。

实施例2混菌NHN8的批次发酵

将实施例1中获得的混菌NHN8(其中含有的三种细菌的菌体数比例为W3:Y1:Y5＝208:17:82)接入装有100mL种子培养基的250mL三角瓶中，瓶口用纱布和牛皮纸封口，37℃、200r/min摇床中进行种子培养12小时，获得种子培养液；然后把种子培养液按照10％体积比接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基提前经蒸汽灭菌后冷却。在37℃、250r/min、氮气通量0.2vvm、维持pH为7.0条件下进行发酵培养。发酵过程中，每隔1或2小时取发酵液，用高碘酸钠氧化法测定甘油浓度，用分光光度法测定菌体OD，并将发酵液于10000r/min离心10分钟，取上清进行高效液相色谱分析。

发酵结果如图2所示，混菌NHN8发酵6小时便将40g/L的甘油消耗完，1,3-丙二醇浓度达到20.96g/L，生产强度为3.49g/(L.h)，摩尔转化率为0.69mol/mol；副产物乙醇为1.77g/L，乳酸为0.84g/L，乙酸为1.95g/L，琥珀酸为0.81g/L。可见本发明的混菌NHN8能够高效地生产1,3-丙二醇，且副产物较少，无2,3-丁二醇检出。

实施例3单菌W3的批次发酵

按照实施例2所述的方法，将实施例1中获得的单菌W3接入种子培养基中培养12小时，获得种子培养液，然后把种子培养液按照10％体积比接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中于37℃、250r/min、氮气通量0.2vvm、用5M NaOH维持pH为7.0条件下进行发酵培养。发酵过程中，每隔1或2小时取发酵液，测定甘油浓度和菌体OD，并将发酵液于10000r/min离心10分钟，取上清进行高效液相色谱分析。

发酵结果如图3所示，菌种W3发酵5.3小时便将40g/L的甘油消耗完，PDO浓度达到17.84g/L，生产强度为3.37g/(L.h)，摩尔转化率为0.65mol/mol；副产物2,3-丁二醇为0.3g/L，乙醇为0.77g/L，乙酸为4.04g/L，甲酸为2g/L，乳酸为0.66g/L，柠檬酸为0.56g/L。菌种W3和混菌NHN8的产物及产量有所差异，但1,3-丙二醇生产效率较高，可见它在混菌NHN8中起到主导作用。

实施例4单菌Y1的批次发酵

按照实施例2所述的方法，将实施例1中获得的单菌Y1接入种子培养基中培养12小时，获得种子培养液，然后把种子培养液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养。发酵过程中，每隔1小时取发酵液，测甘油浓度及菌体OD，并将发酵液离心取上清进行高效液相色谱分析。

发酵结果如图4所示，菌种Y1表现出不同于W3的发酵特征，Y1生长缓慢，发酵23小时才将甘油消耗完，且其主产物为乙醇(浓度为12.69g/L)，1,3-丙二醇浓度仅为2.05g/L，乳酸2.93g/L，不产2,3-丁二醇。

实施例5单菌Y5的批次发酵

按照实施例2所述的方法，将实施例1中获得的单菌Y5接入种子培养基于37℃、200r/min摇床中进行种子培养12小时，获得种子培养液，然后把种子培养液按照10％体积比接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中于37℃、250r/min、氮气通量0.2vvm、维持pH为7.0条件下进行发酵培养。发酵过程中，每隔1或2小时取发酵液，测甘油浓度及菌体OD，并将发酵液于10000r/min离心10分钟，取上清进行高效液相色谱分析。

发酵结果如图5所示，菌种Y5表现出介于W3和Y1之间的发酵特征，发酵9.5小时将甘油消耗完，生长速度比W3慢，比Y1快。主要产物是1,3-丙二醇(9.63g/L)和乙醇(7.6g/L)，不产2,3-丁二醇，有机酸中甲酸1.48g/L。1,3丙二醇的产量比W3低，比Y1高，摩尔转化率为0.32mol/mol。

实施例6不同起始甘油浓度下混菌NHN8的批次发酵

按照实施例2所述的方法，将实施例1中获得的混菌NHN8接入种子培养基中于37℃、200r/min摇床中进行种子培养12小时，获得种子培养液；然后把种子培养液按照10％体积比分别接种到含有不同起始甘油浓度、装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，于37℃、250r/min、氮气通量0.2vvm、pH 7.0条件下进行发酵培养。发酵过程中，每隔1-2小时取发酵液，测定甘油浓度和菌体OD，并将发酵液离心取上清进行高效液相色谱分析。

发酵过程中的甘油消耗曲线如图6所示，菌种NHN8有很强的底物耐受性，可以在高达200g/L的甘油浓度下生长，优选底物浓度为120g/L。当底物起始浓度低于120g/L时，甘油消耗较快，发酵用时较少；当底物浓度高于120g/L时，发酵时间延长。发酵液中1,3-丙二醇浓度最高可达81.4g/L，且均不产2,3-丁二醇。

实施例7不同起始甘油浓度下单菌W3的批次发酵

按照实施例6所述的方法，将实施例1中获得的单菌W3接入种子培养基培养12小时，获得种子培养液，然后把种子培养液按照10％体积比分别接种到含有不同起始甘油浓度、装有2L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养。发酵过程中，每隔1～2小时取发酵液，测定甘油浓度和菌体OD，并将发酵液离心取上清进行高效液相色谱分析。

发酵过程中的甘油消耗曲线如图7所示，单菌W3的底物耐受性比混菌NHN8差，可以在低于100g/L甘油浓度下生长。甘油浓度为60-100g/L时，发酵时间均比混菌NHN8的延长，且100g/L情况下甘油没有消耗完，在47h还有23.05g/L甘油，1,3-丙二醇浓度仅为36.25g/L，摩尔转化率为0.42mol/mol，生产强度为0.77g/(L.h)。

实施例8甘油浓度120g/L时混菌NHN8的批次发酵

按照实施例2所述的方法，将实施例1中获得的混菌NHN8接入种子培养基中培养12小时，获得种子培养液，然后把种子培养液以10％接种量加入起始甘油浓度为120g/L的发酵罐中进行发酵。

发酵结果如图8所示，菌种NHN8发酵18.75小时便将甘油消耗完，1,3-丙二醇浓度达到59.74g/L，生产强度为3.19g/(L.h)，摩尔转化率为0.65mol/mol；副产物主要为乙酸(10.83g/L)、乙醇(5.00g/L)、乳酸(3.04g/L)和琥珀酸(3.05g/L)。混菌NHN8具有较强的底物耐受性，1,3-丙二醇的转化率高，生产强度大，且产物中没有2,3-丁二醇。

实施例9不同比例混合的混菌批次发酵

按照实施例2所述的方法，将实施例1中获得的W3、Y1和Y5分别接入种子培养基中培养12小时，获得种子培养液，然后将它们以如表1所述的不同菌体数的比例混合，接入发酵罐中进行发酵，两株菌混合发酵的初始甘油浓度为100g/L，三株菌混合发酵的初始甘油浓度为120g/L，发酵结果如表1所示。

表1不同比例混合的混菌发酵结果

注：“-”：无。

从表1的结果可以看出，自然比例(W3:Y1:Y5＝208:17:82)的混菌发酵性能最好，发酵时间较短，主产物1,3-丙二醇的浓度最高(59.74g/L)，生产强度也最大(3.19g/(L.h))，且除了对发酵有利的乙酸外其它副产物均较少，不生产2,3-丙二醇。与之相比，若将W3和Y1按不同比例进行混合发酵，则发酵时间延长，主产物1,3-丙二醇产量下降，副产物增多，特别是在W3:Y1＝17:208时乳酸浓度高达15.13g/L；若将W3和Y5按不同比例进行混合发酵，则表现出如同W3和Y1混合发酵的特点，并且在两种差异较大的混合比例(W3:Y5＝208:82和W3:Y5＝82:208)下甘油消耗不彻底；若将三者按W3:Y1:Y5＝1:1:1进行混合发酵，则发酵时间比自然比例的明显延长，1,3-丙二醇产量较低，副产物乳酸增加了约10g/L，琥珀酸也加倍；若按W3:Y1:Y5＝82:17:208混合发酵，26h内仅消耗了12g/L甘油，底物耐受性极差。由此可见，自然状态下的混菌具有优越性和合理性。

实施例10混菌NHN8的连续发酵

初始甘油浓度105.4g/L，稀释速率0.054h^-1，稳定运行时发酵罐中残余甘油浓度为32.6g/L，1,3-丙二醇浓度达到35.65g/L，摩尔转化率0.59mol/mol。

Claims

1.一种利用混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，将保藏号为CGMCC NO.10440的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)W3、保藏号为CGMCC NO.10439的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)Y1和保藏号为CGMCC NO.10438的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)Y5，在以甘油为底物的发酵培养基中混合发酵生产1,3-丙二醇。

2.根据权利要求1所述的生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述肺炎克雷伯氏菌W3、Y1和Y5的接种量比例为150～250:10～20:50～100，优选接种量比例为208:17:82。

3.根据权利要求1所述的生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，混合发酵的甘油起始浓度为20～200g/L，优选浓度为120g/L。

4.根据权利要求1所述的生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，混合发酵的发酵液中不含2,3-丁二醇。