CN106434489A - 一株高产酒肺炎克雷伯菌株及其应用 - Google Patents

一株高产酒肺炎克雷伯菌株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106434489A
CN106434489A CN201611028588.7A CN201611028588A CN106434489A CN 106434489 A CN106434489 A CN 106434489A CN 201611028588 A CN201611028588 A CN 201611028588A CN 106434489 A CN106434489 A CN 106434489A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tryptone
yeast extract
test
klebsiella pneumoniae
wine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611028588.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106434489B (zh
Inventor
袁静
魏晓
李环
林维石
李博星
陆静
程伟伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Original Assignee
Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Disease Control and Prevention of PLA filed Critical Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Priority to CN201611028588.7A priority Critical patent/CN106434489B/zh
Publication of CN106434489A publication Critical patent/CN106434489A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106434489B publication Critical patent/CN106434489B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/22—Klebsiella
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)W14及其应用。该菌株不仅生长速率较快，而且在葡萄糖、果糖的诱导下具有很高的产酒能力，对于筛选治疗自动酿酒综合症的药物具有很高的价值。

Description

一株高产酒肺炎克雷伯菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株高产酒肺炎克雷伯菌株，及其在筛选治疗自动酿酒综合症药物中的应用。
背景技术
肠道微生态菌群是一个复杂的环境，由数以百万亿的细菌、真菌、病毒组成，是人体自身细胞的十倍。寄居在肠道中的微生物与机体的生理和代谢有重要的相互作用。肠道微生物帮助机体从食物中摄取能量，促进营养物质的氧化和吸收。肠道微生态菌群与机体健康和疾病之间的相互作用已经引起越来越广泛的关注。Sarkola(Sarkola T,ErikssonCJ.Effect of 4-methylpyrazole on endogenous plasma ethanol and methanollevels in humans.Alcohol ClinExp Res 2001；25(4):513-516)研究显示，在正常情况下，人体自身细胞会产生酒精，机体摄入不含酒精的食物后，血酒精水平会增高，说明肠道微生物是内源性酒精的主要来源。内源性酒精在肝脏乙醇脱氢酶、过氧化氢酶、微粒体乙醇氧化系统等的作用下，迅速通过门静脉排出体外。然而，肠道菌群失调或者真菌过度生长时，则会在饮食中碳水化合物的诱导下，机体酒精水平显著升高，引发自动酿酒综合症。
自动酿酒综合症是指病人在没有摄入酒精的情况下出现醉酒状态。1948年，Ladkin(Ladkin RG,Davis JNP.Rupture of the stomach in an Africanchild.BMJ.1948；I:644.)首次报道了人体胃肠道内源性酒精的产生。Iwata K.A的研究显示，在1972年之前，共12例自动酿酒综合症病例被报道，并且是由于胃肠道酵母发酵所致。1976年，Kaji(Kaji H,Asanuma Y,Ide H,Saito N,Hi samura M,Murao M,Yoshida T,Takahashi K.The auto-brewery syndrome--therepeated attacks of alcoholicintoxication due to the overgrowth of Candida(albicans)in thegastrointestinal tract.Mater Med Pol1976；8:429-435.)报道了一名女性在食用碳水化合物之后出现醉酒，研究人员取其粪便样品进行体外培养，培养出白色念珠菌和假丝酵母菌，并确定其为致病菌，最终这位女士通过服用杀真菌药物同时限制碳水化合物的摄入使症状得到缓解。2013年，Cordell(Cordell B,McCarthy J.A Case Study of GutFermentation Syndrome(Auto-Brewery)with Saccharomyces cerevisiae as theCausative Organism.Int J Clin Med 2013；4:309-312)报道了一例61岁的男性自动酿酒综合症患者，该病例最终鉴定为酿酒酵母菌所致。至今，所有已报道的自动酿酒综合症均归因于肠道真菌发酵碳水化合物而产生过量酒精所致。
目前，针对自动酿酒综合症的患者，临床上采用采集其消化道内的样品(肠液或者粪便)进行体外的真菌培养及鉴定，得到的致病菌多为酿酒酵母菌，白色念珠菌，假丝酵母菌等真菌，然后选择抗真菌药物对患者进行治疗，患者的症状可以得到缓解。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种可用于筛选治疗自动酿酒综合症药物的一株高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)，其包含序列表中序列1所示的基因组序列。
即肺炎克雷伯氏菌，其微生物保藏号为CGMCC No.12540。
其是革兰氏阴性菌，杆状，有大量黏性的多糖形成的荚膜包覆，有菌毛，无芽孢和鞭毛；其具有O抗原和K抗原，大小为(0.5-0.8)μm×(1-2)μm，兼性厌氧生长，生长温度范围：10℃-50℃，最适生长温度：37℃；生长酸碱度范围：pH 4-10，最适pH值为6.8。
其常规生理生化鉴定结果为：半固体穿刺试验阴性、淀粉水解试验阳性、脂肪水解试验阴性、明胶水解试验阴性、H2S试验阳性、尿素试验阳性、吲哚试验阴性、甲基红试验阳性、伏普试验阳性、柠檬酸盐试验阳性、尿酶试验阳性、蔗糖试验产酸产气、麦芽糖试验产酸产气、D-山梨醇试验产酸产气、鼠李糖试验产酸产气、甘露醇试验产酸产气、乳糖试验产酸产气、海藻糖试验产酸产气。
第二方面，本发明提供一种上述高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiellapneumoniae)W14的体外培养方法，包括以下步骤：
(1)、LB-琼脂培养基培养：采集自动酿酒综合症患者的新鲜粪便样品于LB-琼脂培养基中在37℃下进行培养13小时；
(2)、LB-单糖培养基培养：挑取步骤(1)得到的单克隆转接至LB-单糖培养基中，37℃，摇床转速120rpm下培养13小时，培养结束后测定培养液中的酒精浓度，挑选出产酒精浓度最高的菌株，即为所述高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)，基因组序列见序列表1，命名为W14。
LB-琼脂培养基含胰蛋白胨(tryptone)10g/L，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂10g/L，pH 6.8；
LB-单糖培养基pH 6.8，含胰蛋白胨(tryptone)5-15g/L，葡萄糖或果糖2-20wt％，酵母提取物(yeast extract)3-10g/L，氯化钠(NaCl)5-15g/L；优选：胰蛋白胨(tryptone)8-12g/L，葡萄糖或果糖5-10wt％，酵母提取物(yeast extract)3-7g/L，氯化钠(NaCl)8-12g/L；最优选：胰蛋白胨(tryptone)10g/L，葡萄糖10wt％，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，或胰蛋白胨(tryptone)10g/L，果糖8wt％，酵母提取物(yeastextract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
第三方面，本发明提供一种上述体外培养方法中专用的培养基，含有胰蛋白胨(tryptone)5-15g/L，葡萄糖或果糖2-20wt％，酵母提取物(yeast extract)3-10g/L，氯化钠(NaCl)5-15g/L；优选：胰蛋白胨(tryptone)8-12g/L，葡萄糖或果糖2-10％，酵母提取物(yeast extract)3-7g/L，氯化钠(NaCl)8-12g/L；最优选：胰蛋白胨(tryptone)10g/L，葡萄糖10％，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，或胰蛋白胨(tryptone)10g/L，果糖8％，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
第四方面，本发明提供一种制备上述培养基的方法，将胰蛋白胨、葡萄糖或果糖、酵母提取物和氯化钠置于容器中，加入适量去离子水溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，然后用去离子水定容至1L，121℃灭菌15min即得。
第五方面，本发明提供一种用于筛查和诊断自动酿酒综合症的试剂盒，包括上述培养基。
第六方面，本发明提供上述高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)在筛选治疗自动酿酒综合症药物中的应用。
本发明提供的一株肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)是自动酿酒综合症患者体内分离得到的，本发明确认其是一株能够引起自动酿酒综合症的细菌，该肺炎克雷伯杆菌不仅生长速率较快，在葡萄糖、果糖的诱导下具有很高的产酒能力，可作为需考察的标准菌，可用于对于临床自动酿酒综合症疾病用药的筛选中。
附图说明
图1所示为W14在不同培养基中的生长速率图；
图2所示为W14在不同浓度葡萄糖和培养条件下的产酒能力图；
图3所示为W14在不同浓度果糖和培养条件下的产酒能力图。
具体实施方式
2014年6月，发明人对一名27岁的自酿酒综合征男性患者进行了研究，该患者周期性发作，其血液酒精浓度最高可到400mmol/L。该患者肠道微生态菌群显著失调，测序及微生物培养均未检测到真菌存在。该患者肠道中肠杆菌科过度富集，尤其在其发病阶段，肠杆菌科(后来验证其主要为肺炎克雷伯杆菌)丰度显著升高。通过体外发酵培养技术，证实了单糖和多糖是其发病的饮食诱因。同时，亚胺培南被筛选出作为敏感药物，可以有效抑制产酒细菌的增殖，最终通过抗生素治疗配合低糖饮食，该患者症状得到明显缓解，并且其肠道菌群结构趋于正常。发明人通过微生物体外培养技术，获得一株具有高产酒能力的肺炎克雷伯杆菌，该菌株不仅生长速率较快，而且在葡萄糖、果糖的诱导下具有很高的产酒能力，用于筛选治疗自动酿酒综合症的药物具有很高的价值。
根据最新的分类规则，肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)属于克雷伯菌属，属于人和动物肠道中的正常菌群。
本发明提供的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的名称为W14，该菌株已于2016年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12540。
肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)W14是革兰氏阴性菌，杆状，有大量黏性的多糖形成的荚膜包覆，有菌毛，无芽孢和鞭毛；其具有O抗原和K抗原，大小为(0.5-0.8)μm×(1-2)μm，兼性厌氧生长，生长温度范围：10℃-50℃，最适生长温度：37℃；生长酸碱度范围：pH 4-10，最适pH值为6.8。
生物材料说明：
本发明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的名称为W14，该菌株已于2016年5月24日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12540。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例一：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)W14的分离、鉴定及保藏
一、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)W14的分离
LB-琼脂培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/L，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂10g/L，pH 6.8。
LB-单糖培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/L，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，葡萄糖10wt％，pH 6.8。
采集自酿酒综合征患者的新鲜粪便样品，使用LB-琼脂培养基进行培养，37℃，13小时。挑取单克隆转接至LB-单糖培养基，37℃，摇床转速120rpm，13小时。结束后测定培养液中的酒精浓度，挑选出产酒精浓度最高的菌株，命名为W14(采集地点：北京,采集人：魏晓)。
二、W14的生理生化鉴定
对采集的W14菌株进行生理生化鉴定，该菌株是革兰氏阴性菌，杆状，有大量黏性的多糖形成的荚膜包覆。有菌毛，无芽孢和鞭毛。具有O抗原和K抗原。大小为0.5-0.8μm×1-2μm。兼性厌氧生长，生长温度范围：10℃-50℃，最适生长温度：37℃；生长酸碱度范围：pH4-10，最适pH值为6.8。依据《伯杰氏细菌学鉴定手册》(第八版)和《常见细菌系统鉴定手册》对其进行常规生理生化鉴定，实验结果为：半固体穿刺试验阴性、淀粉水解试验阳性、脂肪水解试验阴性、明胶水解试验阴性、H2S试验阳性、尿素试验阳性、吲哚试验阴性、甲基红试验阳性、伏普试验阳性、柠檬酸盐试验阳性、尿酶试验阳性、蔗糖试验产酸产气、麦芽糖试验产酸产气、D-山梨醇试验产酸产气、鼠李糖试验产酸产气、甘露醇试验产酸产气、乳糖试验产酸产气、海藻糖试验产酸产气，确定为肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)。
三、W14菌株的全基因组测序
LB培养基配方：胰蛋白胨(tryptone)10g/L，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
将W14菌株接种于LB培养基，37℃培养13小时，摇床转速120rpm。收集W14菌体，提取全基因组DNA，并随机打断，电泳回收所需长度的DNA片断，并加上接头进行cluster制备，进行Hiseq4000测序，对测序结果进行SOAPdenovo组装，基于组装结果进行基因信息分析，基因组序列见序列表中序列1。
四、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)W14保藏
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)W14菌株于2016年5月24日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12540。
实施例二：适合W14生长的培养基配方
该培养基的配方为：胰蛋白胨(tryptone)5-15g/L，葡萄糖或果糖2-20wt％，酵母提取物(yeast extract)3-10g/L，氯化钠(NaCl)5-15g/L；优选：胰蛋白胨(tryptone)8-12g/L，葡萄糖或果糖2-10wt％，酵母提取物(yeast extract)3-7g/L，氯化钠(NaCl)8-12g/L；最优选：胰蛋白胨(tryptone)10g/L，葡萄糖10wt％，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，即实施例一中的LB-单糖培养基，或胰蛋白胨(tryptone)10g/L，果糖8wt％，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。制备培养基时，将胰蛋白胨、葡萄糖或果糖、酵母提取物和氯化钠置于容器中，加入适量去离子水溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，然后用去离子水定容至1L，121℃灭菌15min即得。
实施例三：W14的产酒能力分析
1、葡萄糖浓度的筛选：
分别用六组培养基培养本发明的菌株W14，培养温度37℃，摇床转速120rpm，需氧培养8小时，培养过程中每隔一小时检测菌株W14的生长速率，结果见图1；五组培养基均按实施例二中的配方配置得到，仅是培养基中的葡萄糖浓度不同，分别为2wt％，4wt％，6wt％，8wt％，10wt％。
图1的结果显示：本发明的菌株W14分别在葡萄糖浓度为2wt％、4wt％、6wt％、8wt％、10wt％的培养基中培养至稳定期时，OD值分别为1.220、1.303、1.33、1.38、1.47；说明菌株W14在葡萄糖浓度为10wt％的培养基中具有最快的生长速率。
2、葡萄糖浓度和培养条件的筛选：
分别用实施例二的培养基(葡萄糖浓度分别为2wt％，4wt％，6wt％，8wt％，10wt％)培养本发明的菌株W14，培养温度37℃，摇床转速120rpm，培养条件分别为：需氧培养8小时，厌氧培养8h，厌氧培养12h，培养完毕后检测培养液上清中的酒精浓度，检测结果见表1和图2。
表1不同培养条件下，培养液上清中的酒精浓度
需氧8小时 厌氧8小时 厌氧12小时
2％葡萄糖 35.3mmol/L 20.3mmol/L 24.9mmol/L
4％葡萄糖 62.3mmol/L 25.5mmol/L 31.6mmol/L
6％葡萄糖 63.2mmol/L 35.6mmol/L 51.2mmol/L
8％葡萄糖 62.6mmol/L 29.3mmol/L 36.7mmol/L
10％葡萄糖 54.5mmol/L 26.9mmol/L 52.4mmol/L
表1和图2结果表明：菌株W14在需氧条件下比厌氧条件具有更高的产酒精能力；尤其当在葡萄糖浓度为6wt％，需氧培养8小时，该菌株的产酒能力达到峰值，为63.2mmol/L(如图3所示)。
3、果糖浓度的筛选：
用实施例二的培养基(果糖浓度分别为2wt％，4wt％，6wt％，8wt％，10wt％)培养本发明的菌株W14，培养温度37℃，摇床转速120rpm，培养条件分别为：需氧培养8小时，厌氧培养8h，培养完毕后检测培养液上清中的酒精浓度，检测结果见表2和图3。
表2不同培养条件下，培养液上清中的酒精浓度
需氧8小时 厌氧8小时
2wt％果糖 43.2mmol/L 30.0mmol/L
4wt％果糖 60.6mmol/L 32.8mmol/L
6wt％果糖 61.6mmol/L 27.6mmol/L
8wt％果糖 63.6mmol/L 31.8mmol/L
10wt％果糖 53.0mmol/L 25.3mmol/L
表2和图3的结果表明：菌株W14在需氧条件下比厌氧条件具有更高的产酒精能力；尤其当果糖浓度为8wt％，需氧培养8小时，该菌株的产酒能力达到峰值，为64.6mmol/L(如图3所示)，说明实施例二中的葡萄糖也可用果糖替换，且菌株W14在果糖中可比在葡萄糖中具有更高的产酒能力。
实施例四：W14在筛选治疗自动酿酒综合症药物中的应用
发明人从自动酿酒综合症患者的粪便中分离得到一株高产酒肺炎克雷伯杆菌，并确定其是该病的致病菌，说明针对自动酿酒综合症的诊断不能仅局限于是否存在真菌。
采集自动酿酒综合症患者的粪便样品进行体外培养，培养基为实施例二的培养基，培养温度37℃，摇床转速120rpm，需氧培养8h。培养完毕后将得到的菌液进行菌种的鉴定以及产酒量的检测。若培养得到的菌种为肺炎克雷伯杆菌(Klebs iel lapneumoniae)且符合本发明菌株W14的性状特征，则判定该患者为该菌株所致的自动酿酒综合症，然后使用亚胺培南静脉滴注治疗，每天1克，分3次滴注，静脉滴注时间应不少于20～30分钟，滴注7天。经诊断为菌株W14所致的自动酿酒综合症的患者，经亚胺培南治疗后康复，自动酿酒综合症的症状再无发作。
对上述患有菌株W14所致的自动酿酒综合症的患者使用抗真菌药物氟康唑，没有治疗效果；用抗真菌药物氟康唑在体外作用菌株W14，也没有抑菌效果。同时将目前报道的引起自动酿酒综合症的真菌酿酒酵母菌，白色念珠菌，假丝酵母菌均接种在本发明实施例二的培养基中进行体外培养，发现该真菌不能生长，更不具有产酒能力。以上共同说明自动酿酒综合症并不是由真菌引起的，而是本发明的菌株引起的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。
序列表
<110> 中国人民解放军疾病预防控制所
<120> 一株高产酒肺炎克雷伯菌株及其应用
<130> CGCNB165173W
<160> 1
<210> 1
<211> 1554
<212> rDNA
<213> 高产酒肺炎克雷伯菌株（Klebsiella pneumoniae）W14的16S rDNA序列
<400> 1
ttctttaagg taaggaggtg atccaaccgc aggttcccct acggttacct tgttacgact 60
tcaccccagt catgaatcac aaagtggtaa gcgccctccc gaaggttaag ctacctactt 120
cttttgcaac ccactcccat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc 180
accgtagcat tctgatctac gattactagc gattccgact tcatggagtc gagttgcaga 240
ctccaatccg gactacgaca tactttatga ggtccgcttg ctctcgcgag gtcgcttctc 300
tttgtatatg ccattgtagc acgtgtgtag ccctggtcgt aagggccatg atgacttgac 360
gtcatcccca ccttcctcca gtttatcact ggcagtctcc tttgagttcc cggccggacc 420
gctggcaaca aaggataagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tttcacaaca 480
cgagctgacg acagccatgc agcacctgtc tcacagttcc cgaaggcacc aatccatctc 540
tggaaagttc tgtggatgtc aagaccaggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaaacc 600
acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattcattt gagttttaac cttgcggccg 660
tactccccag gcggtcgatt taacgcgtta gctccggaag ccacgcctca agggcacaac 720
ctccaaatcg acatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc 780
acgctttcgc acctgagcgt cagtctttgt ccagggggcc gccttcgcca ccggtattcc 840
tccagatctc tacgcatttc accgctacac ctggaattct acccccctct acaagactct 900
agcctgccag tttcgaatgc agttcccagg ttgagcccgg ggatttcaca tccgacttga 960
cagaccgcct gcgtgcgctt tacgcccagt aattccgatt aacgcttgca ccctccgtat 1020
taccgcggct gctggcacgg agttagccgg tgcttcttct gcgggtaacg tcaatcgatg 1080
aggttattaa ccttatcgcc ttcctccccg ctgaaagtgc tttacaaccc gaaggccttc 1140
ttcacacacg cggcatggct gcatcaggct tgcgcccatt gtgcaatatt ccccactgct 1200
gcctcccgta ggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt ggctggtcat cctctcagac 1260
cagctaggga tcgtcgccta ggtgagccgt taccccacct actagctaat cccatctggg 1320
cacatctgat ggcatgaggc ccgaaggtcc cccactttgg tcttgcgacg ttatgcggta 1380
ttagctaccg tttccagtag ttatccccct ccatcaggca gtttcccaga cattactcac 1440
ccgtccgccg ctcgtcaccc gagagcaagc tctctgtgct accgctcgac ttgcatgtgt 1500
taggcctgcc gccagcgttc aatctgagcc atgatcaaac tcttcaattt aagt 1554

Claims (10)

1.一株高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)，其包含序列表中序列1所示的基因组序列。
2.根据权利要求1所述高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae),其特征在于，其微生物保藏号为CGMCC No.12540。
3.根据权利要求1或2所述高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)，其特征在于，其是革兰氏阴性菌，杆状，有大量黏性的多糖形成的荚膜包覆，有菌毛，无芽孢和鞭毛；其具有O抗原和K抗原，大小为(0.5-0.8)μm×(1-2)μm，兼性厌氧生长，生长温度范围：10℃-50℃，最适生长温度：37℃；生长酸碱度范围：pH 4-10，最适pH值为6.8。
4.根据权利要求1或2或3所述高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)，其特征在于，其常规生理生化鉴定结果为：半固体穿刺试验阴性、淀粉水解试验阳性、脂肪水解试验阴性、明胶水解试验阴性、H2S试验阳性、尿素试验阳性、吲哚试验阴性、甲基红试验阳性、伏普试验阳性、柠檬酸盐试验阳性、尿酶试验阳性、蔗糖试验产酸产气、麦芽糖试验产酸产气、D-山梨醇试验产酸产气、鼠李糖试验产酸产气、甘露醇试验产酸产气、乳糖试验产酸产气、海藻糖试验产酸产气。
5.一种权利要求1-4任一所述高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)W14的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、LB-琼脂培养基培养：采集自动酿酒综合症患者的新鲜粪便样品于LB-琼脂培养基中在37℃下进行培养13小时；
(2)、LB-单糖培养基培养：挑取步骤(1)得到的单克隆转接至LB-单糖培养基中，37℃，摇床转速120rpm下培养13小时，培养结束后测定培养液中的酒精浓度，挑选出产酒精浓度最高的菌株，即为所述高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)，基因组序列见序列表1，命名为W14。
6.根据权利要求5所述体外培养方法，其特征在于，LB-琼脂培养基含胰蛋白胨(tryptone)10g/L，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂10g/L，pH6.8；
LB-单糖培养基pH 6.8，含胰蛋白胨(tryptone)5-15g/L，葡萄糖或果糖2-20wt％，酵母提取物(yeast extract)3-10g/L，氯化钠(NaCl)5-15g/L；优选：胰蛋白胨(tryptone)8-12g/L，葡萄糖或果糖5-10wt％，酵母提取物(yeast extract)3-7g/L，氯化钠(NaCl)8-12g/L；最优选：胰蛋白胨(tryptone)10g/L，葡萄糖10wt％，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，或胰蛋白胨(tryptone)10g/L，果糖8wt％，酵母提取物(yeastextract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
7.一种权利要求5或6所述体外培养方法中专用的培养基，其特征在于，含有胰蛋白胨(tryptone)5-15g/L，葡萄糖或果糖2-20wt％，酵母提取物(yeast extract)3-10g/L，氯化钠(NaCl)5-15g/L；优选：胰蛋白胨(tryptone)8-12g/L，葡萄糖或果糖2-10％，酵母提取物(yeast extract)3-7g/L，氯化钠(NaCl)8-12g/L；最优选：胰蛋白胨(tryptone)10g/L，葡萄糖10％，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，或胰蛋白胨(tryptone)10g/L，果糖8％，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
8.一种制备权利要求7所述培养基的方法，其特征在于，将胰蛋白胨、葡萄糖或果糖、酵母提取物和氯化钠置于容器中，加入适量去离子水溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，然后用去离子水定容至1L，121℃灭菌15min即得。
9.一种用于筛查和诊断自动酿酒综合症的试剂盒，包括权利要求7所述培养基。
10.权利要求1-4任一所述高产酒肺炎克雷伯菌株(Klebsiella pneumoniae)在筛选治疗自动酿酒综合症药物中的应用。
CN201611028588.7A 2016-11-18 2016-11-18 一株高产酒肺炎克雷伯菌株及其应用 Active CN106434489B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611028588.7A CN106434489B (zh) 2016-11-18 2016-11-18 一株高产酒肺炎克雷伯菌株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611028588.7A CN106434489B (zh) 2016-11-18 2016-11-18 一株高产酒肺炎克雷伯菌株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106434489A true CN106434489A (zh) 2017-02-22
CN106434489B CN106434489B (zh) 2021-04-30

Family

ID=58221680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611028588.7A Active CN106434489B (zh) 2016-11-18 2016-11-18 一株高产酒肺炎克雷伯菌株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106434489B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109350629A (zh) * 2018-08-09 2019-02-19 新乡医学院 一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂及其制备方法
CN114058671A (zh) * 2020-07-31 2022-02-18 北京安普生化科技有限公司 一种产乙醇的肺炎克雷伯菌检测方法及检测试剂装置
CN115161292A (zh) * 2022-08-19 2022-10-11 首都儿科研究所 一种多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
CN115261339A (zh) * 2022-08-19 2022-11-01 首都儿科研究所 一种多重耐药序列383型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101531979A (zh) * 2009-02-26 2009-09-16 华东理工大学 肺炎克雷伯氏菌及其制备氢气和2，3-丁二醇的方法
CN102604863A (zh) * 2012-03-01 2012-07-25 中国科学院南海海洋研究所 一种红树林克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用
CN104774879A (zh) * 2015-04-29 2015-07-15 大连理工大学 一种混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101531979A (zh) * 2009-02-26 2009-09-16 华东理工大学 肺炎克雷伯氏菌及其制备氢气和2，3-丁二醇的方法
CN102604863A (zh) * 2012-03-01 2012-07-25 中国科学院南海海洋研究所 一种红树林克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用
CN104774879A (zh) * 2015-04-29 2015-07-15 大连理工大学 一种混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郭学武: "肺炎克雷伯氏菌产2,3-丁二醇的代谢调控研究", 《中国博士学位论文全文数据库》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109350629A (zh) * 2018-08-09 2019-02-19 新乡医学院 一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂及其制备方法
CN114058671A (zh) * 2020-07-31 2022-02-18 北京安普生化科技有限公司 一种产乙醇的肺炎克雷伯菌检测方法及检测试剂装置
CN115161292A (zh) * 2022-08-19 2022-10-11 首都儿科研究所 一种多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
CN115261339A (zh) * 2022-08-19 2022-11-01 首都儿科研究所 一种多重耐药序列383型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
CN115261339B (zh) * 2022-08-19 2024-02-06 首都儿科研究所 一种多重耐药序列383型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
CN115161292B (zh) * 2022-08-19 2024-04-09 首都儿科研究所 一种多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106434489B (zh) 2021-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103275905B (zh) 具有预防糖尿病作用的鼠李糖乳杆菌ccfm0528
CN107893044A (zh) 一株长双歧杆菌及其应用
CN102876614B (zh) 一株地衣芽孢杆菌及其应用
CN101649303B (zh) 一种双歧杆菌及其应用和含有双歧杆菌的食品组合物
CN105132318A (zh) 植物乳杆菌Grx16及其应用
CN106434489A (zh) 一株高产酒肺炎克雷伯菌株及其应用
CN110106119B (zh) 一株分离自母乳的鼠李糖乳杆菌m9及其应用
CN108244432A (zh) 一种发酵蛹虫草益生菌饮料及其制备方法
CN107475162A (zh) 具有二肽基肽酶‑iv高抑制活性的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN105614774A (zh) 一种果蔬活性酵素液的制备方法
CN105087447A (zh) 一株耐微波枯草芽孢杆菌及其在纳豆激酶制备中的应用
CN103271155B (zh) 一种提高益生菌活菌数的方法
CN107412272A (zh) 植物乳杆菌在预防肠道屏障损伤中的应用
CN101134051A (zh) 酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌在制备治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻药物中的应用
CN106222103A (zh) 一株产胞外多糖的戊糖片球菌及其应用
CN105505815A (zh) 一株抗衰老功能的粘膜乳杆菌
CN115895966B (zh) 一株辅助缓解痛风的两歧双歧杆菌bl002及其应用
CN105274032B (zh) 一种拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其flaA基因表达的罗伊氏乳杆菌
CN107048364A (zh) 一种富含γ‑氨基丁酸的桑叶粉及其制备方法
CN105624071A (zh) 一株唾液乳杆菌xjp2及其应用
CN115838661A (zh) 一种植物乳杆菌扁鹊君18、植物乳杆菌制剂及其应用
CN108741087A (zh) 一种通过益生菌发酵植物细胞果粒或器官制作酵素的方法
CN107760724A (zh) 一种利用多粘类芽孢杆菌制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法及该α‑葡萄糖苷酶抑制剂
CN107441121A (zh) 一种唾液链球菌的发酵粗提物及其制备方法和应用
CN112402463A (zh) 一种用于抑制阴道炎症的复合益生菌及其制品和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant