CN107760724A - 一种利用多粘类芽孢杆菌制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法及该α‑葡萄糖苷酶抑制剂 - Google Patents

一种利用多粘类芽孢杆菌制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法及该α‑葡萄糖苷酶抑制剂 Download PDF

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    • C12R2001/12—Bacillus polymyxa ; Paenibacillus polymyxa

Abstract

本发明具体公开了一种利用多粘类芽孢杆菌制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法及该α‑葡萄糖苷酶抑制剂,将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CGMCC No.10062接种于脱脂乳中进行发酵，得发酵乳，经冷冻干燥得发酵乳冻干粉；将得到的发酵乳冻干粉经甲醇浸提，离心取上清，再除去甲醇，得到α‑葡萄糖苷酶抑制剂。首次披露了多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062具有发酵脱脂乳生成的α‑葡萄糖苷酶抑制剂，拓宽了α‑葡萄糖苷酶抑制剂的来源。同时，上述制备方法制备简便，成本低廉，所制备的α‑葡萄糖苷酶抑制剂活性强，稳定性好。

Description

一种利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法及 该α-葡萄糖苷酶抑制剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的方法。此外，本发明还涉及该α-葡萄糖苷酶抑制剂。
背景技术
近年来，糖尿病在全世界广泛流行，目前已成为继肿瘤、心血管疾病之后第三大类严重危害人类健康的慢性疾病。随着我国经济、社会的迅速发展，膳食结构和生活方式的改变，人口老龄化速度的加快，糖尿病的患病率也呈现快速增加的趋势。据统计，2015年全球糖尿病患者约有4.15亿人，而我国糖尿病患者约1.1亿人，已位居世界首位，而且5年间的增长率近20％。在糖尿病患病率快速上升的同时，我国糖尿病的知晓率、治疗率及控制率明显偏低。糖尿病已成为一个严重危害我国人群健康的公共卫生问题，对经济社会发展产生越来越严重的影响。
根据发病机制不同，糖尿病分为Ⅰ型糖尿病(胰岛素依赖型)、Ⅱ型糖尿病(非胰岛素依赖型)和妊娠糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病患者人数占糖尿病患者总数的90％。在目前的医疗水平还无法从根本上治愈糖尿病的情况下，糖尿病患者的日益增多将逐步扩大糖尿病用药的市场规模。糖尿病用药主要包括了口服降糖药、胰岛素及其类似物。对于大多数患者而言，口服降糖药是经济、实用、便利的治疗方案。口服降糖药主要有四大类：(1)胰岛素增敏剂类；(2) 胰岛素增泌剂类；(3)氨基酸相似物类；(4)α-葡萄糖苷酶抑制剂类。
研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收，而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用机制，是竞争性地与小肠黏膜上皮细胞上α-葡萄糖苷酶结合，抑制该酶的活性，从而减慢糖类水解为葡萄糖的速度，同时减缓小肠对葡萄糖等碳水化合物的消化吸收，达到降低餐后血糖的作用。因此，此药特别适合在饮食结构中以碳水化合物为主的糖尿病患者，所以也被推崇为“最适合中国人饮食的降糖药”。在我国的口服降糖药市场中，α-葡萄糖苷酶抑制剂占有主要地位。主要品种包括阿卡波糖和伏格列波糖，其中阿卡波糖为我国第一大口服降糖药。
目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂，主要集中于游动放线菌(Actinoplanes sp.) 的微生物酵法，导致α-葡萄糖苷酶抑制剂来源不足，这是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
基于上述技术问题，本发明发现了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CGMCC No.10062的新用途，并且提供了利用多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)CGMCC No.10062制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，以多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)CGMCC No.10062为发酵菌株，以脱脂乳为培养基，发酵制得α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有强烈的抑制活性。具体如下：
一种利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，该多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10062，该方法包括以下步骤：
(a)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，发酵后的发酵乳再经冷冻干燥，得到发酵乳冻干粉；
(b)在步骤(a)中得到的发酵乳冻干粉中加入甲醇浸提，离心取上清，再除去甲醇，得到所述α-葡萄糖苷酶抑制剂。
进一步优化，步骤(a)中，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为2.5x106～ 8.5x106cfu/mL。
进一步优化，步骤(a)中，所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6％～12％。
进一步优化，步骤(a)中，所述发酵为振荡培养，振荡速度为150rpm～ 250rpm。
进一步优化，步骤(a)中，所述发酵的温度为25℃～35℃，发酵的时间为 2～5d。
进一步优化，步骤(b)中，发酵乳冻干粉中甲醇的添加量为8～12mL/g，浸提的时间为0.5～3h。
一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其特征在于，根据权利要求1-6任一所述的利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法制备而成。
进一步说明，制备所得的α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50≤9.8mg/mL。
上述技术方案中的制备方法，首次采用多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)CGMCC No.10062，以脱脂乳为培养基进行发酵，并经过冷冻干燥，甲醇浸提，离心，除甲醇，制备得到α-葡萄糖苷酶抑制剂，披露了多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062具有发酵脱脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制剂的新用途，拓宽了α-葡萄糖苷酶抑制剂的来源。同时，上述制备方法与超滤等方法相比，操作更加简单，成本更低，适用于工业化生产，并且多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062 发酵脱脂乳所制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性强，稳定性好。
此外，上述技术方案中的制备方法极大简化了生产步骤，仅需发酵、冻干、浸提、离心、去除甲醇五步，大大减少了传统复杂工艺可能带来的污染问题。制备所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，避免使用化学合成培养基；加上发酵菌种采用多粘类芽孢杆菌这单一菌种，上述的原料、菌种的组合，有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。
具体实施方式
下面将对本发明通过具体实施例进一步进行阐述，如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：
在一个具体的实施方式中，提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(a)将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CGMCC No.10062接种于脱脂乳中进行发酵，得发酵乳，再经冷冻干燥得发酵乳冻干粉； (b)将步骤(a)得到发酵乳冻干粉中加入甲醇浸提，离心取上清，除去甲醇，得α-葡萄糖苷酶抑制剂。
上述技术方案中的制备方法，首次采用多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062，以脱脂乳作为培养基进行发酵，并经过冷冻干燥，甲醇浸提，离心，除甲醇，制备得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。披露了多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062具有发酵脱脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制剂的新用途，拓宽了α-葡萄糖苷酶抑制剂的来源。同时，多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062发酵脱脂乳所制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性强，稳定性好。
进一步地，步骤(a)中，多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062的接种量为 2.5x106～8.5x106cfu/mL；较佳地为5.5x106～7.5x106cfu/mL，更佳地为6x106cfu/mL。
进一步地，上述步骤(a)中，脱脂乳可以是新鲜的脱脂乳，也可以是配制而成的脱脂乳。优选的为配制的脱脂乳，配制的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6％～12％。制备方法可以包括以下步骤：在蒸馏水中加入脱脂乳粉，混匀充分溶解后，95～125℃灭菌5～20min，冷却即得。
进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵温度为25～35℃；较佳地为28～ 32℃；更佳地为30℃。
进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵时间为2～5d；较佳地为3～5d；更佳地为4d。
进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵方式为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；较佳地为150～250rpm；更佳地为220rpm。
进一步地，上述步骤(b)中，发酵乳冻干粉中甲醇的添加量为8～12mL/g；较佳为8～10mL/g，更佳为10mL/g。
进一步地，上述步骤(b)中，浸提的时间为0.5～3h；较佳为1～2.5h，更佳为2h。
结合实施例亦可知，在优选的甲醇添加量和浸提时间的范围之外时，得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果明显下降。
此外，进一步地，上述步骤(b)中，浸提次数为1～5次；较佳为2～4次，更佳为3次。
上述步骤(b)中，上述的冷冻干燥较佳为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥条件较佳地为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～ 2.0mm，真空度10～30Pa。
上述步骤(b)中，上述离心的速度为8,000～12,000g；更佳地为10,000～11,000g。离心的时间较佳地为5～10min，更佳地为6～8min。
上述步骤(b)中，除去甲醇可以采用减压蒸发的方法，如旋转蒸发，平行蒸发等。
结合实施例亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，多粘类芽孢杆菌CGMCCNo.10062发酵脱脂乳，再经过冷冻干燥，甲醇浸提，离心，除甲醇后得到的α- 葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果明显下降。例如，在接种量过少时，菌种繁殖速度慢，使得最终获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性低于优选的接种量范围；当接种量过多时，一定时间后菌种个体因生存空间及营养的限制而死亡或停滞生长，不利于代谢物的积累，也使得最终获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性低于优选的接种量范围。又例如，当发酵温度低于优选范围值时，菌种代谢缓慢，会导致α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性有所降低。还例如，发酵的振荡速度低于优选范围时，菌种发酵的溶氧量不够，生长和代谢受到限制，导致α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性降低。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，由上述的任一种制备方法制得。
上述制备方法具备上述有益效果，因此，由上述制备方法所制得的α-葡萄糖苷酶抑制剂也具备相应的有益效果，此处不再赘述。
进一步的，上述α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度 IC50≤9.8mg/mL。结合实施例亦可知，上述α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性显著高于其他常规脱脂乳发酵菌株。
下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、试剂、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。
实施例1
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：将多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062(该菌株的来源请参见公开号为CN106701610A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(OXOID，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC液体培养基(OXOID，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm振荡培养24h 取出，以2％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)接种量接种于TYC液体培养基(OXOID，英国)，30℃、180rpm振荡培养24h后，培养物12,000rpm 离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为2.5x108cfu/mL。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为10％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在110℃下灭菌15min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：将α-葡萄糖苷酶抑制剂溶于无菌水中，pH调至6.80，在4℃、10,000rpm离心10min，取上清，pH调节至6.80，再次4℃、10,000rpm 离心10min，取得的上清即可用于α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。
α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选模型：取100μL待测样品于1.5mL EP (Eppendorf)管，接着加入50μL，浓度为100mU/mLα-葡萄糖苷酶(Sigma，美国)，混匀，37℃温育15min，再加入80μL中含有2mmol/L的4-硝基苯基-D- 吡喃葡糖苷(PNPG，Sigma，美国)，混匀，37℃反应15min，最后加入80μL 0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应。在4℃、10,000rpm离心2min，取200μL上清于96孔微孔板(Greiner bio-one，德国)，Spectra Max M5多功能酶标仪(MolecularDevices, 美国)在405nm波长下，测定吸光度值。待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，如以下公式所示：
其中：阴性对照组为空白脱脂乳替代待测样品；
阴性空白组：浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝6.8)替代阴性对照组中的α-葡萄糖苷酶；
样品空白组为PBS替代待测样品组中的α-葡萄糖苷酶。
α-葡萄糖苷酶半抑制浓度(IC50)的测定：以倍半稀释的方法将待测样品溶液进行稀释，获得不同浓度的待测样品组，利用上述检测方法测定不同浓度的待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率，根据浓度与α-葡萄糖苷酶抑制率构成的线性关系，计算得出样品对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(IC50)。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062种子以接种量2.4％(v/v)无菌接种于 10％(w/w，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比，下同)脱脂乳，30℃、220rpm培养4d得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥，以10mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀，浸提2h，浸提3次，再10,000rpm离心8min取上清，旋转蒸发除去甲醇，得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品A。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品A以上述方法制备为待测样品后测定其对α- 葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品A对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50＝7.5mg/mL。
实施例2
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为12％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062种子以接种量1％(v/v)无菌接种于12％ (w/w)脱脂乳，35℃、100rpm培养5d得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥，以8mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀，浸提0.5h，浸提1次，再8,000g离心5min取上清，旋转蒸发除去甲醇，得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品B。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品B以上述方法制备为待测样品后测定其对α- 葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品B对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50＝ 9.8mg/mL。
实施例3
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为6％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062种子以接种量3.4％(v/v)无菌接种于 6％(w/w)脱脂乳，25℃、300rpm培养2d得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥，以12mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀，浸提3h，浸提5次，再12,000g离心10min取上清，平行蒸发除去甲醇，得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品C。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品C以上述方法制备为待测样品后测定其对α- 葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品C对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50＝ 9.4mg/mL。
实施例4
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为8％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062种子以接种量2.2％(v/v)无菌接种于 8％(w/w)脱脂乳，28℃、150rpm培养3d得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥，以9mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀，浸提1h，浸提2次，再10,000g离心6min取上清，平行蒸发除去甲醇，得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品D。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品D以上述方法制备为待测样品后测定其对α- 葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品D对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50＝ 9.1mg/mL。
实施例5
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为9％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在98℃下灭菌18min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备：同实施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062种子以接种量3％(v/v)无菌接种于9％ (w/w)脱脂乳，32℃、250rpm培养5d得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥，以10mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀，浸提2.5h，浸提4次，再11,000g离心8min取上清，旋转蒸发除去甲醇，得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品E。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品E以上述方法制备为待测样品后测定其对α- 葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品E对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50＝ 8.6mg/mL。
效果实施例1冷藏条件下α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制效果的稳定性
将实施例1-5制备的产品A、B、C、D和E分别装入密封袋后，置于冷藏条件(8℃)保存0、10、20和30d后取出，分别测定各样品对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50值，结果如表1所示。
表1.冷藏条件下α-葡萄糖苷酶抑制剂产品抑制效果的稳定性
由表1可知，所有测试的α-葡萄糖苷酶抑制剂产品在冷藏(8℃)保存30d 后，对α-葡萄糖苷酶抑制活性保持在同一水平，即稳定性较好。
对比例1
将实施例1中的接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间、发酵振荡的速度、甲醇添加量以及浸提时间逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂产品，各组所得α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制效果如表2所示。
表2.不同方法制备所得α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果
从表2所示的结果中可以得出，将所述α-葡萄糖苷酶抑制剂产品的制备方法中接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间、发酵振荡的速度、甲醇添加量以及浸提时间调整到优选范围之外的时候，多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062 依然可以发酵脱脂乳产生α-葡萄糖苷酶抑制剂，但是产物的α-葡萄糖苷酶抑制效果明显下降。
对比例2
参考实施例1所述方法，比较由多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)LB340 (由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科汉森公司提供)制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，具体操作如下：
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：
干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393和保加利亚乳杆菌LB340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解，各自用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck，德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(Merck，德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS 液体，37℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到相应的发酵用的种子。
嗜热链球菌种子的制备：将嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(Merck，德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(Merck，德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v) 接种量接种于50mL M17液体，40℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
(b)脱脂乳的制备：同实施例1。
(c)待测样品制备：同实施例1。
1、α-葡萄糖苷酶抑制剂产品的制备
将各菌株以2.4％(v/v)接种量无菌接种于10％(w/w)脱脂乳，分别培养 (保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养，多粘类芽孢杆菌30℃、220rpm振荡培养)4d，获得相应的发酵乳。
将上述发酵乳按照实施例1中所述方法进行灭菌，离心，超滤，冷冻干燥，制备得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
3、α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的测定
上述不同菌株制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果如表3所示：
表3.不同菌株制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果
由表3可知，其他常规发酵菌株不具有发酵脱脂乳产生α-葡萄糖苷酶抑制剂的能力，而多粘类芽孢杆菌CGMCC No.10062可以发酵脱脂乳，最后得到α- 葡萄糖苷酶抑制剂，对α-葡萄糖苷酶的抑制活性非常显著。
以上对本发明所提供的α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体例子，对本发明的原理及实施方式进行了阐述。以上实施例的说明，只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，该多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10062，该方法包括以下步骤：
(a)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，发酵后的发酵乳再经冷冻干燥，得到发酵乳冻干粉；
(b)在步骤(a)得到的发酵乳冻干粉中加入甲醇浸提，离心取上清，再除去甲醇，得到所述α-葡萄糖苷酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为2.5x106～8.5x106cfu/mL。
3.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6％～12％。
4.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵为振荡培养，振荡速度为150rpm～250rpm。
5.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵的温度为25℃～35℃，发酵的时间为2～5d。
6.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(b)中，发酵乳冻干粉中甲醇的添加量为8～12mL/g，浸提的时间为0.5～3h。
7.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其特征在于，根据权利要求1-6任一所述的利用多粘类芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法制备而成。
8.根据权利要求7所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂，其特征在于，制备所得的α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50≤9.8mg/mL。
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