WO2012016445A1

WO2012016445A1 - 一种枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: WO2012016445A1
Application number: PCT/CN2011/072363
Authority: WO
Inventors: 马成兵; 陈军; 王涛
Original assignee: 新发药业有限公司
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2012-02-09
Also published as: CN101914478B; CN101914478A

Description

一种枯草芽孢杆菌及其应用本申请要求于 2010 年 08 月 06 日提交中国专利局、申请号为 201010252071.2、发明名称为 "一种枯草芽孢杆菌及其应用"的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。技术领域

本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。背景技术

枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis ) 芽孢杆菌属的一种需氧菌，因其广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖而得名。枯草芽孢杆菌单个细胞 0.7 ~ 0.8χ2 ~ 3 μηι, 着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动，为革兰氏阳性菌。芽孢 0.6 ~ 0.9χ 1.0 ~ 1.5μηι, 橢圓到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。枯草芽孢杆菌可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，还能合成维生素 B B₂、 B₆、烟酸等多种 B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。

维生素 B₂, 又称核黄素，是人体必需的 13种维生素之一，是机体中许多酶系统的重要辅基的组成成分，参与物质和能量代谢。维生素 B₂具有强化肝功能、调节肾上腺素的分泌、保护皮肤毛嚢粘膜及皮脂腺的功能。此外维生素 B₂还可以预防动脉硬化，是增进脑记忆功能不可缺少的物质，摄取足够的维生素 B₂对防范动脉硬化很有帮助。维生素 B₂缺乏会引起多种疾病，奶类及其制品、动物肝脏与肾脏、蛋黄、鳝鱼、胡萝卜等食物中富含维生素 B₂。然而身体贮存维生素 B₂的能力有限，当摄入量较大时，肝肾常有较高的浓度，超过肾阈即通过泌尿系统以游离形式排出体外，很难在人体内贮存，所以必须每天补充维生素 B₂, 因此维生素 B₂市场需求量很大。

目前生产维生素 B₂的方法主要有植物体提取法、化学合成法、化学半合成法和微生物发酵法。植物提取法产量低、成本高，不能形成规模化生产。化学合成法反应步骤多，反应复杂且收率很低，限制其工业化生产。化学半合成法产品纯度高，主要用于医药方面，但收率低，且生产过程需要多种有机溶剂，能耗高，并伴随产生大量废料。目前国内外广泛采用微生物发酵法工业生产维生素 B₂。

维生素 B₂可被多种微生物合成，如芽孢杆菌属，阿舒假嚢酵母，棉病嚢霉，假丝酵母等。 1940年由 Meade等采用丙酮丁醇梭状杆菌首先实现了微生物发酵法生产维生素 B₂, 发酵单位约为 70mg/L。 80年代以后，人们借助于基因工程技术有目的改造微生物，构建出多种基因工程菌，如以枯草芽孢杆菌作为受体菌所构建的维生素 B₂生产菌。但现有的枯草芽孢杆菌株维生素 B₂产量较低、成本较高，无法满足大规模工业化生产的需要。发明内容

本发明目的是提供一种糖耗低，维生素 B₂产量高的枯草芽孢杆菌。本发明所述枯草芽孢杆菌，是以保藏编号为 CGMCC No.4019的枯草芽孢杆菌 BS-1为出发菌株，通过紫外诱变的方法，经初筛、复筛和小罐发酵验证后获得的一株新型枯草芽孢杆菌。

本发明所述初为将枯草芽孢杆菌在培养基 A上 37°C培养 2 天后 , 选取菌落呈黄色、不透明、表面粗糙、直径大于 2mm, 菌落背面培养基明显变黄的单菌落接种到培养基 B中 37°C培养。培养 2 天后选取菌落直径小于 lmm的单菌落进行复筛。其中所述培养基 A包含糖、玉米浆和蛋白胨，所述培养基 B包含葡萄糖、酵母粉和豆饼粉。

本发明所述复为将初选出的枯草芽孢杆菌在复培养基上摇瓶培养 40h,选取维生素 B₂发酵单位大于 6000mg/L的维生素 B₂高产菌株，所述复筛培养基主要由葡萄糖、玉米浆、硫酸铵、酵母膏和硫酸镁组成。

将复筛选出的枯草芽孢杆菌进一步进行发酵罐培养，比较发酵液中的生物量、维生素 B₂发酵单位及发酵过程中补料消耗量，最终确定一种糖耗低，维生素 B₂产量高的新型枯草芽孢杆菌菌株 S5。

本发明所述枯草芽孢杆菌菌株 S5已于 2010年 7与 20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC )进行了保藏，保藏中心地址为北京中关村中国科学院微生物所内，保藏号为 CGMCC No.4018。

本发明采用浊度法，利用分光光度计测定发酵液在 600nm下的浊度，快速、准确得知发酵液中的生物量。实验表明，本发明所述枯草芽孢杆菌发酵后，生物量比对照菌株 BS-1提高了 23.6%, 发酵液中维生素 B₂产量提高了 39.9%, 糖耗降低了 29.1%。与对照菌株相比，本发明所述枯草芽孢杆菌糖耗显著降低，维生素 B₂产生量大幅提高，即本发明所述枯草芽孢杆菌提高了维生素 B₂生产效率，降低了生产成本，适合于维生素 B₂ 大规模工业化生产。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌发酵生产维生素 B₂中的方法。包括以下步骤：将所述枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基进行补料分批发酵，收集发酵液加入氢氧化钠溶液进行碱溶，离心收集上清即得。

作为优选，所述补料分批发酵条件为温度为 40°C , pH为 6.5 , 溶氧浓度为 20-40%。作为优选，所述发酵培养基组成为 4.5%玉米浆、 0.6%硫酸铵和 0.04% 硫酸镁，余量为蒸馏水。

作为优选，所述补料分批发酵在残糖浓度低于 6-8mg/ml时补料。所述补料组成为 50%葡萄糖和 1.5%玉米浆，余量为蒸馏水。

作为优选，所述发酵时间为 35h。

作为优选，氢氧化钠浓度为 0.01mol/L。

作为优选，所述离心条件为 8000rpm离心 5min。

在具体实施方式中，本发明提供利用所述枯草芽孢杆菌发酵生产维生素 B₂的方法，将本发明所述枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基，在发酵温度为 40°C、 pH为 6.5、溶氧为 20-40%的条件下进行补料分批发酵，残糖 (葡萄糖）浓度低于 6-8mg/ml时补料。发酵后收集发酵液，混匀后加入氢氧化钠溶液碱溶，离心收集上清即得。

结果表明，本发明所述枯草芽孢杆菌采用补料分批发酵发酵 35 h后，生物量比对照菌株 BS- 1提高了 23.6% ,每升发酵液中维生素 B₂产量提高了 39.9% , 生产每克维生素 B₂糖耗降低了 29.1%。与对照菌株相比，本发明所述枯草芽孢杆菌糖耗显著降低，维生素 B₂产生量大幅提高，补料消耗量显著降低，节约了生产成本，表明本发明所述生产维生素 B₂的方法适合于维生素 B₂大规模工业化生产，具有推广意义。生物保藏说明

菌株 BS- 1 : 分类命名：枯草芽孢杆菌， Bacillus subtilis于 2010年 7 月 20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.4019。

菌株 S5 : 分类命名：枯草芽孢杆菌， Bacillus subtilis于年 Ί 20 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC Νο·4018。具体实施方式

为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及利用其生产维生素 Β₂的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所述枯草芽孢杆菌，是通过紫外诱变的方法，经初筛、复筛和小罐发酵验证后获得的一株新型枯草芽孢杆菌。

本发明所述枯草芽孢杆菌，是以保藏编号为 CGMCC No.4019的枯草芽孢杆菌 BS-1为出发菌株，紫外照射 30s后，经两种不同培养基进行初师。

所述初筛具体步骤为：在培养基 A上 37°C培养 2 d后，选取菌落呈黄色、不透明、表面粗糙、直径大于 2mm, 菌落背面培养基明显变黄的单菌落接种到培养基 B中培养。培养基 B中 37°C培养 2 d后选取菌落直径小于 lmm的单菌落进行复筛。其中所述培养基 A包含糖、玉米浆和蛋白胨，所述培养基 B包含葡萄糖、酵母粉和豆饼粉。

所述复为将初选出的枯草芽孢杆菌在复培养基上摇瓶培养 40h, 筛选维生素 B₂发酵单位大于 6000mg/L的维生素 B₂高产菌株，所述复筛培养基主要由葡萄糖、玉米浆、硫酸铵、酵母膏和硫酸镁组成。

在复筛基础上进一步进行发酵罐培养，比较发酵液中的生物量、维生素 B₂发酵单位及发酵过程中补料消耗量，最终确定了一种糖耗低，维生素 B₂产量高的新型枯草芽孢杆菌菌株 S5。

本发明所述枯草芽孢杆菌菌株 S5已于 2010年 7与 20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏,保藏中心地址为北京中关村中国科学院生物所内，保藏号为 CGMCC No.4018。

生物量是表征微生物生长状况的一项基本参数，测定生物量对了解发酵过程中微生物的生长情况及发酵情况至关重要。测定生物量的方法有多种，如质量法、浊度法、显微镜直接计数法等，其中浊度法筒便、快速且可连续测定。本发明采用浊度法，利用分光光度计测定发酵液在 600nm 下的浊度，快速、准确得知发酵液中的生物量。

实验表明，本发明所述枯草芽孢杆菌采用补料分批发酵，发酵 35 h 后，生物量比对照菌株 BS-1提高了 23.6%, 每升发酵液中维生素 B₂产量提高了 39.9%, 生产每克维生素 B₂糖耗降低了 29.1%。与对照菌株相比，本发明所述枯草芽孢杆菌糖耗显著降低，维生素 B₂产生量大幅提高。

补料分批发酵，又称半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基或某些营养物质的方法。与传统的分批发酵相比，补料分批发酵可以解除底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻退等问题，得到较高的转化率，染菌和退化的概率小。合适的补料工艺能够有效地控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。本发明采用补料分批发酵工艺，在残糖（葡萄糖）浓度低于 6-8mg/ml时补加葡萄糖和玉米浆，以提高维生素 B₂的转化率，达到提高生产效率的目的。本发明所述枯草芽孢杆菌采用补料分批发酵，可提高维生素 B₂生产效率，降低生产成本，适合于维生素 B₂大规模工业化生产。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌在发酵生产维生素 B₂中的应用。具体实施例提供的利用所述枯草芽孢杆菌发酵生产维生素 B₂的方法包括以下步骤：将本发明所述枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基，在发酵温度为 40 °C , pH为 6.5 , 溶氧浓度为 20-40%的条件下补料分批发酵，残糖（葡萄糖）浓度低于 6-8mg/ml时补料。发酵 35h后收集发酵液，混匀后加入

0.01mol/L的氢氧化钠溶液碱溶， 8000rpm, 离心 5min, 收集上清即得。

以下以具体实施例说明本发明的效果，但本发明的保护范围不受以下实施例的限制。实施例 1 : 本发明所述枯草芽孢杆菌的诱变

取保藏编号为 CGMCC No.4019的枯草芽孢杆菌 BS-1接种于斜面培养，在超净台内用 10mL无菌生理盐水沖洗菌种斜面后，取 ImL菌悬液至含有 9mL无菌生理盐水的试管内，稀释 10倍，混匀后，再取出 ImL 菌悬液至含有 9mL无菌生理盐水的试管内，稀释 100倍混匀，依次稀释至 10 倍。

取稀释至 1(Τ⁶倍的菌悬液平铺在灭菌后的 9cm培养亚内，用 18W紫外灯，距离平板 28cm处照射，一次三个培养亚。照射时间为 30s。吸取 ImL处理过的菌悬液涂平板，分离菌种。实施例 2: 本发明所述枯草芽孢杆菌的初筛

1、初筛培养基（本申请中百分比均为质量百分比）

培养基 A: 1%蔗糖、 1%玉米浆和 0.5%蛋白胨，余量为蒸馏水；培养基 B: 1%葡萄糖、 0.5%酵母粉和 0.5%豆饼粉，余量为蒸馏水。 2、菌株的初筛

将紫外诱变后分离的菌种接种于培养基 A中， 37°C培养 2 d后观察菌落生长情况。挑取单菌落为黄色、不透明，菌落表面粗糙，菌落直径大于 2mm, 且菌落背面培养基明显变黄的菌落，共挑取单菌落 76个。将挑取的单菌落接种到培养基 B中， 37°C培养 2 d, 选取菌落直径小于 lmm单菌落，共挑取 8个，作为目标菌株依次命名 Sl-S8。实施例 3: 本发明所述枯草芽孢杆菌的复筛

1、复筛培养基

复筛液体培养基： 5%葡萄糖、 2%玉米浆、 0.05%硫酸铵、 0.5%酵母膏和 0.005%硫酸镁，余量为蒸馏水。

2、摇瓶培养

将初筛获得的 8个目标菌株分别接种于复筛液体培养基中， 37°C , 128 rpm摇瓶培养 40 h。

3、维生素 B₂的提取及测定

取出摇瓶中的培养液，混勾后稀释，精确移取一定体积置于一定体积的棕色容量瓶中，加入 0.01mol/L的氢氧化钠溶液，蒸馏水定容。摇匀后，放于避光处进行碱溶。若所取培养液镜检存在维生素 B₂晶体，碱溶 15min; 若无晶体出现，碱溶 5min。经过碱溶后的培养液混匀后倒入离心管中， 8000rpm, 离心 5min, 收集上清。

将离心后的上清液置于比色杯中，以蒸馏水为参比，在 444nm波长下测量，读数为 a, 读数在 0.2-0.8之间为可信值，维生素 B₂发酵单位按下式计算：

维生素 B₂发酵单位 =读数 ax稀释倍数 /0.0321

每个菌种重复 3次，测量结果如表 1 (单位为 mg/L )。表 1 复筛菌株维生素 B₂发酵单位

维生素 B₂发酵复筛菌株

单位（mg/L ) S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 第 1次 1220 5783 3200 1100 6500 4208 3412 2636 第 2次 1651 6253 4120 986 6218 3985 3335 2875 第 3次 1531 6142 3652 1329 6374 3902 3512 3025 平均 1467.3 6059.3 3657.3 1138.2 6364 4031.6 3419.6 2845 结果显示，目标菌株 S2和 S5维生素 B₂发酵单位分别为 6059.3mg/L 和 6364mg/L, 明显高于其它目标菌株，且差别有统计学意义，并且符合摇瓶培养 40h, 维生素 B₂发酵单位大于 6000mg/L的复筛标准，因此选取目标菌株 S2、 S5进一步进行小罐发酵验证。实施例 4: 本发明所述枯草芽孢杆菌的小罐发酵验证

1、发酵培养基：

底料： 4.5%玉米浆、 0.6%硫酸铵和 0.04%硫酸镁，余量为蒸馏水；补料： 50%葡萄糖和 1.5%玉米浆，余量为蒸馏水。

发酵培养基 121 °C、灭菌 30min。

2、小罐发酵

取目标菌株 S2、 S5以及出发菌株 BS-1的摇瓶菌种各 100ml分别接种于 7L发酵罐中，发酵培养基定容至 2L。采用补料分批发酵，发酵温度 40 °C , pH为 6.5 , 溶氧为 20-40%。残糖（葡萄糖浓度低于 6-8mg/ml时补糖。

3、维生素 B₂及生物量测定发酵 35h后收集发酵液，混勾后稀释，精确移取一定体积按照实施例 3所述的方法测定维生素 B₂的含量。

另外精确移取一定体积稀释的发酵液，测定发酵液生物量。将移取的发酵液置于一定体积的棕色容量瓶中，蒸馏水定容，。混勾后置于比色杯中，以蒸馏水为参比，在 600nm波长下测量生物量，读数为 b, 读数在 0.2-0.8之间为可信值。生物量按下式计算：

生物量 =读数 bx稀释倍数

维生素 B₂及生物量测定每个菌种重复 3批，并记录每批发酵葡萄糖消耗量，结果如表 2。

表 2目标菌株 S2、 S5小罐发酵维生素 B₂及生物量测定

S2 S5 B A

~ Ϊ 2 3 Ϊ 2 3 Ϊ 2 3"" 维生素 B₂发酵

11862 12310 11236 14250 14025 14125 9983 10263 10056 单位（mg/L )

生物量 124 129 128 133 128 132 111 102 105 糖耗（g/g ) 13.5 13.1 12.9 11.6 11.5 11.2 16.5 15.8 16.1 单位： 11802.7 单位： 14133.3 单位： 10100.7 ~~ 平均生物量： 127 生物量： 131 生物量： 106 糖耗： 13.17 糖耗： 11.43 糖耗： 16.13

结果显示，本发明所述枯草芽孢杆菌半连续式发酵 35 h后，目标菌株 S5菌体生长最快，生物量平均为 131 , 比对照菌株 BS-1高了 23.6%, 比目标菌株 S2 高 3%。目标菌株 S5 维生素 B₂发酵单位最高，平均为 14133.3 mg/L, 每升发酵液中维生素 B₂产量比对照菌株 BS-1 提高了 39.9%, 比目标菌株 S2高 19.7%。目标菌株 S5生产每克维生素 B₂消耗葡萄糖最低，平均为 11.43g, 比对照菌株 BS- 1低 29.1% , 比目标菌株 S2 低 13.2%。

因此选取菌株 S5于 2010年 7月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：枯草芽孢杆菌， Bacillus subtilis保藏编号为 CGMCC No.4018。

本发明所述枯草芽孢杆菌与对照菌株 BS-1和目标菌株 S2相比，维生素 B₂产生量大幅提高，补料消耗量显著降低，即本发明所述枯草芽孢杆菌大大提高了维生素生产效率，节约了生产成本，适合于维生素 B₂ 大规模工业化生产。实施例 5 : 本发明所述枯草芽孢杆菌发酵生产维生素 B₂

1、发酵培养基：

发酵培养基 121 °C、灭菌 30min。

2、发酵培养与维生素 B₂的提取

取本发明所述枯草芽孢杆菌 S5摇瓶菌种 100ml接种于 7L发酵罐中，发酵培养基定容至 2L ,控制发酵温度为 40 °C , pH为 6.5 ,溶氧为 20-40%。残糖浓度低于 6-8mg/ml时补糖（葡萄糖）。培养 35h后测定生物量，同时收集发酵液，混匀后加入 0.01mol/L的氢氧化钠溶液，避光处放置进行碱溶。若所取培养液镜检存在维生素 B₂晶体则碱溶 15min, 若无晶体出现，则碱溶 5min。碱溶后混匀， 8000rpm, 离心 5min, 收集上清即得维生素 B₂ , 按照实施例 3所述的方法检测上清液中维生素 B₂的含量。

本发明所述枯草芽孢杆菌半连续式发酵 35 h后，菌体生长快，生物量为 131 , 菌株维生素 B₂发酵单位为 14100 mg/L , 生产每克维生素 B₂消耗葡萄糖为 11.3g。采用本发明所述方法发酵生产维生素 B₂,糖耗低，维生素 B₂产量高，适合维生素 B₂大规模工业化生产。本发明提出的一种枯草芽孢杆菌及利用其制备维生素 B₂的方法已通过实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的精神、范围和内容中。

Claims

1、一种枯草芽孢杆菌，其保藏编号为 CGMCC No.4018。

2、一种生产维生素 B₂的方法，包括以下步骤：将权利要求 1所述枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基进行补料分批发酵，收集发酵液加入氢氧化权

钠溶液进行碱溶，离心收集上清即得。

3、根据权利要求 2所述的方利法，其特征在于，所述补料分批发酵条

3

件为温度为 40°C , pH为 6.5 , 溶氧浓要度为 20-40%。

4、根据权利要求 2所述的方法，其特求征在于，所述发酵时间为 35h。

5、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为 4.5%玉米浆、 0.6%硫酸铵和 0.04%硫酸镁，余量为蒸馏水。

6、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，所述补料分批发酵在残糖浓度低于 6-8mg/ml时补料。

7、根据权利要求 6所述的方法，其特征在于，所述补料组成为 50% 葡萄糖和 1.5%玉米浆，余量为蒸馏水。

8、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液浓度为 0.01mol/L。

9、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，所述离心条件为 8000rpm 离心 5min。