KR20050055174A

KR20050055174A - 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법

Info

Publication number: KR20050055174A
Application number: KR1020030088119A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 이경한; 박장희; 한종권; 이광호; 최향
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2003-12-05
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2005-06-13
Also published as: KR100542563B1

Abstract

본 발명은 리보플라빈을 생산하며 항생제인 트리메토프림(trimethoprim)에 대해 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 변이주 및 상기 미생물을 이용하여 리보플라빈을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003은 미생물의 대사 과정 중 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate)를 생합성하는 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dihydrofolate reductase)를 저해하는 항생제인 트리메토프림에 대해 내성을 가지기 때문에 리보플라빈을 고농도 및 고수율로 생산하는 특징이 있다. 따라서, 본 발명은 상기 미생물을 배양하고 그 배양물로부터 리보플라빈을 대량으로 수득할 수 있는 효과가 있다.

Description

리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법{Microorganism producing riboflavin and method for producing riboflavin using thereof}

본 발명은 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 리보플라빈을 생산하며 항생제인 트리메토프림(trimethoprim)에 대해 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003 및 상기 미생물을 이용하여 리보플라빈을 생산하는 방법에 관한 것이다.

리보플라빈(riboflavin, 비타민 B2)은 다양한 종의 미생물과 모든 식물에서 생합성되는 수용성 비타민의 일종이다. 그러나, 인간을 포함한 척추동물에서는 생합성되지 않는 특성이 있다. 리보플라빈은 모든 유기 세포체의 산화-환원반응에 필요한 조효소인 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)와 플라민 모노뉴클레오티드(flavin mononucleotide, FMN)의 전구물질로서 인간을 포함한 동물에게 필수영양소이다. 리보플라빈이 결핍되면 구강 및 인두점막의 염증, 피부 염증 및 다른 피부손상, 결막염, 시력감퇴, 성장저해 및 체중감소 등을 유발할 수 있다. 따라서, 리보플라빈은 상술한 바와 같은 비타민 결핍과 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 비타민 제제 및 가축성장을 위한 사료첨가물로서 사용되어 왔다. 특히, 농축된 상태의 리보플라빈은 그 자체가 사료로 사용되어 왔다. 현재 리보플라빈의 생산량은 전세계적으로 연간 6000톤 규모이며, 그 중 75% 정도가 사료 첨가제로 사용되고, 나머지가 식품 및 의약용으로 사용되고 있다.

현재, 리보플라빈을 생산하는 방법으로는 화학적 합성법과 미생물을 이용한 발효법이 병용되고 있다. 화학적 합성법은 대개 D-리보오스와 같은 전구물질을 이용하여 다단계 공정을 거쳐 고순도의 리보플라빈을 생산하는 방법이다. 상기 화학적 합성법은 그 출발물질이 고가이기 때문에, 생산비용이 비싼 단점이 있어 미생물을 이용한 발효법이 개발되었다. 미생물을 이용한 발효법은 자연으로부터 리보플라빈을 생산하는 미생물을 분리하거나 또는 리보플라빈이 과생산되도록 유전공학적 방법 또는 화학적-물리적 방법으로 변이를 유도한 미생물을 적절한 조건으로 배양한 다음 상기 배양물로부터 리보플라빈을 분리하는 방법이다.

상기 리보플라빈을 생산하는 미생물로는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)과 캔디다 속(Candida sp.)에 속하는 효모, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.) 및 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.)에 속하는 세균 및 에레모테시움 속(Eremothecium ashbyii sp.)과 에쉬비아(Ashbya sp.) 속에 속하는 곰팡이 등이 알려져 있다.

미국특허 제5,231,007호에는 효모인 캔디다 파마타(Candida famata)를 이용한 리보플라빈의 제조방법이 개시되어 있으며, 문헌에는 리보플라빈 생합성 관련 효소 유전자가 과발현되도록 조작된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 이용하여 각각 4.5g/L와 17.4g/L의 리보플라빈을 생산한 예가 보고된 바 있다.(Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 22:8-`8, 1999). 유럽특허 제0821063호에는 재조합 바실러스 서브틸리스를 이용한 리보플라빈의 생산방법이 개시되어 있으며, 미국특허 제5,837,528호에는 재조합 기술을 이용하여 바실러스 서브틸리스에 rib 오페론을 가진 벡터를 도입함으로서 리보플라빈의 생산성을 증가시킨 재조합 균주가 개시되어 있다. 또한 미국특허 제5,334,510호에는 5'-GMP 분해능을 약화시켜 리보플라빈 생산성을 향상시킨 바실러스 서브틸리스의 변이주를 이용한 리보플라빈 생산방법이 개시되어 있다. 리보플라빈의 산업적 생산에 있어서는, 자낭균류인 에레모테시움 에쉬비(Eremothecium ashbyii)와 에쉬비아 고시피(Ashbya gossypii)가 가장 많이 사용되는 균주이다. 상기 자낭균류의 변이주를 당밀이나 식물유를 주요 탄소원으로 하는 영양 배지에서 배양하여 발효액 1리터 당 15g의 리보플라빈을 생산한 바 있다. 상기 에쉬비아 고시피(Ashbya gossypii)를 이용한 리보플라빈 생산과 관련해서는 국제특허공개 제9526406호에도 개시된 바 있다.

그러나, 상기의 연구성과에도 불구하고 리보플라빈의 산업적인 대량생산은 여전히 요구되고 있기 때문에, 이를 위해 리보플라빈의 생산능이 향상된 미생물을 더욱 더 개발할 필요성이 있다.

한편, 미생물을 이용한 발효법에 있어서 고농도 및 고수율로 배양산물을 수득하기 위해 여러 가지 항생물질들에 대한 내성을 가지는 균주들이 개발되어 왔다. 항생제인 모넨신에 대한 내성을 가지는 라이신 생산 균주에 도입하여 생산성을 향상시킨 연구결과(대한민국 공개특허 2002-0058956), 본 발명에 사용된 항생제인 트리메토프림 등에 내성을 가지는 균주를 이용하여 싸이미딘(thymidine) 생산성을 향상시킨 연구결과(대한민국 공개특허 2002-0046602) 등 항생제 내성 균주에 의한 다양한 발효산물의 생산성 향상이 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 리보플라빈의 생산능이 향상된 미생물을 연구하던 중, 바실러스 서브틸리스에 항생제인 트리메토프림에 대한 내성을 부여함으로써 미생물 대사 과정 중 리보플라빈의 전구물질인 퓨린류 생합성이 강화되어 모균주에 비해 현저하게 리보플라빈을 고농도 및 고수율로 생산하는 변이주를 선별하고 이를 이용하여 리보플라빈을 고농도로 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 리보플라빈을 생산하는 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용한 리보플라빈의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리보플라빈을 생산하며 트리메토프림(trimethoprim)에 대해 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003(KCCM-10526)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003을 이용한 리보플라빈의 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003은 리보플라빈을 생산하는 바실러스 서브틸리스 CJKB0001(Bacillus subtilis CJKB0001)의 변이주로서 미생물 대사 과정 중 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate)의 생합성에 관여하는 효소를 저해하는 항생제인 트리메토프림에 대한 강화된 내성을 가지기 때문에 결과적으로 리보플라빈 생합성 경로가 강화되며, 이에 따라 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001에 비해 현저하게 리보플라빈을 고농도 및 고수율로 생산하는 특징이 있다. 트리메토프림은 5-((3,4,5-Trimethoxyphenyl)methyl)-2,4-pyrimidinediamine의 화학명을 가지는 디아미노피리미딘(diaminopyrimidine)으로 그람 양성과 그람 음성 세균에 모두 작용하며 특히 E.coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 등에 의한 요도 감염과 호흡기 감염 치료에 사용되는 항생물질이다. 트리메토프림의 항균 기작은 세균의 폴레이트(folate) 생합성 저해에 의한 것으로 알려져 있다. 트리메토프림은 인체의 디하이드로폴레이트 리덕테이즈에 작용하는 것보다 세균의 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dehydrofolate reductase)에 50000배 이상 강하게 결합한다. 이 경우 트리메토프림은 디하이드로폴레이트 리덕테이즈에 결합하여 효소 작용을 저해함으로써 디하이드로폴레이트로부터 테트라하이드로폴레이트의 생합성을 억제한다. 테트라하이드로폴레이트는 분자 사이에서 일탄소 단위(one-carbon fragment)를 전달하며, 싸이미딘(thymidine), 퓨린류(purines), 아미노산들의 생합성에 중요한 역할을 하게 된다. 이러한 기작에 의해 트리메토프림은 세균의 핵산과 단백질 생합성을 선택적으로 저해하여 항균 효과를 나타내게 되는 것이다.

이러한 일련의 기작으로부터 트리메토프림에 대한 내성이 강화된 균주의 경우 테트라하이드로폴레이트의 생합성이 강화될 것으로 유추할 수 있다. 한편, 테트라하이드로폴레이트는 퓨린류 생합성에서 일탄소 단위를 전달하는 반응의 조효소 역할을 한다. 결론적으로 트리메토프림에 대한 내성도입에 의한 테트라하이드로폴레이트의 생합성 강화는 리보플라빈의 전구물질인 퓨린의 생합성을 강화하여 리보플라빈 생산성을 증가시킬 것으로 생각되었다.

따라서, 본 발명자들은 바실러스 서브틸리스 CJKB0001에 트리메토프림 내성을 부여하기 위해 돌연변이원을 처리하여 변이를 유도한 다음 트리메토프림이 함유된 배지에서 생육할 수 있는 트리메토프림에 대한 내성을 갖는 균주를 선별하고, 이 중에서 리보플라빈 생성능이 가장 우수한 균주를 선별하였다.

상기 모균주로 사용한 바실러스 서브틸리스 CJKB0001(Bacillus subtilis CJKB0001)은 대한민국특허 제10-2002-076868호로 출원되어 있다. 모균주에 변이를 유도하는 방법으로는 당업계에 공지된 물리적 또는 화학적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적 방법으로는 X선 또는 자외선을 사용할 수 있으며, 화학적 방법으로는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitrosoguanidine, NTG), 디에틸설페이트(diethyl sulfate) 및 에틸아민(ethylamine) 등의 화학변이제를 사용할 수 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 변이가 유도된 균주를 항생제인 트리메토프림이 농도별로 함유된 배지에서 배양하여 고농도의 트리메토프림 존재하에서 생육이 가능한 변이주를 선별하고 이 중에서 리보플라빈 생성능이 가장 우수한 변이주 1주를 선별하였다. 이를 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003으로 명명하고 한국종균협회(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2003년 11월 17일 기탁하여 수탁번호 제KCCM-10526호를 부여받았다.

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003(KCCM-10526)은 트리메토프림이 130㎍/l까지 포함된 배지에서도 생육이 가능한 특성이 있다. 이에 반해 모균주로 사용한 바실러스 서브틸리스 CJKB0001는 트리메토프림이 100㎍/l이하로 포함된 배지에서 생육이 가능하며 그 이상의 농도에서는 생육하지 못하는 특성이 있다.

따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003은 트리메토프림에 대한 내성이 부여되어, 이에 따라 균주의 대사 과정중 디하이드로폴레이트 리덕테이즈의 트리메토프림에 의한 저해가 완화되고 리보플라빈 생합성의 전구물질인 퓨린류의 생합성이 강화됨으로써, 결과적으로 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001에 비해 리보플라빈 생산능이 현저하게 향상된 균주이다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003을 플라스크에서 배양한 결과, 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001 균주에 비해 약 13.8% 높은 농도인 9.1g/l의 리보플라빈을 배지 내에 축적함을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003을 51 발효조에서 배양한 결과, 모균주에 비해 약 10.4% 높은 농도인 29.6g/l의 리보플라빈을 배지 내에 축적함을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003(KCCM-10526) 은 모균주에 비해 항생제인 트리메토프림에 대한 내성이 향상된 균주로 퓨린류 생합성 강화에 의해 리보플라빈 생산능이 현저하게 향상된 균주이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003을 적합한 조건 하에 배양함으로써 상기 배양물로부터 리보플라빈을 생산하는 방법을 제공한다.

즉, 상기 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003(KCCM-10526)을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산 및 비타민 등이 함유된 통상의 배지 내에 접종하고 호기적인 조건 하에서 온도 및 pH 등을 조절함으로써 배양한다. 상기 탄소원으로는 포도당(glucose), 당밀(molasses), 젖당(lactose), 설탕(sucrose), 말토스(maltose), 덱스트린(dextrin), 전분(starch), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol) 및 글리세롤(glycerol)을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 포도당과 당밀을 사용한다. 상기 질소원으로는 암모니아(ammonia), 염화암모늄(ammonium chloride), 황산암모늄(ammonium sulfate)과 같은 각종 무기 질소원이나 펩톤(peptone), NZ-아민(NZ-amine), 육류 추출물(beef extract), 효모 추출물(yeast extract), 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해 생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물과 같은 유기 질소원을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 효모 추출물 및 옥수수 침지액을 사용한다. 상기 무기 화합물로는 인산1수소칼륨(Kalium monohydrogen phosphate), 인산2수소칼륨(Kalium dihydrogen phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 황산철(ferrous sulfate), 황산망간(magnese sulfate) 및 탄산칼슘(calcium carbonate) 등을 사용할 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양 요구성 염기 등을 추가로 첨가할 수 있다. 배양은 호기적 조건 하에서 예를 들면, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해 30~45℃의 온도, 바람직하게는 37~40℃의 온도에서 수행한다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양 기간은 2~6일간 수행한다.

본 발명에 따른 일 실시예에서는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003을 종배지에 접종하여 공기를 1vvm으로 공급하면서 37℃, 800rpm에서 20시간 배양한 후, 발효배지에 상기 종배양액을 접종하여 공기를 1vvm으로 공급하고 40℃, 800rpm, pH 7.0에서 60~70시간동안 진탕배양하면서, 배양액 내 잔존 당농도가 0.5~1%가 되도록 포도당이 첨가된 추가배지를 공급하여 배양액 내 총당 함량이 27%가 되도록 첨가하여 배양함으로써 모균주에 비해 약 10.4% 향상된 농도로 리보플라빈을 수득하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003의 선별

본 발명의 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003은 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001에 돌연변이원을 처리하여 변이를 유도한 다음 트리메토프림이 함유된 배지에서 배양하여 생육이 가능한 콜로니를 수득한 후 이 중에서 리보플라빈 생성능이 가장 우수한 변이주를 선별함으로써 이루어졌다.

모균주로 사용한 바실러스 서브틸리스 CJKB0001은 대한민국특허 제10-2002-076868호로 출원된 균주이다. 상기 바실러스 서브틸리스 CJKB0001을 인산 완충액(phosphate buffer, pH7.0) 또는 구연산 완충액(citrate buffer, pH5.5)에 10⁷~10⁸cells/ml의 농도로 현탁하였다. 상기 현탁액에 변이 유발제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitroguanidine)을 최종농도가 10~50㎍/ml가 되도록 첨가하였다. 이를 실온 또는 30℃에서 30~60분간 처리하여 돌연변이를 유발시켰다. 이를 0.85% 식염수로 3회 세척하고 적절히 희석한 다음, 1.8%의 한천(agar)이 함유된 최소배지에 트리메토프림을 농도별로 첨가하여 배지를 제조한 다음 상기 트리메토프림을 첨가한 배지에 도말한 후 37℃에서 5일동안 배양하여 콜로니(colony)를 수득하였다. 이 때, 트리메토프림의 농도는 0mg/l~140mg/l가 되도록 하였다. 다양한 농도의 트리메토프림을 함유한 최소배지에서 생장한 콜로니를 각각 영양배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 이를 발효배지에 접종하여 37℃에서 4~5일간 배양하여 발효 배양액에 축적되는 리보플라빈의 생성량이 가장 우수한 균주를 선별하였다. 리보플라빈의 생성량은 HPLC를 이용하여 분석하였다.

HPLC를 이용한 리보플라빈의 분석방법은 다음과 같다.

장치: Water 510

컬럼 크기: 내경 4.6mm, 길이 250mm

충진제: 크로마실 C18 5um

이동상: A. 5mM 소디움 헥사네술포네이트(5mM Sodium hexanesulfonate)

+ 20mM H₃PO₄

B. 아세토니트릴(Acetonitrile)

A : B = 89 : 11

유속: 1ml/min

검출기: TSP UV2000(UV 260nm)

시료주입량: 15ul

시료용매: 증류수

실험에 사용된 각각의 배지 조성은 표 1에 나타낸 바와 같다.

발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003의 선별을 위한 배지조성

배지	조성
영양한천배지	트립토스 10g/l, 우육 추출물 3g/l, 염화나트륨 5g/l,한천 15g/l
최소 배지	포도당 2.5g/l, 인산제1칼륨 7g/l, 인산제2칼륨 3g/l, 구연산나트륨 0.5g/l, 황산마그네슘 7수화물 0.75g/l, 효모 추출물 0.5g/l, 카사미노산 0.15g/l, 트립토판 20mg/l
트리메토프림 첨가배지	최소배지에 트리메토프림(trimethoprim) 40~140㎍/l을 첨가한 배지
발효 배지	포도당 100g/l, 건조효모 20g/l, 황산마그네슘 7수화물 0.5g/l, 인산제1칼륨 1.5g/l, 인산제2칼륨 3.5g/l, 요소 6g/l, 에리스로마이신 10mg/l, 클로람페니콜 10mg/l, pH 7.2~7.4

배양 결과, 트리메토프림 130㎍/l가 함유된 배지에서 생육하는 균주 중에서 리보플라빈 생성량이 가장 우수한 변이주 1주를 선별하고 이를 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003으로 명명하였다. 이렇게 선별된 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003은 한국종균협회(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2003년 11월 17일 기탁하여 수탁번호 제KCCM-10526호를 부여받았다.

실시예 2: 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003과 모균주로 사용한 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 트리메토프림에 대한 내성 비교

상기 실시예 1에서 선별한 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003(KCCM-10526)과 모균주로 사용한 바실러스 서브틸리스 CJKB0001을 트리메토프림이 농도별로 첨가된 배지에서 배양하여 트리메토프림에 대한 내성을 비교하였다. 즉, 각각의 균주를 상기 실시예 1의 표 1에 나타낸 바와 같은 트리메토프림 첨가배지에 접종하고 37℃에서 5일간 배양하였다.

실험 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 모균주로 사용한 바실러스 서브틸리스 CJKB0001 균주는 트리메토프림이 100㎍/l 첨가된 배지에서는 생육할 수 있었으나 그 이상의 농도에서는 생육할 수 없었다. 이에 반해 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003은 트리메토프림 130㎍/l가 포함된 배지에서도 생육이 가능하였다.

바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003과 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 트리메토프림에 대한 내성 비교

균주/티아프롤린농도(㎍/l)	0	40	60	100	120	130	140
바실러스 서브틸리스CJKB0001	+++	++	+	+	-	-	-
바실러스 서브틸리스CJKB0003(KCCM-10526)	+++	+++	+++	++	++	+	-

+: 생육함, -: 생육하지 못함

실시예 3: 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003의 플라스크 발효 역가

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 CJKB0003(KCCM-10526)의 플라스크 발효 역가를 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 발효 역가와 비교하여 조사하였다. 상기 본 발명에 따른 변이주와 모균주를 각각 종배지에 접종하여 종배양한 다음 종배양액을 플라스크 발효 배지에 접종하여 발효하였다. 종배지는 지름 18mm의 시험관에 5ml씩 분주한 다음 이를 121℃에서 15분간 가압 살균하여 제조하였다. 여기에 본 발명에 따른 변이주와 모균주를 각각 접종하고 200rpm, 37℃에서 20시간 동안 진탕배양하였다. 배양이 완료되면 종배양액 1ml를 플라스크 발효 배지에 접종하고 200rpm, 37℃에서 90~96시간 동안 진탕 배양하였다. 상기에서 플라스크 발효 배지는 본 배지와 별살 배지를 상기 종배지와 동일한 방법으로 가압 살균한 다음 미리 가압 살균한 250ml 용량의 플라스크에 각각 15ml와 5ml씩 분주하여 제조하였다. 배양이 완료되면, 배지 내에 축적된 리보플라빈의 양을 분석하였다. 리보플라빈 농도는 HPLC로 분석하였으며, 이 경우 분석 조건은 앞서 기술한 바와 같다.

실험에 사용한 종배지와 발효 배지의 조성은 표 3에 나타낸 바와 같다.

플라스크 발효를 위한 배지 조성

배지	조성
종배지	효모 추출물 5g/l, 트립톤 10g/l, 염화나트륨 10g/l, pH 조정 안함
발효 배지	본배지: 포도당 100g/l, 건조효모 20g/l, 황산마그네슘 7수화물 0.5g/l별살배지: 인산제1칼륨 1.5g/l, 인산제2칼륨 3.5g/l, 요소 6g/l, 에리스로마이신 10mg/l, 클로람페니콜 10mg/l, pH 7.2~7.4

실험 결과, 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 배지 내 리보플라빈 축적량은 8.0g/l였으며, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003의 배지 내 리보플라빈의 축적량은 모균주에 비해 무려 13.8%가 향상된 9.1g/l였다.

실시예 4: 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003의 51 발효조에서의 발효 역가

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 CJKB0003(KCCM-10526)의 51 발효조에서의 발효 역가를 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 발효 역가와 비교하여 조사하였다. 상기 본 발명에 따른 변이주와 모균주를 각각 종배지에 접종하여 종배양한 다음 종배양액을 발효 배지에 접종하여 유가식 발효(fed-batch fermentation)를 수행하였다. 먼저, 종배지를 2.5L 용량의 실험용 발효조에 11씩 분주한 다음 121℃에서 10분간 가압 살균하여 제조하였다. 이를 냉각한 다음 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003과 모균주를 각각 식염수에 현탁하여 10ml씩 접종한 후 제균된 공기를 1vvm으로 공급하고 37℃에서 800rpm으로 교반하면서 20시간 동안 배양하였다. 배양 중 pH는 조절하지 않았다. 종배양이 완료되면, 상기 종배양액을 발효 배지에 접종하여 유가식 발효를 수행하였다. 상기 발효 배지는 51 용량의 실험용 발효조에 1.41씩 분주한 다음 121℃에서 20분간 가압 살균하여 제조하였다. 이를 냉각한 다음 상기의 종배양액 200ml씩을 접종하고 제균된 공기를 1vvm으로 공급하면서 800rpm, 40℃에서 배양하였다. 이 때, 배양 중 잔존 당농도가 0.5~1%가 되도록 조절하면서 추가 배지를 공급하여 발효배지에 첨가된 총당농도가 27%가 되도록 하였다. 배양 중 pH는 암모니아수를 이용하여 7.0으로 조절하면서, 60~70시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 리보플라빈의 배지 내 축적량을 HPLC법으로 분석하였다. HPLC에 의한 리보플라빈 분석방법은 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명에서 사용한 배지의 조성은 표 4에 나타낸 바와 같다.

51 발효조 배양을 위한 배지 조성

배지	조성
종배지	당밀(50% 당기준)30g/l, 옥수수 침지액(corn steep liquor) 15g/l, 황산마그네슘 7수화물 0.5g/l, 황산암모늄 5g/l, 요소 3g/l, 에리스로마이신 10mg/l, 클로람페니콜 10mg/l, pH 7.4
발효 배지	본배지: 건조효모 20g/l, 옥수수 침지액 5g/l, 황산암모늄 2g/l, 황산마그네슘 7수화물 0.5g/l, 인산 제1칼륨 17.5g/l, 인산 제2칼륨 7.5g/l, 에리스로마이신 5mg/l, 클로람페니콜 10mg/l, pH 7.2~7.4추가배지: 포도당 270g/l, 건조효모 26.7g/l, 옥수수 침지액 26.7g/l

실험 결과, 리보플라빈의 배지 내 축적량은 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 26.8g/l였으며, 본 발명에 따른 변이주 CJKB0003의 경우에는 모균주에 비해 약 10.4%가 향상된 29.6g/l였다.

이상, 상기 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0003은 미생물 대사과정 중 리보플라빈의 전구물질인 퓨린류 생합성에 관여하는 조효소인 테트라하이드로폴레이트 생합성을 저해하는 트리메토프림에 대해 내성을 가지기 때문에 퓨린 생합성이 강화되어 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001에 비해 현저하게 리보플라빈을 고농도 및 고수율로 생산할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 상기 미생물을 배양하고 그 배양물로부터 리보플라빈을 대량으로 수득할 수 있는 효과가 있다.

Claims

리보플라빈을 생산하며 트리메토프림(trimethoprim)에 대해 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 변이주.
제1항에 있어서, 변이주는 바실러스 서브틸리스 CJKB0003 (KCCM-10526).
제1항 또는 제2항에 따른 미생물을 배양하여 그 배양물로부터 리보플라빈을 생산하는 방법.