JPS5942895A - イノシンおよびグアノシンの製造法 - Google Patents

イノシンおよびグアノシンの製造法

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JPS5942895A
JPS5942895A JP57131664A JP13166482A JPS5942895A JP S5942895 A JPS5942895 A JP S5942895A JP 57131664 A JP57131664 A JP 57131664A JP 13166482 A JP13166482 A JP 13166482A JP S5942895 A JPS5942895 A JP S5942895A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、イノシンおよび/またはグアノシンの製造法
に関するつ イノシンおよびグアノシンは、各々呈味性5’−イノシ
ン酸および5′−グアニμ酸の合成原料として重要な物
質であシ、これを安価かつ大量に製造することは、L業
上極めて意義深いことである。
従来、発酵法によるイノシンおよび/またはグアノシン
の製造法に関しては、アデニン要求株、あるいは、それ
にアデニン・アデノシン耐性、GMPレダクターゼ欠損
性、ヌクレオチドホスホリフーゼ欠損性などの一種ある
いはニ種以−にの性質が付与された変異株を用いる方法
が、工業的見地から有利な方法とされている。
本発明者らは、従来の発酵法によるイノシンおよび/ま
たはグアノシンのIM造法を改良すべく鋭意研究した結
果、バチルス属に属し、アデニン要求性を有するイノシ
ンおよび/またはグアノシン生産菌に、メソトレキセ−
1・、アミノ1テリン。
ビリメサミン、トリメトプリムなどの葉酸拮抗剤耐性を
付与することによって、イノシンおよび/またはグアノ
シンの蓄積が著しく増大することを見出し、この知見に
基き、さらに研究kfKねて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、バチルス属に属し、生育のために
アデニンを要求し、葉酸拮抗剤に耐性を有し、イノシン
および/またはグアノシン生産能を有する変異株を、培
地に培養し培5キ物中にイノシンおよび/またはグアノ
シンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
るイノシンおよび/またはグアノシンの!!l!造法、
である。
本発明に用いられる微生物は、バチルス属に属し、アデ
ニン要求性を有し、かつ葉酸拮抗剤に耐性含有するイノ
シンおよび/またはグアノシン生産菌であるが、これら
の微生物は、バチルス属に属する微生物、たとえはバチ
ルス・1ミμス、バチ/Vヌ・ズブチリス、バチルス壷
りヶニフォルミヌなどの、野生株からはもちろんのこと
、公知のバチルス1バに属するイノシンおよび/lたは
グアノシン生産菌株、たとえば、特公昭51−4683
9号公報に記載のバチ/L’ス・プミルス−11(工F
O  12476)を、親株としても誘導することがで
きる。
本発明に用いられる微生物の誘導および単離は、通常の
方法によって容易に達成することができる。
すなわち、バチルス・1ミルス,バチルス・ズブチリス
、バチルス・リヶニフォμミス等の、バチルス属に属す
る微生物に、たとえば、紫外線照射。
N−メチμ/ーN’ーニトローN−二トロソグアニジン
( NTG )処理など、通常の及異銹導処理を施した
後、親株の生育し得ない高い/uJ¥のノソトレキセー
ト,アミノプテリン、トリメトプリム、あるいはピリメ
サミンを含む培地で平板培養全行い、生じたコロニーを
分離釣菌することによって、目的とする変異株金得るこ
とができるっ かくして得られた微生物の葉酸拮抗剤に対する剛性度は
次のようにしてm11定することができる。
表1の培地(A)に所定の濃度の葉酸拮抗剤を加えた培
地(B)5−を含む試験管に、あらかじめニュートリエ
ンドアガーC Difco 社’M )スラント上で生
育させた試験菌株を約106個/ atになるように接
種して、37℃で24時間振艙培養するっ得られた培養
物を水で10倍に希釈して、590に汎における吸光度
を測定して生育度(B針9o )を求める。葉酸拮抗剤
を添加しない培地(A)で試験菌株を生育させた場合の
生育度( A ppO ) tlooとすると、葉酸拮
抗剤を含有する培地における相対生育度は(Bり96/
Aげo)X100で表わすことができる。本発明にいう
r 朗tg:′fC有する株」とは、これらの葉酸拮抗
剤を含む培地での相対生育値が親株の場合のそれよりも
大となるような変異株であろう 第1表 硫酸アンモニウム        o.3/グルタミン
酸ソーダ       1.ogα−アフニン    
     0.5〆硫酸マグネシウム        
o.o1%燐酸二カリウム         o.1%
硫酸マンガン          2   q/1硫酸
亜鉛            2   ’IFI/1ビ
オチン           100  μg/IIチ
アミン           100  μg/lアデ
ノシン         200   ダ/lかくして
得られる本発明で使用される変異株の例としては、バチ
ルス・プミルス ( L+cilluθpumi1.u
s) N A − 1  1  0 1  ( 工FO
   14184。
FEBM  P−6639)、バチルス・ブ°ミIレス
NA−1102( 工FO   14185,E’ER
MP−6640 )、バチルス・プミルス1103(I
FO   14186,E’ERM   I)−664
1)、バチルス・ズブチリス( Bacilluseu
btilis  )  N A −  60  1  
1  (  工F(]   +4189。
FEBM  P−6642)およびバチルス・ズブfー
リス HA−6012(−IFo  14190。
FEitM p−6643)があけられる。
上記のIFO番号は財団法人発酵研究7yr(I[i’
O。
大阪府大阪市淀川区十三木町2丁目17111−85号
)への寄託番号を、またPIFM  P番号は工業技術
微生物工業技術研究所(Fi?l,茨城県筑波谷田部町
東1丁目1番3号)への寄託番号ケあられすう上記各嶽
生物紘工FOへは昭和57年7月13日に、また1°R
■へは昭和5T年7月22日にそれぞれ寄託されている
上記のHA−1101株、Ii A − 1 1 0 
2株おj:びNA− 1 1 03株はバチ/L’メ・
プミルス隘158−A−11(IFO+2476)を、
HA−6011株オヨびNA−6012株はl<チルス
・ズブチリス1l15(IrO14187)をそれぞれ
親株として誘導されたものである。
これら友人性のF’4学的性質は、親株であるバチルス
・フ”ミノ1/スff1l  58−A−11(IF。
+2476)およびバチルス・ズブチリス凪115(I
Fo  14187)と同一である。親株の菌学的性質
は次のとおシである。
上記の工F0 12476株および11014187株
の性質を R、E、 1)uebnna、nおXびN。
E、 Gibbons編の[バージズ・マニュア1v1
1オプ・デターミナテイプ・バクテリオロジ−(Ber
gysMa、nual  6f Determinat
ive  Bacteriology)第8版、197
4jにしたがって横系の結果、それぞれバチルス・プミ
ルスおよびバチルス・ズブチリスに属する微生物である
と同定された。
このようにして得られたイノシンおよび/またはグアノ
シン生産菌を培養して、・イノシンおよび/またはグア
ノシンを生産せしめる培地としてtま、通常のイノシン
および/またはグアノシン発酵に用いられる培地が用い
られる。
たとえば、炭素源としては、グルコース、マルトース、
澱粉液化液、シュークロース々どの糖類のをユか、グリ
セリン、エタノール、ソルビトール等の一価ないし多価
のアμコーyvd、酢酸、プロピオン酸、ステアリン酸
、オレイン酸なとの脂肪酸類が、それぞれ単独もしくは
混合して用いられる。窒素源としては、ペプトン、大豆
粉、コーンステイーフ”リカー、酵母、肉エキス、尿素
などの有機窒素源のほか、硫酸、硝酸、塩酸1度酸など
のアンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水など
の無機窒素源が、それぞれ単独もしくは混合して用いら
れる。その他の栄養源として社、該菌の生育に必要な各
種の無機塩力゛1、たとえば、カpシウム、カリウム、
ナトリウム、マグネシウム。
マンガン、鉄、桐、亜鉛などの硫酸塩、塩酸塩。
炭r1々塩、硝酸塩、燐酸塩、酢酸塩などのほかに、該
菌の生育に必要なアミノ酸類、ビタミン類などが、J閾
宜βす沢のヒそれぞれ単独もしくは混合して用いられる
1、アテ′ニン源七しては、アデニン、アデノシン、ア
デニル酸、リボ核酸はもとよ勺、それらを含有する微生
物菌体や、その抽出物、肉エキスなどの天然有機物が用
いられる。さらに、培地には必要に応じて、シリコーン
オイル、ポリアルキレングリコールエーテμなどの消泡
剤や界面活性剤などを添加してもよい。
培養は、通常、撮盪あるいは、通気攪拌深部培養などの
好気的条件下に行われる。培地のT)Hは通常4ないし
9の範囲が好ましい。培養中に培地のpHの変動が観測
されれば、これを望ましい範囲に補正するため、たとえ
ば、水酸化アルカリ。
炭酸カルシウム、アンモニアなどの水溶液、懸濁液ある
いは、アンモニアガスなどを、適宜補添してもよい。培
養温度は、通常20℃ないし45℃の範囲から、使用さ
れる微生物の生育およびイノシン−やグアノシンの蓄積
に好適な温度が選沢される。培養時間は、イノシンおよ
び/またはグアノシンの蓄積量が最大に達するまで墳孜
すればよく、通常24時間ないし144時間培養ずれQ
よその目的を達成することができる。
発酵液からイノシンおよびグアノシンを分離採取する際
は、すでに公知にされている通常の]h列手段、たとえ
ば沈敞法、イオン交ノヅ(樹7Jl=rや活性度による
クロマトグラフィー法などの分屋精製法が用いられる。
以T”K実施例ケあげて木発明金さらに具体的に説明す
る。
実施例1 バチルス・プミルス!1&Ll 58−A−11(エア
°012476:il伝的特性としては、アデニン要求
性、アデニン・アデノシン劇V1ユ、グアユ1v(9レ
ダクターゼ欠損性、ヒスチジン要求性)K、常法によジ
ニトロソグアニジン(N T () )処理を行った後
、前記第1表の培地(A)にメソトレキセ−1・50/
1g、/mtオJ−(J悪天25 f / (l k加
えて調製した平板培地北に塗1落して、37℃で3日間
培養し、生じたコロニーの中からバチルス・プミルスN
AII(11(:[FO,1’4184.FERMP−
663El)1CGjn択し1ζ。この株と親株風15
8−A−11のメソトレキセートに対する剛性度(相対
生行度)を前記の方法で測定したところ、第2表に示す
結果を得たつ 第2表 次に、第3表に示す種培地20m1を含む200m1容
三1曲フラスコに、ニュートリエンドア〃−(Difc
o  社製)スラント上で生育させたバチルス・フ゛ミ
ルス NA−1101の一白金耳を接mし、37 ’C
で18時間振盪培養し、その1献を第3表の主発酵培地
20 mlを含む200 F11!容ヒダ付フラスコに
接種し、回転式損益機上で37 ’C,4日間培養した
ところ、23. OQ / vtの割合でグアノシンが
蓄積された。
第3表 約50個のフラスコを用いて同様の培養を行い、同質の
培養液11を得た。これを水酸化ナトリウムでpH1+
にしてグアノシン結晶′tr:溶解させた後、遠心分離
によって菌体を除去し、得られた上清液を中和、冷却し
、グア、ノシンの粗結晶21.0gを得た、このイl結
晶f:900 mlのn?!!水に溶解し、活性度を用
いて脱色し、冷所にてグアノシンを析出せしめ、グアノ
シンの稍結晶18.4fを得た。なお、前記N、l 5
8−A−11株を同一条件で培養したところ、4.51
’W / mlの割合でグアノシンが蓄積されたにすぎ
なかった。
実施例2 バチルス・フ”ミル7ff1158−A−11に常法に
より紫外線照射およびNTG処理を施した後、実施例1
と同様にしてアミノプテリン200μg/s+1を含有
する平板培地上に塗抹して培養し、生じたコロニーの中
からバチルス・プミルスHA−1102(工F0141
85.FEBM  P−6640)を選択した。これを
実施例1の条件で培養したところ、培養液中にイノシン
およびグアノシンがそれぞれ18ダ/−および6 ’I
 / atの割合で蓄積された。
実施例3 バチルス・ズブチリスの野生株隘115(UFO141
87)に常法によりN TG熱処理行い、アテ゛ニン要
求性変異株NA−6001(、T]i−014188)
を得た。
この株をさらにNTGで数回処理して、アミノプテリン
100μty、−/ tel f含有する平板培地上に
生育し得る変異株バチルス・ズブチリスNA −601
1(工FO14189,pb、nya  L)−664
2)を取得した。次に、これらの1泊株のアミノプテリ
ン酎性ならびにイノシンおよびグアノシン生産能tl−
実施例1と同様の方法で検削し、それぞれ表4および表
5に示す結果を得た。
実施例4 バチルス・プミルスN−158−A−11から常法妃よ
シN ’I’ G処理にょ夛、トリメト1リム1゜μt
z/mlを含有する平板培地上に生育し得る変異株とし
てバチルス・プミルス NA−1103(工FO141
86、FERM  p−6641)を得たつこの株のト
リメトップリム鋼性度は下表の通ルであったっ 第6表 ついで、この菌株を実施例1と同様の条件下で培養した
と辷る、22’51/weの割合でグアノシンが蓄積さ
れた。
実施例5 バチルス・ズブチリスNA−6001(工I’ 014
188)に常法によシNTG処[を数回繰り返して、ピ
リメサミン50 Itg/ atを含有する平板培地に
生育し得る変異株バチルス・ズブチリスNA 6012
 (IFO14190,FERM  P−6643)を
得た。これを実施例1と同様の条件で培養したところ、
イノシンおよびグアノシンがそれぞれ9〜/ mlおよ
び141l−j/ l #/の割合で蓄積された。
受託番号ダ史届 昭有158年′2月7;p日 / 事件の表示 昭和57年特許願@1.31664号 2発明の名称 イノシン卦よびグアノシンの製造法 3 手続を[7た者 一コ1件との関係  特許出願人 住所 大阪市東区道修町2丁目27番地名(ラド  武
田薬品工朶株式会社 代表者  倉 林 育 四 部 り代理人 住 所  大阪市淀用区十三木町2丁目17番85号1
孔 6、旧受託番号 (ll trgRu  P−6639 (2)FERM  P−6640 (3) F’ E RM  P −6641(4) I
i’ E RM  P −6642(5) ii’ R
RM  P −6643Z 新寄託機関の名称 工奈技術院微生物工業技術研究所 と新受託″flf号 (1)  P’ E RM  J3 P −288(4
)(1)iC文、対応)(2)  F’ E RM  
J3 F −289(A +/)(2)[対応)(3)
  l’ K RM  B P −290(,4)(3
)に対Uス)(4)FERN  BP−291(4の(
4)tc対応)(5)  F’ E RM  B P 
 292  (A (7%51C対応)9 M別置類の
目録 (1)  新受託番号を征明する書面     5通以
上 手  続  補  正  書 (自発)昭和58年 9
月二゛す[( 1、事件の表示 昭和57年特許願第131664号 2、発明の名称 イノシンおよびグアノシンの製造法 3、補正をする者 事f1との関係   特許出願人 住  所  大阪市東区道11に町21N」27番地名
 称(293)武IJI薬品」二業株式会社代表者  
 倉  林  育  四  部4、代理人 住  所  大阪市淀用区十三本町2丁目17番B5.
>;。
フ 」 」 東京連絡先(特許法規課)電話278−2219・22
186、補正の内容 1)明X叱J1第6頁第18行の「寄託されている。
」の後に、[該FRIへの寄託祉ブタベスト条約に基づ
く寄託に切換えられて、NA−1101株はF ERM
  B P −288、NA−1102株はV E R
IJ  B l) −289、HA−i 103株はF
E RM  13 P −290、NA−6011株は
FERIJ  B P−291、またN A −601
2株はFERM  BP−292の各受託番号で同研究
所に保管されている。」をそう入する。
2)同書第13頁第4〜5行の「F’ERMP−663
9Jを「1i’1ThRt、(BP−288Jに補正す
る。
3)同書)I’515頁第18行第18行 1・’ E
 RM  P −6640」を[rzRM BP−28
9Jに補正す= □ る。
:4)同町第16頁第11行の「1’F:RM  P−
6642」をl−F’ E RM  B P −2り 
l Jに補正する。
5)同町第17頁第18行のl’−F’ERM  P−
6641」をl’−F’ E RM  B P −29
1) Jに補正する。。
6)同、繋第18頁第16〜lフイjの[F ElセM
P−6643JをJ’ F E R?、(1’I P−
292jに補正する。
1′J、  −h

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. バチルス属に属し、生育のためにアデニンを要求し、葉
    酸拮抗剤に耐性を有し、イノシンおよび/またはグアノ
    シン生産能を有する変異株を、培地に培養し培養物中に
    イノシンおよび/またはグアノシン全生成蓄積せしめ、
    これを採取することを特徴とするイノシンおよび/また
    はグアノシンの製造法。
JP57131664A 1982-07-27 1982-07-27 イノシンおよびグアノシンの製造法 Granted JPS5942895A (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP57131664A JPS5942895A (ja) 1982-07-27 1982-07-27 イノシンおよびグアノシンの製造法
US06/515,260 US4701413A (en) 1982-07-27 1983-07-19 Method of producing inosine and/or guanosine
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