JP2001238700A - 異種個体の存在割合の測定方法 - Google Patents
異種個体の存在割合の測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 異種個体の存在割合の定量的かつ正確な測定
方法を提供すること。 【解決手段】生物集団または生物集団の加工物から２個
以上の試料を得；ＤＮＡを抽出し；ＤＮＡ、標的遺伝子
特異的プライマー、およびコントロール遺伝子特異的プ
ライマーを含有する反応液を調製し；定量的ＰＣＲに供
して各増幅産物の量を測定し；両増幅産物の量に基づい
て生物集団中の異種個体の存在割合を決定し；存在割合
の信頼度を統計処理によって決定することを包含する、
生物集団中の異種個体の存在割合の定量的測定方法。
方法を提供すること。 【解決手段】生物集団または生物集団の加工物から２個
以上の試料を得；ＤＮＡを抽出し；ＤＮＡ、標的遺伝子
特異的プライマー、およびコントロール遺伝子特異的プ
ライマーを含有する反応液を調製し；定量的ＰＣＲに供
して各増幅産物の量を測定し；両増幅産物の量に基づい
て生物集団中の異種個体の存在割合を決定し；存在割合
の信頼度を統計処理によって決定することを包含する、
生物集団中の異種個体の存在割合の定量的測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の検出方法
に関する。より詳細には、本発明は、生物集団中の異種
個体の存在割合の定量的かつ正確な測定方法に関する。
に関する。より詳細には、本発明は、生物集団中の異種
個体の存在割合の定量的かつ正確な測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】作物の生産性または品質を向上および／
または変化させるように改変された遺伝子を有する遺伝
子組換え作物（Genetically Modified Organism (ＧＭ
Ｏ)）が開発されている。例えば、遺伝子を改変して害
虫抵抗性、除草剤耐性を付与した作物が既に市販されて
いる（Wolfram Hemmer著、Foods Derived from Genetic
ally Modified Organisms and Detection Methods, Feb
ruary 1997, Agency BATS）。
または変化させるように改変された遺伝子を有する遺伝
子組換え作物（Genetically Modified Organism (ＧＭ
Ｏ)）が開発されている。例えば、遺伝子を改変して害
虫抵抗性、除草剤耐性を付与した作物が既に市販されて
いる（Wolfram Hemmer著、Foods Derived from Genetic
ally Modified Organisms and Detection Methods, Feb
ruary 1997, Agency BATS）。
【０００３】ＧＭＯの安全性に対する不安から（例え
ば、Losey, J.E. et al., Nature, 399:214 (1999)参
照）、ＧＭＯと非遺伝子組換え作物（ｎｏｎ−ＧＭＯ）
とを分別することおよび／またはＧＭＯの使用を表示す
ることが望まれていた。これに対応して、ＧＭＯとｎｏ
ｎ−ＧＭＯとの混合を防止するためのＩＰ（Identity P
reserved）輸送システムが実施されている。また、日本
国農林水産省は、日本農林規格（ＪＡＳ）法のＧＭＯに
関する品質表示の基準案を１９９９年１１月２９日に公
表した。
ば、Losey, J.E. et al., Nature, 399:214 (1999)参
照）、ＧＭＯと非遺伝子組換え作物（ｎｏｎ−ＧＭＯ）
とを分別することおよび／またはＧＭＯの使用を表示す
ることが望まれていた。これに対応して、ＧＭＯとｎｏ
ｎ−ＧＭＯとの混合を防止するためのＩＰ（Identity P
reserved）輸送システムが実施されている。また、日本
国農林水産省は、日本農林規格（ＪＡＳ）法のＧＭＯに
関する品質表示の基準案を１９９９年１１月２９日に公
表した。
【０００４】しかし、例えば、ＩＰ輸送が採用されない
場合に、あるいはＩＰ輸送が採用されていても故意また
は過失によって、ＧＭＯとｎｏｎ−ＧＭＯとが混合され
る可能性がある。従って、ＧＭＯとｎｏｎ−ＧＭＯとの
分別を保証するための、またはそれらの存在割合を測定
するための定量的な検査技術の開発が望まれていた。
場合に、あるいはＩＰ輸送が採用されていても故意また
は過失によって、ＧＭＯとｎｏｎ−ＧＭＯとが混合され
る可能性がある。従って、ＧＭＯとｎｏｎ−ＧＭＯとの
分別を保証するための、またはそれらの存在割合を測定
するための定量的な検査技術の開発が望まれていた。
【０００５】作物検体において、特定の遺伝子型が異な
る作物（例えば、ＧＭＯ）の存在割合を測定するために
使用され得る方法の例としては、特異的に核酸配列を増
幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および遺伝子
にコードされるタンパク質を免疫学的に検出するＥＬＩ
ＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）が挙げら
れる。しかし、下記のように、これらの方法を使用して
作物検体中のＧＭＯの存在割合を正確に測定することは
困難である。
る作物（例えば、ＧＭＯ）の存在割合を測定するために
使用され得る方法の例としては、特異的に核酸配列を増
幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および遺伝子
にコードされるタンパク質を免疫学的に検出するＥＬＩ
ＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）が挙げら
れる。しかし、下記のように、これらの方法を使用して
作物検体中のＧＭＯの存在割合を正確に測定することは
困難である。
【０００６】ＥＬＩＳＡは、目的タンパク質と酵素標識
した目的タンパク質に対する抗体との結合を定量的に測
定する方法である。ＥＬＩＳＡを作物検体の検査に適用
するためには、試験しようとする検体からタンパク質を
含有する試料を調製する必要がある。しかし、検体から
全てのタンパク質を規定された効率で調製することは困
難である。それゆえ、ＥＬＩＳＡを利用した測定方法
は、大きな誤差を伴い、真の値より低い値を与え得ると
考えられる。さらに、検体が加工食品である場合は、検
体中のタンパク質が加熱処理などによって変性し得るの
で、測定がさらに困難となり得る。
した目的タンパク質に対する抗体との結合を定量的に測
定する方法である。ＥＬＩＳＡを作物検体の検査に適用
するためには、試験しようとする検体からタンパク質を
含有する試料を調製する必要がある。しかし、検体から
全てのタンパク質を規定された効率で調製することは困
難である。それゆえ、ＥＬＩＳＡを利用した測定方法
は、大きな誤差を伴い、真の値より低い値を与え得ると
考えられる。さらに、検体が加工食品である場合は、検
体中のタンパク質が加熱処理などによって変性し得るの
で、測定がさらに困難となり得る。
【０００７】核酸の増幅方法であるＰＣＲは、多くの目
的のために使用されている。特に、ＰＣＲは、核酸を特
異的に多量に増幅させることができるので、高感度な核
酸検出方法として有用である。例えば、ＰＣＲは、トウ
モロコシ中の改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の検出に使用されて
いる（特開平１１−２６６８７５）。一般にＰＣＲは定
性的な検出に使用されるが、ＰＣＲを使用した試料中の
目的核酸の定量的測定も試みられている。例えば、目的
核酸配列と同様に増幅されかつ目的核酸配列とは異なる
大きさのバンドを生じる規定量の競合鋳型を添加してＰ
ＣＲを実施する競合的ＰＣＲが記載されている（例え
ば、Wang, A.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Vol. 86, 9717-9721 (1989)）。しかし、この方法は操
作が煩雑であり、この方法を用いて正確な測定値を得る
ことは困難である。このように、検体中のＧＭＯの存在
割合を測定するために適用できる、定量的かつ正確なＰ
ＣＲを利用した測定方法は知られていない。
的のために使用されている。特に、ＰＣＲは、核酸を特
異的に多量に増幅させることができるので、高感度な核
酸検出方法として有用である。例えば、ＰＣＲは、トウ
モロコシ中の改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の検出に使用されて
いる（特開平１１−２６６８７５）。一般にＰＣＲは定
性的な検出に使用されるが、ＰＣＲを使用した試料中の
目的核酸の定量的測定も試みられている。例えば、目的
核酸配列と同様に増幅されかつ目的核酸配列とは異なる
大きさのバンドを生じる規定量の競合鋳型を添加してＰ
ＣＲを実施する競合的ＰＣＲが記載されている（例え
ば、Wang, A.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Vol. 86, 9717-9721 (1989)）。しかし、この方法は操
作が煩雑であり、この方法を用いて正確な測定値を得る
ことは困難である。このように、検体中のＧＭＯの存在
割合を測定するために適用できる、定量的かつ正確なＰ
ＣＲを利用した測定方法は知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、生物集団中
の異種個体の存在割合を定量的かつ正確に測定する方法
を提供する。
の異種個体の存在割合を定量的かつ正確に測定する方法
を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者らは鋭意研究した結果、生物集団または生
物集団の加工物から得た複数の試料から抽出したＤＮＡ
を鋳型として、標的遺伝子およびコントロール遺伝子の
両方について定量的ＰＣＲを実施し、それぞれの遺伝子
の増幅産物の量に基づいて生物集団中の異種個体の存在
割合を算出し、複数の試料についての独立した測定結果
を統計処理することによって上記算出された値の信頼度
を決定することによって、定量的かつ正確に生物集団中
の異種個体の存在割合を測定できることを見出し、本発
明を完成するに至った。すなわち、本発明は、生物集団
中の異種個体の存在割合の定量的測定方法であって： ａ）生物集団または生物集団の加工物から２個以上の試
料を得る工程； ｂ）試料からＤＮＡを抽出する工程； ｃ）抽出したＤＮＡ、標的遺伝子特異的プライマー、お
よびコントロール遺伝子特異的プライマーを含有する反
応液を調製する工程； ｄ）反応液を定量的ＰＣＲに供して標的遺伝子特異的増
幅産物の量およびコントロール遺伝子特異的増幅産物の
量を測定する工程； ｅ）標的遺伝子特異的増幅産物の量およびコントロール
遺伝子特異的増幅産物の量に基づいて生物集団中の異種
個体の存在割合を決定する工程；および ｆ）決定された存在割合の信頼度を統計処理によって決
定する工程、を包含する方法を提供する。
め、本発明者らは鋭意研究した結果、生物集団または生
物集団の加工物から得た複数の試料から抽出したＤＮＡ
を鋳型として、標的遺伝子およびコントロール遺伝子の
両方について定量的ＰＣＲを実施し、それぞれの遺伝子
の増幅産物の量に基づいて生物集団中の異種個体の存在
割合を算出し、複数の試料についての独立した測定結果
を統計処理することによって上記算出された値の信頼度
を決定することによって、定量的かつ正確に生物集団中
の異種個体の存在割合を測定できることを見出し、本発
明を完成するに至った。すなわち、本発明は、生物集団
中の異種個体の存在割合の定量的測定方法であって： ａ）生物集団または生物集団の加工物から２個以上の試
料を得る工程； ｂ）試料からＤＮＡを抽出する工程； ｃ）抽出したＤＮＡ、標的遺伝子特異的プライマー、お
よびコントロール遺伝子特異的プライマーを含有する反
応液を調製する工程； ｄ）反応液を定量的ＰＣＲに供して標的遺伝子特異的増
幅産物の量およびコントロール遺伝子特異的増幅産物の
量を測定する工程； ｅ）標的遺伝子特異的増幅産物の量およびコントロール
遺伝子特異的増幅産物の量に基づいて生物集団中の異種
個体の存在割合を決定する工程；および ｆ）決定された存在割合の信頼度を統計処理によって決
定する工程、を包含する方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本明細書において用いる異種個体
なる用語は、生物集団中に存在する、特定の遺伝子型が
異なる生物をいう。異なる特定の遺伝子型としては、特
定品種に特異的に存在する遺伝子によるもの、人為的に
導入された遺伝子によるもの、内因性の遺伝子を人為的
に改変した遺伝子によるもの等が挙げられる。
なる用語は、生物集団中に存在する、特定の遺伝子型が
異なる生物をいう。異なる特定の遺伝子型としては、特
定品種に特異的に存在する遺伝子によるもの、人為的に
導入された遺伝子によるもの、内因性の遺伝子を人為的
に改変した遺伝子によるもの等が挙げられる。
【００１１】上記人為的に導入された遺伝子としては、
外来タンパク質をコードする遺伝子あるいは内因性遺伝
子の発現を制御するためのプロモーター、エンハンサー
やアンチセンス核酸をコードする遺伝子等が挙げられ
る。
外来タンパク質をコードする遺伝子あるいは内因性遺伝
子の発現を制御するためのプロモーター、エンハンサー
やアンチセンス核酸をコードする遺伝子等が挙げられ
る。
【００１２】異種個体の例としては、例えば、複数の品
種が混在する検体中の特定品種、ウイルスなどの病原体
に感染した個体、天然以外の遺伝子を導入したあるいは
内因性の遺伝子を改変した遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）
等が挙げられる。
種が混在する検体中の特定品種、ウイルスなどの病原体
に感染した個体、天然以外の遺伝子を導入したあるいは
内因性の遺伝子を改変した遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）
等が挙げられる。
【００１３】以下、本発明を主に作物検体中のＧＭＯの
存在割合の測定について説明するが、本発明は真核生物
および原核生物を包含する全ての生物に適用可能であ
る。本発明の方法を使用して、複数の品種が混在する検
体中の特定品種の存在割合を測定することができる。例
えば、「こしひかり」のブランド名で高価で市販されて
いるコメ製品のいくつかには、品種「こしひかり」以外
の安価なコメ品種が混合されている。このようなコメ製
品中の品種「こしひかり」の存在割合を測定すること
は、作物の表示に重要な意味を有する。
存在割合の測定について説明するが、本発明は真核生物
および原核生物を包含する全ての生物に適用可能であ
る。本発明の方法を使用して、複数の品種が混在する検
体中の特定品種の存在割合を測定することができる。例
えば、「こしひかり」のブランド名で高価で市販されて
いるコメ製品のいくつかには、品種「こしひかり」以外
の安価なコメ品種が混合されている。このようなコメ製
品中の品種「こしひかり」の存在割合を測定すること
は、作物の表示に重要な意味を有する。
【００１４】本発明に使用される生物集団は、該生物集
団自体、およびその加工物を包含する。生物集団が作物
である場合、未加工作物、該作物を原料として得られる
加工食品を本発明に使用することができる。未加工作物
は、遺伝子操作可能ないずれかの作物であり、限定する
ものではないが、ダイズ、トウモロコシ、イネ、コム
ギ、オオムギ、トマト、カボチャ、ジャガイモ、サツマ
イモ、ワタ、ナタネ、テンサイを包含する。加工食品
は、上記の未加工作物から加工されるいずれかの食品で
あり、限定するものではないが、豆腐、豆腐関連食品
（油揚げ、凍り豆腐、豆乳、湯葉等）、脱脂ダイズ、き
な粉、未精製ダイズタンパク質、コーングリッツ、コー
ンフラワー、コーンスターチ、ポップコーン、スナック
菓子を包含する。作物の乾燥品もまた、加工食品に包含
される。また、加工食品において、異種個体の存在割合
とは、該加工食品の原料中に含まれる異種固体の割合を
いう。
団自体、およびその加工物を包含する。生物集団が作物
である場合、未加工作物、該作物を原料として得られる
加工食品を本発明に使用することができる。未加工作物
は、遺伝子操作可能ないずれかの作物であり、限定する
ものではないが、ダイズ、トウモロコシ、イネ、コム
ギ、オオムギ、トマト、カボチャ、ジャガイモ、サツマ
イモ、ワタ、ナタネ、テンサイを包含する。加工食品
は、上記の未加工作物から加工されるいずれかの食品で
あり、限定するものではないが、豆腐、豆腐関連食品
（油揚げ、凍り豆腐、豆乳、湯葉等）、脱脂ダイズ、き
な粉、未精製ダイズタンパク質、コーングリッツ、コー
ンフラワー、コーンスターチ、ポップコーン、スナック
菓子を包含する。作物の乾燥品もまた、加工食品に包含
される。また、加工食品において、異種個体の存在割合
とは、該加工食品の原料中に含まれる異種固体の割合を
いう。
【００１５】加熱処理、酵素処理、精製、発酵などの工
程を経た加工食品中のＤＮＡは、その含量が低下し、そ
して／または分解されている可能性がある。このような
加工食品中のＧＭＯの存在割合を本発明の方法によって
測定できるかどうかは、下記のコントロール遺伝子の増
幅結果に基づいて判断される。
程を経た加工食品中のＤＮＡは、その含量が低下し、そ
して／または分解されている可能性がある。このような
加工食品中のＧＭＯの存在割合を本発明の方法によって
測定できるかどうかは、下記のコントロール遺伝子の増
幅結果に基づいて判断される。
【００１６】本発明の遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）と
は、外来遺伝子の導入、内因性遺伝子の改変などによっ
て改変された作物をいう。ＧＭＯは、限定するものでは
ないが、例えば、改変５−エノール−ピルボイルシキメ
ート−３−ホスフェートシンターゼ（5-enolpyruvoylsh
ikimate-3-phosphate synthase（ＥＰＳＰＳ））タンパ
ク質遺伝子を組込んで除草剤グリホサート（商品名「ラ
ウンドアップ（Roundup）」）に対する耐性を付与した
作物、ストレプトマイセス・ビリドクリモジェネス（St
reptomyces viridochrimogenes）由来のホスフィノトリ
シンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinothricin a
cetyltransferase（ｐａｔ））遺伝子を組込んで除草剤
グルホシネート（商品名「バスタ（Basta）」）に対す
る耐性を付与した作物、ストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカス（Streptomyces hygroscopicus）由来のｐａ
ｔ相同遺伝子であるｂａｒ遺伝子を組込んで、除草剤グ
ルホシネート（商品名「バスタ」）に対する耐性を付与
した作物、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus t
huringiensis）由来のＣｒｙＩＡ遺伝子、ＣｒｙＩＩＩ
Ａ遺伝子を組込んで害虫抵抗性を付与した作物を包含す
る。
は、外来遺伝子の導入、内因性遺伝子の改変などによっ
て改変された作物をいう。ＧＭＯは、限定するものでは
ないが、例えば、改変５−エノール−ピルボイルシキメ
ート−３−ホスフェートシンターゼ（5-enolpyruvoylsh
ikimate-3-phosphate synthase（ＥＰＳＰＳ））タンパ
ク質遺伝子を組込んで除草剤グリホサート（商品名「ラ
ウンドアップ（Roundup）」）に対する耐性を付与した
作物、ストレプトマイセス・ビリドクリモジェネス（St
reptomyces viridochrimogenes）由来のホスフィノトリ
シンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinothricin a
cetyltransferase（ｐａｔ））遺伝子を組込んで除草剤
グルホシネート（商品名「バスタ（Basta）」）に対す
る耐性を付与した作物、ストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカス（Streptomyces hygroscopicus）由来のｐａ
ｔ相同遺伝子であるｂａｒ遺伝子を組込んで、除草剤グ
ルホシネート（商品名「バスタ」）に対する耐性を付与
した作物、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus t
huringiensis）由来のＣｒｙＩＡ遺伝子、ＣｒｙＩＩＩ
Ａ遺伝子を組込んで害虫抵抗性を付与した作物を包含す
る。
【００１７】また、内因性遺伝子の改変によるＧＭＯと
しては、特定の内因性の構造遺伝子に置換、欠失、挿
入、付加等の変異を導入して該遺伝子産物の活性を改良
したもの、特定の内因性の調節遺伝子（プロモーター、
エンハンサー等）に置換、欠失、挿入、付加等の変異を
導入して該調節遺伝子の制御下にある遺伝子の発現を改
良したもの等が挙げられる。
しては、特定の内因性の構造遺伝子に置換、欠失、挿
入、付加等の変異を導入して該遺伝子産物の活性を改良
したもの、特定の内因性の調節遺伝子（プロモーター、
エンハンサー等）に置換、欠失、挿入、付加等の変異を
導入して該調節遺伝子の制御下にある遺伝子の発現を改
良したもの等が挙げられる。
【００１８】本発明の試料は、異種個体を含む可能性の
ある生物集団、該生物集団を原料とする加工物、ならび
に該生物集団、該加工物を処理して得られた調製物から
得られる。例えば、生物集団がトウモロコシ、ダイズな
どの作物の場合、これらの作物を破砕し（例えば、０．
０１％の検出限界を達成するために約１０，０００粒に
相当する約２ｋｇを破砕する）、均質にした調製物から
試料を得る。測定対象が均質な加工食品である場合は、
このような処理は必要とされない。
ある生物集団、該生物集団を原料とする加工物、ならび
に該生物集団、該加工物を処理して得られた調製物から
得られる。例えば、生物集団がトウモロコシ、ダイズな
どの作物の場合、これらの作物を破砕し（例えば、０．
０１％の検出限界を達成するために約１０，０００粒に
相当する約２ｋｇを破砕する）、均質にした調製物から
試料を得る。測定対象が均質な加工食品である場合は、
このような処理は必要とされない。
【００１９】本発明の方法において、１検体当り２個以
上の試料を得る。一般に、試料の数が多ければ多いほ
ど、より正確な測定値が得られる。一方、操作を簡便に
するためには試料の数を減少させることが好ましい。例
えば、１検体当り、２〜３０個、好ましくは３〜２０
個、より好ましくは５〜１０個、最も好ましくは４〜８
個の試料を得る。試料の量は、ＤＮＡを抽出するために
適切であるように決定される。例えば、ダイズもしくは
トウモロコシ粉末、または乾燥豆腐粉末の場合、０．５
〜１ｇの試料を採取する。
上の試料を得る。一般に、試料の数が多ければ多いほ
ど、より正確な測定値が得られる。一方、操作を簡便に
するためには試料の数を減少させることが好ましい。例
えば、１検体当り、２〜３０個、好ましくは３〜２０
個、より好ましくは５〜１０個、最も好ましくは４〜８
個の試料を得る。試料の量は、ＤＮＡを抽出するために
適切であるように決定される。例えば、ダイズもしくは
トウモロコシ粉末、または乾燥豆腐粉末の場合、０．５
〜１ｇの試料を採取する。
【００２０】ＤＮＡの抽出方法は、使用する試料に適切
なように選択される。例えば、トウモロコシ粉末および
ダイズ粉末からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知のＤＮＡ
抽出方法によって実施することができる。また、例え
ば、多数の試料を扱う場合には、ＤＮＡ抽出ロボットＢ
ＩＯＲＯＢＯＴ９６０４（キアゲン社製）およびこのロ
ボット用のＤＮＡ抽出キットを用いて、あるいは自動機
器ＧＥＮＥＥＸＴＲＡＣＴＯＲ ＴＡ１００（宝酒造社
製）および抽出試薬キットＧＥＮＥＥＸＴＲＡＣＴＩＮ
ＢＣキット（宝酒造社製）を使用して行うことができ
る。又、公知の方法によって抽出されたＲＮＡより、公
知の方法で合成されたＤＮＡも本発明に使用できる。
なように選択される。例えば、トウモロコシ粉末および
ダイズ粉末からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知のＤＮＡ
抽出方法によって実施することができる。また、例え
ば、多数の試料を扱う場合には、ＤＮＡ抽出ロボットＢ
ＩＯＲＯＢＯＴ９６０４（キアゲン社製）およびこのロ
ボット用のＤＮＡ抽出キットを用いて、あるいは自動機
器ＧＥＮＥＥＸＴＲＡＣＴＯＲ ＴＡ１００（宝酒造社
製）および抽出試薬キットＧＥＮＥＥＸＴＲＡＣＴＩＮ
ＢＣキット（宝酒造社製）を使用して行うことができ
る。又、公知の方法によって抽出されたＲＮＡより、公
知の方法で合成されたＤＮＡも本発明に使用できる。
【００２１】本発明の方法に使用される標的遺伝子と
は、異種個体以外の生物（例えば、非遺伝子組換え作物
（ｎｏｎ−ＧＭＯ））中には存在せず、異種個体（例え
ば、ＧＭＯ）中に存在する、または異種個体中の配列と
それ以外の生物中の配列とが異なる、検出しようとする
遺伝子をいう。例えば、上記の遺伝子組換え作物に組込
まれている外来遺伝子や、改変された内因性遺伝子が標
的遺伝子として挙げられる。好ましくは、標的遺伝子の
ヌクレオチド配列は公知である。標的遺伝子のヌクレオ
チド配列が未知である場合は、当該分野で周知の組換え
ＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＲ、クローニング、配列決定
を包含する）を使用することによって、そのような遺伝
子のヌクレオチド配列を決定することができる。標的遺
伝子は、限定するものではないが、例えば、ｐａｔ遺伝
子、改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子、ＣｒｙＩＡ遺伝
子、ｂａｒ遺伝子、ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子を包含する。
は、異種個体以外の生物（例えば、非遺伝子組換え作物
（ｎｏｎ−ＧＭＯ））中には存在せず、異種個体（例え
ば、ＧＭＯ）中に存在する、または異種個体中の配列と
それ以外の生物中の配列とが異なる、検出しようとする
遺伝子をいう。例えば、上記の遺伝子組換え作物に組込
まれている外来遺伝子や、改変された内因性遺伝子が標
的遺伝子として挙げられる。好ましくは、標的遺伝子の
ヌクレオチド配列は公知である。標的遺伝子のヌクレオ
チド配列が未知である場合は、当該分野で周知の組換え
ＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＲ、クローニング、配列決定
を包含する）を使用することによって、そのような遺伝
子のヌクレオチド配列を決定することができる。標的遺
伝子は、限定するものではないが、例えば、ｐａｔ遺伝
子、改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子、ＣｒｙＩＡ遺伝
子、ｂａｒ遺伝子、ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子を包含する。
【００２２】本発明の方法に使用されるコントロール遺
伝子とは、異種個体（例えば、ＧＭＯ）および異種個体
以外の生物（例えば、ｎｏｎ−ＧＭＯ）の両方に存在す
るいずれかの遺伝子をいう。好ましくは、コントロール
遺伝子のヌクレオチド配列は公知である。コントロール
遺伝子は、限定するものではないが、例えば、ツエイン
（zein）遺伝子、アクチンタンパク質遺伝子、レクチン
遺伝子を包含する。
伝子とは、異種個体（例えば、ＧＭＯ）および異種個体
以外の生物（例えば、ｎｏｎ−ＧＭＯ）の両方に存在す
るいずれかの遺伝子をいう。好ましくは、コントロール
遺伝子のヌクレオチド配列は公知である。コントロール
遺伝子は、限定するものではないが、例えば、ツエイン
（zein）遺伝子、アクチンタンパク質遺伝子、レクチン
遺伝子を包含する。
【００２３】本発明の方法における定量的ＰＣＲは、標
的遺伝子およびコントロール遺伝子の増幅産物の量に基
づいて、生物集団中の異種個体の存在割合を定量的に測
定することを可能にするＰＣＲである。例えば、定量的
な測定を可能にするような反応条件下でＰＣＲを行い、
増幅産物を電気泳動にかけ、増幅産物に対応するバンド
の強度に基づいて定量的測定を達成することができる。
より簡便かつ正確に定量的測定を実施するためには、増
幅産物の経時的定量的な測定を可能にするＰＣＲ用装置
（リアルタイム（Real Time）ＰＣＲ装置）を使用する
ことが好ましい。このようなＰＣＲ装置として、Ｌｉｇ
ｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロッシュ社製）、ＡＢＩ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＰＲＩＳＭ ７７００
（パーキンエルマーバイオシステムズ社製）などが市販
されている。リアルタイムＰＣＲを行う方法としては、
ＴａｑＭａｎ法（特許第２８２５９７６号）、ハイブリ
ダイゼーション法あるいはサイバーグリーンＩなどのイ
ンターカレーターを用いる方法等が挙げられる。何れの
方法も本発明の目的に使用できる。
的遺伝子およびコントロール遺伝子の増幅産物の量に基
づいて、生物集団中の異種個体の存在割合を定量的に測
定することを可能にするＰＣＲである。例えば、定量的
な測定を可能にするような反応条件下でＰＣＲを行い、
増幅産物を電気泳動にかけ、増幅産物に対応するバンド
の強度に基づいて定量的測定を達成することができる。
より簡便かつ正確に定量的測定を実施するためには、増
幅産物の経時的定量的な測定を可能にするＰＣＲ用装置
（リアルタイム（Real Time）ＰＣＲ装置）を使用する
ことが好ましい。このようなＰＣＲ装置として、Ｌｉｇ
ｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロッシュ社製）、ＡＢＩ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＰＲＩＳＭ ７７００
（パーキンエルマーバイオシステムズ社製）などが市販
されている。リアルタイムＰＣＲを行う方法としては、
ＴａｑＭａｎ法（特許第２８２５９７６号）、ハイブリ
ダイゼーション法あるいはサイバーグリーンＩなどのイ
ンターカレーターを用いる方法等が挙げられる。何れの
方法も本発明の目的に使用できる。
【００２４】定量的ＰＣＲに供される反応液は、試料か
ら抽出したＤＮＡ、標的遺伝子特異的プライマー、およ
びコントロール遺伝子特異的プライマーを含有する。プ
ライマーの設計および作製方法は当該分野において公知
である。さらに、反応液は、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液、その他の添加物を含有し得る。
このような成分は使用するＰＣＲ用装置、キットなどに
依存して適切に選択される。反応液は、増幅産物を検出
するための標識プローブを含有してもよい。
ら抽出したＤＮＡ、標的遺伝子特異的プライマー、およ
びコントロール遺伝子特異的プライマーを含有する。プ
ライマーの設計および作製方法は当該分野において公知
である。さらに、反応液は、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液、その他の添加物を含有し得る。
このような成分は使用するＰＣＲ用装置、キットなどに
依存して適切に選択される。反応液は、増幅産物を検出
するための標識プローブを含有してもよい。
【００２５】本発明の方法において、生物集団中の異種
個体の存在割合を、標的遺伝子特異的増幅産物の量およ
びコントロール遺伝子特異的増幅産物の量に基づいて決
定する。１つの実施態様において、１つの試料中に含ま
れる標準遺伝子およびコントロール遺伝子両方の初期鋳
型ＤＮＡの量を、各々の増幅産物の量から、検量線を用
いて算出する。試料の測定には、検量線の作成と同一の
条件（増幅用プライマー／検出用プローブの組合せを包
含する）を使用する。
個体の存在割合を、標的遺伝子特異的増幅産物の量およ
びコントロール遺伝子特異的増幅産物の量に基づいて決
定する。１つの実施態様において、１つの試料中に含ま
れる標準遺伝子およびコントロール遺伝子両方の初期鋳
型ＤＮＡの量を、各々の増幅産物の量から、検量線を用
いて算出する。試料の測定には、検量線の作成と同一の
条件（増幅用プライマー／検出用プローブの組合せを包
含する）を使用する。
【００２６】まず、ＧＭＯのような異種個体のみを含有
する陽性生物集団由来の試料からＤＮＡを抽出し、この
ＤＮＡを段階希釈して希釈液を調製し、この希釈液を鋳
型として標的遺伝子、コントロール遺伝子のそれぞれに
ついてＰＣＲを行い、その結果に基づいて初期鋳型ＤＮ
Ａ量対増幅産物量の検量線を作成する。次いで、測定し
ようとする試料について同様にＤＮＡの抽出およびＰＣ
Ｒを実施し、増幅産物量を測定し、上記のようにして作
成した検量線に基づいて、それぞれの遺伝子の初期鋳型
ＤＮＡ量を決定する。次いで、コントロール遺伝子の初
期鋳型ＤＮＡ量に対する標的遺伝子の初期鋳型ＤＮＡ量
の比率（百分率）を算出して、生物集団中の異種個体
（ＧＭＯ）の存在割合を決定する。試料について決定さ
れる初期鋳型ＤＮＡ量は相対的な値であり、検量線作成
用鋳型ＤＮＡとは異なるＤＮＡの抽出効率または抽出Ｄ
ＮＡ中に含まれ得るＰＣＲ反応のインヒビターの存在も
しくは量などの因子による変動を受け得る。しかし、こ
れらの因子はコントロール遺伝子および標的遺伝子の両
方に同様に寄与するので、２つの鋳型ＤＮＡ量の比を算
出して、生物集団中の異種個体の存在割合を決定する場
合、そのような変動は最終的に決定される存在割合に影
響を与えない。
する陽性生物集団由来の試料からＤＮＡを抽出し、この
ＤＮＡを段階希釈して希釈液を調製し、この希釈液を鋳
型として標的遺伝子、コントロール遺伝子のそれぞれに
ついてＰＣＲを行い、その結果に基づいて初期鋳型ＤＮ
Ａ量対増幅産物量の検量線を作成する。次いで、測定し
ようとする試料について同様にＤＮＡの抽出およびＰＣ
Ｒを実施し、増幅産物量を測定し、上記のようにして作
成した検量線に基づいて、それぞれの遺伝子の初期鋳型
ＤＮＡ量を決定する。次いで、コントロール遺伝子の初
期鋳型ＤＮＡ量に対する標的遺伝子の初期鋳型ＤＮＡ量
の比率（百分率）を算出して、生物集団中の異種個体
（ＧＭＯ）の存在割合を決定する。試料について決定さ
れる初期鋳型ＤＮＡ量は相対的な値であり、検量線作成
用鋳型ＤＮＡとは異なるＤＮＡの抽出効率または抽出Ｄ
ＮＡ中に含まれ得るＰＣＲ反応のインヒビターの存在も
しくは量などの因子による変動を受け得る。しかし、こ
れらの因子はコントロール遺伝子および標的遺伝子の両
方に同様に寄与するので、２つの鋳型ＤＮＡ量の比を算
出して、生物集団中の異種個体の存在割合を決定する場
合、そのような変動は最終的に決定される存在割合に影
響を与えない。
【００２７】作物検体を破砕して得た微粉末を試料とす
る場合、粉末を均質になるように十分に混合しても測定
値にはサンプリングによる誤差が含まれ得る。測定対象
が一見均質な加工食品である場合も同様である。さら
に、抽出工程、ＰＣＲ工程においても誤差が生じ得る。
本発明の方法において、複数の試料について独立した測
定を実施し、得られた結果に対して統計処理をすること
によって、このような誤差を含む測定値の信頼度が保証
される。本発明に適用可能な統計処理は当該分野におい
て公知である。例えば、区間推定を使用して、測定値の
所定の（例えば、９９％）の信頼度を保証する上限値お
よび下限値で規定された範囲を決定することができる。
本発明以前には、このような統計処理は、生物集団中の
異種個体の存在割合の定量的測定方法に適用されていな
い。
る場合、粉末を均質になるように十分に混合しても測定
値にはサンプリングによる誤差が含まれ得る。測定対象
が一見均質な加工食品である場合も同様である。さら
に、抽出工程、ＰＣＲ工程においても誤差が生じ得る。
本発明の方法において、複数の試料について独立した測
定を実施し、得られた結果に対して統計処理をすること
によって、このような誤差を含む測定値の信頼度が保証
される。本発明に適用可能な統計処理は当該分野におい
て公知である。例えば、区間推定を使用して、測定値の
所定の（例えば、９９％）の信頼度を保証する上限値お
よび下限値で規定された範囲を決定することができる。
本発明以前には、このような統計処理は、生物集団中の
異種個体の存在割合の定量的測定方法に適用されていな
い。
【００２８】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
るが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００２９】実施例１：遺伝子組換えトウモロコシの存
在割合の測定 陽性トウモロコシとして、ＧＭＯの１つであるＴ１４／
２５系統トウモロコシ（商品名VARIETY8539、Garst See
d Company社製）（以下、Ｔ１４／２５と記載する）を
用いた。Ｔ１４／２５にはストレプトマイセス・ビリド
クリモジェネス（Streptomyces viridochrimogenes）由
来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ
（ｐａｔ）遺伝子（商品名Liberty Link、Hoechst/AgrE
vo社製）が導入されており、この遺伝子のゲノム中での
コピー数は１であることが知られている。尚、配列およ
びコピー数は、アグレボ（AgrEvo）社が厚生省へ提出し
た書類中に記載されており、該書類の情報は（財）日本
食品衛生協会において入手することができる。トウモロ
コシには、ツエイン（zein）タンパク質が普遍的に存在
し、このタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド
配列は既知である（Kirihara J.A. et al., Mol. Gen.
Genet, 211:477-484 (1988)）。ｐａｔ遺伝子を標的遺
伝子とし、ツエイン遺伝子をコントロール遺伝子として
両遺伝子の量比を測定することにより、トウモロコシ検
体におけるＴ１４／２５の存在割合を測定した。
在割合の測定 陽性トウモロコシとして、ＧＭＯの１つであるＴ１４／
２５系統トウモロコシ（商品名VARIETY8539、Garst See
d Company社製）（以下、Ｔ１４／２５と記載する）を
用いた。Ｔ１４／２５にはストレプトマイセス・ビリド
クリモジェネス（Streptomyces viridochrimogenes）由
来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ
（ｐａｔ）遺伝子（商品名Liberty Link、Hoechst/AgrE
vo社製）が導入されており、この遺伝子のゲノム中での
コピー数は１であることが知られている。尚、配列およ
びコピー数は、アグレボ（AgrEvo）社が厚生省へ提出し
た書類中に記載されており、該書類の情報は（財）日本
食品衛生協会において入手することができる。トウモロ
コシには、ツエイン（zein）タンパク質が普遍的に存在
し、このタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド
配列は既知である（Kirihara J.A. et al., Mol. Gen.
Genet, 211:477-484 (1988)）。ｐａｔ遺伝子を標的遺
伝子とし、ツエイン遺伝子をコントロール遺伝子として
両遺伝子の量比を測定することにより、トウモロコシ検
体におけるＴ１４／２５の存在割合を測定した。
【００３０】陰性トウモロコシとして、ＧＭＯを含有し
ないトウモロコシ（以下、ＧＭＯＦｒｅｅと記載する）
を使用した。Ｔ１４／２５をＧＭＯ Ｆｒｅｅトウモロ
コシに対して２％または６％の重量比で含有するトウモ
ロコシ検体（それぞれＡ、Ｂと称する）を調製した。ト
ウモロコシ検体Ａ、Ｂは表１に示すように調製した。
ないトウモロコシ（以下、ＧＭＯＦｒｅｅと記載する）
を使用した。Ｔ１４／２５をＧＭＯ Ｆｒｅｅトウモロ
コシに対して２％または６％の重量比で含有するトウモ
ロコシ検体（それぞれＡ、Ｂと称する）を調製した。ト
ウモロコシ検体Ａ、Ｂは表１に示すように調製した。
【００３１】
【表１】
【００３２】混合したトウモロコシ検体をカッターミキ
サー５．５（デイトサマ社、フランス）を用いて微粉末
状に破砕した。この破砕したトウモロコシ検体Ａ、Ｂか
ら１ｇずつ、それぞれ８点で粉末試料を得、そのそれぞ
れから独立してゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡ
の抽出には、ＤＮＡ抽出ロボットＢＩＯＲＯＢＯＴ９６
０４（キアゲン社製）およびこのロボット用のＤＮＡ抽
出キットを使用した。このキット添付のＡＥ Ｂｕｆｆ
ｅｒに溶解したＤＮＡ溶液１００μｌを得た。
サー５．５（デイトサマ社、フランス）を用いて微粉末
状に破砕した。この破砕したトウモロコシ検体Ａ、Ｂか
ら１ｇずつ、それぞれ８点で粉末試料を得、そのそれぞ
れから独立してゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡ
の抽出には、ＤＮＡ抽出ロボットＢＩＯＲＯＢＯＴ９６
０４（キアゲン社製）およびこのロボット用のＤＮＡ抽
出キットを使用した。このキット添付のＡＥ Ｂｕｆｆ
ｅｒに溶解したＤＮＡ溶液１００μｌを得た。
【００３３】Ｔ１４／２５のみを含有する検体を破砕し
て得た粉末を陽性試料とし、この試料から上記と同様に
ゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを滅菌蒸留水で１
０倍ずつ５段階希釈して希釈液を調製した（原液、１０
倍希釈、１００倍希釈、１，０００倍希釈、１０，００
０倍希釈）。
て得た粉末を陽性試料とし、この試料から上記と同様に
ゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを滅菌蒸留水で１
０倍ずつ５段階希釈して希釈液を調製した（原液、１０
倍希釈、１００倍希釈、１，０００倍希釈、１０，００
０倍希釈）。
【００３４】これらの希釈液を鋳型としてｐａｔ遺伝
子、ツエイン遺伝子のそれぞれを増幅するＰＣＲを行
い、その結果に基づいて両遺伝子に関する検量線を作成
した。ｐａｔ遺伝子の増幅にはｐａｔ遺伝子増幅用プラ
イマー対ｐａｔ ＦＰおよびｐａｔ ＲＰ（配列番号１
および配列番号２）ならびに蛍光標識プローブ（配列番
号３）を使用した。ツエイン遺伝子の増幅にはツエイン
遺伝子増幅用プライマー対Ｚｅｉｎ ＦＰおよびＺｅｉ
ｎ ＲＰ（配列番号４および配列番号５）ならびに蛍光
標識プローブ（配列番号６）を使用した。上記の２種の
蛍光標識プローブの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴ
ＡＭＲＡ（ともに、グレーンリサーチ社製）を付加し
た。表２にこの増幅反応の反応液組成を示す。
子、ツエイン遺伝子のそれぞれを増幅するＰＣＲを行
い、その結果に基づいて両遺伝子に関する検量線を作成
した。ｐａｔ遺伝子の増幅にはｐａｔ遺伝子増幅用プラ
イマー対ｐａｔ ＦＰおよびｐａｔ ＲＰ（配列番号１
および配列番号２）ならびに蛍光標識プローブ（配列番
号３）を使用した。ツエイン遺伝子の増幅にはツエイン
遺伝子増幅用プライマー対Ｚｅｉｎ ＦＰおよびＺｅｉ
ｎ ＲＰ（配列番号４および配列番号５）ならびに蛍光
標識プローブ（配列番号６）を使用した。上記の２種の
蛍光標識プローブの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴ
ＡＭＲＡ（ともに、グレーンリサーチ社製）を付加し
た。表２にこの増幅反応の反応液組成を示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】上記の各希釈液のそれぞれについてＰＣＲ
を２連で実施した。反応は、９６穴プレート中でＡＢＩ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＰＲＩＳＭ
７７００（パーキンエルマーバイオシステムズ社製）を
用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により実施した。標的
遺伝子（ｐａｔ遺伝子）およびコントロール遺伝子（ツ
エイン遺伝子）の増幅を経時的に記録し、両遺伝子に関
する検量線を作成した。
を２連で実施した。反応は、９６穴プレート中でＡＢＩ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＰＲＩＳＭ
７７００（パーキンエルマーバイオシステムズ社製）を
用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により実施した。標的
遺伝子（ｐａｔ遺伝子）およびコントロール遺伝子（ツ
エイン遺伝子）の増幅を経時的に記録し、両遺伝子に関
する検量線を作成した。
【００３７】次に、トウモロコシ検体Ａ、Ｂから得たそ
れぞれ８個の試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし
て同様にＰＣＲを実施し、検量線に基づいて、各試料中
の標的遺伝子（ｐａｔ遺伝子）およびコントロール遺伝
子（ツエイン遺伝子）の相対的な初期鋳型ＤＮＡ量（表
３および表４中それぞれａおよびｂ）を算出した。それ
ぞれの試料について、コントロール遺伝子（ツエイン遺
伝子）に対する標的遺伝子（ｐａｔ遺伝子）の百分率
（ａ／ｂ×１００）を算出した。さらに、トウモロコシ
検体Ａ、Ｂのそれぞれについて、８個の試料から得られ
た相対百分率から区間推定法により９９％信頼度の下限
値および上限値を求めた。結果を表３および表４に示
す。
れぞれ８個の試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし
て同様にＰＣＲを実施し、検量線に基づいて、各試料中
の標的遺伝子（ｐａｔ遺伝子）およびコントロール遺伝
子（ツエイン遺伝子）の相対的な初期鋳型ＤＮＡ量（表
３および表４中それぞれａおよびｂ）を算出した。それ
ぞれの試料について、コントロール遺伝子（ツエイン遺
伝子）に対する標的遺伝子（ｐａｔ遺伝子）の百分率
（ａ／ｂ×１００）を算出した。さらに、トウモロコシ
検体Ａ、Ｂのそれぞれについて、８個の試料から得られ
た相対百分率から区間推定法により９９％信頼度の下限
値および上限値を求めた。結果を表３および表４に示
す。
【００３８】
【表３】
【００３９】
【表４】
【００４０】トウモロコシ検体Ａ、Ｂの両方について、
添加したＴ１４／２５の存在割合（それぞれ２％、６
％）は、測定値に基づいた区間推定によって決定した下
限値と上限値との間の範囲内であった。
添加したＴ１４／２５の存在割合（それぞれ２％、６
％）は、測定値に基づいた区間推定によって決定した下
限値と上限値との間の範囲内であった。
【００４１】実施例２：遺伝子組換えダイズの存在割合
の測定 陽性ダイズとして、ＧＭＯを含有しないダイズにＧＭＯ
の１つであるラウンドアップレディ（Roundup Ready、
モンサント社製）を０、０．１、０．５、及び２％の濃
度にて含むSoya Bean Powder SB-Set（Ｆｌｕｋａ社
製、Individual sample number 1673、Lot and filling
code 92683/1）を用いた。本サンプルは、Institute f
or Reference Materials and Measurements（ＩＲＭ
Ｍ）によって承認を受けた標準大豆粉である。
の測定 陽性ダイズとして、ＧＭＯを含有しないダイズにＧＭＯ
の１つであるラウンドアップレディ（Roundup Ready、
モンサント社製）を０、０．１、０．５、及び２％の濃
度にて含むSoya Bean Powder SB-Set（Ｆｌｕｋａ社
製、Individual sample number 1673、Lot and filling
code 92683/1）を用いた。本サンプルは、Institute f
or Reference Materials and Measurements（ＩＲＭ
Ｍ）によって承認を受けた標準大豆粉である。
【００４２】なお、本サンプルに含まれるラウンドアッ
プレディには、アグロバクテリウム・チュメファシエン
スＣＰ４株（Agrobacterium tumefaciens CP4 strain）
由来の改変（ＣＰ４）ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子が導
入されており、本遺伝子のゲノム中でのコピー数は１で
あることが分かっている。また、ダイズには、アクチン
タンパク質が普遍的に存在し、該タンパク質をコードす
る遺伝子の塩基配列は既知である（Shah, D.M. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 79, 1022-1026 (1
982)）。そこで、改変（ＣＰ４）ＥＰＳＰＳタンパク質
遺伝子を標的遺伝子とし、アクチン遺伝子をコントロー
ル遺伝子として両遺伝子の量比を測定することで、Soya
Bean Powder SB-Setにおけるラウンドアップレディの
存在割合を測定した。
プレディには、アグロバクテリウム・チュメファシエン
スＣＰ４株（Agrobacterium tumefaciens CP4 strain）
由来の改変（ＣＰ４）ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子が導
入されており、本遺伝子のゲノム中でのコピー数は１で
あることが分かっている。また、ダイズには、アクチン
タンパク質が普遍的に存在し、該タンパク質をコードす
る遺伝子の塩基配列は既知である（Shah, D.M. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 79, 1022-1026 (1
982)）。そこで、改変（ＣＰ４）ＥＰＳＰＳタンパク質
遺伝子を標的遺伝子とし、アクチン遺伝子をコントロー
ル遺伝子として両遺伝子の量比を測定することで、Soya
Bean Powder SB-Setにおけるラウンドアップレディの
存在割合を測定した。
【００４３】４種のSoya Bean Powder SB-Setの０．５
ｇずつから、それぞれ４点のサンプリングを行い、その
それぞれから独立してゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノム
ＤＮＡの抽出は、ＤＮＡ抽出ロボットＢＩＯＲＯＢＯＴ
９６０４（キアゲン社製）およびこのロボット用のＤＮ
Ａ抽出キットを使用した。このキット添付のＡＥ Ｂｕ
ｆｆｅｒに溶解したＤＮＡ溶液１００μｌを得た。
ｇずつから、それぞれ４点のサンプリングを行い、その
それぞれから独立してゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノム
ＤＮＡの抽出は、ＤＮＡ抽出ロボットＢＩＯＲＯＢＯＴ
９６０４（キアゲン社製）およびこのロボット用のＤＮ
Ａ抽出キットを使用した。このキット添付のＡＥ Ｂｕ
ｆｆｅｒに溶解したＤＮＡ溶液１００μｌを得た。
【００４４】抽出したＤＮＡの状態をアガロースゲル電
気泳動によって確認したところ、ラダー状の泳動パター
ンを示した。このことは、ダイズのＤＮＡが保存もしく
はダイズ粉調製中にアポトーシスによって酵素的に分解
されていたことを示す。このようなＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲを行う場合、同じプライマーを使用しても、試料
によって増幅効率が変動し、従って正確な定量が困難と
なる可能性がある。
気泳動によって確認したところ、ラダー状の泳動パター
ンを示した。このことは、ダイズのＤＮＡが保存もしく
はダイズ粉調製中にアポトーシスによって酵素的に分解
されていたことを示す。このようなＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲを行う場合、同じプライマーを使用しても、試料
によって増幅効率が変動し、従って正確な定量が困難と
なる可能性がある。
【００４５】ラウンドアップレディのみを含有する検体
を破砕して得た粉末を陽性試料とし、この試料から上記
と同様にゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを滅菌蒸
留水で１０倍ずつ５段階希釈して希釈液を調製した（原
液、１０倍希釈、１００倍希釈、１，０００倍希釈、１
０，０００倍希釈）。
を破砕して得た粉末を陽性試料とし、この試料から上記
と同様にゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを滅菌蒸
留水で１０倍ずつ５段階希釈して希釈液を調製した（原
液、１０倍希釈、１００倍希釈、１，０００倍希釈、１
０，０００倍希釈）。
【００４６】これらの希釈液を鋳型として改変ＥＰＳＰ
Ｓタンパク質遺伝子、アクチン遺伝子のそれぞれを増幅
するＰＣＲを行い、その結果に基づいて両遺伝子に関す
る検量線を作成した。改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子
の増幅には改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子増幅用プラ
イマー対ＣＰ４ ＦＰおよびＣＰ４ ＲＰ（配列番号７
および配列番号８）ならびに蛍光標識プローブ（配列番
号９）を使用した。アクチン遺伝子の増幅にはアクチン
遺伝子増幅用プライマー対ａｃｔｉｎ ＦＰおよびａｃ
ｔｉｎ ＲＰ（配列番号１０および配列番号１１）なら
びに蛍光標識プローブ（配列番号１２）を使用した。上
記の２種の蛍光標識プローブの５’末端にＦＡＭを、
３’末端にＴＡＭＲＡを付加した。表５にこの増幅反応
の反応液組成を示す。
Ｓタンパク質遺伝子、アクチン遺伝子のそれぞれを増幅
するＰＣＲを行い、その結果に基づいて両遺伝子に関す
る検量線を作成した。改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子
の増幅には改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子増幅用プラ
イマー対ＣＰ４ ＦＰおよびＣＰ４ ＲＰ（配列番号７
および配列番号８）ならびに蛍光標識プローブ（配列番
号９）を使用した。アクチン遺伝子の増幅にはアクチン
遺伝子増幅用プライマー対ａｃｔｉｎ ＦＰおよびａｃ
ｔｉｎ ＲＰ（配列番号１０および配列番号１１）なら
びに蛍光標識プローブ（配列番号１２）を使用した。上
記の２種の蛍光標識プローブの５’末端にＦＡＭを、
３’末端にＴＡＭＲＡを付加した。表５にこの増幅反応
の反応液組成を示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】上記の各希釈液のそれぞれについてＰＣＲ
を２連で実施した。反応は、９６穴プレート中でＡＢＩ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＰＲＩＳＭ
７７００（パーキンエルマーバイオシステムズ社製）を
用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により実施した。標的
遺伝子（改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子）およびコン
トロール遺伝子（アクチン遺伝子）の増幅を経時的に記
録し、両遺伝子に関する検量線を作成した。
を２連で実施した。反応は、９６穴プレート中でＡＢＩ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＰＲＩＳＭ
７７００（パーキンエルマーバイオシステムズ社製）を
用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により実施した。標的
遺伝子（改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝子）およびコン
トロール遺伝子（アクチン遺伝子）の増幅を経時的に記
録し、両遺伝子に関する検量線を作成した。
【００４９】次に、４種のSoya Bean Powder SB-Setか
ら得たそれぞれ４個の試料から抽出したゲノムＤＮＡを
鋳型として同様にＰＣＲを実施し、検量線に基づいて、
各試料中の標的遺伝子（改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝
子）およびコントロール遺伝子（アクチン遺伝子）の相
対的初期鋳型ＤＮＡ量を算出した（表６中それぞれａお
よびｂ）。それぞれの試料について、コントロール遺伝
子（アクチン遺伝子）に対する標的遺伝子（改変ＥＰＳ
ＰＳタンパク質遺伝子）の百分率（ａ／ｂ×１００）を
算出した。さらに、４種のSoya Bean Powder SB-Setの
それぞれについて、区間推定法により９９％信頼度の下
限値および上限値を求めた。結果を表６に示す。
ら得たそれぞれ４個の試料から抽出したゲノムＤＮＡを
鋳型として同様にＰＣＲを実施し、検量線に基づいて、
各試料中の標的遺伝子（改変ＥＰＳＰＳタンパク質遺伝
子）およびコントロール遺伝子（アクチン遺伝子）の相
対的初期鋳型ＤＮＡ量を算出した（表６中それぞれａお
よびｂ）。それぞれの試料について、コントロール遺伝
子（アクチン遺伝子）に対する標的遺伝子（改変ＥＰＳ
ＰＳタンパク質遺伝子）の百分率（ａ／ｂ×１００）を
算出した。さらに、４種のSoya Bean Powder SB-Setの
それぞれについて、区間推定法により９９％信頼度の下
限値および上限値を求めた。結果を表６に示す。
【００５０】
【表６】
【００５１】４種のSoya Bean Powder SB-Setにおける
それぞれのラウンドアップレディの存在割合（それぞれ
０％、０．１％、０．５％、２％）は、測定値に基づい
た区間推定によって決定した下限値と上限値との間の範
囲内であった。
それぞれのラウンドアップレディの存在割合（それぞれ
０％、０．１％、０．５％、２％）は、測定値に基づい
た区間推定によって決定した下限値と上限値との間の範
囲内であった。
【００５２】実施例３：豆腐検体中の遺伝子組換えダイ
ズの存在割合 主原料がダイズである豆腐について、ＧＭＯダイズの存
在割合の測定が可能であるかどうかを検討した。実施例
２と同様の手順により、陽性ダイズとしてラウンドアッ
プレディ（Roundup Ready、モンサント社製）を使用
し、ＧＭＯの存在割合が４％である原料ダイズ標準品を
作製した。実施例２と同様に、この原料ダイズ標準品を
破砕し、滅菌水に一晩浸潤させた後、上清を加熱（約８
０℃）し、市販凝固剤（にがり）を加えた。この混合物
が豆腐状に固まるまで穏やかに撹拌し、豆腐状固形物を
ガーゼを通して濾過して水分を除去し、ＧＭＯ存在割合
既知の豆腐検体を得た。
ズの存在割合 主原料がダイズである豆腐について、ＧＭＯダイズの存
在割合の測定が可能であるかどうかを検討した。実施例
２と同様の手順により、陽性ダイズとしてラウンドアッ
プレディ（Roundup Ready、モンサント社製）を使用
し、ＧＭＯの存在割合が４％である原料ダイズ標準品を
作製した。実施例２と同様に、この原料ダイズ標準品を
破砕し、滅菌水に一晩浸潤させた後、上清を加熱（約８
０℃）し、市販凝固剤（にがり）を加えた。この混合物
が豆腐状に固まるまで穏やかに撹拌し、豆腐状固形物を
ガーゼを通して濾過して水分を除去し、ＧＭＯ存在割合
既知の豆腐検体を得た。
【００５３】豆腐検体を凍結乾燥して水分を完全に除去
して乾燥豆腐粉末を得た。４点から得た約０．５ｇの粉
末試料からゲノムＤＮＡを抽出した。
して乾燥豆腐粉末を得た。４点から得た約０．５ｇの粉
末試料からゲノムＤＮＡを抽出した。
【００５４】遠心管に０．５ｇの粉末試料を入れ、ここ
に２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む抽出バッフ
ァー［１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５０ｍ
ＭＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ］３．５ｍ
ｌおよび５Ｍグアニジン４００μｌを加えて懸濁した
後、５８℃で１時間加熱した。３０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、得られた上清３００μｌを回収した。ここ
に１００μｇ／μｌのＲＮａｓｅＡを含む細胞懸濁液
［１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）］１００μｌを加えて懸濁した。次に、ここに
２００μｌの０．２％ＳＤＳ溶液を添加し、振とう操作
により５分間混和した。さらに、核酸吸着体懸濁液［５
０ｍｇ／ｍｌシリカゲル粒子（粒径５μｍ、富士シリシ
ア化学社製）、７Ｍ塩酸グアニジン、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）］６３容とエ
タノール３７容の混合液１ｍｌを添加してさらに５分間
振とうした。
に２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む抽出バッフ
ァー［１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５０ｍ
ＭＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ］３．５ｍ
ｌおよび５Ｍグアニジン４００μｌを加えて懸濁した
後、５８℃で１時間加熱した。３０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、得られた上清３００μｌを回収した。ここ
に１００μｇ／μｌのＲＮａｓｅＡを含む細胞懸濁液
［１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）］１００μｌを加えて懸濁した。次に、ここに
２００μｌの０．２％ＳＤＳ溶液を添加し、振とう操作
により５分間混和した。さらに、核酸吸着体懸濁液［５
０ｍｇ／ｍｌシリカゲル粒子（粒径５μｍ、富士シリシ
ア化学社製）、７Ｍ塩酸グアニジン、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）］６３容とエ
タノール３７容の混合液１ｍｌを添加してさらに５分間
振とうした。
【００５５】上記の混合液を遠心分離した後、上清を除
き、沈殿を３００μｌの洗浄液［５０％エタノール（ｖ
／ｖ）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）］に懸濁し、Ｓ
ＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社製）に移し、１２０００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離することによって洗浄した。同様
の洗浄操作をもう一度繰り返した後（但し、洗浄液の液
量は２００μｌとした）、沈殿を７０℃に加温した１０
０μｌのＴＥバッファーに懸濁して遠心分離を行った
後、上清を回収した。この上清をＤＮＡ溶液として以下
の工程に使用した。
き、沈殿を３００μｌの洗浄液［５０％エタノール（ｖ
／ｖ）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）］に懸濁し、Ｓ
ＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社製）に移し、１２０００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離することによって洗浄した。同様
の洗浄操作をもう一度繰り返した後（但し、洗浄液の液
量は２００μｌとした）、沈殿を７０℃に加温した１０
０μｌのＴＥバッファーに懸濁して遠心分離を行った
後、上清を回収した。この上清をＤＮＡ溶液として以下
の工程に使用した。
【００５６】抽出したＤＮＡの状態をアガロースゲル電
気泳動によって確認したところ、高分子ＤＮＡがスメア
になっていた。このことは、豆腐に含まれるＤＮＡが、
加熱などにより物理的に分解されていたことを示す。こ
のようなＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合、同じプ
ライマーを使用しても、試料によって増幅効率が変動
し、従って正確な定量が困難となる可能性がある。
気泳動によって確認したところ、高分子ＤＮＡがスメア
になっていた。このことは、豆腐に含まれるＤＮＡが、
加熱などにより物理的に分解されていたことを示す。こ
のようなＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合、同じプ
ライマーを使用しても、試料によって増幅効率が変動
し、従って正確な定量が困難となる可能性がある。
【００５７】標的遺伝子としては、改変ＥＰＳＰＳタン
パク質遺伝子を用い、該遺伝子の増幅および検出には実
施例２に記載のプライマー対ＣＰ４ ＦＰおよびＣＰ４
ＲＰ（配列番号７および配列番号８）ならびに蛍光標
識プローブ（配列番号９）を使用した。
パク質遺伝子を用い、該遺伝子の増幅および検出には実
施例２に記載のプライマー対ＣＰ４ ＦＰおよびＣＰ４
ＲＰ（配列番号７および配列番号８）ならびに蛍光標
識プローブ（配列番号９）を使用した。
【００５８】コントロール遺伝子としては、ダイズアク
チン遺伝子を用い、アクチン遺伝子の増幅および検出に
は、実施例２記載のプライマー対ａｃｔｉｎ ＦＰおよ
びａｃｔｉｎ ＲＰ（配列番号１０および配列番号１
１）ならびに蛍光標識プローブ（配列番号１２）を使用
した。上記２種の蛍光標識プローブの５’末端にＦＡＭ
を、３’末端にＴＡＭＲＡを付加した。
チン遺伝子を用い、アクチン遺伝子の増幅および検出に
は、実施例２記載のプライマー対ａｃｔｉｎ ＦＰおよ
びａｃｔｉｎ ＲＰ（配列番号１０および配列番号１
１）ならびに蛍光標識プローブ（配列番号１２）を使用
した。上記２種の蛍光標識プローブの５’末端にＦＡＭ
を、３’末端にＴＡＭＲＡを付加した。
【００５９】ＰＣＲを実施例１と同様に実施した。標的
遺伝子およびコントロール遺伝子の相対的初期鋳型ＤＮ
Ａ量は、ラウンドアップレディのみを含有する検体を用
いて作成した。結果を表７に示す。
遺伝子およびコントロール遺伝子の相対的初期鋳型ＤＮ
Ａ量は、ラウンドアップレディのみを含有する検体を用
いて作成した。結果を表７に示す。
【００６０】
【表７】
【００６１】表７に示すように、ＤＮＡが分解している
豆腐のような加工食品について、主原料であるダイズ中
のＧＭＯ（ラウンドアップレディダイズ）の存在割合を
測定することができた。この結果は、油揚げ、凍り豆
腐、豆乳、脱脂ダイズのような、豆腐と同様にＤＮＡが
分解、損傷されている加工食品検体中のＧＭＯの存在割
合を、本発明の方法によって測定できることを示唆す
る。
豆腐のような加工食品について、主原料であるダイズ中
のＧＭＯ（ラウンドアップレディダイズ）の存在割合を
測定することができた。この結果は、油揚げ、凍り豆
腐、豆乳、脱脂ダイズのような、豆腐と同様にＤＮＡが
分解、損傷されている加工食品検体中のＧＭＯの存在割
合を、本発明の方法によって測定できることを示唆す
る。
【発明の効果】本発明によって、生物集団中の異種個体
の存在割合の定量的かつ正確な測定方法が提供される。
の存在割合の定量的かつ正確な測定方法が提供される。
【００６２】配列表フリーテキスト SEQ ID NO:1: Designed oligonucleotide primer desig
nated aspat FP to amplify a portion of pat gene. SEQ ID NO:2: Designed oligonucleotide primer desig
nated aspat RP to amplify a portion of pat gene. SEQ ID NO:3: Designed oligonucleotide probe to det
ect patgene sequence. SEQ ID NO:4: Designed oligonucleotide primer desig
nated asZein FP to amplify a portion of zein gene. SEQ ID NO:5: Designed oligonucleotide primer desig
nated asZein RP to amplify a portion of zein gene. SEQ ID NO:6: Designed oligonucleotide probe to det
ect zeingene sequence. SEQ ID NO:7: Designed oligonucleotide primer desig
nated asCP4 FP to amplify a portion of EPSPS prote
in gene. SEQ ID NO:8: Designed oligonucleotide primer desig
nated asCP4 RP to amplify a portion of EPSPS prote
in gene. SEQ ID NO:9: Designed oligonucleotide probe to det
ect EPSPS protein gene sequence. SEQ ID NO:10: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as actin FP to amplify a portion of actin g
ene. SEQ ID NO:11: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as actin RP to amplify a portion of actin g
ene. SEQ ID NO:12: Designed oligonucleotide probe to de
tect actin gene sequence. SEQ ID NO:13: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as 35-1 specific to Cauliflower mosaic viru
s 35S promoter. SEQ ID NO:14: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as NOS-3 specific to nopaline synthase gene
terminator.
nated aspat FP to amplify a portion of pat gene. SEQ ID NO:2: Designed oligonucleotide primer desig
nated aspat RP to amplify a portion of pat gene. SEQ ID NO:3: Designed oligonucleotide probe to det
ect patgene sequence. SEQ ID NO:4: Designed oligonucleotide primer desig
nated asZein FP to amplify a portion of zein gene. SEQ ID NO:5: Designed oligonucleotide primer desig
nated asZein RP to amplify a portion of zein gene. SEQ ID NO:6: Designed oligonucleotide probe to det
ect zeingene sequence. SEQ ID NO:7: Designed oligonucleotide primer desig
nated asCP4 FP to amplify a portion of EPSPS prote
in gene. SEQ ID NO:8: Designed oligonucleotide primer desig
nated asCP4 RP to amplify a portion of EPSPS prote
in gene. SEQ ID NO:9: Designed oligonucleotide probe to det
ect EPSPS protein gene sequence. SEQ ID NO:10: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as actin FP to amplify a portion of actin g
ene. SEQ ID NO:11: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as actin RP to amplify a portion of actin g
ene. SEQ ID NO:12: Designed oligonucleotide probe to de
tect actin gene sequence. SEQ ID NO:13: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as 35-1 specific to Cauliflower mosaic viru
s 35S promoter. SEQ ID NO:14: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as NOS-3 specific to nopaline synthase gene
terminator.
【００６３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> Method for determining content of heterologous individual <130> 170108 <160> 14 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pat FP to amplify a portion of pat gene. <400> 1 gcgcaaggtt ttaagtctgt gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pat RP to amplify a portion of pat gene. <400> 2 caaagcctca tgcaacctaa ca 22 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect pat gene sequence. <400> 3 tgctgttata ggccttccaa acgatcca 28 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as Zein FP to amplify a portion of zein gene. <400> 4 ttaccgcttc agacgatgcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as Zein RP to amplify a portion of zein gene. <400> 5 cataatctgc gagacggcgt 20 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect zein gene sequence. <400> 6 tgccacagat gatgacgcct aacatga 27 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as CP4 FP to amplify a portion of EPSPS protein gene. <400> 7 cgatttcgac agcaccttca 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as CP4 RP to amplify a portion of EPSPS protein gene. <400> 8 ttccgatttc acctgcacg 19 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect EPSPS protein gene sequen ce. <400> 9 tgttgaaccc gctgcgcgaa at 22 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as actin FP to amplify a portion of actin gene. <400> 10 ccttcaatgt gcctgccat 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as actin RP to amplify a portion of actin gene. <400> 11 cagttgtgcg accacttgca 20 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to detect actin gene sequence. <400> 12 tatgtggcca tccaagctgt tctctcct 28 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as 35-1 specific to Cau liflower mosaic virus 35S promoter. <400> 13 gctcctacaa atgccatca 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as NOS-3 specific to no paline synthase gene terminator. <400> 14 ttatcctagt ttgcgcgcta 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AD20 CA06 CB03 4B024 AA05 AA08 AA10 AA11 CA01 CA09 CA20 HA13 HA14 4B063 QA01 QQ02 QQ04 QQ05 QQ16 QQ42 QR08 QR32 QR38 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02
Claims (10)
- 【請求項１】 生物集団中の異種個体の存在割合の定量
的測定方法であって： ａ）生物集団または生物集団の加工物から２個以上の試
料を得る工程； ｂ）該試料からＤＮＡを抽出する工程； ｃ）抽出した該ＤＮＡ、標的遺伝子特異的プライマー、
およびコントロール遺伝子特異的プライマーを含有する
反応液を調製する工程； ｄ）該反応液を定量的ＰＣＲに供して標的遺伝子特異的
増幅産物の量およびコントロール遺伝子特異的増幅産物
の量を測定する工程； ｅ）該標的遺伝子特異的増幅産物の量および該コントロ
ール遺伝子特異的増幅産物の量に基づいて該生物集団中
の異種個体の存在割合を決定する工程；および ｆ）決定された存在割合の信頼度を統計処理によって決
定する工程、を包含する方法。 - 【請求項２】 生物集団が未加工作物である、請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 未加工作物がトウモロコシ、ダイズ、イ
ネ、コムギ、オオムギ、トマト、カボチャ、サツマイ
モ、ワタ、ナタネまたはテンサイである、請求項２記載
の方法。 - 【請求項４】 生物集団の加工物が、作物を原料とした
加工食品である、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 加工食品が豆腐、豆腐関連食品、脱脂ダ
イズ、きな粉、未精製ダイズタンパク質、コーングリッ
ツ、コーンフラワー、コーンスターチ、ポップコーン、
スナック菓子である、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 特異的遺伝子が外来遺伝子である、請求
項１〜５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 外来遺伝子がｐａｔ遺伝子、改変ＥＰＳ
ＰＳ遺伝子、ＣｒｙＩＡ遺伝子、ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子
またはｂａｒ遺伝子である、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 コントロール遺伝子が生物集団に共通し
て存在する遺伝子である、請求項１〜７のいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項９】 コントロール遺伝子がツエイン遺伝子、
アクチン遺伝子またはレクチン遺伝子である、請求項８
記載の方法。 - 【請求項１０】 工程ａ）において４〜８個の試料を
得、工程ｆ）において区間推定を用いる統計処理によっ
て９９％信頼度の範囲を決定する、請求項１〜９のいず
れか１項記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000058726A JP2001238700A (ja) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | 異種個体の存在割合の測定方法 |
| KR1020000016786A KR20010086586A (ko) | 2000-03-03 | 2000-03-31 | 이종 개체 존재비율의 측정 방법 |
| US09/774,107 US20020100082A1 (en) | 2000-03-03 | 2001-01-31 | Method for determining content of heterologous individual |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000058726A JP2001238700A (ja) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | 異種個体の存在割合の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001238700A true JP2001238700A (ja) | 2001-09-04 |
Family
ID=18579275
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000058726A Pending JP2001238700A (ja) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | 異種個体の存在割合の測定方法 |
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|---|---|
| US (1) | US20020100082A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001238700A (ja) |
| KR (1) | KR20010086586A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2003027283A1 (fr) * | 2001-09-21 | 2003-04-03 | National Food Research Institute | Fragment d'acide nucleique competitif, trousse pour quantifier un gene de recombinaison et procede pour quantifier un gene de recombinaison en utilisant cette trousse |
| WO2004101794A1 (ja) * | 2003-05-16 | 2004-11-25 | House Foods Corporation | 食品または食品原材料中の特定植物属の定量的pcr検出法 |
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|---|---|---|---|---|
| KR100474115B1 (ko) * | 2001-06-01 | 2005-03-08 | 대한민국 | 유전자변형식물에 대한 ｐｃｒ 검정용 프라이머 |
| KR20030018218A (ko) * | 2001-08-27 | 2003-03-06 | 주식회사 지디바이오텍 | 유전자 조작 농산물과 이의 가공품 검정용 프라이머 및검정키트 |
| KR20030084184A (ko) * | 2002-04-25 | 2003-11-01 | 주식회사 지디바이오텍 | 유전자 조작 농산물과 이의 가공품의 정성 검정용프라이머와 정량 검정용 프라이머, 프로브 및 검정키트 |
| KR100458009B1 (ko) * | 2002-09-03 | 2004-11-18 | 대한민국 | 감자 특이 ｄｎａ를 증폭하는 단일 ｐｃｒ 프라이머 및이를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 ｐｃｒ 판별방법 |
| KR100838105B1 (ko) * | 2006-08-24 | 2008-06-16 | 대한민국 | 유전자변형 벼의 정성 및 정량분석 방법 |
| WO2016138212A1 (en) * | 2015-02-26 | 2016-09-01 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Quantitative genetic analysis of articles including gossypium barbadense and gossypium hirsutum cotton |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2001
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