KR20030018218A - 유전자 조작 농산물과 이의 가공품 검정용 프라이머 및검정키트 - Google Patents

유전자 조작 농산물과 이의 가공품 검정용 프라이머 및검정키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 조작 농산물과 이의 가공품 검정용 프라이머 및 검정키트에 관한 것으로, 시판되고 있는 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품을 검출할 수 있는 특이 프라이머 및 동시에 여러 종의 재조합 유전자를 검출할 수 있는 검사키트에 관한 것이다. 본 발명의 특이 프라이머는 유전자 조작 농산물에 주로 사용되는 EPSPS 유전자, cry1A(b) 유전자, cry9C 유전자 및 PAT 유전자를 PCR로 검출할 수 있으며, GMO 검사키트로 상업화하여 유통중인 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품 판별에 이용될 수 있다.

Description

유전자 조작 농산물과 이의 가공품 검정용 프라이머 및 검정키트{DETECTION PRIMER FOR GENETICALLY MODIFIED ORGANISM AND MANUFACTURED GOODS, AND DETECTION KIT USING SAME}
본 발명은 유전자 조작 농산물 검정용 프라이머 및 검정키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 시판되고 있는 유전자 조작 농산물 및 상기 농산물의 가공품을 검출할 수 있는 특이 프라이머 및 동시에 여러종의 재조합 유전자를 검출할 수있는 검사키트에 관한 것이다.
유전자 조작 농산물(GMO : Genetically Modified Organism)이란 기존의 작물육종에 의한 품종 개발과는 달리, 동식물 또는 미생물의 유용 유전자를 인공적으로 분리, 결합시켜 생산성이 증가 되도록 한 생물체를 총칭하는 것이다. 일반적으로 유전자 조작 농산물의 생산성을 증가시키기 위하여 제초제 저항성, 내충성, 내병성, 내한성 등에 관련된 유전자를 농산물에 도입하고 있다.
현재, 세계적으로 가장 많이 상업화 되어 있는 유전자 조작 농산물로는 옥수수, 콩이 있으며, 그 밖에 다른 작물에도 넓게 적용되고 있는 실정이다. 하지만 유전자 조작 농산물의 안정성 및 잠재적 위험성에 대한 과학적 고찰이 이루어지지 않은 시점에서 일반 농산물과 구분되지 않은 채 우리 식탁에까지 오르고 있다.
이에 2001년 3월 1일부터 농수산물 품질 관리법에 의한 원물의 의무 표시 대상품목으로 콩, 콩나물 및 옥수수가 지정되었고, 2002년 3월 1일부터는 감자도 대상품목에 포함될 예정이다.
현재 유전자 조작 농산물에 도입된 외부 유전자로는 EPSPS(enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), PAT(Phosphinothricin acetyl transferase) 및 BT(Bacillus thuringiensis)의 cry계열의 유전자 등이 가장 대표적이다. 상기 EPSPS 유전자는 글리포세이트(glyphosate)라는 제초능을 가지는 화학물질에 내성을 갖도록 하는 유전자이고, PAT 유전자는 글루포시네이트(gluphosinate)라는 제초능을 가지는 화학물질에 내성을 갖도록 하는 유전자이고, 상기 cry 계열의 유전자는 해충 저항성을 갖도록 하는 유전자이다.
상기한 유전자를 포함하는 시판되는 유전자 조작 농산물에는 글리포세이트 내성/해충 내성 옥수수(Agrobacterium sp.종 CP4 EPSPS + Ochrobactrum anthropi의 glyphosate oxidaoreductase, 몬산토사), 글리포세이트 내성 면실(Agrobactarium spp. CP4 EPSPS), 글리포세이트 내성 캐놀라(Agrobactarium spp. CP4 EPSPS), 글루포시네이트 내성 옥수수(Streptomyces hygroscopicus의 Phosphinothricin acetyl hydrolase, Dekalb Genetics Corp.), 글루포시네이트 내성 캐놀라(Steptomyces virdochromogenes의 PAT, Agevo Inc.), 글루포시네이트 내성 옥수수 (Steptomyces virdochromogenes의 PAT), 해충 내성 옥수수(crylA(b), 몬산토사), 해충 내성 옥수수(crylA(b), 몬산토사), 해충 내성 감자(crylll A, 몬산토사), 해충 내성 옥수수(crylA(b), Northrup King), 해충 내성 옥수수(crylA(b), Ciba-Geigy Corp.) 등이 있다.
상기한 유전자 조작 농산물을 검정하기 위하여 사용되는 기술로는 단백질 검출에 의한 방법과 유전자 검출에 의한 방법으로 크게 나누어 볼 수 있다. 상기 단백질 검출방법은 유전자 조작 농산물에 도입된 재조합 단백질을 검출하는 방법이나, 종자에 따라 발현량이 다르며, 유전자 발현을 위한 조절부위에 따라 종자에서 발현되지 않는 경우도 있으며, 보관상태 또는 가공과정에서 분해되는 경우도 있어 검정에 한계가 있다. 또한 상기 유전자 검출방법은 연쇄 중합 반응(PCR)에 의한 검정 기술로, 유전자 조작 농산물에 도입된 외부유전자의 발현을 조절하는 프로모터나 전사종결부에 대한 특이 프라이머로 PCR하여 검정하고 있다. 그러나, 유전자 조작 농산물에 따라 사용되어지고 있는 재조합 유전자의 종류, 발현방법, 염기서열변형정도가 다양하여 유전자 조작의 정확한 판단이 쉽지 않으며, 하나의 농산물에 대하여 다수의 재조합 유전자 프라이머로 동시에 PCR 할 수 있는 방법이 확립되어지지 않은 실정이다.
따라서, 본 발명은 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품을 검출할 수 있는 특이 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 다수의 재조합 유전자를 동시에 검출할 수 있는 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품 검정용 검사키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 라운드업 레디에 도입된 EPSPS 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 2는 Bt11에 도입된 Cry1A(b) 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 3은 Event176에 도입된 Cry1A(b) 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 4는 Event176에 도입된 Cry1A(b) 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 5는 Mon810에 도입된 Cry1A(b) 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 6은 Starlink에 도입된 Cry9C 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 7은 Ga21에 도입된 EPSPS 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 8은 Libertlink에 도입된 PAT 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 9는 ep78/ep220 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 10은 b2/b392 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 11은 p4/p340 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 12는 c6/c211 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 13은 m76/m216 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 14는 9c26/9c265 프라이머, 9c874/9c686 프라이머 및 9C962/9c1153 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 15는 g165/g355 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 16은 t13/t203 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 17은 L227/L592, L227/L701, L359/L611 및 L554/L701 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 18은 za30/za127, za30/za621 및 za108/za380 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 19는 sb314/sb583 및 sb1043/sb1142 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 20은 본 발명의 콩 검사키트로 곡식샘플을 PCR한 전기영동사진이고,
도 21은 본 발명의 콩 식품 검사키트로 식품샘플을 PCR한 전기영동사진이고,
도 22는 본 발명의 옥수수용 검사키트로 곡식을 PCR한 전기영동사진이고,
도 23은 본 발명의 옥수수용 검사키트로 곡식을 PCR한 전기영동사진이고,
도 24는 본 발명의 곡물용 검사키트로 곡식을 PCR한 전기영동사진이고,
도 25는 본 발명의 곡물용 검사키트로 곡식을 PCR한 전기영동사진이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 ep78 프라이머 또는 서열번호 2의 ep220 프라이머를 포함하는 EPSPS 유전자 검정용 PCR 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 3의 b398 프라이머, 서열번호 4의 b2 프라이머, 서열번호 5의 p340 프라이머, 서열번호 6의 p4 프라이머, 서열번호 7의 c211 프라이머, 서열번호 8의 c6 프라이머, 서열번호 9의 m76 프라이머, 서열번호 10의 m216 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되어진 것을 포함하는 cry1A(b) 유전자 검정용 PCR 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 11의 9c26 프라이머, 서열번호 12의 9c265 프라이머, 서열번호 13의 9c686 프라이머, 서열번호 14의 9c874 프라이머, 서열번호 15의 9c962 프라이머 및 서열번호 16의 9c1153 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되어진 것을 포함하는 cry9C 유전자 검정용 PCR 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 17의 g165 프라이머 또는 서열번호 18의 g355 프라이머를 포함하는 벼 엑틴1 프로모터 유전자 검정용 PCR 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 19의 t13 프라이머 또는 서열번호 20의 t203 프라이머를 포함하는 PAT(phosphinothricin acetyl transferase) 검정용 PCR 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 21의 L227 프라이머, 서열번호 22의 L592 프라이머, 서열번호 23의 L701 프라이머, 서열번호 24의 L359 프라이머, 서열번호 25의 L611 프라이머 및 서열번호 26의 L554 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되어진 것을 포함하는 콩 양성대조군 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 27의 za30 프라이머, 서열번호 28의 za127 프라이머, 서열번호 29의 za621 프라이머, 서열번호 30의 za108 프라이머, 서열번호 31의 za380 프라이머, 서열번호 32의 sb314 프라이머, 서열번호 33의 sb583 프라이머, 서열번호 34의 sb1043 프라이머 및 서열번호 35의 sb1142 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되어진 것을 포함하는 옥수수 양성대조군 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 ep78 프라이머, 서열번호 2의 ep220 프라이머, 서열번호 3의 b398 프라이머, 서열번호 4의 b2 프라이머, 서열번호 5의 p340 프라이머, 서열번호 6의 p4 프라이머, 서열번호 7의 c211 프라이머, 서열번호 8의 c6 프라이머, 서열번호 9의 m76 프라이머, 서열번호 10의 m216 프라이머, 서열번호 11의 9c26 프라이머, 서열번호 12의 9c265 프라이머, 서열번호 13의 9c686 프라이머, 서열번호 14의 9c874 프라이머, 서열번호 15의 9c962 프라이머, 서열번호 16의 9c1153 프라이머, 서열번호 17의 g165 프라이머, 서열번호 18의 g355 프라이머, 서열번호 19의 t13 프라이머 및 서열번호 20의 t203 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품 검정용 PCR 검사키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 농작물 또는 가공품에서 DNA를 분리한 다음 상기 DNA에 특이 프라이머로 PCR함으로써 유전자 조작 여부를 확인할 수 있도록 개발되었다.
더욱 바람직하게는 유전자 조작 농산물에 통상적으로 도입된 재조합 유전자 또는 상기 유전자를 발현하기 위한 구조체(프로모터, 전사종결자 또는 인트론 등)를 PCR 할 수 있는 프라이머를 개발하였다.
상기 농산물은 식물에서 수득할 수 있는 모든 종류의 물질로, 바람직하기로는 뿌리, 줄기, 잎, 종자, 열매 및 꽃이다. 또한 상기 가공품은 식물을 이용하여 제조된 모든 종류의 물질로, 가장 바람직하게는 식품이다.
본 발명의 ep78 프라이머 및 ep220 프라이머는 EPSPS 유전자를 PCR로 증폭시키는데 사용되는 것으로, EPSPS 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 몬산토사의 제초제 저항성 콩인 라운드업 레디(Roundup ready)를 PCR로 검정할 수 있는 프라이머이다.
본 발명의 b398 프라이머 및 b2 프라이머는 cry1A(b) 유전자를 PCR로 증폭시키는데 사용되는 것으로, cry1A(b) 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 노바티스사의 해충저항성 옥수수인 Bt11을 PCR로 검정할 수 있는 프라이머이다.
본 발명의 p340 프라이머 및 p4 프라이머는 포스포에놀피루베이트 카르복실레이즈 프로모터(Pepc) 및 cry1A(b) 유전자를 PCR로 증폭시키는 것으로, Pepc-cry1A(b) 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 노바티스사의 Event176 옥수수를 PCR로 검정할 수 있는 프라이머이다.
본 발명의 c211 프라이머 및 c6 프라이머는 칼슘의존성 단백질 카이네이즈 프로모터(Pcdpk) 및 cry1A(b) 유전자를 PCR로 증폭시키는 것으로, Pcdpk-cry1A(b) 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 노바티스사의 Event176 옥수수를 PCR로 검정할 수 있는 프라이머이다.
본 발명의 m76 프라이머 및 m216 프라이머는 cry1A(b) 유전자를 PCR로 증폭시키는 것으로, cry1A(b) 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 몬산토사의 Mon810 옥수수를 PCR로 검정할 수 있는 프라이머이다.
본 발명의 9c26 프라이머, 9c265 프라이머, 9c686 프라이머, 9c874 프라이머, 9c962 프라이머 및 9C1153 프라이머는 cry9C 유전자를 PCR로 증폭시키는 것으로, cry9C 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 아벤티스사의 Starlink 옥수수를 PCR로 검정할 수 있는 프라이머이다.
본 발명의 g165 프라이머 및 g355 프라이머는 유전자 조작 농산물의 재조합단백질을 발현시키는 프로모터로 사용되는 벼 엑틴 프로모터1을 검정할 수 있는 것이다. 따라서 벼 엑틴 프로모터1을 프로모터로 사용한 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품을 검출할 수 있다. 더욱 바람직하게는 몬산토사의 제초제 저항성 옥수수 Ga21에 대한 PCR 검정용 프라이머이다.
본 발명의 t13 프라이머 및 t203 프라이머는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼레이즈(phosphinothricin acetyltransferase; PAT)을 검출할 수 있는 PCR 프라이머로, 상기 PAT를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품을 검출할 수 있다. 더욱 바람직하게는 아벤티스사의 제초제 저항성 옥수수 Libertylink에 대한 PCR 검정용 프라이머이다.
상기의 유전자 조작 농산물용 프라이머는 통상의 PCR 방법 및 조건으로 실시되어지는 것이 바람직하며, 프라이머의 염기서열 특성에 따라 조절하여 PCR을 실시하는 것이 좋다.
또한 본 발명의 상기 유전자 조작 농산물용 프라이머를 포함하는 검사키트를 제공한다. 상기 검사키트는 PCR 완충액, dNTP, Taq 중합효소 및 프라이머를 포함한다. 검사키트는 포함되는 프라이머는 검출하고자 하는 목적 농산물에 따라 달라질 수 있으며, 프라이머에 따라 PCR 반응조건이 달라질 수 있다. 상기 프라이머는프라이머의 GC%, 및 Tm에 따라 PCR 반응조건을 조절하는 것이 바람직하며, 가장 최적의 반응조건에서 PCR될 수 있는 프라이머를 포함하는 것이 좋다. 바람직한 검사키트는 곡물 검사키트, 콩 원물 검사키트, 콩 가공품 검사키트 및 옥수수 검사키트이다.
또한 상기 검사키트는 통상의 프라이머를 더욱 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 36의 Rctp 프라이머, 서열번호 37의 R35S 프라이머, 서열번호 38의 b1 프라이머, 서열번호 39의 b2 프라이머, 서열번호 40의 T9 프라이머, 서열번호 41의 T10 프라이머, 서열번호 42의 m7 프라이머, 서열번호 43의 m8 프라이머, 서열번호 44의 p3 프라이머, 서열번호 45의 p4 프라이머, 서열번호 46의 n1 프라이머, 서열번호 47의 n2 프라이머, 서열번호 48의 s268 프라이머, 서열번호 49의 s384 프라이머이다.
상기 Rctp 프라이머/R35S 프라이머는 유전자 조작 농산물에 사용되는 CaMV 35S 프로모터(P35S)-엽록체 표적 펩타이드(CTP)를 321 bp로 검정하는 것으로, 바람직하게는 몬산토사의 유전자 조작 농산물을 검정한다. 상기 b1 프라이머/b2 프라이머는 유전자 조작 농산물에 사용되는 알콜디하이드로게나제(adh1) 인터론6번-합성 CryIA(b)(493 bp)를 검정하는 것으로, 바람직하게는 Bt11을 검정하기 위한 프라이머이다. 상기 T9 프라이머/T10 프라이머는 합성 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼레이즈(synthetic phosphinotricin acetyltransferase; PAT, 331 bp)을 검정하는 것이다. 상기 m7 프라이머/m8 프라이머는 옥수수 열충격 단백질(heat shock protein70; hsp70 인트론1번 - 합성 CryIA(b)(336 bp)를 검정하는 것으로, 바람직하게는 Mon810을 검정하는 프라이머이다. 또한 상기 p3/p4 프라이머는 포스포에놀피루베이트 카르복실레이즈 프로모터(phosphoenolpyruvate carboxylase promoter; Ppepc) - 합성 CryIA(b)(472 bp)를 검정하는 것으로, 바람직하게는 Event176을 검정한다.
상기 Rctp 프라이머, R35S 프라이머, b1 프라이머, b2 프라이머, T9 프라이머, T10 프라이머, m7 프라이머, m8 프라이머, p3 프라이머 및 p4 프라이머에 의한 유전자 조작 농산물 판정은 정확성이 떨어지는 문제점이 있으나, 본 발명의 프라이머들과 함께 사용하여 유전자 조작 농산물의 판정에 정확성을 기할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 유전자 조작 농산물용 PCR 프라이머 이외에 농작물별로 특이적으로 작용하는 대조군 프라이머들을 개발하였다. 상기 대조군 프라이머는 콩의 경우 콩의 렉틴(lectin) 유전자를 검출하는 프라이머 6개를 제작하였다. 옥수수는 제인(zein) 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 5개 및 녹말 합성효소II b 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 4개를 제작하였다. 본 발명의 렉틴 유전자용 프라이머는 L227, L592, L701, L359, L611 및 L554이고, 제인 유전자용 프라이머는 za30, za127, za621, za108 및 za380이고, 녹말 합성효소II b 유전자용 프라이머는 sb314, sb583, sb1043 및 sb1142이다. 이러한 대조군 프라이머들은 유전자 조작 농산물의 확인시 양성대조군 또는 음성대조군으로 사용될 수 있어 유용하다.
따라서, 본 발명의 유전자 조작 농산물용 PCR 프라이머는 유전자 조작 농산물 및 상기 농산물로부터 제조된 가공식물의 DNA를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 다수의 프라이머로 PCR이 가능하여 경제적이고, 검사시간을 단축시킨다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] EPSPS 유전자 검출용 프라이머
EPSPS 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물의 대표적인 것은 몬산토사의 라운드업 레디(Roundup ready)이다. 상기 라운드업 레디는 도 1의 구조(CaMV 35S 프로모터(P35S)-엽록체 표적 펩타이드(CTP)-EPSPS-노팔린 합성효소(Nos) 전사종결자(Tnos))로 EPSPS를 발현하도록 제조되어 있다. 유전자 조작 농산물내의 EPSPS 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 1의 ep78 프라이머 및 서열번호 2의 ep220 프라이머를 합성((주)바이오니아)하였다. 상기 ep78/ep220 프라이머는 EPSPS 유전자내에 결합하여 143 bp의 EPSPS 유전자 단편을 증폭시킨다.
[실시예 2] cry1A(b) 유전자 검출용 프라이머
cry1A(b) 유전자는 해충저항을 목적으로 사용되는 유전자로, 노바티스사의 BT11(해충저항성 옥수수)에 도 2의 구조(CaMV 35S 프로모터(P35S)-알콜디하이드로게나제(adh1) 인트론 6번(IVS6 intron)-합성 CryIA(b)-노팔린 합성효소 전사종결자(Tnos))로 삽입되어있다. cry1A(b) 유전자를 검출할 수 있는 프라이머로 서열번호 3의 b2 프라이머 및 서열번호 4의 b398 프라이머를 합성((주)바이오니아)하였다. 상기 b398/b2 프라이머세트는 96 bp의 cry1A(b) 단편을 증폭시켜 농산물 내 cry1A(b) 유전자의 존재여부를 확인할 수 있다.
[실시예 3] cry1A(b) 유전자 검출용 프라이머
cry1A(b) 유전자는 노바티스사의 Event176(해충저항성 옥수수)에 도 3의 구조(포스포에놀피루베이트 카르복실레이즈 프로모터(Ppepc)-합성 CryIA(b)-PEPC 인트론 9번-CaMV 35S 전사종결자(T35S))로 삽입되어있다. cry1A(b) 유전자를 검출할 수 있는 프라이머로 서열번호 5의 p4 프라이머 및 서열번호 6의 p340 프라이머를 합성((주)바이오니아)하였다. 상기 p4/p340 프라이머세트는 133 bp의 cry1A(b) 단편을 증폭시켜 농산물 내 cry1A(b) 유전자의 존재여부를 확인할 수 있다.
[실시예 4] cry1A(b) 유전자 검출용 프라이머
cry1A(b) 유전자는 노바티스사의 Event176(해충저항성 옥수수)에 도 4의 구조(칼슘 의존성 단백질 카이네이즈 프로모터(Pcdpk)-합성 CryIA(b)-PEPC 인터론 9번-CaMV 35S 전사종결자(T35S))로 삽입되어있다. cry1A(b) 유전자를 검출할 수 있는 프라이머로 서열번호 7의 c6 프라이머 및 서열번호 8의 c211 프라이머를 합성((주)바이오니아)하였다. 상기 c6/c211 프라이머세트는 111 bp의 cry1A(b) 단편을 증폭시켜 농산물 내 cry1A(b) 유전자의 존재여부를 확인할 수 있다.
[실시예 5] cryA(b) 유전자 검출용 프라이머
몬산토사의 Mon810 옥수수에 도입된 cryA(b)는 도 5의 구조(CaMV 35S 프로모터(P35S)-옥수수 열충격 단백질 70(Hsp70) 인터론 1번-합성 CryIA(b)-노팔린 합성효소 전사종결자(Tnos))로 발현되도록 제조되어 있다. 유전자 조작 농산물내의 EPSPS 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 9의 m76 프라이머 및 서열번호 10의 m216 프라이머를 합성((주)바이오니아)하였다. 상기 m76/m216 프라이머는 cryA(b) 유전자내에 결합하여 141 bp의 cryA(b)유전자 단편을 증폭시킨다.
[실시예 6] cry9C 유전자 검출용 프라이머
(1) 9C26/9C265 프라이머 세트
cry9C 유전자를 검출하기 위하여 프라이머를 제조하였다. 대표적인 cry9C를 포함하는 유전자 조작 농산물 아벤티스사의 Starlink) 옥수수는 도 6(a)의 구조(CaMV 35S 프로모터(P35S)-페투니아 리더 서열-수정된 Cry9C-노팔린 합성효소 전사종결자(Tnos))로 제조되어 있다. 유전자 조작 농산물내의 cry9C 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 11의 9C26 프라이머 및 서열번호 12의 9C265 프라이머를 합성((주)바이오니아)하였다. 상기 9C26/9C265 프라이머는 cry9C 유전자내에 결합하여 240 bp의 cry9C 유전자 단편을 증폭시킨다.
(2) 9C686/9C874 프라이머 세트
cry9C 유전자를 검출하기 위하여 프라이머를 제조하였다. 도 6(b)의 구조체의 cry9C에 할 수 있는 서열번호 13의 9C686 프라이머 및 서열번호 14의 9C874 프라이머를 합성((주)바이오니아)하였다. 상기 9C686/9C874 프라이머는 cry9C 유전자내에 결합하여 189 bp의 cry9C 유전자 단편을 증폭시킨다.
(3) 9C962/9C1153 프라이머 세트
cry9C 유전자를 검출하기 위하여 프라이머를 제조하였다. 도 6(c)의 구조체의 cry9C에 할 수 있는 서열번호 15의 9C962 프라이머 및 서열번호 16의 9C1153 프라이머를 합성((주)바이오니아)하였다. 상기 9C962/9C1153 프라이머는 cry9C 유전자내에 결합하여 192 bp의 cry9C 유전자 단편을 증폭시킨다.
[실시예 7] Ga21 옥수수 검출용 프라이머
몬산토사에서 개발한 제초제 저항성 옥수수 Ga21를 검정할 수 있는 서열번호 17의 g165 프라이머와 서열번호 18의 g355 프라이머를 제조((주)바이오니아)하였다. 상기 g165/g355 프라이머는 도 7의 구조체(벼 엑틴 1 프로모터- 벼 엑틴1 인터론-최적화된 목적 펩타이드- 수정된 EPSPS-Tnos)중 프로모터에 결합하여 191 bp의 단편을 증폭시킨다.
[실시예 8] PAT(phosphinothricin acetyl transferase) 유전자 검출용 프라이머
아벤티스사에서 개발한 제초제 저항성 옥수수 Libertylink에 도입된 PAT 유전자를 확인하기 위한 프라이머를 제작((주)바이오니아)하였다. 서열번호 19의 t13 프라이머 및 서열번호 20의 t203 프라이머는 도 8의 구조체(CaMV 35s 프로모터-합성 PAT-CaMV 35s 전사종결자)에 결합하여 191 bp의 단편을 증폭시킨다.
[실험예 1]
(1) ep78/ep220 프라이머를 이용한 EPSPS를 포함하는 유전자 조작 농산물의 검출
1종의 천연 콩, 1종의 라운드업 레디(몬산토사), 벼, 옥수수 및 밀을 준비하였다. 상기 곡물들은 65 ℃에서 건조시키고, 혼합기(blender)에서 미세하게 분쇄하였다. 분쇄물 100 mg은 DNeasy 식물 미니(DNeasy plant mini, Qiagen)키트로 매뉴얼에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA는 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)상에서 260 nm/280nm상에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
상기에서 정제한 5 종의 게놈 DNA는 각각 100 ng을 취하여, 하기의 조성 및방법으로 PCR을 실시하였다.
<PCR 반응물>
DNA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 100 ng
ep78/ep220 프라이머 - - - - - - - - - - - - - - 10 pmol/10 pmol
Taq중합효소(HotstarTaq DNA polymerase, Qiagen) - 1 unit
10X 완충액 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 ㎕
증류수 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - up to 20 ㎕
<PCR 반응조건>
1. 변성단계 : 95 ℃, 15 분
2. 효소중합반응 단계(40회 반복): 95 ℃, 15초 -> 60 ℃, 20초 -> 72 ℃, 10초
3. 중합반응 단계 : 72 ℃, 2분
상기에서 PCR한 반응물은 EtBr을 포함하는 2 % 아가로즈 젤상에서 전기영동하였고, PCR된 DNA 단편이 있는 레인을 확인하였다. 상기한 EPSPS 프라이머세트로 PCR한 결과 도 9의 전기영동 사진을 관찰할 수 있었다. 도 2의 m은 DNA 사이즈마커이고, 레인 1은 프라이머 없는 상태에서 PCR한 것이고, 레인 2는 게놈 DNA 없는 상태에서 PCR한 것이고, 레인 3은 천연 콩이고, 레인 4는 몬산토사의 라운드업 레디이고, 레인 5는 벼, 레인 6은 옥수수 및 레인 7은 밀에 대한 PCR 결과이다. 도 9에 나타난바와 같이, ep78/ep220 프라이머는 유전자 조작 농산물의 143 bp의 EPSPS 단편을 검출할 수 있었다.
(2) b398/b2 프라이머를 이용한 cry1A(b) 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물의 검출
노바티스사의 Bt11 옥수수, Event176, Mon810, Libertylink, 옥수수, 콩, 벼 및 밀을 구입하였고, 게놈 DNA를 추출하였다.
PCR은 상기 (1)과 동일하게 실시하였고, 프라이머는 b398/b2 프라이머세트를 사용하였고 PCR 반응조건은 하기 조건을 따랐다.
<PCR 반응조건>
1. 변성단계 : 95 ℃, 15 분
2. 효소중합반응 단계(40회 반복): 95 ℃, 15초 -> 58 ℃, 20초 -> 72 ℃, 10초
3. 중합반응 단계 : 72 ℃, 2분
PCR 산물은 2 % 아가로즈 젤상에서 전기영동하여 도 10의 전기영동사진을 촬영하였다. 도 10에서 M은 사이즈 마커(100 bp ladder)이고, 레인 1은 프라이머를 사용하지 않고 PCR한 것이고, 레인 2는 DNA 없이 PCR한 것이고, 레인 3은 옥수수이고, 레인 4는 Bt11이고, 레인 5는 Event176이고, 레인 6은 Mon810이고, 레인 7은 Libertylink이고, 레인 8은 콩이고, 레인 9는 벼이고, 레인 10은 밀이다. 즉, 상기 b398/b2 프라이머 세트는 Bt11 옥수수의 96 bp cry1A(b) 단편을 증폭시켜 유전자 조작 농산물을 검출시켰다.
(3) p4/p340 프라이머를 이용한 cry1A(b) 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물의 검출
Bt11 옥수수, Event176, Mon810, Libertylink, 옥수수, 콩, 벼 및 밀을 구입하였고, 게놈 DNA를 추출하였다.
PCR은 상기(2)와 동일하게 실시하였고, 프라이머는 p4/p340 프라이머세트를 사용하였다. PCR 산물은 2 % 아가로즈 젤상에서 전기영동하여 도 9의 전기영동사진을 촬영하였다. 도 11에서 레인 1은 프라이머를 사용하지 않고 PCR한 것이고, 레인 2는 DNA 없이 PCR한 것이고, 레인 3은 옥수수이고, 레인 4는 Bt11이고, 레인 5는 Event176이고, 레인 6은 Mon810이고, 레인 7은 Libertylink이고, 레인 8은 콩이고, 레인 9는 벼이고, 레인 10은 밀이다. 즉, 상기 p4/p340 프라이머 세트는 Event176의 133 bp 단편을 증폭시켜 유전자 조작 농산물을 검출시켰다.
(4) c6/c211 프라이머를 이용한 cry1A(b) 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물의 검출
Bt11 옥수수, Event176, Mon810, Libertylink, 옥수수, 콩, 벼 및 밀을 구입하였고, 게놈 DNA를 추출하였다.
PCR은 상기(2)에서와 동일하게 실시하였고, 프라이머는 c6/c211 프라이머세트를 사용하였다. PCR 산물은 2 % 아가로즈 젤상에서 전기영동하여 도 10의 전기영동사진을 촬영하였다. 도 12에서 레인 1은 프라이머를 사용하지 않고 PCR한 것이고, 레인 2는 DNA 없이 PCR한 것이고, 레인 3은 옥수수이고, 레인 4는 Bt11이고, 레인 5는 Event176이고, 레인 6은 Mon810이고, 레인 7은 Libertylink이고, 레인 8은 콩이고, 레인 9는 벼이고, 레인 10은 밀이다. 즉, 상기 c6/c211 프라이머 세트는 Event176내의 111 bp cry1A(b) 단편을 증폭시켜 유전자 조작 농산물을 검출시켰다.
(5) m76/m216 프라이머를 이용한 cry1A(b) 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물의 검출
Bt11 옥수수, Event176, Mon810, Libertylink, 옥수수, 콩, 벼 및 밀을 구입하였고, 게놈 DNA를 추출하였다.
PCR은 상기(2)에서와 동일하게 실시하였고, 프라이머는 m76/m216 프라이머세트를 사용하였다. PCR 산물은 2 % 아가로즈 젤상에서 전기영동하여 도 11의 전기영동사진을 촬영하였다. 도 13에서 레인 1은 프라이머를 사용하지 않고 PCR한 것이고, 레인 2는 DNA 없이 PCR한 것이고, 레인 3은 옥수수이고, 레인 4는 Bt11이고, 레인 5는 Event176이고, 레인 6은 Mon810이고, 레인 7은 Libertylink이고, 레인 8은 콩이고, 레인 9는 벼이고, 레인 10은 밀이다. 즉, 상기 m76/m216 프라이머 세트는 Mon810의 141 bp cry1A(b) 단편을 증폭시켜 유전자 조작 농산물을 검출시켰다.
(6) Cry9C 유전자를 포함하는 유전자 조작 농산물 검출
옥수수, Starlink, 콩, 벼 및 밀의 게놈 DNA를 추출하였고, 상기(1)에서와 동일한 반응조건으로 PCR을 실시하였다. 사용된 프라이머세트는 3가지로, 9c26/9c265, 9c686/9c874, 9c962/9c1153이다. 각 프라이머세트 별로 PCR을 하였다.
PCR 산물은 아가로즈 젤상에서 전기영동하였고, 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 도 14는 9c26/9c265 프라이머(A), 9c686/9c874 프라이머(B) 및9c962/9c1153 프라이머(C)로 농작물 DNA를 PCR한 전기영동사진이다. 도 14에서 M은 사이즈마커(100 bp ladder)이고, 레인 1은 프라이머 없이 PCR한 것이고, 레인 2는 DNA 없이 PCR한 것이고, 레인 3은 옥수수이고, 레인 4는 Starlink이고, 레인 5는 콩이고, 레인 6은 벼이고, 레인 7은 밀이다. 9c26/9c265 프라이머, 9c686/9c874 프라이머, 9c962/9c1153 프라이머는 유전자 조작 농산물의 cry9C 단편을 240 bp, 189 bp, 192 bp로 각각 증폭시켜 유전자 조작 농산물을 검출하였다.
(7) g165/g355 프라이머를 이용한 Ga21 검출
옥수수, Ga21, 콩, 및 벼의 게놈 DNA를 추출하였고, 상기(2)와 동일한 반응조건으로 PCR을 실시하였다. 사용된 프라이머세트는 g165/g355 이다.
PCR 산물은 아가로즈 젤상에서 전기영동하였고, 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 도 15는 농작물 DNA를 PCR한 전기영동사진이다. 도 15에서 M은 사이즈마커(100 bp ladder)이고, 레인 1은 프라이머를 없이 PCR한 것이고, 레인 2는 DNA 없이 PCR한 것이고, 레인 3은 옥수수이고, 레인 4는 Ga21이고, 레인 5는 콩이고, 레인 6은 밀이다. g165/g355 프라이머는 Ga21의 단편을 191 bp로 각각 증폭시켜 유전자 조작 농산물을 검출하였다.
(8) PAT를 포함하는 유전자 조작 농산물 검출
Bt11, Event176, Mon810, Libertylink, 콩, 밀 및 벼의 게놈 DNA를 추출하였고, 상기(2)와 동일한 반응조건으로 PCR을 실시하였다. 사용된 프라이머세트는 t13/t203 이다.
PCR 산물은 아가로즈 젤상에서 전기영동하였고, 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 도 16은 농작물 DNA를 PCR한 전기영동사진이다. 도 16에서 M은 사이즈마커(100 bp ladder)이고, 레인 1은 프라이머를 없이 PCR한 것이고, 레인 2는 DNA 없이 PCR한 것이고, 레인 3은 옥수수이고, 레인 4는 Bt11이고, 레인 5는 Event176이고, 레인 6은 Mon810이고, 레인 7은 libertlink이고, 레인 8은 콩이고, 레인 9는 벼이고, 레인 10은 밀이다. t13/t203프라이머는 PAT의 단편을 191 bp로 각각 증폭시켜 PAT를 포함하는 Bt11과 Libertylink를 검출하였다.
[실시예 9] 콩에 대한 양성 대조군 프라이머 합성
유전자 조작 농산물에 대한 PCR을 실시할 때 PCR의 정확성을 확인할 수 있는 양성 대조군 프라이머를 제조하였고, 상기 프라이머는 콩의 렉틴 (lectin)유전자를 검출할 수 있도록 4세트를 제작하였다.
세트 프라이머 명 서열번호 염기서열
1 세트 L227 21 tcaccttctatgcccctgac
L592 22 tcttcaaatcgaccacatcg
2세트 L227 21 tcaccttctatgcccctgac
L701 23 ttccccaggtatgtcgagtc
3세트 L359 24 tcgtcgctgttgagtttgac
L611 25 acccactcgggaagagaagt
4세트 L554 26 gcctcttggttgcttctttg
L701 23 ttccccaggtatgtcgagtc
L227/L592 프라이머는 렉틴 유전자의 366 bp를, L227/L701 프라이머는 475 bp를, L359/L611 프라이머는 253 bp를, L554/L701 프라이머는 148 bp를 증폭시킨다.
[실시예 10] 옥수수에 대한 양성 대조군 프라이머 합성
PCR의 정확성을 확인할 수 있는 옥수수에 대한 양성 대조군 프라이머를 제조하였고, 상기 프라이머는 옥수수의 제인(zein) 유전자를 검출할 수 있도록 3세트를 제작하였다.
세트 프라이머 명 서열번호 염기서열
1 세트 za30 27 cgcttcttgcccttttagtg
za127 28 aactggtgggaggaactgtg
2 세트 za30 27 cgcttcttgcccttttagtg
za621 29 gacacagccagttggttgaa
3 세트 za108 30 cacagttcctcccaccagtt
za380 31 ctacgttcgccagagcaagt
상기 za30/za127 프라이머는 옥수수 DNA를 주형으로 하여 98 bp 단편을 증폭시키고, za30/za621 프라이머는 592 bp를, za108/za380 프라이머는 273 bp를 증폭시킨다.
[실시예 11] 옥수수에 대한 양성 대조군 프라이머 합성
PCR의 정확성을 확인할 수 있는 옥수수에 대한 양성 대조군 프라이머를 제조하였고, 상기 프라이머는 옥수수의 녹말 합성효소 IIb 유전자를 검출할 수 있도록 2세트를 제작하였다.
세트 프라이머 명 서열번호 염기서열
1 세트 Sb314 32 ctccgaagcaaagtcagagc
Sb583 33 cctccctgtcataaggagca
2 세트 Sb1043 34 ccgcacttctgcctgtctat
Sb1142 35 ccctgatgagcaatgttgtg
상기 Sb314/Sb583 프라이머는 옥수수 DNA를 주형으로 하여 270 bp 단편을 증폭시키고, Sb1043/Sb1142 프라이머는 100 bp를 증폭시킨다.
[실험예 2]
(1) 콩에 대한 양성 대조군 프라이머의 검증
콩, 벼, 옥수수 및 밀에서 게놈 DNA를 분리하였고, L227/L592 프라이머, L227/L701 프라이머, L359/L611 프라이머, L554/L701 프라이머로 각각 PCR을 실시하였다. PCR 반응물의 조성은 실험예 1과 동일하게 하였고, 반응조건은 하기 표 4에 따라 실시하였다.
프라이머 반응조건
L227/L592L227/L701 95 ℃, 15분 ->(95 ℃, 15초-> 60 ℃, 20초 -> 72 ℃, 20초), 40회 반복 -> 72 ℃, 2분
L359/L611L554/L701 95 ℃, 15분 ->(95 ℃, 15초-> 60 ℃, 20초 -> 72 ℃, 10초), 40회 반복 -> 72 ℃, 2분
PCR 반응물을 2 % 아가로즈젤상에서 전기영동하여 PCR 결과를 확인하였다. 전기영동사진은 도 17에 나타내었다. 도 17의 A는 L227/L592 프라이머로 PCR한 것이고, B는 L227/L701 프라이머로 PCR한 것이고, C는 L359/L611 프라이머로 PCR한 것이고, D는 L554/L701 프라이머로 PCR한 것이다. 또한 레인 1은 프라이머를 사용하지 않은 음성대조군이고, 레인 2는 DNA를 사용하지 않은 음성대조군이고, 레인 3은 콩이고, 레인 4는 벼이고, 레인 5는 옥수수이고, 레인 6은 밀이다. 도 17의 사진에서 상기 4종의 프라이머는 레인 3의 콩만을 각각 365, 475, 253, 148 bp로 증폭시킴을 알 수 있었다.
(2) 옥수수에 대한 양성 대조군 프라이머의 검증
콩, 벼, 옥수수 및 밀에서 게놈 DNA를 분리하였고, za30/za127 프라이머, za30/za621 프라이머, za108/za380 프라이머로 각각 PCR을 실시하였다. PCR 반응물의 조성은 실험예 1과 동일하게 하였고, 반응조건은 하기 표 5에 따라 실시하였다.
프라이머 반응조건
za30/za127za108/za380 95 ℃, 15분 ->(95 ℃, 15초-> 60 ℃, 20초 -> 72 ℃, 10초), 40회 반복 -> 72 ℃, 2분
za30/za621 95 ℃, 15분 ->(95 ℃, 15초-> 60 ℃, 20초 -> 72 ℃, 30초), 40회 반복 -> 72 ℃, 2분
PCR 반응물을 2 % 아가로즈젤상에서 전기영동하여 PCR 결과를 확인하였다. 전기영동사진은 도 18에 나타내었다. 도 18의 A는 za30/za127 프라이머로 PCR한 것이고, B는 za30/za621 프라이머로 PCR한 것이고, C는 za108/za380 프라이머로 PCR한 것이다. 또한 레인 1은 프라이머를 사용하지 않은 음성대조군이고, 레인 2는 DNA를 사용하지 않은 음성대조군이고, 레인 3은 옥수수이고, 레인 4는 콩이고, 레인 5는 벼이고, 레인 6은 밀이다. 도 18의 사진에서 상기 3종의 프라이머는 레인 3의 옥수수만을 각각 98, 592, 273 bp로 증폭시킴을 알 수 있었다.
(3) 옥수수에 대한 양성 대조군 프라이머의 검증
콩, 벼, 옥수수 및 밀에서 게놈 DNA를 분리하였고, sb314/sb583 프라이머, sb1043/sb1142 프라이머로 각각 PCR을 실시하였다. PCR 반응물의 조성은 실험예 1과 동일하게 하였고, 반응조건은 하기 표 6에 따라 실시하였다.
프라이머 반응조건
sb314/sb583sb1043/sb1142 95 ℃, 15분 ->(95 ℃, 15초-> 60 ℃, 20초 -> 72 ℃, 10초), 40회 반복 -> 72 ℃, 2분
PCR 반응물을 2 % 아가로즈젤상에서 전기영동하여 PCR 결과를 확인하였다. 전기영동사진은 도 19에 나타내었다. 도 19의 A는 sb314/sb583 프라이머로 PCR한 것이고, B는 sb1043/sb1142 프라이머로 PCR한 것이다. 또한 레인 1은 프라이머를사용하지 않은 음성대조군이고, 레인 2는 DNA를 사용하지 않은 음성대조군이고, 레인 3은 옥수수이고, 레인 4는 콩이고, 레인 5는 벼이고, 레인 6은 밀이다. 도 19의 사진에서 상기 2종의 프라이머는 레인 3의 옥수수만을 각각 270, 100 bp로 증폭시킴을 알 수 있었다.
[실시예 12] 유전자 조작 농산물 검정 키트의 제조
(1) 콩 원물용 검정키트
콩 원물용 키트는 PCR 1회 당 요구되는 물질들을 하기 표 7의 조성으로 정하였다.
2X 혼합물 10X 완충액(Elpisbiotech HipiTaq) 2㎕
dNTP(2.5mM) 2㎕
MgCl2 0.8㎕
프라이머(L227/L701-각 0.25 ㎕, ep78/ep220-각 0.5 ㎕, Rctp/R35S-각 0.5 ㎕) 2.5 ㎕
dH20 2.7㎕
음성 대조군 pUC19 벡터에 L227/L701 PCR 산물이 포함됨
양성대조군 pUC19 벡터에 L227/L701 PCR 산물 및 Rtcp/ep220 PCR 산물이 포함됨
Taq 중합효소 Elpisbiotech HipiTaq(1unit/㎕) 1㎕
상기에서, 음성대조군은 L227/L701 프라이머로 PCR하였을 때 증폭되는 단편을 가진 주형이다. 양성대조군은 L227/L701, ep78/ep220, Rctp/R35S 프라이머들로 PCR하였을 때 증폭되는 단편을 가진 주형이다.
(2) 콩 식품용 검정키트
콩 식품용 키트는 PCR 1회 당 요구되는 물질들을 하기 표 8의 조성으로 정하였다.
2X 혼합물 10X 완충액(qiagen HotstarTaq) 2㎕
dNTP(2.5mM) 2㎕
프라이머(L359/L611-각 0.3 ㎕, ep78/ep220-각 0.5 ㎕) 1.6 ㎕
dH20 4.4㎕
음성 대조군 pUC19 벡터에 L227/L701 PCR 산물이 포함됨
양성대조군 pUC19 벡터에 L227/L701 PCR 산물 및 Rtcp/ep220 PCR 산물이 포함됨
Taq 중합효소 qiagen HotstarTaq, 5unit/ul 0.2㎕
(3) 옥수수 검정용 검정키트
옥수수 검정용 키트는 PCR 1회 당 요구되는 물질들을 하기 표 9에 기재된 두 가지 조성물을 제조하였다.
조성물 1 2X 혼합물 10X 완충액(qiagen HotstarTaq) 2㎕
dNTP(2.5mM) 2㎕
MgCl2 0.2 ㎕
프라이머(za30/za621-각 0.25 ㎕, b1/b2-각 1 ㎕, T9/T10-각 0.5 ㎕, g165/g355-각 1 ㎕) 5.5 ㎕
dH20 0.3㎕
음성 대조군 pUC19 벡터에 za30/za621 PCR 산물이 포함됨
양성대조군 pUC19 벡터에 za30/za621 산물 및 b1/b2, T9/T10, g165/g355 PCR 산물이 포함됨
Taq 중합효소 qiagen HotstarTaq, 5unit/ul 0.3㎕
조성물 2 2X 혼합물 10X 완충액(qiagen HotstarTaq) 2㎕
dNTP(2.5mM) 2㎕
프라이머(za30/za621-각 0.4 ㎕, p3/p4-각 0.5 ㎕, m7/m8-각 0.5 ㎕) 2.8 ㎕
dH20 3.2㎕
음성 대조군 pUC19 벡터에 za30/za621 PCR 산물이 포함됨
양성대조군 pUC19 벡터에 za30/za621 산물 및 p3/p4, m7/m8 PCR 산물이 포함됨
Taq 중합효소 qiagen HotstarTaq, 5unit/ul 0.3㎕
상기 조성물 1은 Bt11, Libertylink, Ga21을 검정하기 위한 것이고, 조성물 2는 Event176, Mon810을 검정하기 위한 것이다. b1/b2 프라이머는 Bt11(493 bp)을 검정하고, T9/T10 프라이머는 Libertylink(331 bp)를 검정하고, m7/m8 프라이머는Mon810(336 bp)을 검정하고, p3/p4 프라이머 Event176(472 bp)을 검정한다.
(4) 곡물용 검사키트
곡물용 검사키트는 곡물의 유전자 조작 여부를 스크리닝하기 위하여 제조하였다. 키트에 사용된 프라이머는 n1 프라이머와 n2 프라이머이다. n1/n2 프라이머는 노팔린 합성효소 전사종결자(Tnos)를 180 bp로 검정하는 것으로, 상기 노팔린 합성효소 전사종결자는 유전자 조작 농산물의 재조합 유전자의 전사종결자로 흔히 이용되는 것이다. 또한 s268 프라이머와 s384 프라이머는 P35S를 117 bp로 검정하는 것으로, 유전자 조작 농산물의 재조합 유전자 발현을 위한 프로모터로 흔히 사용되는 것이다. 따라서, n1/n2 프라이머 및 s268/s384 프라이머로 검정하여 1차적인 유전자 조작 여부를 판별할 수 있다. 곡물용 키트는 PCR 1회 당 요구되는 물질들을 하기 표 10의 조성으로 정하였다.
2X 혼합물 10X 완충액(qiagen HotstarTaq) 2㎕
dNTP(2.5mM) 2㎕
프라이머(n1/n2-각 0.3 ㎕, s268/s384-각 0.5 ㎕) 1.6 ㎕
dH20 4.4㎕
음성 대조군 콩 용:pUC19 벡터에 L359/L611 PCR 산물이 포함
옥수수 용:pUC19 벡터에 za108/za380 PCR 산물이 포함
양성대조군 콩 용: pUC19 벡터에 L359/L611, n1/n2, s268/s384 PCR 산물이 포함됨
옥수수 용: pUC19 벡터에 za108/za380, n1/n2, s268/s384 PCR 산물이 포함됨
Taq 중합효소 qiagen HotstarTaq, 5unit/ul 0.3㎕
[실험예 3]
(1) 콩의 유전자 조작 여부 검정
벼, 옥수수, 콩에서 게놈 DNA를 분리하였고, 실시예 12의 콩 원물용 키트로PCR을 실시하였다. 반응물 조성 및 반응조건은 표 11에 나타내었다.
음성대조군 실험군 양성대조군 실험군 샘플 반응군
반응물 2X 혼합물 10㎕ 10㎕ 10㎕
Taq 중합효소 (1U/㎕) 1㎕ 1㎕ 1㎕
dH2O 4㎕ 4㎕ 4㎕
(-) control 5㎕ 0㎕ 0
(+) control 0 5㎕ 0
샘플 DNA 0 0 5㎕
반응조건 94 ℃, 5분 ->(94 ℃, 20초-> 68 ℃, 30초 -> 72 ℃, 15초), 40회 반복 -> 72 ℃, 2분
PCR 반응물은 2 % 아가로즈 젤에 전기영동하여 PCR 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 전기영동사진은 도 20에 나타내었다. M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 음성대조군 실험군이고, 레인 2는 양성대조군 실험군이고, 레인 3,4는 천연형 콩이고, 레인 5 부터 레인 14는 EPSPS가 0.5 %에서부터 100 % 함유된 콩이고, 레인 15는 벼이고, 레인 16은 옥수수이다.
도 20의 결과에서 EPSPS가 함유된 콩에서, 렉틴 유전자 단편(366 bp), Rctp/R35S 프라이머로 증폭된 EPSPS 단편(321 bp), 및 ep78/ep220 프라이머로 증폭된 EPSPS 단편(143 bp)이 검정되었다. 하지만 그 외의 천연형 농산물에서는 증폭된 산물이 없었으며, 천연형 콩은 렉틴 유전자 단편(366 bp)이 검정되어, 콩 원물용 검사키트에 의한 반응이 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었다.
즉 콩 원물용 키트는 유전자 조작 농산물의 식별을 가능케 하였다.
(2) 콩 식품의 유전자 조작 여부 검정
콩, Bt11, 된장, 청국장, 간장, 고추장, 두반장, 쌈장, 이유식 및 메주가루들은 65 ℃에서 건조시키고, 혼합기(blender)에서 미세하게 분쇄하였다. 분쇄물200 mg은 키트(Wizard Magnetic DNA Purification System for Food 키트)로 매뉴얼을 변형하여 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA는 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)상에서 260 nm/280nm상에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 분리한 DNA를 샘플로 하여 실시예 12의 콩 식품용 키트로 PCR을 실시하였다. 반응물 조성 및 반응조건은 표 12에 나타내었다.
음성대조군 실험군 양성대조군 실험군 샘플 반응군
반응물 조성 2X 혼합물 10㎕ 10㎕ 10㎕
Taq 중합효소 (5U/㎕) 0.2㎕ 0.2㎕ 0.2㎕
dH2O 4.8㎕ 4.8㎕ 4.8㎕
(-) control 5㎕ 0㎕ 0
(+) control 0 5㎕ 0
샘플 DNA 0 0 5㎕
반응조건 95 ℃, 15분 ->(95 ℃, 15초-> 60 ℃, 20초 -> 72 ℃, 10초), 40회 반복 -> 72 ℃, 2분
PCR 반응물은 2 % 아가로즈 젤에 전기영동하여 PCR 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 전기영동사진은 도 21에 나타내었다. M은 사이즈마커이고, 레인 1은 천연형 콩이고, 레인 2는 EPSPS이고, 레인 3 및 레인 4는 된장이고, 레인 5 내지 레인 6은 청국장이고, 레인 7은 간장이고, 레인 8 및 레인 9는 고추장이고, 레인 10은 두반장이고, 레인 11 및 레인 12는 쌈장이고, 레인 13 및 레인 14는 이유식이고, 레인 15는 메주가루이다.
도 21의 결과에서 모든 샘플이 렉틴 유전자 단편(253 bp)을 나타내어, 콩을 원료로 제조된 가공품임을 확인하였다. 또한 된장, 청국장, 간장, 고추장, 쌈장 및 이유식에 대하여 EPSPS 단편(143 bp)가 검정되어 유전자 조작 콩으로 제조되었음을 확인하였다.
즉 콩 식품용 키트는 유전자 조작 농산물의 가공품 식별을 가능케 하였다.
(3) 옥수수의 유전자 조작 여부 검정
유전자 조작 옥수수, 콩, 벼, 밀, 옥수수에서 게놈 DNA를 분리하였고, 실시예 12의 옥수수용 키트로 PCR을 실시하였다. 반응물 조성 및 반응조건은 표 13에 나타내었다. 상기 샘플에 대한 PCR은 옥수수용 키트의 조성물 1 및 조성물 2로 두 번 실시하여 각각 확인하였다.
음성대조군 실험군 양성대조군 실험군 샘플 반응군
반응물 조성 2X 혼합물 10㎕ 10㎕ 10㎕
Taq 중합효소 (5U/㎕) 0.3㎕ 0.3㎕ 0.3㎕
dH2O 4.7㎕ 4.7㎕ 4.7㎕
(-) control 5㎕ 0㎕ 0
(+) control 0 5㎕ 0
샘플 DNA 0 0 5㎕
반응조건 95 ℃, 15분 ->(95 ℃, 10초-> 61 ℃, 25초 -> 72 ℃, 15초), 40회 반복 -> 72 ℃, 2분
PCR 반응물은 2 % 아가로즈 젤에 전기영동하여 PCR 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 전기영동사진은 도 22 및 도 23에 나타내었다.
도 22의 M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 천연형 옥수수이고, 레인 2은 유전자조작 옥수수 0.5 % 함유시료이고, 레인 3은 유전자조작 옥수수 2 % 함유시료이고, 레인 4는 콩이고, 레인 5는 밀이다.
도 22에서, 레인 1 내지 레인 3의 옥수수시료에서는 제인 유전자 단편(592 bp)이 검출되었고, 유전자 조작 옥수수에서는 cry1A(b) 유전자 단편(493 bp), PAT 유전자 단편(331 bp) 및 벼 엑틴1 프로모터 단편(191 bp)이 검출되었다. 즉, 레인2와 레인 3의 옥수수는 Bt11, Libertlink 및 Ga21이 혼합되어 있음을 알 수 있다.
또한 도 23의 M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 천연형 옥수수이고, 레인 2은 유전자조작 옥수수 0.5 % 함유시료이고, 레인 3은 유전자조작 옥수수 2% 함유시료이고, 레인 4는 콩이고, 레인 5는 벼이고, 레인 6은 밀이다. 도 23에서, 레인 1 내지 레인 3의 옥수수시료에서는 제인 유전자 단편(592 bp)이 검출되었고, 유전자 조작 옥수수에서는 cry1A(b) 유전자 단편(472 bp) 및 cry1A(b) 유전자 단편(336 bp)가 검출되었다. 즉, 레인 2와 레인 3의 옥수수 시료는 Event176, Mon810이 혼합되어 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 옥수수 검정키트는 다수의 프라이머로 다양한 종류의 유전자 조작 옥수수를 한번에 검출할 수 있다.
(4) 곡물용 검사키트를 이용한 검증
천연형 옥수수, 유전자 조작 옥수수, 천연형 콩, 유전자 조작 콩에서 게놈 DNA를 분리하였고, 실시예 12의 곡물용 검사키트로 PCR을 실시하였다. 반응물 조성 및 반응조건은 표 14에 나타내었다.
음성대조군 실험군 양성대조군 실험군 샘플 반응군
반응물 조성 2X 혼합물 10㎕ 10㎕ 10㎕
프라이머(콩:L359/L611 또는 옥수수:za108/za380) 1㎕ 1㎕ 1㎕
Taq 중합효소 (5U/㎕) 0.3㎕ 0.3㎕ 0.3㎕
dH2O 3.7㎕ 3.7㎕ 3.7㎕
(-) control(콩 또는 옥수수용) 5㎕ 0㎕ 0
(+) control(콩 또는 옥수수 용) 0 5㎕ 0
샘플 DNA 0 0 5㎕
반응조건 95 ℃, 15분 ->(95 ℃, 10초-> 60 ℃, 20초 -> 72 ℃, 10초), 40회 반복 -> 72 ℃, 2분
PCR 반응물은 2 % 아가로즈 젤에 전기영동하여 PCR 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 전기영동사진은 도 24 및 도 25에 나타내었다.
도 24의 M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 천연형 콩이고, 레인 2는 유전자 조작 콩 0.5 % 함유시료이고, 레인 3은 유전자 조작 콩 1 % 함유시료이고, 레인 4는 유전자조작 콩 3 % 함유시료이고, 레인 5는 유전자조작 콩 10 % 함유시료이고, 레인 6은 유전자조작 콩 100 % 함유시료이다.
도 24에서, 레인 1 내지 레인 6의 시료에서는 렉틴 유전자 단편(253 bp)이 검출되었고, 레인 2 내지 레인 6의 유전자 조작 콩 시료에서는 nos 단편(180bp) 및 P35S 단편(117bp)가 검출되었다. 즉, 레인 2 내지 레인 6의 콩이 유전자 조작 콩임을 확인할 수 있었다.
또한, 도 25의 M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 천연형 옥수수이고, 레인 2은 유전자 조작 옥수수 0.5 % 함유시료이고, 레인 3은 유전자 조작 옥수수 1 % 함유시료이고, 레인 4는 유전자 조작 옥수수 3 % 함유시료이고, 레인 5는 유전자 조작 옥수수 10 % 함유시료이고, 레인 6은 Bt11 0.5 %이고, 레인 7은 Event176 0.5 %이고, 레인 8은 Mon810 0.5 %이고, 레인 9는 Libertylink 0.5 %이고, 레인 10은 Ga21 0.5 %이다.
도 25에서, 레인 1은 제인 유전자 단편(273 bp)만 검출되어 천연형 옥수수임이 식별되었고, 레인 2 내지 레인 6 및 레인 11의 시료는 nos 단편(180 bp) 및 P35S 단편(117 bp)가 검출되었다. 또한 레인 7 내지 9는 제인 유전자 단편(273 bp) 및 P35S 단편(117 bp)이 검출되었고, 레인 10은 제인 유전자 단편(273 bp) 및 nos 단편(180 bp)이 검출되었다. 이는 시료로 사용한 Bt11, Event176, Mon810, Libertylink, Ga21 및 Starlink에 Tnos 유전자와 P35S 유전자의 존재여부와 동일한 결과이다.
즉 곡물용 검사키트는 유전자 조작 농작물을 검정할 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 유전자 조작 농산물용 PCR 프라이머는 유전자 조작 농산물 및 상기 농산물로부터 제조된 가공식물의 DNA를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 다수의 프라이머로 PCR이 가능하여 경제적이고, 검사시간을 단축시킨다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 ep78 프라이머 또는 서열번호 2의 ep220 프라이머를 포함하는 EPSPS(enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) 유전자 검정용 PCR 프라이머.
  2. 서열번호 3의 b398 프라이머, 서열번호 4의 b2 프라이머, 서열번호 5의 p340 프라이머, 서열번호 6의 p4 프라이머, 서열번호 7의 c211 프라이머, 서열번호 8의 c6 프라이머, 서열번호 9의 m76 프라이머, 서열번호 10의 m216 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되어진 것을 포함하는 cry1A(b) 유전자 검정용 PCR 프라이머.
  3. 서열번호 11의 9c26 프라이머, 서열번호 12의 9c265 프라이머, 서열번호 13의 9c686 프라이머, 서열번호 14의 9c874 프라이머, 서열번호 15의 9c962 프라이머 및 서열번호 16의 9c1153 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되어진 것을 포함하는 cry9C 유전자 검정용 PCR 프라이머.
  4. 서열번호 17의 g165 프라이머 또는 서열번호 18의 g355 프라이머를 포함하는 벼 엑틴1 프로모터 유전자 검정용 PCR 프라이머.
  5. 서열번호 19의 t13 프라이머 또는 서열번호 20의 t203 프라이머를 포함하는PAT(phosphinothricin acetyltransferase) 검정용 PCR 프라이머.
  6. 서열번호 21의 L227 프라이머, 서열번호 22의 L592 프라이머, 서열번호 23의 L701 프라이머, 서열번호 24의 L359 프라이머, 서열번호 25의 L611 프라이머 및 서열번호 26의 L554 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되어진 것을 포함하는 콩 양성대조군 프라이머.
  7. 서열번호 27의 za30 프라이머, 서열번호 28의 za127 프라이머, 서열번호 29의 za621 프라이머, 서열번호 30의 za108 프라이머, 서열번호 31의 za380 프라이머, 서열번호 32의 sb314 프라이머, 서열번호 33의 sb583 프라이머, 서열번호 34의 sb1043 프라이머 및 서열번호 35의 sb1142 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되어진 것을 포함하는 옥수수 양성대조군 프라이머.
  8. 서열번호 1의 ep78 프라이머, 서열번호 2의 ep220 프라이머, 서열번호 3의 b398 프라이머, 서열번호 4의 b2 프라이머, 서열번호 5의 p340 프라이머, 서열번호 6의 p4 프라이머, 서열번호 7의 c211 프라이머, 서열번호 8의 c6 프라이머, 서열번호 9의 m76 프라이머, 서열번호 10의 m216 프라이머, 서열번호 11의 9c26 프라이머, 서열번호 12의 9c265 프라이머, 서열번호 13의 9c686 프라이머, 서열번호 14의 9c874 프라이머, 서열번호 15의 9c962 프라이머, 서열번호 16의 9c1153 프라이머, 서열번호 17의 g165 프라이머, 서열번호 18의 g355 프라이머, 서열번호 19의 t13프라이머 및 서열번호 20의 t203 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품 검정용 PCR 검사키트.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 검사키트는 서열번호 21의 L227 프라이머, 서열번호 22의 L592 프라이머, 서열번호 23의 L701 프라이머, 서열번호 24의 L359 프라이머, 서열번호 25의 L611 프라이머, 서열번호 26의 L554 프라이머, 서열번호 27의 za30 프라이머, 서열번호 28의 za127 프라이머, 서열번호 29의 za621 프라이머, 서열번호 30의 za108 프라이머, 서열번호 31의 za380 프라이머, 서열번호 32의 sb314 프라이머, 서열번호 33의 sb583 프라이머, 서열번호 34의 sb1043 프라이머 및 서열번호 35의 sb1142 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되어진 것을 더욱 포함하는 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품 검정용 PCR 검사키트.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 검사키트는 서열번호 36의 Rctp 프라이머, 서열번호 37의 R35S 프라이머, 서열번호 38의 b1 프라이머, 서열번호 39의 b2 프라이머, 서열번호 40의 T9 프라이머, 서열번호 41의 T10 프라이머, 서열번호 42의 m7 프라이머, 서열번호 43의 m8 프라이머, 서열번호 44의 p3 프라이머, 서열번호 45의 p4 프라이머, 서열번호 46의 n1 프라이머, 서열번호 47의 n2 프라이머, 서열번호 48의 s268 프라이머 및 서열번호 49의 s384 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되어진 것을 더욱 포함하는 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품 검정용 PCR 검사키트.
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