KR100723069B1 - 유전자 변형 옥수수에 대한 특이 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드와 이를 이용한 정량 및 정성 분석 방법 - Google Patents

유전자 변형 옥수수에 대한 특이 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드와 이를 이용한 정량 및 정성 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 변형 농산물에 대한 정성 및 정량 분석용 특이 프라이머, 프로브 및 표준 플라스미드와 이를 이용한 검정방법에 관한 것으로서, 구체적으로 외래에서 도입된 목적 유전자 전체 또는 일부와 다른 발현조절부위의 DNA 영역의 전부 또는 일부를 포함한 영역을 증폭하도록 하는 프라이머(Primer), 프로브(Probe) 및 표준 플라스미드(Standard plasmid)를 사용함으로써 다양한 계통의 재조합 유전자를 판별하여 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 변형 농산물 검정용 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머와 프로브 및 표준 플라스미드는 GMO(Genetically Modified Organism) 검사 키트로 상업화할 수 있으며, 특히 유통 중이거나 수입된 농산물 및 식품으로 사용되는 유전자 변형 옥수수의 정성 및 정량 분석에 이용될 수 있다.
유전자 변형 옥수수, PCR, 실시간 PCR, 특이 프라이머, 프로브, GMO 검정, cry1Fa2 유전자, ubiquitin promoter, CP4-EPSPS 유전자

Description

유전자 변형 옥수수에 대한 특이 프라이머, 프로브 및 표준 플라스미드와 이를 이용한 정량 및 정성 분석 방법{Qualitative and quantitative detection methods using specific primers, probes and standard plasmid for GM corns}
도 1은 몬산토사의 제초제 저항성 옥수수 NK603에 도입된 CP4-EPSPS 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,
도 2는 다우아그로사이언스사의 해충 저항성 옥수수 TC1507에 도입된 cry1Fa2 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,
도 3은 유전자 변형 옥수수 및 천연형 옥수수에 대한 본 발명의 유전자 변형 식물체 검정용 프라이머 세트의 특이성을 확인한 전기 영동 사진이고,
도 4는 NK-F163 프라이머 및 NK-R393 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열이고,
도 5는 NK-F163 프라이머 및 NK-R393 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석 결과이고,
도 6은 TC-F195 프라이머 및 TC-R445 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열이고,
도 7은 TC-F195 프라이머 및 TC-R445 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서 열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석 결과이고,
도 8은 NK-F294 프라이머 및 NK-R378 프라이머로 증폭된 산물과 TC-F196 프라이머 및 TC-R326 프라이머로 증폭된 산물을 삽입한 옥수수 정량 분석용 표준 플라스미드 pCSNT의 제작과정을 나타낸 모식도이고,
도 9의 A는 옥수수 정량 분석용 표준 플라스미드 pCSNT의 개열지도이고, 도 9의 B는 옥수수 정량 분석용 표준 플라스미드 pCSNT에 삽입된 DNA 서열 중 NK-F294, NK-R378, TC-F196 및 TC-R326 프라이머와 NK-318 및 TC-254 프로브의 위치를 나타낸 것이고,
도 10은 pCSNT 표준 플라스미드의 실시간 PCR에 의한 유전자 변형 옥수수 검정용 정량곡선을 나타낸 것이다.
본 발명은 유전자 변형 농산물에 대한 정성 및 정량 분석용 특이 프라이머, 프로브 및 표준 플라스미드와 이를 이용한 검정방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 외래에서 도입된 목적 유전자 전체 또는 일부와 다른 발현 조절부위의 DNA 영역의 전부 또는 일부를 포함한 영역을 증폭하도록 하는 프라이머(Primer), 프로브(Probe) 및 표준 플라스미드(Standard plasmid)를 사용함으로써 다양한 계통의 재조합 유전자를 판별하여 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
유전자 변형 식물이란 유전공학기술을 이용하여 특정 생물로부터 유용한 유전자를 취해 이를 기존의 작물에 도입함으로써 그와 동일한 유전자 기능을 발휘하도록 조작된 식물을 의미한다. 유전자 변형 식물은 동식물 및 미생물 등 유전자 변형 생명체를 통칭하는 GMO(Genetically Modified Organisms)에 속하며, 또한 형질 전환 작물(Transgenic Plants)로 통용되기도 한다. 특히 이런 유전자 변형 식물 중 농작물의 유전자 변형은 주로 제초제에 대한 내성, 병해충에 대한 저항력, 생산력의 증가, 긴 유통기간에도 쉽게 상하지 않는 특성을 지니게 하거나, 영양가치가 높은 식물을 개발하는 등의 분야에 초점을 맞추어 개발되어 왔으며, 현재까지 여러 GMO 농작물들이 이미 상용화되었거나 준비 중에 있다.
유전자 변형 농산물에 대한 연구는 1970년대 이후 수확량 향상을 위한 돌파구를 찾으려는 시도로부터 출발했다. 이러한 유전자 변형 농산물의 개발은 1994년 미국 칼젠(Calgene)사가 "Flavr Savr"라는 상품명의 잘 물러지지 않는 토마토를 개발한 이후 빠르게 상업화되었으며, 1996년 몬산토사의 제초제에 내성을 지니는 대두 및 노바티스사의 병충해 내성을 지니는 옥수수 등이 개발되면서 농화학기업의 참여와 함께 상품화의 단계에 본격적으로 접어들기 시작하였다. 초기 유전자 변형 식물 재배는 유전자 변형식물을 개발한 회사가 일반 종자보다 비싸게 판매함에도 불구하고 농민의 입장에서는 농약과 비료의 비용이 크게 줄고 병충해가 감소해 그 사용이 급격하게 증가하였다. 1994년부터 1998년까지 FDA의 검증을 마치고 시판이 허용된 유전자 재조합 식물은 옥수수, 토마토, 감자, 대두 등을 중심으로 80여종에 이른다. 국가별로는 미국이 전 세계 재배면적의 80%를 차지하고 있으며, 이밖에 중국, 캐나다, 멕시코, 아르헨티나, 브라질 등의 재배면적도 늘어가고 있는 추세이다.
한편, 유전자 변형 농산물의 상업화가 급진전되면서 유럽을 중심으로 이의 안전성에 대한 우려가 증가되고 있으며, 안전성 기준 또한 점차 강화되고 있다. 특히, 우리나라는 많은 곡물을 미국에서 수입하고 있으며, 국내 수요량의 90% 정도를 수입에 의존하고 있는 수입콩의 경우 GM 콩의 수치가 30%가 넘는 것으로 추정되고 있다. 이에 따라, 소비자들의 GM 농산물에 대한 우려가 높아지자 정부는 2001년 3월부터 GM 농산물 구분 표시제를 시행하고 있으며, 또한 2002년 9월부터 바이오 안정성 의정서가 국제적으로 발효됨에 따라 국내에서 수입 및 유통되고 있는 유전자 변형 농산물에 대하여 안정성 심사에 의하여 승인된 농산물과 미승인 농산물의 판별이 요구되고 있다. 그러나, 유전자 변형 농산물에 대한 수요의 급증과 더불어 유전자 변형 여부에 대한 확인 및 분석이 요구되어지는 현시점에 비추어 볼 때, GMO 식물에 대한 신뢰성 있고 효율적인 검사방법의 개발이 필수적으로 요구되고 있다.
현재, 유전자 변형 식물 또는 식품에 대한 검사방법에는 단백질 검출에 의한 검정 방법과 DNA 검출에 의한 검정 방법이 있다.
단백질을 이용한 검출방법은 유전자 변형 생물체 내에 새롭게 도입된 유전자가 생산하는 재조합 단백질을 항원 단백질로 인지하여 반응하도록 한 항체 단백질 을 검사용 스트립(strip)에 결합시키는 항원-항체 반응을 이용한 검출방법이다.
구체적으로, EPSPS 유전자가 도입된 콩과 CryIA(b), Cry9C, PAT, EPSPS 및 cry1Fa2 유전자가 도입된 옥수수에 대하여 EPSPS 또는 Bt 단백질을 항원으로 인지하여 반응하도록 항체가 결합된 검출 스트립(lateral flow strip) 키트가 이미 상품화되어 있고, 효소면역학적 방법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)에 의한 EPSPS와 CryIA(b) 유전자 단백질의 정량용 분석 키트도 최근 상품화되었다. 그러나 단백질의 발현양은 유전자 변형 농산물에 따라 다르고, 개발회사에서 사용한 유전자 발현 조절부위(프로모터)에 따라 종자에서 발현되지 않는 경우도 있으며, 보관상태 또는 가공식품의 경우에 가공과정에서 분해 되는 경우도 있어 검정에 한계가 있다.
상기의 단백질 검출방법에 비해 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통한 유전자 변형 농작물의 DNA 검출방법은 보다 신뢰성 있는 방법으로서 정량 및 정성 분석이 가능한 방법이다. 상기 DNA를 이용한 검출방법은 유전자 변형 식물에 많이 사용되는 조절부위 특이적 프라이머를 PCR에 이용함으로써 1차적인 검출이 가능하며, 유전자 변형 농산물의 계통 특이적인 프라이머를 사용한 PCR을 통하여 2차적으로 검정할 수 있다.
현재 유전자 변형식물에 많이 사용되는 컬리플라워 모자이크 바이러스 프로모터(CaMV 35S promoter)에 대한 특이적인 PCR 프라이머로 유전자 변형 여부를 확인할 수 있다. 특히, 스위스, 독일 등 EU에서는 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이 터 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정법이 유전자 변형식품을 검정하는 공인기술로 이용되고 있다(A. Jankiewicz 등, Eur. Food res. Technol. 209:77-82, 1999; Pietsch 등, DG JRC 보고서, 1999). 현재 상품화되고 있는 PCR 검정 키트(kit)도 역시 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 것이다. 그러나 상기의 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 PCR 검출방법은 의사 양성(false positive) 또는 의사 음성(false negative)이 나타날 가능성이 있으며(Lipp 등, J. AOAC International 82:923-928, 1999), 유전자 변형 농산물의 종류에 따라 이들 조절부위 유전자를 이용하고 있지 않는 경우도 있다. 따라서 스위스 등 EU에서는 이들 조절부위 특이적인 프라이머를 이용한 PCR은 유전자 변형 농산물의 1차적인 스크리닝에 이용하고 있으며, 유전자 변형 농산물의 계통 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정을 2차 검정으로 확인하고 있다(Huber 등, Nat. Biotechnol. 17:1137-1138, 1999).
그러나, 유전자 변형 농산물 개발회사에 따라 도입시킨 유전자의 염기서열이 다수 변경되어 있으며 도입 유전자의 발현방법도 다를 뿐만 아니라, 상기한 유전 정보를 개발회사의 비밀정보(Confidential Business Information, CBI)로 취급하고 있어서 도입 유전자에 대한 유전 정보를 확보하기에 곤란한 실정이며, 이에 대한 특이 프라이머의 정보도 공개되지 않고 있어서 유전자 변형 농작물에 대한 계통별 특이 프라이머 개발이 국내외적으로 시급한 상황이다.
특히 유전자 변형 옥수수의 경우, 각각의 유전자 변형 계통에 따라 도입된 유전자 및 운반체의 구조가 달라 기존 안정성이 승인되어 유통 중인 유전자 변형 5 계통에 대하여는 DNA를 이용한 검정방법이 개발되어 있으나, 2001년 3월부터 시행되는 유전자 변형 농산물 표시제의 표시대상 품목으로 최근 국내 안정성 승인품목으로 추가되어 수입이 예상되는 제초제 또는 해충 저항성 유전자 변형 옥수수 2 계통에 대하여는 검정이 불가능하다.
이에, 본 발명자들은 상기 제초제 저항성 또는 해충 저항성 유전자 변형 옥수수 2 계통에 대한 검정방법을 개발하고자, 이들 계통에 도입된 재조합 유전자를 검출하기 위한 특이적인 프라이머, 프로브 및 정량 분석용 표준 플라스미드를 제조하였으며, 상기 프라이머, 프로브 및 표준 플라스미드를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 검정방법으로 제초제 또는 해충 저항성 유전자 변형 옥수수 2 계통에 대하여 특이적인 정성 및 정량 분석이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 제초제 저항성 또는 해충 저항성을 나타내는 유전자 변형 옥수수를 검정할 수 있는 계통 특이적인 PCR 프라이머, 프로브 및 표준 플라스미드와 이를 이용한 정성 및 정량 분석방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 제초제 저항성 유전자 변형 식물체를 검정할 수 있는 특이적 프라이머, 프로브 및 표준 플라스미드와 이를 이용한 정성 및 정량적 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 해충 저항성 유전자 변형 식물체를 검정할 수 있는 특이적 프라이머, 프로브 및 표준 플라스미드와 이를 이용한 정성 및 정량적 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트(Kit) 및 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 제초제 저항성 유전자 변형 옥수수를 검정할 수 있는 PCR 프라이머인 서열번호 1의 NK-F163, 서열번호 2의 NK-R393, 서열번호 3의 NK-F294 및 서열번호 4의 NK-R378 프라이머와 이를 이용한 제초제 저항성 유전자 변형 식물체를 검정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 해충 저항성 유전자 변형 옥수수를 검정할 수 있는 PCR 프라이머인 서열번호 6의 TC-F195, 서열번호 7의 TC-R445 및 서열번호 8의 TC-R326 프라이머와 이를 이용한 해충 저항성 유전자 변형 식물체를 검정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 제초제 저항성 유전자 변형 옥수수를 정량적으로 검정할 수 있는 서열번호 5의 NK-318 프로브 및 해충 저항성 유전자 변형 옥수수를 정량적으로 검정할 수 있는 서열번호 9의 TC-254 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 유전자 변형 옥수수를 정량적으로 검정할 수 있는 pCSNT 표준 플라스미드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 3 내지 4의 프라이머와 서열번호 5의 NK-318프로브를 이용하여 제초제 저항성 유전자 변형 옥수수의 외래도입 유전자 혼입률을 산출하는 정량적 검정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 6 내지 8의 프라이머와 서열번호 9의 TC-254 프로브를 이용하여 해충 저항성 유전자 변형 옥수수의 외래 도입 유전자 혼입률을 산출하는 정량적 검정방법을 제공한다.
본 발명은 제초제 저항성 유전자 변형 옥수수를 검정할 수 있는 PCR 프라이머인 서열번호 1의 NK-F163, 서열번호 2의 NK-R393, 서열번호 3의 NK-F294 및 서열번호 4의 NK-R378 프라이머를 제공한다.
상기 유전자 변형 옥수수는 NK603 계통으로서, 벼의 액틴프로모터(rice actin promoter, 이하 'P-actin'이라 함): 애기장대 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, 이하 'EPSPS'라 함) 유전자의 엽록체 전이 펩타이드(chloroplast transit peptide; 이하'CTP2-EPSPS'라 함):아그로박테리움 CP4 균주(strain)의 EPSPS 유전자(이하 'CP4-EPSPS'라 함):노팔린 합성효소 전자종결인자(nopaline synthase terminator; 이하 'Tnos' 라 함)로 구성되는 유전자 운반체 1종과, 컬리플라워 모자이크 강화 프로모터(Enhanced Cauliflower Mosaic Virus, 이하 'E35S'라 함):옥수수 열충격 단백질(heat shock protein 70) 인트론(이하 'hsp70 Int'라 함):CTP2-EPSPS:Tnos로 구성되는 유전자 운반체 1종 등 총 2종의 유전자 운반체 구조를 포함한다.
본 발명의 유전자 변형 옥수수 NK603을 검정하기 위한 프라이머는 도입된 제초제 저항성 유전자의 hsp70 Int:CTP2-EPSPS의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머로서, 바람직하게는 hsp70 Int를 특이적으로 인식하는 서열번호 1의 NK-F163 프라이머 및 서열번호 3의 NK-F294 프라이머, CTP2-EPSPS를 특이적으로 인식하는 서열번호 2의 NK-R393 프라이머 및 서열번호 4의 NK-R378 프라이머이다.
상기에서 서열번호 1의 NK-F163 프라이머 및 서열번호 3의 NK-F294 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2의 NK-R393 프라이머 및 서열번호 4의 NK-R378 프라이머는 역방향 프라이머이다. 따라서 NK603에 도입된 외래유전자의 검출을 위한 PCR 프라이머 세트는 서열번호 1의 NK-F163 프라이머 및 서열번호 3의 NK-F294 프라이머에서 선택된 1종과 서열번호 2의 NK-R393 프라이머 및 서열번호 4의 NK-R378 프라이머에서 선택된 1종으로 구성된 프라이머 세트를 사용한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머를 사용하여 제초제 저항성 유전자 변형 식물체를 검정하는 방법을 제공한다.
상기의 제초제 저항성 유전자 변형 식물체의 검정방법은
i) 제초제 저항성 유전자 변형 식물체의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 게놈 DNA를 주형으로 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트를 이용하여 제초제 저항성 유전자 변형 식물체의 외래 도입 유전자 hsp70 Int:CTP2-EPSPS의 일부를 증폭하는 단계; 및
iii) 증폭된 외래 도입 유전자의 일부를 전기영동으로 확인하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 해충 저항성 유전자 변형 옥수수를 검정할 수 있는 PCR 프라이머인 서열번호 6의 TC-F195, 서열번호 7의 TC-R445 및 서열번호 8의 TC-R326 프라이머를 제공한다.
상기 유전자 변형 옥수수는 TC1507 계통으로서, 벼의 유비퀴틴 프로모터(rice ubiquitin promoter, 이하 'Pubi'이라 함):Cry1Fa2 유전자(바실러스 투린지엔시스(Bacillus turingiensis) 유래의 Bt 독소유전자):아그로박테리움 ORF25 3' 폴리아데닐레이션 영역의 구조를 포함한다.
본 발명의 유전자 변형 옥수수 TC1507을 검정하기 위한 프라이머는 도입된 해충 저항성 유전자의 Pubi:Cry1Fa2의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머로서, 바람직하게는 유비퀴틴 프로모터를 특이적으로 인식하는 서열번호 6의 TC-F195 프라이머, CryFa2를 특이적으로 인식하는 서열번호 7의 TC-R445 프라이머 및 서열번호 8의 TC-R326 프라이머이다.
상기에서 서열번호 6의 TC-F195 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 7의 TC-R445 프라이머 및 서열번호 8의 TC-R326 프라이머는 역방향 프라이머이다. 따라서 TC1507에 도입된 외래유전자의 검출을 위한 PCR 프라이머 세트는 서열번호 6의 TC-F195 프라이머와 서열번호 7의 TC-R445 프라이머 및 서열번호 8의 TC-R326 프라이머에서 선택된 1종으로 구성된 프라이머 세트를 사용한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8 로 기재되는 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머를 사용하여 해충 저항성 유전자 변형 식물체를 검정하는 방법을 제공한다.
상기의 해충 저항성 유전자 변형 식물체의 검정방법은
i) 해충 저항성 유전자 변형 식물체의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 게놈 DNA를 주형으로 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트를 이용하여 해충 저항성 유전자 변형 식물체의 외래 도입 유전자 Pubi:Cry1Fa2 의 일부를 증폭하는 단계; 및
iii) 증폭된 외래 도입 유전자의 일부를 전기영동으로 확인하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 제초제 저항성 유전자 변형 옥수수를 정량적으로 검정할 수 있는 서열번호 5의 NK-318 프로브 및 해충 저항성 유전자 변형 옥수수를 정량적으 로 검정할 수 있는 서열번호 9의 TC-254 프로브를 제공한다.
상기에서 NK-318 프로브는 제초제 저항성 유전자 변형 옥수수 NK603의 hsp70 Int와 CTP2-EPSPS의 연결부위를 특이적으로 인지하며, TC-254 프로브는 해충 저항성 유전자 변형 옥수수 TC1507의 유비퀴틴 프로모터를 특이적으로 인지한다.
또한, 본 발명은 유전자 변형 옥수수를 정량적으로 검정할 수 있는 pCSNT 표준 플라스미드를 제공한다.
pCSNT 플라스미드는 NK-F294 프라이머와 NK-R378 프라이머에 의해 증폭된 PCR 산물과 TC-F195 프라이머와 TC-R326 프라이머에 의해 증폭된 PCR 산물을 연결하여 얻어진 NK-TC DNA(서열번호 13)를 pCRII(Invitrogen K4660) 벡터에 삽입한 플라스미드(도 8 참조)로서, 하기의 유전자 변형 옥수수의 외래 도입 유전자 혼입률을 산출하는 정량적 검정방법인 실시간 PCR을 위한 표준 플라스미드로 사용된다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 3 내지 4의 프라이머와 서열번호 5의 NK-318프로브, 또는 서열번호 6 내지 8의 프라이머와 서열번호 9의 TC-254 프로브를 이용하여 유전자 변형 옥수수의 외래 도입 유전자 혼입률을 산출하는 정량적 검정방법을 제공한다.
본 발명에서는 유전자 변형 농산물에 대한 외래 도입 유전자의 혼입율 분석을 위한 정량적 검정 방법으로서 중합효소연쇄반응의 반응 튜브 내 측정 수단으로 형광측정법을 이용하는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR)을 사용한다. 실 시간 PCR은 젤 상에서의 전기영동이 필요 없고, 반응 사이클 도중에 증폭산물을 확인할 수 있으며, 정량적인 결과를 얻을 수 있는 이점이 있는 방법이다. 통상 실시간 PCR의 모니터링은 형광시약을 이용한 형광검출이 사용되는데, 본 발명에서는 프로브의 5' 말단에 리포터 형광물질을 붙이고 3' 말단에는 퀀처를 붙여, PCR이 진행될 때 5' 말단의 리포터 형광이 떨어지면서 내는 고유의 형광을 정량하는 방식을 이용한다. 상기 과정 중 프로브의 서열은 타겟의 고유한 염기서열로서, 특정 산물에만 붙으며, PCR 반응이 없으면 3' 말단의 퀀처에 의해 형광이 억제되고, PCR 반응이 많으면 비례적으로 형광의 양도 누적 증가하므로 간접적인 정량 측정수단이 될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 5' 말단을 형광물질 FAM으로, 3' 말단을 퀀처 물질 TAMRA로 수식한 NK-318 프로브 또는 MGB 프로브인 TC-254 프로브를 사용하였다.
구체적으로, 상기에서 NK-318 프로브는 제초제 저항성 유전자 변형 옥수수 NK 603의 hsp70 Int와 CTP2-EPSPS의 연결부위를 특이적으로 인지하며, TC-254 프로브는 해충 저항성 유전자 변형 옥수수 TC1507의 유비퀴틴 프로모터를 특이적으로 인지한다.
또한, 상기의 pCSNT 플라스미드는 NK-F294 프라이머와 NK-R378 프라이머에 의해 증폭된 PCR 산물과 TC-F195 프라이머와 TC-R326 프라이머에 의해 증폭된 PCR 산물을 연결하여 pCRII(Invitrogen K4660) 벡터에 삽입한 플라스미드로 실시간 PCR을 위한 표준 플라스미드로 사용된다.
실시간 PCR을 이용한 유전자 변형 옥수수의 외래 도입 유전자 혼입율을 산출 하는 정량적 검정 방법은
i) pCSNT 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;
ii) 농도별로 희석한 pCSNT와 유전자 변형 식물체의 게놈 DNA를 각각 주형으로 유전자 변형 식물체의 외래 도입 유전자에 특이적인 검정용 PCR 프라이머 세트와 프로브를 이용한 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
iii) 표준정량곡선 대비 유전자 변형 식물체의 게놈 DNA에 대한 증폭산물의 양을 환산하여 외래 도입 유전자의 혼입률(%)을 산출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 단계별로 희석한 pCSNT 표준 플라스미드를를 주형으로 하여 NK-F294 프라이머, NK-R378 프라이머 및 NK-318 프로브 세트를 이용한 실시간(realtime) PCR 분석치와 TC-F195 프라이머, TC-R326 프라이머 및 TC-254 프로브 세트를 이용한 실시간(realtime) PCR 분석치로 각각의 유전자 변형 옥수수에 대한 정량용 표준곡선을 작성하고, 표준정량곡선 대비 NK603 및 TC1507의각각 유전자 변형 옥수수의 게놈 DNA(genomic DNA)에 대한 증폭산물의 양을 환산하여 외래 도입 유전자의 혼입률(%)을 산출함으로써 정량적인 검정 방법을 수행하였다.
상기한 본 발명의 유전자 변형 옥수수에 대한 정성 및 정량 검정방법에 사용되는 PCR 방법은 통상적인 PCR 방법으로 하기 표 1에 가장 바람직한 PCR 반응조건을 각 프라이머에 따라 나타내었다.
프라이머 반응조건
NK-F163 프라이머/ NK-R393 프라이머 95℃,10분 -> 95℃,30초 -> 59℃,30초 -> 72℃,30초,35회 -> 72℃,7분
NK-F294 프라이머/ NK-R378 프라이머 NK-318 프로브 50℃,2분 -> 95℃,10분 -> 95℃,30초 -> 59℃,30초,40회
TC-F195 프라이머/ TC-R445 프라이머 95℃,10분 -> 95℃,30초 -> 59℃,30초 -> 72℃,30초,35회 -> 72℃,7분
TC-F195 프라이머/ TC-R326 프라이머 TC-254 프로브 50℃,2분 -> 95℃,10분 -> 95℃,30초 -> 59℃,30초,40회
이외에도, 본 발명의 유전자 변형 식물 검정용 PCR 프라이머 및 프로브는 도입유전자별 특이적 계통 특이성을 가지므로, 상기한 바와 같이 유전자 변형 옥수수인 NK603 및 TC1507의 검정뿐만 아니라 hsp70:CTP2-EPSPS 유전자 또는 Pubi:Cry1Fa2 유전자를 포함하는 다른 유전자 변형 식물 또는 식품에 대하여도 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트를 포함하는 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트(Kit) 및 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트를 포함하는 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트를 제공한다. 또한, 상기 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트에 서열번호 5로 기재되는 NK-318 프로브와 pCSNT 표준 플라스미드가 추가되고, 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트에 서열번호 9로 기재되는 TC-254 프로브와 pCSNT 표준 플라스미드가 추가된 검정용 키트를 제공함으로써, 실시간 PCR에 의한 정량 분석이 가능하다. 상기 키트는 전사, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시 사항을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 전사효소, 데옥시뉴클레오티드, DNA 증폭 반응에 적합한 열안정성 폴리머라제 및 핵산의 표지화 및 검출용 시약을 함유할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유전자 변형 옥수수 NK603 계통에 대한 특이 프라이머 및 프로브 제작
NK603 옥수수는 몬산토(Monsanto)회사에서 개발하여 상품화한 제초제 저항성 옥수수이다. 제초제 저항성 유전자는 아그로박테리움 CP4 균주의 EPSPS 유전자이고, 도 1에 나타난 바와 같이, CaMV 35S 강화 프로모터(Sanders et al., Nucleic Acid Research 25:15(4), 1543-1558), 옥수수 열충격 단백질유전자 HSP70 인트론과 애기장대의 CTP2 및 NOS 터미네이터가 발현조절인자로서 연결되어 있다.
본 발명자들은 제초제 저항성 옥수수 NK603의 외래 도입 유전자를 증폭하기 위한 특이 프라이머로 서열번호 1의 NK-F163 프라이머, 서열번호 2의 NK-R393 프라이머, 서열번호 3의 NK-F294 프라이머 및 서열번호 4의 NK-R378 프라이머를 제작하였으며, 외래 도입 유전자의 정량적 분석을 위하여 추가적으로 서열번호 5의 NK-318 프로브를 추가로 제작하였다(표 2).
프라이머 프라이머 결합부위 서열번호 서열
NK-F163 HSP70 인트론 서열번호 1 5'-CCTCCTGATGGTATCTAGTATCTACCAACT-3'
NK-R393 CTP2-EPSPS 서열번호 2 5'-GAGAGATTGGAGATAAGAGATGGGTTC-3'
NK-F294 HSP70 인트론 서열번호 3 5'-CAGATACCAAGCGGCCTCTAGA-3'
NK-R378 CTP2-EPSPS 서열번호 4 5'-AGAGATGGGTTCTGCACACCA-3'
NK-318프로브 HSP70 Int-CTP2 서열번호 5 5'-FAM-ATCCAGGAGCAACCATGGCGCA-TAMRA-3'
상기 NK-F163 프라이머는 HSP70 인트론을 특이적으로 인식하고, NK-R393 프라이머는 CTP2-EPSPS를 특이적으로 인식한다. NK-F163 프라이머 및 NK-R393 프라이머는 GC 함량이 각각 43% 및 44%로서, Tm 차이가 0.9℃로 적정 어닐링(annealing) 온도가 59℃이며, 상기 프라이머를 이용한 NK603의 PCR 산물의 크기는 231 bp로 예상된다.
또한, NK-F294 프라이머와 NK-R378 프라이머는 GC 함량이 각각 54% 및 52%로서, Tm의 차이는 0.7℃로 적정 어닐링 온도가 59℃이며, 상기 프라이머를 이용한 PCR 산물의 크기는 85 bp로 예상된다. NK-318 프로브의 GC 함량은 59%이며 Tm은 70℃로 적정 어닐링 온도가 70℃이다.
<실시예 2> 유전자 변형 옥수수 TC1507 계통에 대한 특이 프라이머 및 프로브 제작
TC1507는 다우아그로사이언스(Dow AgroScience) 회사에서 개발하여 상품화한 해충 및 제초제 복합 저항성 옥수수이며, 해충 저항성 유전자는 Cry1Fa2 유전자이고 제초제 저항성 유전자는 PAT 유전자이다. 도 2에 나타난 바와 같이, Cry1Fa2 유전자는 벼 유비퀴틴 프로모터와 아그로박테리움 ORF25 3' 터미네이터가 발현조절인자로 연결되어있고, PAT 유전자는 CaMV 프로모터와 T35S 터미네이터가 발현조절인자로 연결되어있다. 본 발명자들은 해충 저항성 옥수수 TC1507의 외래 도입 유전자를 증폭하기 위한 특이 프라이머로 서열번호 6의 TC-F195, 서열번호 7의 TC-R445 및 서열번호 8의 TC-R326를 제작하였으며, 정량적 검정이 가능하도록 추가적으로 서열번호 9의 TC-254 프로브를 제작하였다(표 3).
프라이머 프라이머 결합부위 서열번호 서열
TC-F195 유비퀴틴 프로모터 서열번호 6 5'-CTGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3'
TC-R445 Cry1Fa2 서열번호 7 5'-GGAACAAACTCAGACAACAGGAAAC-3'
TC-R326 Cry1Fa2 서열번호 8 5'-GACGCACTGATTCTGTATGTTGTTCT-3'
TC-254프로브 ubi promoter 서열번호 9 5'-FAM-TGTTTGGTGTTACTTCTGCAG-MGB-3'
TC-F195 프라이머와 TC-R445 프라이머는 GC 함량이 각각 40% 및 42%로서, Tm 차이가 0℃로 적정 어닐링 온도가 59℃이며, 상기 프라이머를 이용한 TC1507의 PCR 산물의 크기는 251 bp로 예상된다. 또한 TC-R326 프라이머는 GC 함량이 42%로서 TC-F195 프라이머와의 Tm 차이가 0℃로 적정 어닐링 온도가 59℃이며, 이들 프라이머를 이용한 TC1507의 PCR 산물의 크기는 132 bp로 예상된다. TC-254 프로브의 GC 함량은 43%이며 Tm은 69℃로 적정 어닐링 온도가 69℃이다.
<실시예 3> 정량 분석용 표준 플라스미드 pCSNT 제작
유전자 변형 옥수수 NK603과 TC1507에 도입된 유전자 카피의 분석을 통한 정량검정을 위하여, NK603 및 TC1507내 도입 유전자에 대한 PCR 산물을 연결하여 pCRII(Invitrogen K4660) 벡터에 삽입한 표준 플라스미드 pCSNT를 제작하였다(도 8). 구체적으로, 상기 NK603의 도입 유전자에 대한 PCR 산물은 NK-F294 프라이머와 NK-R378을 이용하여 증폭하였고, TC1507의 도입유전자에 대한 PCR 산물은 TC-F195 프라이머와 TC-R326 프라이머를 이용하여 증폭하여 도 3과 같이 PCR 산물을 얻은 후, 각각의 PCR 산물에 대하여 도 8의 단계 I과 같이 SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열을 인위적으로 합성하여 연결하는 서열번호 10의 SrfI-NK linker(염기서열: 5'-GCCCGGGCCAGATACCAAGCGGCCTCTAGA-3')와 서열번호 11의 NK-TC 3' linker(염기서열: 5'-ATAGCGTATGAAGGCAGAGAGATGGGTTCT-3') 프라이머 세트 및 서열번호 12의 NK-TC 5' linker(염기서열: 5'-AGAACCCATCTCTCTGCCTTCATACGCTAT-3')와 TC-R326 프라이머 세트를 이용하여 94℃ 5분간 열변성 반응후에 94℃에서 30초간의 열변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 DNA 중합 등 35회간 PCR 반응을 실시하여 도 8의 단계 II와 같이 110bp, 134bp 크기의 각 해당 PCR 산물을 얻었다. 상기의 110bp, 134bp 크기의 PCR 산물을 동일 농도로 혼합한 후 이를 주형으로 SrfI-NK linker와 TC-R326 프라이머 세트로 94℃ 5분간 열변성 반응후에 94℃에서 30초간 의 열변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 DNA 중합 등 35회간 PCR 반응을 실시하여 재증폭하여 도 8의 단계 IV의 NK603과 TC1507에 대한 PCR 증폭 산물이 서로 연결된 225bp 크기의 PCR산물을 획득하였고, 이를 NK-TC DNA로 명명하였다(서열번호 13). 이를 pCRII 벡터(InVitrogen 사)에 삽입함으로써 도 8의 과정과 같이 pCSNT를 제작하였다. 상기 제작된 플라스미드 벡터 pCSNT는 도 9의 A와 같이 pCRII 벡터 유래로서 대장균내 복제를 위한 f1 오리진(origin)과 대장균 형질전환 선발을 위한 암피실린 및 카나마이신 내성유전자가 포함된 3973bp, SrfI 제한효소 인식부위와 NK603 및 TC1507 유전자의 PCR 융합물인 225bp가 포함된 전체 4198bp로 구성된 재조합 벡터이다. 또한, 플라스미드 벡터 pCSNT는 플라스미드 DNA의 높은 복제수(high copy number)로 대장균내에서 플라스미드 DNA를 다량으로 합성할 수 있으며 Sma I/Srf I 제한효소 인식부위 도입으로 Sma I 또는 Srf I 제한효소 처리에 의해 4.2kb의 리니어(linear) 형태의 DNA를 얻을 수 있으며, 또는 희석에 의해 다양한 카피수의 DNA를 수득할 수 있으므로 실시간 PCR을 위한 표준플라스미드로 제공될 수 있다.
상기 pCSNT에 삽입된 PCR 산물은 도 9의 B에 나타난 바와 같이 225개의 염기로 구성되며, 9번부터 30번까지의 염기는 NK-F294 프라이머 염기서열과 일치하였고 74부터 93번까지의 염기는 NK-R378 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 33번부터 54번까지의 염기는 NK-318 프로브 염기서열과 일치함을 확인하였다. 또한, 94번부터 118번까지의 염기는 TC-F195 프라이머 염기서열과 일치하였으며, 200번부터 225번까지의 염기는 TC-R326 프라이머와 상보적인 염기서열과 일치하였고, 150번부터 173번까지의 염기는 TC-254 프로브 염기서열과 일치함을 확인하였다. 또한, 1부터 8번까지 SmaI/SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열이 있음을 확인하였다.
<실험예 1> 특이 프라이머를 이용한 유전자 변형 옥수수의 검출
상기 <실시예 1> 과 <실시예 2> 에서 제작한 프라이머 각각의 특이성을 유전자 변형 옥수수인 NK603 및 TC1507에 대하여 하기와 같이 확인하였다.
<1-1> 식물의 게놈 DNA 분리
먼저, 유전자 변형 옥수수 NK603 및 TC1507 옥수수 2 계통의 게놈 DNA를 분리하였다. NK603에 대한 옥수수분말은 몬산토회사, TC1507에 대한 옥수수분말은 다우아그로사이언스사로부터 입수하여 1 g을 50 ㎖ 튜브에 넣고 DNeasy plant maxi kit(Qiagen 68163)를 이용하여 게놈 DNA를 분리 및 정제하였으며, 수득한 게놈 DNA는 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량하였다.
<1-2> PCR 분석
상기에서 수득한 2 계통의 게놈 DNA 25 ng을 주형으로 하여, 각각에 대한 프라이머 세트(NK-F163/NK-R393 및 TC-F195/R445)로 PCR을 실시하였다. 대조군으로는 프라이머 미첨가군, 천연형 옥수수 및 타 계통의 유전자 변형 옥수수 게놈 첨가군을 사용하였다. 각 프라이머에 대한 PCR 반응조건은 하기 표 4에 나타내었다.
프라이머 반응조건
NK-F163 프라이머/ NK-R393 프라이머 95℃,10분 -> 95℃,30초 -> 59℃,30초 -> 72℃,30초,35회 -> 72℃,7분
TC-F195 프라이머/ TC-R445 프라이머 95℃,10분 -> 95℃,30초 -> 59℃,30초 -> 72℃,30초,35회 -> 72℃,7분
상기의 PCR 산물을 EDTA를 함유한 2% 아가로스 겔상에서 전기영동으로 분석하였다. 도 3은 PCR 산물들에 대한 전기영동사진으로서 A 패널은 NK-F163 프라이머와 NK-R393 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 산물을 전기영동한 결과이며, B 패널은 TC-F195 프라이머와 TC-R445 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 산물의 전기영동결과이다. 레인 1과 레인 13은 사이즈 마커이고, 각 레인에 대해서 레인 2는 음성대조군, 레인 3은 천연형 옥수수 DNA, 레인 4는 Bt11 옥수수, 레인 5는 Event176 옥수수, 레인 6은 Mon810 옥수수, 레인 7은 T25 옥수수, 레인 8은 GA21 옥수수, 레인 9는 NK603 옥수수, 레인 10은 TC1507 옥수수, 레인 11과 12는 옥수수와 같은 화분과 작물인 벼와 보리의 게놈 DNA를 각각의 PCR 주형으로서 사용하여 PCR한 결과이다.
1) NK-F163 프라이머 및 NK-R393 프라이머 세트를 이용한 유전자 변형 옥수수의 검정
NK-F163 프라이머 및 NK-R393 프라이머를 이용한 PCR 결과, NK603 계통의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며, PCR 산물의 크기도 예상한 바와 같이 231 bp로 확인되었다. 상기에서 생성된 PCR 산물이 NK603임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였으며, 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 PCR 산물은 231개의 염기로 구성되었으며, 1부터 30번까지의 염기는 NK-F163 프라이머 염기서열과 일치하였고, 206부터 231번까지의 염기는 NK-R393 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 170번 위치의 ATG부터는 CTP2-EPSPS 단백질의 아미노산을 암호화함을 확인하였다.
이외에도, 상동성 분석 결과, 1부터 145개의 염기서열은 옥수수 열충격단백질의 3'-UT 염기서열(GeneBank accession No. X03697.1)과 91%의 상동성을 보였으며(도 5의 A), 170번 위치의 ATG부터 231번까지의 염기는 애기장대 EPSPS 유전자의 CTP 염기서열(GeneBank accession No. 30689986, At2g45300)과 완전히 일치하였다(도 5의 B).
2) TC-F195 프라이머 및 TC-R445 프라이머 세트를 이용한 유전자 변형 옥수수의 검정
TC-F195 프라이머 및 TC-R445 프라이머를 이용한 PCR 결과, 유전자 변형 옥수수 TC1507 계통의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며, PCR 산물의 크기도 예상한 바와 같이 251 bp로 확인되었다. 상기의 PCR 산물이 TC1507 특이적임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 생성된 PCR 산물은 251개의 염기로 구성되었으며, 1부터 25번까지의 염기는 TC-F195 프라이머 염기서열과 일치하였고, 227부터 251번까지의 염기는 TC-R445 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 103번 위치의 ATG부터는 Cry1Fa2 단백질의 아미노산을 암호화함을 확인하였다.
또한, 1부터 80번까지의 염기서열은 옥수수 유비퀴틴 프로모터 염기서열(GeneBank accession No. U29159.1)과 100%의 상동성을 보였으며(도 7의 A), 103번 위치의 ATG부터 251번까지의 염기는 Cry1F 유전자의 염기서열(GeneBank accession No.M63897)과 78%의 상동성을 나타내었다(도 7의 B).
<실험예 2> 프라이머와 프로브 및 표준 플라스미드를 이용한 유전자 변형 옥수수의 정량적 분석
상기 <실시예 1>, <실시예 2> 및 <실시예 3>에서 제작한 프라이머와 프로브 및 표준 플라스미드를 이용하여 유전자 변형 옥수수인 NK603 및 TC1507에 도입된 유전자의 혼입율을 정량적으로 분석하였다.
<2-1> 식물의 게놈 DNA 분리 및 표준 플라스미드 준비
먼저, 유전자 변형 옥수수 NK603 및 TC1507의 2 계통의 게놈 DNA를 분리하였다. 구체적으로, 상기 유전자 변형 옥수수 NK603 및 TC1507 2 계통에 대한 옥수수분말을 몬산토 및 다우아그로사이언스 회사로부터 각각 입수하여 1 g을 50 ㎖ 튜브에 넣고 DNeasy plant maxi kit(Qiagen 68163)를 이용하여 게놈 DNA를 분리 정제하였다. DNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)로 A260/A280를 측정하여 DNA 농도를 정량하였다.
표준 플라스미드는 대장균(E.coli DH5α)에 형질 전환하여 정제한 후 10 ㎍을 SmaI 효소로 25℃에서 2 시간 처리하여 절단한 후 1% 아가로스 겔에 전기영동 하였다. 상기 선형(linear)으로 절단된 플라스미드를 아가로스 겔로부터 회수하여 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량한 후 20, 125, 1,000, 20,000, 250,000 copies/2.5㎕의 5 단계로 각각 희석하여 표준곡선을 작성하는데 이용하였다.
<2-2> 실시간 PCR 분석을 이용한 유전자 변형 옥수수 외래 도입 유전자의 혼입율 분석
상기에서 수득한 2 계통의 게놈 DNA 25 ng와 각 5 단계별 카피수로 희석한 표준 플라스미드 20, 125, 1,000, 20,000, 250,000 copies/2.5㎕ 및 표준 플라스미드를 첨가하지 않은 NTC(no template control)를 각각 주형으로 하여, 총 2 세트의 프라이머(NK-F294/NK-R378, TC-F195/TC-R326) 각 1.25 μM과 프로브(NK-318, TC-254) 각 0.5 μM를 첨가하여 실시간 PCR을 수행하였다. 대조군으로는 표준 플라스미드를 넣지 않고 실시간 PCR을 수행하였다. 각 프라이머와 프로브에 대한 실시간 PCR 조건은 하기 표 5에 나타내었다.
프라이머/프로브 반응조건
NK-F294 프라이머/ NK-R378 프라이머 NK-318 프로브 50℃, 2분 -> 95℃, 10분 -> 95℃, 30초 -> 59℃, 1분 40회
TC-F195 프라이머/ TC-R445 프라이머 TC-254 프로브 50℃, 2분 -> 95℃, 10분 -> 95℃, 30초 -> 59℃, 1분 40회
<2-3> 표준 플라스미드를 이용한 정량성 확인
pCSNT 플라스미드를 5 단계의 카피수로 희석한 DNA를 주형으로 사용하여 NK-F294 프라이머, NK-R378 프라이머 및 NK-318 프로브 그리고 TC-F195 프라이머, TC-R326 프라이머 및 TC-254 프로브와 같이 실시간 PCR을 수행한 결과, 상기의 pCSNT 플라스미드 카피수에 의하여 증폭되는 실시간 PCR의 상관계수가 0.99이상으로 나타나 정량 분석용 표준 플라스미드로 이용 가능함을 확인하였다(도 10).
또한, 상기 표준 플라스미드의 실시간 PCR 결과치를 이용하여 작성된 표준곡선에 따른 유전자 변형 옥수수 NK603 및 TC1507 계통의 외래 도입 유전자의 도입된 카피수를 분석하였다. 그 결과, 본 발병의 실험예에서 사용된 유전자 변형 옥수수 NK603 및 TC1507 계통에 도입된 외래 유전자의 카피수는 각각 12034 및 15775로 나타났으며, 보정계수는 0.28 및 0.30 이었다(표 6).
GM 옥수수 내재유전자(ssIIb)카피수 도입유전자 카피수 보정계수
NK603 43,744 12,034 0.28
TC1507 53,168 15,775 0.30
결론적으로, 본 발명에 의한 유전자 변형 농산물 검정용 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머와 프로브 및 표준 플라스미드는 GMO(Genetically Modified Organism)의 검사키트로 상업화할 수 있으며, 특히 유통 중이거나 수입된 농산물 및 식품으로 사용되는 유전자 변형 옥수수의 간편하고 정확한 정성 및 정량 분석에 이용될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 유전자 변형 옥수수 검정용 PCR 프라이머, 프로브 및 표준 플라스미드는 각 유전자 변형 옥수수 계통을 특이적으로 검출할 수 있고, 외래 도입 유전자의 혼입율 또한 간단하고 정확하게 분석할 수 있으므로, 현재 유통 중이거나 수입되는 농산물 및 식품 중의 유전자 변형 옥수수를 정성 및 정량적으로 검정하는 GMO 판별에 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (18)

  1. 서열번호 1의 NK-F163 프라이머 및 서열번호 3의 NK-F294 프라이머에서 선택된 1종과 서열번호 2의 NK-R393 프라이머 및 서열번호 4의 NK-R378 프라이머에서 선택된 1종으로 구성되는 것을 특징으로 하는 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 유전자 변형 식물체는 옥수수 NK603 계통(line)인 것을 특징으로 하는 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트.
  4. i) 제초제 저항성 유전자 변형 식물체의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)의 게놈 DNA를 주형으로 제 1항의 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트를 이용하여 제초제 저항성 유전자 변형 식물체의 외래도입 유전자를 증폭하는 단계; 및,
    iii) 증폭된 외래 도입 유전자의 일부를 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 제초제 저항성 유전자 변형 식물체의 검정방법.
  5. 서열번호 6의 TC-F195 프라이머 1종과 서열번호 7의 TC-R445 및 서열번호 8의 TC-R326 프라이머에서 선택된 1종으로 구성되는 것을 특징으로 하는 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서, 상기 유전자 변형 식물체는 옥수수 TC1507 계통(line)인 것을 특징으로 하는 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트.
  8. i) 해충 저항성 유전자 변형 식물체의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)의 게놈 DNA를 주형으로 제 5항의 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트를 이용하여 해충 저항성 유전자 변형 식물체의 외래 도입 유전자를 증폭하는 단계; 및
    iii) 증폭된 외래 도입 유전자의 일부를 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 해충 저항성 유전자 변형 식물체의 검정방법.
  9. 제 1항 또는 3항의 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트에 추가로 사용되는 서열번호 5의 정량검정용 NK-318 프로브.
  10. 제 5항 또는 7항의 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트에 추가로 사용되는 서열번호 9의 정량검정용 TC-254 프로브.
  11. 제초제 저항성 또는 해충 저항성 유전자 변형 식물체 외래 도입 유전자의 정량적 검정에 사용되는 서열번호 13의 NK-TC 유전자를 포함하는 도 9의 A의 개열지도로 표시되는 pCSNT 표준 플라스미드.
  12. i) 도 9의 A의 개열지도로 표시되는 pCSNT 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;
    ii) 농도별로 희석한 pCSNT와 유전자식물체의 게놈 DNA를 주형으로 유전자 변형 식물체의 외래 도입 유전자에 특이적인 검정용 PCR 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
    iii) 표준 정량곡선 대비 유전자 변형 식물체의 게놈 DNA에 대한 증폭산물의 양을 환산하여 외래 도입 유전자의 혼입률(%)을 산출하는 단계를 포함하는 유전자 변형 농산물에 혼입된 외래 도입 유전자의 정량 분석방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 단계 i)의 유전자 변형 식물체는 옥수수 NK603 계통 또는 옥수수 TC1507 계통인 것을 특징으로 하는 정량 분석방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 단계 ii)의 검정용 PCR 프라이머 세트와 프로브는 제 1항 또는 3항의 PCR 프라이머 세트와 서열번호 5의 NK-318 프로브 또는 제 5항 또는 7항의 PCR 프라이머 세트와 서열번호 9의 TC-259 프로브인 것을 특징으로 하는 정량 분석방법.
  15. 제 1항 또는 제 3항의 프라이머 세트를 포함하는 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트(Kit).
  16. 제 15항에 있어서, 상기 프라이머 세트에 추가로 제 9항의 서열번호 5로 기재되는 NK-318 프로브와 제 11항의 pCSNT 표준 플라스미드를 포함하는 제초제 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트.
  17. 제 5항 또는 제 7항의 프라이머 세트를 포함하는 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 프라이머 세트에 추가로 제 10항의 서열번호 9로 기재되는 TC-254 프로브와 제 11항의 pCSNT 표준 플라스미드를 포함하는 해충 저항성 유전자 변형 식물체 검정용 키트.
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