CN102586304B - 含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，由SEQ IDNo.1(35S启动子)、SEQ ID No.2(Bt)、SEQ ID No.3(SPS)、SEQ ID No.4(ACP)、SEQ ID No.5(NOS终止子)和SEQ ID No.6(Npt II新霉素)所示核苷酸片段添加常规酶切位点后，插入克隆载体制得。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、高效经济，解决了转Bt基因农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便的含有多种转座因子的转Bt基因荧光定量PCR检测试剂盒，能够很好的进行转Bt基因农作物的定性、定量分析检测。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒及其应用，以及一种含有多种转座因子的转Bt基因荧光定量PCR检测试剂盒。
(二)背景技术
Bt基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)晶体蛋白基因的简称。1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。Bt基因中分为Cry和Cyt二大类。迄今为止，已经报道的Bt达到476种，其中Cry分为58群、449种，Cyt分为2群、27种(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/toxins2.html)。经过密码子优化的Bt基因已被成功地导入水稻、棉花、烟草、玉米等多种植物，获得一大批具良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源，Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因。
目前全世界总共已获得了50多种转Bt杀虫晶体蛋白基因植物，其中玉米、棉花、马铃薯、油菜、杨树、烟草等已商品化，我国农业部于2009年批准转基因抗虫水稻的生物安全证书。自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与应用快速发展。截至2010年底，已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积由1996年的170万公顷发展到2010年的14800万公顷，14年间增长了87倍。
ACP(Fiber-specific acyl carrier protein)基因是棉花内源基因，用于定量检测的棉花ACP基因片段长度为116b的DNA片段；其核苷酸序列不仅具备种内一致性，即所有棉花品种中含有ACP基因；还具备种间特异性，即在除棉花外其它物种里没有该基因DNA片段。
SPS(sucrose phosphate synthase)基因是水稻内源基因，用于定量检测的水稻SPS基因长度为81bp的DNA片段；其核苷酸序列不仅具备种内一致性，即所有水稻品种中含有SPS基因；还具备种间特异性，即在除水稻外其它物种里没有该基因DNA片段。
CaMV35S启动子来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子，存在于转基因大豆、玉米、油菜籽、番茄、马铃薯及其加工产品中；NOS终止子为胭脂碱合成酶基因终止子，也广泛存在于转基因大豆、玉米、油菜籽、番茄、马铃薯及其加工产品中；Npt II为新霉素-3’-磷酸转移酶基因，该基因的加入可促使转基因产品在新霉素培养基中成长。
近年来，关于转基因植物的安全性事件报道不断，如1996年巴西豆过敏事件、1998年Pusztai事件、1999年美国大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星联Bt玉米事件、2007年印度转基因抗虫棉事件、加拿大超级杂草事件和中国抗虫棉事件等，这些事件促使国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良植物及其产品实施标识制度。
为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，有必要建立一套高效、快速、特异的检测技术。聚合酶链反应(PCR)无疑是最佳选择。在实际检测中，标准物质十分关键。标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有检测目的基因特异性片段的线性化重组质粒分子。经实验验证，不管是由单一特异性外源序列还是多段目标序列构建的质粒标准分子，都能很好的达到转基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。
质粒标准分子由于生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济等优点愈来愈受全世界转基因检测专家和研究者们重视，在转基因生物鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物，应用于转基因品系以及其加工品的定量PCR检测。标准质粒分子在转基因作物和附属产品检测鉴定中的应用将会发挥越来越重要的作用。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒分子，解决转Bt基因农作物尤其是转Bt基因棉花、水稻检测中标准物质缺乏的难题。
本发明采用的技术方案是：
一种含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，由SEQ ID No.1(35S启动子)、SEQ ID No.2(Bt)、SEQ ID No.3(SPS)、SEQ ID No.4(ACP)、SEQ ID No.5(NOS终止子)和SEQ ID No.6(Npt II新霉素)所示核苷酸片段添加常规酶切位点后，插入克隆载体制得。
优选的，上述6个核苷酸，每个核苷酸片段两端添加同一种酶切位点，其添加顺序依次为HindIII、KpnI、XbaI、XhoI、BamHI、BglII。
本发明的转Bt基因棉花、水稻标准质粒分子既含有Bt外源基因又包括棉花ACP内源基因和水稻SPS内源基因。Bt外源基因既可用于定性、定量检测转Bt基因农作物的转基因含量，又可以定性检测样品是否来自转Bt基因农产品；相同原理，棉花ACP和SPS内源基因可定性检测上述转Bt基因农产品是否为棉花或水稻品系，亦可定量检测转Bt基因棉花、水稻的转基因含量。
所述克隆载体为常规克隆载体(PMD18-T、PMD19-T、pEASY-T3等克隆载体)，本发明中优选为pEASY-T3。
优选的，所述标准质粒由SEQ ID No.7(SEQ ID No.1两端添加HindIII位点)、SEQ ID No.8(SEQ IDNo.2两端添加KpnI位点)、SEQ ID No.9(SEQ ID No.3两端添加XbaI位点)、SEQ ID No.10(SEQ ID No.4两端添加XhoI位点)、SEQ ID No.11(SEQID No.5两端添加BamHI位点)和SEQ ID No.12(SEQ ID No.6两端添加BglII位点)所示核苷酸序列依次连接后，插入pEASY-T3载体制得。
所述标准质粒的构建，包括如下步骤：
1.设计PCR特异性引物；
2.PCR扩增；
3、35S启动子、Bt、SPS、ACP、NOS终止子以及Npt II新霉素核苷酸目标序列获取，长度分别为74、174、81、116、180和183bp，通过测序进行验证；并设计荧光定量PCR引物及探针；
4.构建标准质粒；
将4中所选取的35S启动子、Bt、SPS、ACP、NOS终止子以及Npt II新霉素特异片段经过拼接，每个核苷酸头尾均添加相同成分酶切位点，添加的酶切位点依次为HindIII、KpnI、XbaI、XhoI、BamHI、BglII，最终获得长度为880bp的基因片段，而后插入pEASY-T3载体，完成标准质粒的组合，标准质粒分子如图1(因其插入片段长度为880bp，本发明简称880号质粒)。
5.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒；
6.对标准质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测；
7.对标准质粒特异性、稳定性及均匀性结果进行分析。
本发明还涉及所述的标准质粒在定量检测转基因农作物中转基因含量中的应用。
所述农作物可为下列之一：水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。
所述标准质粒可用于检测下列之一的Bt外源基因：(1)CryIA(α)，(2)CryIA(b)，(3)CryIA(c)，(4)CryIab/ac。
本发明还涉及一种含多种转座因子的转Bt基因荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和所述含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，所述特异性引物和探针序列如下：
35S启动子的引物和探针(目标条带74bp)：
35S-F：5’-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3’
35S-R：5’-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’
35S-P：5’-(FAM)-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-(TAMRA)-3’
NOS终止子的引物和探针(目标条带180bp)：
NOS-F：5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’
NOS-R：5’-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’
NOS-P：5’-(FAM)-GCATGACGTTATTTATGAGATGGGT-(TAMRA)-3’
Npt II新霉素的引物和探针(目标条带183bp)：
NPT II-F：5’-GCACGAGGAAGCGGTCA-3’
NPT II-R：5’-AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3’
NPTII-P：5’-(FAM)-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-(TAMRA)-3’
棉花ACP基因的引物和探针(目标条带116bp)：
ACP-F：5’-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’
ACP-R：5’-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3’
ACP-P：5’-(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-(TAMRA)-3’
Bt基因的引物和探针(目标条带174bp)：
Bt-F：5’-GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’
Bt-R：5’-CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’
Bt-P：5’-(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-(Eclipse)-3’
水稻SPS基因的引物和探针(目标条带81bp)：
SPS-F：5′-TTGCGCCTGAACGGATAT-3′
SPS-R：5′-CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3′
SPS-p：5’-(FAM)-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-(TAMRA)-3’
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA、Eclipse为荧光淬灭基团；
所述含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒分子由SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示核苷酸序列依次连接后，插入pEASY-T3载体制得。
使用以上试剂盒对转Bt基因农作物的荧光定量PCR检测可按本领域常规方法进行，提取待测样品基因组DNA后，配制PCR缓冲液进行PCR扩增，取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现Bt基因的特异性条带(174bp)，判断待测农作物是否含有相应外源基因，若电泳结果同时出现ACP基因特异性条带(116bp)，则待测农作物为转Bt基因棉花；若电泳结果同时出现SPS基因特异性条带(81bp)，则待测农作物为转基因水稻；还可用于转基因大豆、玉米、油菜籽、番茄、马铃薯及其加工产品中CaMV35S启动子、NOS终止子以及Npt II基因的定性定量检测。定量检测时同时以标准质粒梯度浓度溶液于相同条件下进行扩增，绘制标准曲线，对照标准曲线，即可获得待测样品中外源基因和内源基因的拷贝数，即可获知待测样品的外源基因含量。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、高效经济，解决了转基因农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便的含多种转座因子的抗虫水稻、棉花荧光定量PCR检测试剂盒，能够很好的进行转基因农作物的定性、定量分析检测。
(四)附图说明
图1为pEASY-T3重组载体结构图；1～6分别为酶切位点HindIII、KpnI、XbaI、XhoI、BamHI、BglII；
图2为Bt和ACP基因验证电泳图；Marker：DL2000；1(35S)、2(NTC)、3(NOS)、4(NTC)、5(SPS)、6(NTC)、7(Npt II)、8(NTC)、9(ACP)、10(NTC)、11(Bt)、12(NTC)；
图3为EcoRI单酶切；M：(DL2000)；1：(880质粒)；2：(HindIIII酶切)；3：(KpnI酶切)；4：(XbaI酶切)；5：(XhoI酶切)；6：(BamHI酶切)；7：(880质粒)；8：(Bgl II酶切)；M：(DL2000)；
图4为880号质粒的各基因荧光定量PCR结果(标准曲线)；A～F分别为35S、Bt、SPS、ACP、NOS、Npt II；
图5为880号质粒各基因片段短期稳定性荧光定量PCR结果(标准曲线)；1为-70℃、-20℃、4℃的检测扩增曲线；2为20℃、40℃的检测扩增曲线；A～F分别为35S、Bt、SPS、ACP、NOS、Npt II；
图6为880号质粒各基因均匀性qPCR分析，A～F分别为35S、Bt、SPS、ACP、NOS、Npt II；
图7为880号质粒荧光定量检测极限分析。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：880标准质粒分子的构建
本发明含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒包含Bt、35S启动子、NOS终止子以及Npt II基因四个外源基因和棉花ACP、水稻SPS二种内源基因，其构建方法包括如下步骤：
1.设计PCR特异性引物；
2.PCR扩增；
3.Bt、35S启动子、NOS终止子、Npt II、ACP、SPS等目标序列获取，并通过测序进行验证；
4.选择合适片段，并设计荧光定量PCR引物及探针；
荧光定量PCR引物及探针如下所示：
35S-F：5’-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3’
35S-R：5’-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’
35S-P：5’-FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-TAMRA-3’
Bt-F：5’-GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’
Bt-R：5’-CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’
Bt-P：5’-(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG(Eclipse)-3’
SPS-F：5′-TTGCGCCTGAACGGATAT-3′
SPS-R：5′-CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3′
SPS-p：5’-FAM-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-TAMRA-3’
ACP-F：5’-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’
ACP-R：5’-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3’
ACP-P：5’-(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG(TAMRA)-3’
NOS-F：5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’
NOS-R：5’-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’
NOS-P：5’-FAM-GCATGACGTTATTTATGAGATGGGT-TAMRA-3’
NPT II-F：5’-GCACGAGGAAGCGGTCA-3’
NPT II-R：5’-AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3’
NPT II-P：5’-FAM-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA-3’
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
5.构建标准质粒；
35S启动子、Bt、SPS、ACP、NOS终止子以及Npt II新霉素核苷酸片段其长度分别为：74bp、174bp、81bp、116bp、180bp、183bp。上述6个核苷酸片段，每个核苷酸片段两端添加同一种酶切位点，其添加顺序依次为HindIII、KpnI、XbaI、XhoI、BamHI、BglII。所得片段插入pEASY-T3克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，完成标准质粒的组合，标准质粒分子如附图1(因其插入片段长度为880bp，本发明简称880号质粒)。
其重组流程如下：
a.基因序列的QC：对所需合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列。根据序列情况设计合成方案；
b.根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；
c.利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；
d.将合成好的基因装入pEASY-T3Cloning载体并转化至感受态细胞DH5α；
e.测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。
6.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒；
(1)PCR验证
对所构建的880号质粒用35S启动子、Bt、SPS、ACP、NOS终止子以及Npt II引物进行扩增电泳，在目标片段区域获得清晰的单一预期条带，如图2，说明这六个片段已经被正确地插入质粒中。
(2)酶切验证
根据插入片段和pEASY-T3载体TA克隆位点两端特异性较高的酶切位点选择EcoRI单酶切，结果见图3。根据载体结构图以及载体和整合片段序列估算，880号质粒经HindIIII、KpnI、XbaI、XhoI、BamHI、Bgl II六种限制性内切酶进行单酶切，酶切获得选取的35S启动子、BT、SPS、ACP、NOS终止子、NPT II新霉素这六个基因的特异片段，大小分别为74、174、81、116、180、183bp，基本肯定质粒片段的正确性。
(3)测序验证
根据插入片段(含两端酶切位点)设计引物，进行PCR扩增，将扩增结果进行测序。并对测序结果与设计序列进行匹配对比，结果完全吻合，验证了质粒序列100％的可靠性。
7.对标准质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测；
(1)标准质粒的浓度测定和检测重复性
质粒荧光定量PCR引物与上述4中相同，探针采用Primer Express2.0和Beacondesigner设计，然后由TaKaRa公司负责合成。根据PicoGreen dsDNA Reagent and Kits所测定母液浓度计算质粒拷贝数，再用灭菌去离子水分别稀释成初始模板拷贝数为107、106、105、104、103、100、10拷贝的标准质粒进行荧光定量PCR绘制标准曲线，从而建立标准质粒的qPCR定量分析体系并用于实际标准分子的定量分析，重复定量分析3次，分析检测灵敏性。表1为qPCR扩增程序，表2为荧光定量PCR 25μl扩增体系。
表1：qPCR扩增程序
| step1 | step2 | |
| 35S | 95℃，30s； | 95℃，5s；63℃，30s；40cycles |
| Bt | 95℃，30s； | 95℃，5s；60℃，30s；40cycles |
| SPS | 95℃，30s； | 95℃，5s；55℃，30s；40cycles |
| ACP | 95℃，30s； | 95℃，5s；59℃，30s；40cycles |
| NOS | 95℃，30s； | 95℃，5s；57℃，30s；40cycles |
| nptII | 95℃，30s； | 95℃，5s；65℃，30s；40cycles |
表2：荧光定量PCR 25μl扩增体系
(2)标准质粒稳定性分析
配制浓度为107拷贝的质粒DNA，每管50ul，分别保存在-70℃、-20℃、4℃、20℃、40℃的环境中，比较分析标准质粒DNA在存储1天、3天、一周、两周、三周、四周时质粒DNA的短期稳定性，和在-70℃、-20℃、4℃温度处理下1、2、3个月的长期稳定性。
(3)标准质粒均匀性分析
两个质粒分别配制30管浓度分别为107拷贝和108拷贝的质粒标准品，每管100ul。随机选取15管，利用Picogreen试剂盒和荧光定量PCR方法分别测定标准质粒的浓度。荧光定量PCR分析所用引物与探针、体系和程序与上同。
8.对标准质粒特异性、稳定性及均匀性结果的分析；
(1)标准质粒的浓度
用QIAGEN质粒提取试剂盒抽提880质粒，纯化后用母液分装，并用PicoGreen试剂盒测定母液浓度，并按照其浓度计算拷贝数浓度，所得结果见表3：
表3：880号质粒的纯度、浓度、拷贝数的检测结果
根据计算所得拷贝数，将母液以10倍梯度稀释成107、106、105、104、103、100、10拷贝数，每个浓度取3个重复，制作标准曲线。结果如图4，其中A-F分别为35S、Bt、SPS、ACP、NOS、Npt II。
对880质粒每个浓度梯度3个重复样品Ct值进行标准差分析，发现其标准差都较小，可见每个样品间重复性良好，而且在较低拷贝数(10拷贝)浓度范围依然有较好的重复性，其结果见表4。
表4：880号质粒检测的重复性
(2)880号质粒的短期稳定性分析
采用荧光定量PCR方法对880号质粒Bt基因进行短期稳定性检测。以已经建立的880号标准质粒107-10拷贝的标准曲线为参考，随机选取5个温度条件下的4管样品作相对定量实验，每管做3次重复，以确定不同温度下(-70、-20、4、20、40℃)质粒溶液拷贝数变化，考察了第一天、第三天、第一周、第二周、第三周和第四周时拷贝数的变化，见图5，其中A-F分别为35S、Bt、SPS、ACP、NOS、Npt II。并进一步对各温度条件下，不同存储时间的荧光定量PCR结果进行平均数分析和方差分析，结果见表5、6。
表5：880号质粒各基因不同温度下短期稳定性分析(平均Ct值±相对标准偏差)
表6：880号质粒各基因稳定性检测的方差分析结果
从表中可知，各温度条件、存储时间下的荧光定量PCR结果的相对标准偏差均小于10％，说明实验体系稳定性好，结果可靠。进一步的方差分析结果表明，-70℃、-20℃、4℃、20℃条件下，28天内均表现为稳定，说明880号在上述温度条件下进行短期存储是稳定的。而40℃时，P值小于0.05，说明40℃时不同时期间的质粒量值有了显著的差异。因此，为保证880号质粒量值的稳定性，建议不要在高于40℃条件下运输和储存。
对于所构建质粒内各基因片段，随着时间的增长，Ct值变化都呈明显降低趋势，其中在-70℃至20℃的温度区间变化不显著，40℃以上的温度段变化比较明显。可能在储存过程中溶液的蒸发，使相对浓度偏高，同时质粒模板可能发生了一定降解，间接造成了浓度的增高。
(3)标准质粒均匀性分析
880号质粒各基因片段均匀性分析结果见附图6，Ct值可信度分析见表7。
表7：880号质粒的均匀性检测的荧光定量PCR结果
从荧光定量PCR的结果以及两个质粒Bt基因和ACP基因的Ct值分析结果来看，所有107拷贝浓度下的重复样品扩增结果都集中在标准曲线相应浓度的范围内，说明每个样品的重现性高，同时根据所测得的Ct值进一步分析了两类标准质粒分别在同一批次样品的各基因的荧光定量PCR扩增的均匀性性方差分析，结果见表8。
表8：880号质粒的均匀性检测方差分析结果
从表中可知，880号质粒的管间差异的P值均大于0.05，说明不同管之间没有显著差异，质粒分子的管间均匀性较好。
(4)质粒标准分子的定量检测极限分析
根据前面优化的反应体系和程序，对880号质粒按照107、106、105、104、103、102、10拷贝数浓度梯度稀释的3个重复样品进行荧光定量PCR检测以后，得到结果见附图7。
通过对三次重复实验结果分析以及ΔCt值计算比较，确定定量PCR的LOD为10个拷贝。
实施例2：构建的880号质粒标准分子在转基因农作物及其制品定性检测中的应用
本实施例选取中棉所常规棉、浙江大学1个品种转基因棉花(222)、秀水04、克螟稻1号四个样品进行对比实验，考察本发明构建的含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒分子在转基因农作物及其制品中定性检测结果。
本发明构建的含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒分子，可以定性检测包括CryIA(a)，CryIA(b)，CryIA(c)，CryIab/ac在内的四种Bt外源基因以及35S、NOS、NPT II三种外源基因。若待测农作物或制品中含上述四种任意一种Bt外源基因特异性序列，则检测结果为阳性，该待测物为转Bt基因产品；若待测农作物或制品含有任一种35S、NOS、NPT II外源基因特异性序列，则检测结果为阳性，该待测物为转基因产品；若该农作物或制品为棉花品系种类，含有棉花ACP内源基因，则检测结果为阳性，同理水稻样品及其制品检测结果亦为阳性。
定性检测实验过程包括如下几个步骤：
(1)农作物基因组DNA提取
a.分别将1g左右磨碎的中棉所常规棉、浙江大学1个品种转基因棉花(222)、秀水04、克螟稻1号样品放入10ml离心管中，加入Solution I 5ml，充分混合后振荡约30分钟，得样品。
b.2000rpm室温离心2分钟，将上清液移入2ml的离心管中。此时注意不要吸入变性蛋白质(白色悬浮物)。
c.12000rpm室温离心5分钟。离心时，请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一，离心管的小耳朵朝上。
d.小心除去上清液。此时沉淀虽然看不清，但紧贴在离心管外侧(带小耳朵一侧)的内壁上。除去上清液时，请一定注意枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部，将上清液吸取干净。
e.向沉淀中加入Solution II 1ml。此时Solution II应沿着离心管内侧的内壁加入到离心管中。
f.将离心管上下颠倒混合后，12000rpm室温离心2分钟，按操作d的方法小心除去上清液。
g.加入Solution III 500μl，剧烈振荡10秒钟以使沉淀溶解。
h.12000rpm室温离心5分钟后，将上清液移入新的1.5ml离心管中。
i.加入等量的经TE饱和的苯酚/氯仿混合后，12000rpm室温离心5分钟，将水层(上层)移入新准备的1.5ml离心管中。
j.加入等量的氯仿/异戊醇混合后，12000rpm离心5分钟，将水层(上层)移入新准备的1.5ml离心管中。
k.加入等量(约500μl)的异丙醇，充分颠倒混合。
l.4℃、12000rpm离心5分钟，小心除去上清液。注意：此时的DNA沉淀易剥离。
m.用70％的乙醇清洗沉淀后，简单干燥。
n.将沉淀溶于50μl TE或其它缓冲液中，最终得到样品1、2、3、4。
(2)质粒基因组DNA提取
a.柱平衡步骤：向吸附柱CP5中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液BL，10000rpm(～11500×g)离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
b.取100ml过夜培养的菌液加入离心管，室温10000rpm(～11500×g)离心3分钟收集细菌，尽量吸除上清。
c.尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。
d.向留有菌体沉淀的离心管中加入7ml溶液P1(已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
e.向离心管中加入7ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5分钟。
f.向离心管中加入7ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。然后室温放置10分钟左右。10000rpm(～11500×g)离心5分钟，将溶液全部倒入过滤器CS中，慢慢推动推(plunger)过滤，滤液收集在干净的50ml的管中。
g.向滤液中加入滤液体积的0.3倍的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP5中(吸附柱放入50ml收集管中)。注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP5的最大容积为15ml，所以需要分2次过柱。
h.室温10000rpm(～11500×g)离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
i.向吸附柱中加入10ml漂洗液PW，10000rpm(～11500×g)离心2分钟，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
j.重复操作步骤i。
k.向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温10000rpm(～11500×g)离心2分钟，倒掉废液。
l.将吸附柱CP5重新放回收集管中，10000rpm(～11500×g)离心5分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
m.将吸附柱CP5置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5分钟，室温10000rpm(～11500×g)离心2分钟。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，-20℃保存。
(3)选取引物序列(测Bt基因)：
Bt-F：5’-GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’
Bt-R：5’-CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’
Bt-P：5’-(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-(Eclipse)-3’
(4)农作物及质粒DNA检测
取1-10ul(共1ug左右)提取的DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据其亮度和扩散程度判断DNA的质量。利用紫外分光光度法(NanoDrop ND-100)测定所提DNA的浓度与纯度。
(5)待测农作物PCR反应
提取上述样品1、2、3、4DNA，以样品1、2、3、4DNA为模板，在包括上述步骤(3)所述引物序列的荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增。
所述PCR反应体系终浓度组成为：
Premix Ex-Taq(2×) 12.5μL；
Forward primer(10μM) 0.2μM；
Reverse primer(10μM) 0.2μM；
Taqman probe(10μM) 0.2μM；
Template DNA 50ng/μL；
溶剂 ddH2O补足至25μL；
PCR反应条件为：(1)95℃，30s；(2)95℃，5s；60℃，30s，共40cycles。
(6)结果分析
取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测农作物是否含有相应外源基因。样品1、3未出现特异性条带，样品1、3为非转基因农作物；样品2、4出现特异性条带，为转Bt基因农作物。
(7)选取引物序列包括(测ACP基因)：
ACP-F-Primer：5’-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’
ACP-R-Primer：5’-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3’
ACP-Probe：5’-(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG(TAMRA)-3’
提取样品1、2、3、4DNA，以样品1、2、3、4DNA为模板，在包括上述引物序列的荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增。
所述PCR反应体系终浓度组成为：
Premix Ex-Taq(2×) 12.5μL；
Forward primer(10μM) 0.2μM；
Reverse primer(10μM) 0.2μM；
Taqman probe(10μM) 0.2μM；
Template DNA 50ng/μL；
溶剂 ddH2O补足25μL；
PCR反应条件为：(1)95℃，30s；(2)95℃，5s；59℃，30s；共40cycles；
取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测农作物是否含有相应ACP内源基因；检测棉花ACP内源基因时，样品1、2出现特异性条带，为棉花品种，样品3、4为非棉花品种。综合上述6、7结果，可知样品2为转Bt基因棉花品种。
(8)选取引物序列包括(测SPS基因)：
SPS-F：5′-TTGCGCCTGAACGGATAT-3′
SPS-R：5′-CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3′
SPS-p：5’-(FAM)-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-(TAMRA)-3’
提取样品1、2、3、4DNA，以样品1、2、3、4DNA为模板，在包括上述引物序列的荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增。
所述PCR反应体系终浓度组成为：
Premix Ex-Taq(2×) 12.5μL；
Forward primer(10μM) 0.2μM；
Reverse primer(10μM) 0.2μM；
Taqman probe(10μM) 0.2μM；
Template DNA 50ng/μL；
溶剂 ddH2O补足25μL；
PCR反应条件为：(1)95℃，30s；(2)95℃，5s；55℃，30s；共40cycles；
(9)选取引物序列包括(测35S基因)
35S-F：5’-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3’
35S-R：5’-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’
35S-P：5’-(FAM)-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-(TAMRA)-3’
提取样品1、2、3、4DNA，以样品1、2、3、4DNA为模板，在包括上述引物序列的荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增。
所述PCR反应体系终浓度组成为：
Premix Ex-Taq(2×) 12.5μL；
Forward primer(10μM) 0.2μM；
Reverse primer(10μM) 0.2μM；
Taqman probe(10μM) 0.2μM；
Template DNA 50ng/μL；
溶剂 ddH2O补足25μL；
PCR反应条件为：(1)95℃，30s；(2)95℃，5s；63℃，30s；共40cycles；
相同方法亦可以对NOS和NPT II荧光定量PCR引物进行PCR扩增。
取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测农作物是否含有相应SPS内源基因；检测水稻SPS内源基因时，样品3、4出现特异性条带，为水稻品种，样品1、2为非棉花品种。综合上述6、7、8结果，可知样品2为转Bt基因棉花品种，样品4为转Bt基因水稻品种；综合上述9结果，样品2和样品4为转基因产品。
实施例3：构建的880质粒标准分子在转Bt基因棉花、水稻转基因含量定量检测中的应用
本实施例选取二组不同品系样品，中棉30和浙江大学08-6棉花品种以及秀水11和克螟稻1号水稻品种，对这二组混合物进行拷贝数测定，混合物总重量均为1g；本实施例实验考察本发明构建的含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒分子在转Bt基因棉花、水稻中定量检测的结果。
定量检测实验过程包括如下几个步骤：
(1)农作物基因组DNA提取
本实施例中棉花品种和水稻品种，二者组成分别如表9。
表9：待检混合物组成
定量检测中待测农作物基因组DNA提取方法与定性检测方法中的相一致。
(2)质粒基因组DNA提取
定量检测中质粒基因组DNA提取方法与定性检测方法中的相一致。
(3)DNA检测
利用紫外分光光度法(NanoDrop ND-100)测定所提DNA的浓度与纯度。取1-10ul(共1ug左右)提取的DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据其亮度和扩散程度判断DNA的质量。
(4)荧光定量PCR检测Bt含量、ACP以及SPS以及待测农作物PCR反应，与定性检测所选取的反应条件相一致。
(5)荧光定量PCR结果
进行荧光定量PCR检测，外源基因与内源基因的拷贝数见表10、表11、表12。
表10：荧光定量PCR定量结果
I1-1＝(外源拷贝数/内源拷贝数)*K1-1*100(％)
＝100(Bt平均拷贝数/ACP平均拷贝数)*K1-1(％)
其中K1-1＝4.6-4.8，本实施例取4.70；
I2-1＝(外源拷贝数/内源拷贝数)/K2-1*100(％)
＝100(Bt平均拷贝数/SPS平均拷贝数)/K2-1(％)
其中K2-1＝3.5-3.7，本实施例取3.60；
从表10可以看出，I1-1、I2-1与重量百分比的相对误差均小于5％，结果符合预期。
表11：荧光定量PCR定量结果
I1-2＝(外源拷贝数/内源拷贝数)*K1-2*100(％)
＝100(35s平均拷贝数/ACP平均拷贝数)*K1-2(％)
其中K1-2＝1.3-1.5，本实施例取1.36；
I2-2＝(外源拷贝数/内源拷贝数)/K2-2*100(％)
＝100(35s平均拷贝数/SPS平均拷贝数)/K2-2*(％)
其中K2-2＝16.6-16.8，本实施例取16.67；
从表11可以看出，除转基因含量0.5％外，其余各组I1-2、I2-2与重量百分比的相对误差均小于5％，结果符合预期。
表12：荧光定量PCR定量结果
I1-3＝(外源拷贝数/内源拷贝数)*K1-3*100(％)
＝100(NPTII平均拷贝数/ACP平均拷贝数)*K1-3(％)
其中K1-3＝8.6-8.8，本发明取8.74；
I2-3＝(外源拷贝数/内源拷贝数)/K2-3*100(％)
＝(NPTII平均拷贝数/SPS平均拷贝数)/K2-3*100(％)
其中K2-3＝3.4-3.6，本发明取3.50；
从表12可以看出，I1-3、I2-3与重量百分比的相对误差均小于5％，结果符合预期。
若对未知浓度样品进行定量检测，需采用实施例3中的方法，先做标准曲线，而后通过检测其未知浓度下的拷贝数，得出待测未知样品浓度。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国计量学院
<120> 含多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒及其应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt 60
tccaaccacg tctt 74
<210> 2
<211> 174
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
cgccttgacc acagctatcc cattgttcgc agtccagaac taccaagttc ctctcttgtc 60
cgtgtacgtt caagcagcta atcttcacct cagcgtgctt cgagacgtta gcgtgtttgg 120
gcaaaggtgg ggattcgatg ctgcaaccat caatagccgt tacaacgacc ttac 174
<210> 3
<211> 81
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
ttgcgcctga acggatatct ttcagtttgt aaccaccgga tgacgcacgg acggctcgga 60
tcatcccgaa aagatcaacc g 81
<210> 4
<211> 116
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
caagagaatc agctccaaga tcaagaaatg ttgattcacc ggtgattggt ttgtcattgt 60
ctaaagctaa ttgtctcttt actacttcac ataccttatc cacggtctct tgtttg 116
<210> 5
<211> 180
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 60
tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 120
cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 180
<210> 6
<211> 183
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 60
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 120
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 180
cct 183
<210> 7
<211> 86
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
aagcttcgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 60
agacgttcca accacgtctt aagctt 86
<210> 8
<211> 186
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
ggtacccgcc ttgaccacag ctatcccatt gttcgcagtc cagaactacc aagttcctct 60
cttgtccgtg tacgttcaag cagctaatct tcacctcagc gtgcttcgag acgttagcgt 120
gtttgggcaa aggtggggat tcgatgctgc aaccatcaat agccgttaca acgaccttac 180
ggtacc 186
<210> 9
<211> 93
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
tctagattgc gcctgaacgg atatctttca gtttgtaacc accggatgac gcacggacgg 60
ctcggatcat cccgaaaaga tcaaccgtct aga 93
<210> 10
<211> 128
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 10
ctcgagcaag agaatcagct ccaagatcaa gaaatgttga ttcaccggtg attggtttgt 60
cattgtctaa agctaattgt ctctttacta cttcacatac cttatccacg gtctcttgtt 120
tgctcgag 128
<210> 11
<211> 192
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 11
ggatccgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt 60
taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat 120
tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta 180
ggataaggat cc 192
<210> 12
<211> 195
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 12
agatctgcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca atatcacggg 60
tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc 120
cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca tgggtcacga 180
cgagatccta gatct 195
Claims (7)
1.含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示核苷酸片段添加酶切位点后，插入克隆载体制得。
2.如权利要求1所述的标准质粒，其特征在于所述克隆载体为pEASY-T3。
3.如权利要求1所述的标准质粒，其特征在于所述标准质粒由SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示核苷酸片段依次连接后，插入pEASY-T3载体制得。
4.如权利要求1～3之一所述的标准质粒在定量检测转基因农作物中转基因含量中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述农作物为下列之一：水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述标准质粒用于检测下列之一的Bt外源基因：(1)CryIA(a)，(2)CryIA(b)，(3)CryIA(c)，(4)CryIab/ac。
7.一种含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒含有荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒，其特征在于：所述特异性引物和探针序列如下：
35S-F：5’-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3’
35S-R：5’-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’
35S-P：5’-(FAM)-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-(TAMRA)-3’
NOS-F：5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’
NOS-R：5’-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’
NOS-P：5’-(FAM)-GCATGACGTTATTTATGAGATGGGT-(TAMRA)-3’
NPT II-F：5’-GCACGAGGAAGCGGTCA-3’
NPT II-R：5’-AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3’
NPT II-P：5’-(FAM)-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-(TAMRA)-3’
ACP-F：5’-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’
ACP-R：5’-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3’
ACP-P：5’-(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-(TAMRA)-3’
Bt-F：5’-GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’
Bt-R：5’-CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’
Bt-P：5’-(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-(Eclipse)-3’
SPS-F：5′-TTGCGCCTGAACGGATAT-3′
SPS-R：5′-CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3′
SPS-p：5’-(FAM)-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-(TAMRA)-3’
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA、Eclipse为荧光淬灭基团；
所述含有多种转座因子的抗虫水稻、棉花标准质粒由SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示核苷酸片段依次连接后，插入pEASY-T3载体制得。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20120718 Assignee: Hangzhou DNA Sci-Tech Co.,Ltd. Assignor: China Jiliang University Contract record no.: 2014330000017 Denomination of invention: Standard plasmid containing various transposable elements for insect-resistant rice and cotton and application of standard plasmid Granted publication date: 20131113 License type: Common License Record date: 20140221 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131113 Termination date: 20220112 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |