KR100838105B1 - 유전자변형 벼의 정성 및 정량분석 방법 - Google Patents

유전자변형 벼의 정성 및 정량분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자변형 벼의 정성 및 정량분석 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 유전자변형농산물에 대한 검정방법으로 벼 염색체 DNA로부터 핵산중합효소연쇄반응(PCR) 방법에 의해 벼 내재유전자와 외래도입유전자를 특이적으로 검출함으로써 유전자변형 벼를 검사할 수 있는 방법으로 내재유전자 및 목적유전자 전체 또는 일부와 다른 발현조절부위의 DNA 영역의 전부 또는 일부를 포함한 영역을 증폭하도록 하는 프라이머 세트를 사용함으로써 다양한 계통의 재조합유전자를 판별하여 검출할 수 있음을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 본 발명의 유전자변형 벼 검정용 PCR 프라이머, 프로브, 표준플라스미드는 GMO 검사키트로 상업화할 수 있으며, 유통 중인 유전자변형 벼의 정성 및 정량분석뿐만이 아니라 동형접합계통(homozygote line) 벼의 선별에 이용될 수 있다.
유전자변형 벼, PCR, 실시간 PCR, 특이 프라이머, 프로브, GMO 검정, 동형접합체(homozygote), 내재유전자, 도입유전자

Description

유전자변형 벼의 정성 및 정량분석 방법{Qualitative and quantitative detection for GM rice products}
도 1은 유전자변형 벼에 도입된 GFP 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,
도 2는 유전자변형 벼 및 천연형 벼에 대한 프라이머의 특이성을 확인한 전기영동사진이고,
도 3은 CytC-F1265 프라이머(서열번호1) 및 CytC-R1345 프라이머(서열번호2)로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 4는 CytC-F1265 프라이머(서열번호1) 및 CytC-R1345 프라이머(서열번호2)로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,
도 5는 GFP-F203 프라이머(서열번호4) 및 GFP-R303 프라이머(서열번호5)로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 6은 GFP-F203 프라이머(서열번호4) 및 GFP-R303 프라이머(서열번호5)로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,
도 7은 CytC-F1265 프라이머(서열번호1) 및 CytC-R1345 프라이머(서열번호2)로 증폭된 산물과 GFP-F203 프라이머(서열번호4) 및 GFP-R303 프라이머(서열번호5) 로 증폭된 산물 및 P35S 1-5' 프라이머(서열번호7) 및 P35S 1-3' 프라이머(서열번호8)로 증폭된 산물을 삽입하여 벼의 정량분석 및 동형접합계통 선별용 표준 플라스미드 pOS2을 제작하는 과정을 모식화한 것이고,
도 8는 CytC-F1265 프라이머(서열번호1) 및 CytC-R1345 프라이머(서열번호2)로 증폭된 산물과 P35S 1-5' 프라이머(서열번호7) 및 P35S 1-3' 프라이머(서열번호8)로 증폭된 산물 및 GFP-F203 프라이머(서열번호4) 및 GFP-R303 프라이머(서열번호5)로 증폭된 산물을 삽입한 벼 정량분석 및 동형접합계통 선별용 플라스미드 pOS2(도8A)에 삽입한 DNA 단편의 염기서열(도8B), 상기 6종의 프라이머 및 CytC-1292 프로브(서열번호3), GFP-232 프로브(서열번호6)와 P35S-Taq 프로브(서열번호9)를 나타낸 것이고,
도 9는 pOS2 표준플라스미드의 실시간 PCR에 의한 벼 정량분석 및 동형접합체 검정용 정량곡선을 나타낸 것이다.
본 발명은 유전자변형 벼의 정성 및 정량분석 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 유전자변형 벼에 포함된 재조합유전자의 검정방법 및 동형접합체 선별방법 및 이 방법에 사용되는 DNA에 관한 것으로 벼의 내재유전자와 도입유전자를 검출할 수 있는 PCR 프라이머 및 이들의 혼입율 및 동형접합체 분석을 위한 프라이머와 프로브, 표준플라스미드에 관한 것이다.
유전자변형식물(Genetically Modified Organism : GMO)이란 통상적으로 유전공학기술로 기존의 번식방법으로는 나타날 수 없는 형질이나 유전자를 지니도록 개발된 식물을 통칭한다. 유전자변형식물 중 농작물의 유전자 변형은 주로 생산량을 증가시키는 형질, 병충해에 저항적인 형질, 고농도의 농약에 저항적인 형질, 긴 유통기간에도 쉽게 상하지 않는 형질 등으로 이미 상용화되었거나 준비 중에 있다.
유전자변형식물의 상업화는 1994년 미국 칼젠(Calgene)사가 잘 물러지지 않는 토마토를 개발한 이후 빠르게 진행되었으며, 1996년 몬산톤사의 대두와 노바티스사의 옥수수가 본격적으로 상품화되었다. 초기 유전자변형식물 재배는 유전자변형식물을 개발한 회사가 일반종자 보다 비싸게 판매함에도 불구하고 농민의 입장에서는 농약과 비료의 비용이 크게 줄고 병충해가 감소해 그 사용이 급격하게 증가하였다. 1994년부터 1998년까지 FDA의 검증을 마치고 시판이 허용된 유전자재조합식물은 옥수수, 토마토, 감자, 대두 등을 중심으로 80여종에 이른다.
현재 식물 또는 식품의 유전자변형여부를 확인하기 위한 방법은 유전자변형식물의 DNA를 검출하는 방법과 단백질을 검출하는 방법 두 가지이다.
(1) 단백질 검출에 의한 검정 기술
EPSPS 유전자가 도입된 콩 및 CryIA(b), Cry9C, PAT, EPSPS, cry1Fa2 유전자가 도입된 옥수수에 대하여 EPSPS 또는 CryIA(b), Cry9C, PAT, cry1Fa2 단백질을 항체로 이용하여 검출하는 스트립(strip) 키트가 이미 상품화되어 있고, 효소면역학적 방법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)에 의한 EPSPS과 CryIA(b) 유전자 단백질 정량용 분석 키트도 최근 상품화되었다. 그러나 단백질의 발현양은 유전자변형농산물에 따라 다르며, 개발회사에서 사용한 유전자 발현 조절부위(프로모터)에 따라 종자에서 발현되지 않는 경우도 있으며, 보관상태 또는 가공식품의 경우에 가공과정에서 분해되는 경우도 있어 검정에 한계가 있다.
(2) DNA 검출에 의한 검정기술
핵산중합효소 연쇄 반응법(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 검정기술이다. 현재 유전자변형 농산물 및 가공식품의 검정시 국내외적으로 표시대상 품목인 콩, 옥수수, 감자 및 그 가공식품에 대하여 계통 특이적 PCR 프라이머 및 프로브 등이 개발되어 유전자변형 여부 및 혼입율을 확인할 수 있다. 또한 현재 상품화되고 있는 PCR 검정키트(kit)도 역시 콩, 옥수수, 감자 등을 대상으로 각각에 대한 내재유전자 및 도입유전자를 검출할 수 있는 특이 프라이머를 이용한 것이다. 그러나 콩, 옥수수, 감자이외에도 국외에서 안전성이 승인되어 재배 및 유통되고 있는 농산물이 증가하고 있는 실정으로 국내로 유입되어 문제시되기도 하였다. 따라서 콩, 옥수수, 감자이외의 유전자 변형 농산물 및 가공식품의 검정이 시급한 상황이다.
2001년 3월부터 시행된 유전자변형농산물 표시제의 표시대상 품목은 콩, 옥수수, 콩나물, 감자이다. 또한 2002년 9월부터 바이오안전성의정서가 국제적으로 발효됨에 따라 국내 수입,유통되고 있는 유전자변형 농산물에 대하여 유전자변형농산물의 안전성이 승인된 품목과 미승인 품목에 대한 판별이 요구된다. 최근 국내에서 농산물 및 식품으로서 안전성이 미승인된 유전자변형 옥수수 및 유전자변형 벼가 유통되어 문제시됨에 따라 국내 안전성 미승인 품목에 대한 판별이 시급한 실정이다.
유전자변형 벼로부터 재조합유전자를 검출하는 방법으로 핵산합성효소연쇄 반응(PCR)에 의하여 재조합유전자를 증폭하고 이를 검출하는 방법이 알려져 있다. 그러나 이들 방법은 기존 안전성이 승인되어 유통 중인 유전자변형옥수수와 콩에 대하여만 검출 가능한 것(HIDEO KURIBARA, YOICHIRO SHINDO, TAKESHIMATSUOKA, KENTAKUBO, SATOSHI FUTO, NOBUTARO AOKI, TAKASHIHIRAO, HIROSHI AKIYAMA, YUKIHIRO GODA, MASATAKE TOYODA and AKIHIRO HINO (2002) JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL 85(5): 1077~1089)으로 최근 안전성이 추가적으로 승인되어 유통 가능한 유전자변형 벼 및 안전성이 승인되어 있지 않은 채 국내 유입이 되어 문제시되었던 유전자 변형 벼에 대한 검출은 불가능하다. 따라서 본 발명에서는 유전자변형 벼를 특이적으로 검출하는 방법으로 정성 및 정량적으로 판별할 수 있으며 동시에 유전자변형 벼를 개발 육종시 후대 동형접합체(homozygote line)를 선별 기준으로 사용할 수 있는 PCR 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드와 그 방법을 제공한다. 본 발명은 유전자변형 벼를 특이적으로 검정할 수 있는 벼의 내재유전자와 도입유전자 특이 PCR 프라이머 2조, 즉 4종과 상기의 유전자변형 벼의 혼입율, 즉 정량적인 분석을 위한 프로브 2종을 포함하며, 벼 정량분석 및 동형접합계통 선별용 표준플라스미드 1종을 포함한다. 이들 7종의 프라이머 및 프로브는 벼의 내재유전 자에 특이적인 cytochrome C 유전자 및 GFP 유전자, 발현조절부위의 유전정보와 운반체의 구조를 파악하여 운반체에 도입된 도입유전자에 대하여 특이적으로 설계하였으며 정성적인 판별과 정량적인 분석 및 동형접합체에 대한 판별이 가능하다. 본 발명에서는 GFP 유전자를 도입한 벼로부터 genomic DNA를 분리하여 이를 주형으로 하여 PCR한 결과, 각각에 대하여 프라이머의 특이성을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 유전자변형 벼를 검정할 수 있는 PCR 프라이머와 정량용 프라이머/프로브 및 표준플라스미드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 유전자변형 벼를 검정할 수 있는 서열번호 1의 PCR 프라이머 CytC-F1265을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자변형 벼를 검정할 수 있는 서열번호 2의 PCR 프라이머 CytC-R1345을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 PCR 프라이머 CytC-F1265와 서열번호 2의 PCR 프라이머 CytC-R1345 세트를 동시 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PCR 프라이머 CytC-F1265(서열번호1)와 PCR 프라이머 CytC-R1345(서열번호2)으로 유전자변형 벼를 정성 및 정량적으로 검정할 수 있는 프로브 CytC-1292(서열번호 3)을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자변형체를 검정할 수 있는 서열번호 4의 PCR 프라이머 GFP-F203(서열번호4)을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자변형체를 검정할 수 있는 서열번호 5의 PCR 프라이머 GFP-R303(서열번호5)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 4의 PCR 프라이머 GFP-F203와 서열번호 5의 PCR 프라이머 GFP-R303 세트를 동시 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PCR 프라이머 GFP-F203(서열번호4)과 PCR 프라이머 GFP-F303(서열번호5)으로 유전자변형체를 정성 및 정량적으로 검정할 수 있는 프로브 GFP-232(서열번호 6)을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 2종의 PCR 프라이머 세트 전부(서열번호1,2,4,5)를 동시 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 벼의 내재유전자인 CytC, 도입유전자인 GFP와 컬리플라워모자이크 바이러스 CaMV35S 프로모터 부위에 대한 각각의 PCR 산물을 연결하여 pCRII(Invitrogen K4600) 벡터에 삽입하여 제작한 유전자변형 벼의 정성 및 정량 검정과 동형접합체 선별에 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pOS2를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PCR 프라이머 세트 CytC-F1265(서열번호1)과 CytC-R1345(서열번호2) 및 프로브 CytC-1292(서열번호3)와 플라스미드 pOS2를 동시에 사용하여 유전자변형체의 정성 및 정량 검정과 동형접합체를 선별하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 제공하는 것이다.
삭제
본 발명의 또 다른 목적은 PCR 프라이머 세트 GFP-F203(서열번호4)과 GFP-R303(서열번호5) 및 프로브 GFP-232(서열번호6)와 플라스미드 pOS2를 동시에 사용하여 유전자변형체의 정성 및 정량 검정과 동형접합체를 선별하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GFP-F203(서열번호4)과 GFP-R303(서열번호5)를 사용하는 유전자변형체 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자변형체로서 벼임을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 제공하는 것이다.
삭제
본 발명은 유전자변형 벼의 정성 및 정량분석 방법에 관한 것이다.
본 발명은 유전자변형 벼를 검정할 수 있는 서열번호 1의 PCR 프라이머 CytC-F1265을포함한다.
본 발명은 유전자변형 벼를 검정할 수 있는 서열번호 2의 PCR 프라이머 CytC-R1345을 포함한다.
본 발명은 서열번호 1의 PCR 프라이머 CytC-F1265와 서열번호 2의 PCR 프라이머 CytC-R1345 세트를 동시 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 포함한다.
본 발명은 PCR 프라이머 CytC-F1265(서열번호1)와 PCR 프라이머 CytC-R1345(서열번호2)으로 유전자변형 벼를 정성 및 정량적으로 검정할 수 있는 프로브 CytC-1292(서열번호 3)을 포함한다.
본 발명은 유전자변형체를 검정할 수 있는 서열번호 4의 PCR 프라이머 GFP-F203(서열번호4)을 포함한다.
본 발명은 유전자변형체를 검정할 수 있는 서열번호 5의 PCR 프라이머 GFP-R303(서열번호5)를 포함한다.
본 발명은 서열번호 4의 PCR 프라이머 GFP-F203와 서열번호 5의 PCR 프라이머 GFP- R303 세트를 동시 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 포함한다.
본 발명은 PCR 프라이머 GFP-F203(서열번호4)과 PCR 프라이머 GFP-F303(서열번호5)으로 유전자변형체를 정성 및 정량적으로 검정할 수 있는 프로브 GFP-232(서열번호 6)을 포함한다.
본 발명은 상기 2종의 PCR 프라이머 세트 전부(서열번호1,2,4,5)를 동시 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 포함한다.
본 발명은 벼의 내재유전자인 CytC, 도입유전자인 GFP와 컬리플라워모자이크 바이러스 CaMV35S 프로모터 부위에 대한 각각의 PCR 산물을 연결하여 pCRII(Invitrogen K4600) 벡터에 삽입하여 제작한 유전자변형 벼의 정성 및 정량 검정과 동형접합체 선별에 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pOS2를 포함한다.
본 발명은 PCR 프라이머 세트 CytC-F1265(서열번호1)과 CytC-R1345(서열번호2) 및 프로브 CytC-1292(서열번호3)와 플라스미드 pOS2를 동시에 사용하여 유전자변형체의 정성 및 정량 검정과 동형접합체를 선별하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 포함한다.
삭제
본 발명은 PCR 프라이머 세트 GFP-F203(서열번호4)과 GFP-R303(서열번호5) 및 프로브 GFP-232(서열번호6)와 플라스미드 pOS2를 동시에 사용하여 유전자변형체의 정성 및 정량 검정과 동형접합체를 선별하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 포함한다.
본 발명은 GFP-F203(서열번호4)과 GFP-R303(서열번호5)를 사용하는 유전자변형체 검출용 키트를 포함한다.
본 발명은 상기 유전자변형체로서 벼임을 특징으로 하는 PCR 검정방법을 포함한다.
삭제
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 유전자변형 벼를 검정하기 위한 벼의 내재유전자와 도입유전자를 검출할 수 있는 PCR 프라이머 및 이들의 혼입율 및 동형접합체 분석을 위한 프라이머와 프로브, 표준플라스미드에 관한 것이다.
싸이토크롬 씨(cytochrome C) 유전자는 모든 작물에 존재하나 본 발명에서는 벼 유래의 cytochrome C 단백질 유전자인 OsCc-1(Kemmerer EC, Lei M, Wu R (1991a) Mol Biol Evol 8:212-226)만을 특이적으로 검출함으로써 유전자 변형 벼를 정성 및 정량적으로 검정하고 또한 동형접합체를 선별할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검정방법을 제공한다.
본 발명은 유전자변형 벼를 정성 및 정량적으로 검정할 수 있고 또한 동형접합체를 선별할 수 있는 프라이머와 프로브를 제공한다. 서열번호 1의 CytC-F1265 프라이머와 서열번호 2의 CytC-R1345 프라이머 및 서열번호 3의 CytC-1292 프로브이다. 서 열번호 1의 CytC-F1265 프라이머와 서열번호 2의 CytC-R1345 프라이머 및 서열번호 3의 CytC-1292 프로브는 벼의 염색체에 단일유전자로 내재하는 cytochrome C 유전자를 특이적으로 인지한다.
또한 본 발명은 유전자변형체 개발시 마커 또는 리포터 유전자로 많이 사용하고 있는 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)인 GFP 유전자를 정성 및 정량적으로 검정할 수 있는 프라이머와 프로브를 제공한다. 서열번호 4의 GFP-F203 프라이머와 서열번호 5의 GFP-R303 프라이머 및 서열번호 6의 GFP-232 프로브이다. 상기 서열번호 4의 GFP-F203 프라이머와 서열번호 5의 GFP-R303 프라이머 및 서열번호 6의 GFP-232 프로브는 GFP 유전자를 특이적으로 인지한다.
또한 본 발명은 유전자변형 벼를 정량적으로 검정할 수 있고 또한 유전자변형 벼의 동형접합체를 선별할 수 있는 정량분석용 표준플라스미드 pOS2를 제공한다. 상기의 pOS2 플라스미드는 CytC-F1265 프라이머(서열번호1)와 CytC-R1345 프라이머(서열번호2)에 의해 증폭된 PCR 산물과 GFP-F203 프라이머(서열번호4)와 GFP-R303 프라이머(서열번호5)에 의해 증폭된 PCR 산물을 연결하여 삽입한 플라스미드이다. 이 플라스미드를 단계별로 희석한 카피수를 주형으로 하여 CytC-F1265 프라이머(서열번호1)와 CytC-R1345 프라이머(서열번호2) 및 CytC-1292 프로브(서열번호3), GFP-F203 프라이머(서열번호4)와 GFP-R303 프라이머(서열번호5) 및 GFP-232 프로브(서열번호6)를 이용한 실시간(realtime) PCR 분석으로 정량용 표준곡선을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 유전자변형 벼 검정용 PCR 프라이머를 이용한 유전자변형벼 검정방법을 제공한다. 본 발명의 유전자변형 벼 검정방법은 통상의 PCR 방법으로 시료의 게놈 DNA에 대한 PCR 방법이다. 하기 표 1에 가장 바람직한 PCR 반응조건을 PCR 프라이머에 따라 나타내었다.
[표 1]
프라이머 반응조건
CytC-F1265 프라이머/ CytC-R1345 프라이머 95 ℃, 10분-> 95 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
CytC-F1265 프라이머/ CytC-R1345 프라이머 CytC-1292 프로브 50℃, 2분->95 ℃, 10분-> 95 ℃, 30초-> 59 ℃, 30초,40회
GFP-F203 프라이머/ GFP-R303프라이머 95 ℃,10분-> 95 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
GFP-F203 프라이머/ GFP-R303프라이머 GFP-232 프로브 50℃, 2분->95 ℃, 10분-> 95 ℃, 30초-> 59 ℃, 30초,40회
본 발명의 유전자변형식물 검정용 PCR 프라이머는 벼에 특이성을 가진다. 유전자변형 벼를 검출할 수 있고 유전자변형 벼를 포함하는 식품 검정에 사용할 수 있으며 GMO 검정키트로 활용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 벼 내재유전자 특이 프라이머 및 프로브 제작
벼의 내재유전자인 싸이토크롬 씨(cytochrome C, OsCc-1) 유전자에 대한 특이 프라이머로 서열번호 1의 CytC-F1265 프라이머(5'-TCTGTTTGGAAGGCAGTCAGG-3')와 서열번호 2의 CytC-R1345 프라이머(5‘-TCCTCCCAGATCACAGCCAT-3')를 제조하였다. 상기 CytC-F1265 프라이머(서열번호1)와 CytC-R1345(서열번호2)는 OsCc-1 유전자의 2번째 엑손(Exon)에 특이적으로 인지한다. CytC-F1265 프라이머(서열번호1)와 CytC-R1345 프라이머(서열번호2)는 GC 함량이 52.3%, 55%이며 Tm 차이가 0.5℃로 적정 어닐(anneal) 온도가 59℃이며 이들 프라이머를 이용한 CytC PCR 산물의 크기는 81 bp로 예상된다. 또한 정량적 분석 및 동형접합체 선별을 위하여 상기 2종과 더불어 1종의 프로브를 제작하였다.
[표 2]
프라이머 서열번호 및 서열
CytC-F1265 서열번호 1: 5'-TCTGTTTGGAAGGCAGTCAGG-3'
CytC-R1345 서열번호 2: 5'-TCCTCCCAGATCACAGCCAT-3'
CytC-1292 서열번호 3: 5' FAM-CCCTGGTTATTCCTACTCTACGGCCAACAA-TAMRA 3'
[실시예 2] GFP 유전자 특이 프라이머 제작
GFP 유전자는 해파리 유래의 녹색형광단백질 유전자로 유전자변형체 제작시 마커 유전자나 리포터 유전자로 많이 사용하고 있으며 본 발명에서는 유전자 변형 벼의 검정 및 동형접합체 선별을 위한 재료로 GFP를 도입한 유전자변형 벼를 육성하였고 도 1에 GFP 유전자와 및 그 발현조절부위를 나타내었다. GFP 유전자는 벼 글로부린 프로모터와 PinII 3' 터미네이터가 발현조절인자로 연결되어있고, 제초제저항성 유전자인BAR 유전자는 CaMV 프로모터와 T35S 터미네이터가 연결되어있는 형태를 나타낸 것이다.
따라서, GFP 유전자 변형 벼를 검정하기 위하여 2개의 프라이머와 1개의 프로브를 제작하였다.
[표 3]
프라이머 서열번호 및 서열
GFP-F203 서열번호 4: 5'-CTACGGCGTGCAGTGCTTC-3'
GFP-F303 서열번호 5: 5'-AGATGGTGCGCTCCTGGAC-3'
GFP-232 서열번호 6: 5'-FAM-CCGACCACATGAAGCAGCACGACTT-TAMRA-3'
GFP-F203 프라이머(서열번호4)와 GFP-R303 프라이머(서열번호5)는 GC 함량이 모두 63.1%이며 Tm 차이가 0 ℃로 적정 어닐온도가 59℃이며, 이들 프라이머를 이용한 GFP의 PCR 산물의 크기는 101 bp로 예상된다. GFP-232 프로브(서열번호6)의 GC 함량이 63%이며 Tm은 59℃이다.
[실시예 3] 정량분석용 표준플라스미드 제작
유전자 변형 벼에 도입된 유전자 카피수를 이용한 정량 분석을 위하여 벼의 내재유전자인 CytC와 도입유전자인 GFP에 대한 PCR 산물 및 조절부위 유전자로 컬리플라워모자이크 바이러스 CaMV35S 프로모터 부위에 대한 PCR 산물을 연결하여 pCRII(Invitrogen K4600) 벡터에 삽입한 표준플라스미드 pOS2를 제작하였다. 상기의 벼 내재유전자인 CytC 유전자에 대한 PCR 산물은 CytC-F1265 프라이머(서열번호1)와 CytC-R1345 프라이머(서열번호2)를 이용하여 증폭한 것이고, 조절부위 유전자인 P35S에 대한 PCR산물은 이미 보고되어있는 컬리플라워모자이크 바이러스 CaMV35S 프로모터 부위를 특이적으로 선발함으로써 유전자변형농산물의 스크린에 많이 이용하고 있는 프라이머 세트인 P35S 1-5'(서열번호7)와 P35S 1-3'(서열번호8)(HIDEO KURIBARA, YOICHIRO SHINDO, TAKESHIMATSUOKA, KENTAKUBO, SATOSHI FUTO, NOBUTARO AOKI, TAKASHIHIRAO, HIROSHI AKIYAMA, YUKIHIRO GODA, MASATAKE TOYODA and AKIHIRO HINO (2002) JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL 85(5): 1077~1089)을 이용하여 증폭한 것이고, 도입유전자인 GFP 유전자에 대한 PCR 산물은 GFP-F203 프라이머(서열번호4)와 GFP-R303 프라이머(서열번호5)를 이용하여 증폭한 것이다(도 7).
표준플라스미드 pOS2의 구조 및 제작과정을 보다 상세히 기술한다.
각각 CytC-F1265(서열번호1)와 CytC-R1345 프라이머(서열번호2) 세트, P35S 1-5'(서열번호7)와 P35S 1-3' 프라이머(서열번호8) 세트 및 GFP-F203(서열번호4)와 GFP-R303 프라이머(서열번호5) 세트를 이용하여 증폭한 다음, 도7의 I과 같이 1) CytC-R1345(서열번호2)와 SmaI/SrfI 제한효소 인식부위를 매개로 하여 P35S1-5'(서열번호7)를 연결한 CytC-SrfI-P35S-3' linker(서열목록 10: 5'-TGGAGATATCACATCAATGCCCGGGCTCCTCCCAGATCACAGCC-3') 프라이머 세트, 2) CytC-SrfI-P35S-5' linker(서열목록 11: 5‘-GGCTGTGATCTGGGAGGAGCCCGGGCATTGATGTGATATCTCCA-3')와 P35S 1-3' 프라이머(서열번호8) 세트, 3) P35S-GFP-5' linker (서열목록12: 5'-TCATTTCATTTGGAGAGGCTACGGCGTGCAGTGCTT-3')와 GFP R303(서열번호5)도 프라이머 세트로 high fidelity PCR용 효소인 KOD plus DNA polymerase (TOYOBO KOD-201)를 이용하여 PCR 산물을 각각 얻었다(도7의 II). 또한 도7의 II에 해당하는 PCR 산물을 동일농도로 혼합하여 PCR 주형으로 하였고 CytC-F1265(서열번호1)와 P35S 1-3' 프라이머(서열번호8) 세트와 P35S 1-5'(서열번호7)와 GFP-R303 프라이머(서열번호5) 세트를 각각 일반 PCR 증폭효소를 이용하여 2번째의 PCR 증폭 결과, CytC-P35S 및 P35S-GFP가 융합된 PCR 산물이 얻었다(도7의 III). 상기 두 종류의 PCR 융합산물을 동일농도로 혼합하여 CytC-F1265(서열번호1)와 GFP R303 프라이머(서열번호5)를 이용하여 3번째 PCR을 수행한 결과 291개 염기로 구성된 CytC::P35S::GFP의 PCR 산물-융합물을 얻었다(도7의 IV~V).
얻어진 PCR 산물-융합물을 Invitrogen사에서 구입한 pCRII-TOPO (Invitrogen K4600) 벡터에 삽입하여 표준플라스미드 pOS2를 제작하였다. pCRII-TOPO 벡터는 일반적으로 PCR 산물에 A 염기가 연장되어 있으므로 PCR 산물을 바로 클로닝할 수 있도록 lacZ 부위가 절단된 부위에 T 염기가 1개 연장되어 있는 상태로 시판되고 있다. 제조사의 프로토콜에 따라 도7의 IV의 PCR산물-융합물 3ul를 Topoisomerase I을 이용하여 pCRII-TOPO에 삽입하여 플라스미드 벡터 pOS2를 제작하였다(도7의 VI, 도8A). 플라스미드 벡터 pOS2는 염기서열을 분석한 결과, 도 8B에 도시된 바와 같은 서열특성을 가진다. 즉, 1~21번 염기서열은 CytC-F1265 프라이머와 동일하였고, 61~114번 염기서열은 CytC 유전자와 P35S 유전자의 PCR 산물이 SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열(82~89번)로 연결되어 있음을 확인하였다. 또한 166~209번 염기서열은 P35S 유전자와 GFP 유전자의 PCR 산물이 바로 연결되어 있음을 확인하였다.
따라서 플라스미드 벡터 pOS2는 도8A과 같이 pCRII 벡터 유래로써 대장균내 복제를 위한 f1 origin과 대장균 형질전환 선발을 위한 암피실린 및 카나마이신 내성유전 자가 포함된 3973bp, CytC와 P35S, GFP유전자의 PCR 융합물인 291bp가 포함된 전체 4264bp로 구성된 재조합 벡터이다. 또한 플라스미드 벡터 pOS2는 플라스미드 DNA의 높은 복제수(high copy number)로 대장균내에서 플라스미드 DNA를 다량으로 합성할 수 있으며 CytC와 P35S 유전자 사이에는 Sma I/Srf I 제한효소 인식부위 도입으로 Sma I 또는 Srf I 제한효소 처리에 의해 4.26kb의 리니어(linear) 형태의 DNA를 얻을 수 있으며, 또는 희석에 의해 다양한 카피수의 DNA를 수득할 수 있으므로 실시간 PCR을 위한 표준플라스미드로 제공될 수 있다.
[실시예 4]
상기 실시예 1, 실시예 2에서 제작한 프라이머의 특이성을 유전자변형 벼에 대하여 확인하였다.
식물의 게놈 DNA 분리
GFP 유전자 변형 벼와 일반 벼의 게놈 DNA를 분리하였다. 벼 식물체 잎을 액체질소를 넣고 유발을 이용하여 미세하게 마쇄한 다음, 1g을 50 ml 튜브에 넣고 DNeasy plant maxi kit(Qiagen 68163)를 이용하여 분리 정제하였다. DNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량하였다.
PCR 분석
상기에서 수득한 유전자변형 벼 및 일반 벼의 게놈 DNA 20 ng를 주형으로 하 여 총 3세트의 프라이머(CytC-F1265(서열번호1)/R1345(서열번호2), P35S 1-5'(서열번호7)/1-3'(서열번호8), GFP-F203(서열번호4)/R303(서열번호5))로 PCR을 실시하였다. 또한 대조군으로 프라이머 미첨가군 및 타 유전자변형작물 게놈 첨가군으로 PCR을 실시하였다. 각 프라이머에 대한 PCR 조건은 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
프라이머 반응조건
CytC-F1265 프라이머/ CytC-R1345 프라이머 95 ℃, 10분-> 95 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
P35S 1-5' 프라이머/ P35S 1-3' 프라이머 95 ℃, 10분-> 95 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
GFP-F203 프라이머/ GFP-R303프라이머 95 ℃, 10분-> 95 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
PCR 산물은 EDTA를 포함한 3 % 아가로즈 젤로 전기영동으로 분석하였다.
도 2는 PCR 산물들에 대한 전기영동사진을 나타낸 것이다. A는 CytC-F1265 프라이머(서열번호1)/CytC-R1345 프라이머(서열번호2) 세트로 실시한 PCR 산물, B는 P35S 1-5' 프라이머(서열번호7)/ P35S 1-3' 프라이머(서열번호8)로 실시한 PCR 산물, C는 GFP-F203 프라이머(서열번호4)/GFP-R303 프라이머(서열번호5)로 실시한 PCR산물이다. 또한 레인1과 레인 8은 사이즈 마커이고, 레인2는 GFP 유전자 변형 벼 , 레인3는 일반 천연형 벼, 레인 4와 5는 벼와 같은 화분과 작물인 보리, 옥수수 DNA, 레인 6는 콩, 레인 7은 감자 DNA이다.
(1) CytC-F1265 프라이머(서열번호1)/CytC-R1345 프라이머(서열번호2)
PCR 결과 벼의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 81 bp로 확인되었다. 상기 도 2의 A 패널에 나타난 PCR 산물이 CytC임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.
도 3은 본 발명의 CytC-F1265 프라이머(서열번호1)/CytC-R1345 프라이머(서열번호2)에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 81개의 염기로 구성되었으며, 1부터 21번까지의 염기는 CytC-F1265 프라이머(서열번호1) 염기서열과 일치하였으며 61부터 81번까지의 염기는 CytC-R1345 프라이머(서열번호2)와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다.
또한 도 4에 나타난 바와 같이, 1부터 81개의 염기서열은 벼 CytC 염기서열(GeneBank accession No. M63704)과 완전히 일치하였다.
(2) GFP-F203 프라이머(서열번호4)/GFP-R303 프라이머(서열번호5)
PCR 결과 GFP 유전자변형 벼의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 101 bp로 확인되었다. 상기 도 3의 C 패널에 나타난 PCR 산물이 GFP 특이적임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.
도 5은 본 발명의 GFP-F203 프라이머(서열번호4)/GFP-R303 프라이머(서열번호5)에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 101개의 염기로 구성되었으며, 1부터 19번까지의 염기는 GFP-F203 프라이머(서열번호4) 염기서열과 일치하였으며 82부터 101번까지의 염기는 GFP-R303 프라이머(서열번호5)와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다.
또한 도 6에 나타난 바와 같이, 1부터 101번까지의 염기서열은 GFP 형광유전자(GeneBank accession No. AY237157.1)과 100%의 상동성을 보였다.
[실시예5]
상기 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3에서 제작한 프라이머와 프로브의 특이성및 표준플라스미드의 정량성을 유전자변형 벼에 대하여 확인하였다.
식물의 게놈 DNA 분리 및 표준플라스미드 조제
GFP 유전자 변형 벼와 일반 벼의 게놈 DNA를 분리하였다. 벼 식물체 잎을 액체질소를 넣고 유발을 이용하여 미세하게 마쇄한 다음, 1g을 50 ml 튜브에 넣고 DNeasy plant maxi kit(Qiagen 68163)를 이용하여 분리 정제하였다. DNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량하였다. 표준플라스미드는 대장균(E. coli DH5α)에 형질전환하여 정제한 후 10 ㎍을 SmaI 효소로 25℃에서 2시간 처리하여 절단한 후 1% 아가로스 전기영동하여 linear 형태로 절단된 플라스미드를 아가로스 겔로부터 회수하여 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량한 후 200, 1250, 10,000, 200,000, 2,500,000 copies/2.5㎕로 희석하여 표준검량선을 작성하는데 이용하였다.
실시간 PCR 분석
상기에서 수득한 2 계통의 게놈 DNA 20 ng와 각 5 단계별 카피수로 희석한 표준플라스미드 200, 1250, 10,000, 200,000, 2,500,000 copies/2.5㎕와 표준플라스미드를 첨가하지 않은 NTC(no template control)를 주형으로 하여 1) CytC- F1265(서열번호1)/CytC-R1345(서열번호2)와 GFP-F203(서열번호4)/GFP-R303 프라이머(서열번호5), 2) CytC-F1265(서열번호1)/CytC-R1345(서열번호2)와 P35S 1-5'(서열번호7)/P35S 1-3' 프라이머(서열번호8) 각 1.25 μM과 프로브(CytC-1292(서열번호3), GFP-232(서열번호6), P35S-Taq(서열번호9)) 각 0.1 μM을 첨가하여 실시간 PCR을 실시하였다. 각 프라이머/프로브에 대한 실시간 PCR 조건은 하기 표 5에 나타내었다.
[표 5]
프라이머/프로브 반응조건
CytC-F1265 프라이머/ CytC-R1345 프라이머 CytC-1292 프로브 50 ℃ 2분-> 95 ℃, 10분-> 95 ℃, 30초-> 59 ℃, 1분 40회
GFP-F203 프라이머/ GFP-R303 프라이머 GFP-232 프로브 50 ℃ 2분-> 95 ℃, 10분-> 95 ℃, 30초-> 59 ℃, 1분 40회
P35S 1-5' 프라이머/ P35S 1-3' 프라이머 P35S-Taq 프로브 50 ℃ 2분-> 95 ℃, 10분-> 95 ℃, 30초-> 59 ℃, 1분 40회
도 7, 8은 CytC-F1265 프라이머(서열번호1)와 CytC-R1345 프라이머(서열번호2), P35S 1-5'프라이머(서열번호7)와 P35S 1-3'(서열번호8), GFP-F203 프라이머(서열번호4)와 GFP-R303 프라이머(서열번호5)를 이용하여 증폭한 각각의 PCR 산물을 SmaI/SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열을 인위적으로 합성하여 연결하고 재증폭하여 pCRII 벡터(In Vitrogen 사)에 삽입한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로 PCR 산물은 291개의 염기로 구성되었으며, 1부터 21번까지의 염기는 CytC-F1265 프라이머(서열번호1) 염기서열과 일치하였으며 62부터 81번까지의 염기는 CytC-R1345 프라이머(서열번호2)와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다. 또한 37번부터 57번까지의 염기는 CytC-1292 프로브(서열번호3) 염기서열과 일치함이 확인되 었다. 또한 82부터 89번까지 SmaI/SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열이 있음을 확인하였다. 또한 90번부터 114번까지의 염기는 P35S 1-5' 프라이머(서열번호7) 염기서열과 일치하였으며, 166번부터 190번까지의 염기는 P35S 1-3' 프라이머(서열번호8)와 상보적인 염기서열과 일치하였고, 142번부터 158번까지의 염기는 P35S-Taq 프로브(서열번호9) 염기서열과 일치함이 확인되었다. 191번부터 209번까지의 염기는 GFP-F203 프라이머(서열번호4)와 염기서열이 일치하였으며, 273번부터 291번까지의 염기는 GFP-R303 프라이머(서열번호5)와 상보적인 염기서열과 일치하였고, 220번부터 244번까지의 염기는 P35S-Taq 프로브(서열번호9) 염기서열과 일치함이 확인되었다.
(1) 표준플라스미드를 이용한 정량성 확인
pOS2 플라스미드를 5 단계의 카피수로 희석한 DNA를 주형으로 CytC-F1265 프라이머(서열번호1)와 CytC-R1345 프라이머(서열번호2) 및 CytC-1292 프로브(서열번호3), GFP-F203 프라이머(서열번호4)와 GFP-R303 프라이머(서열번호5) 및 GFP-232 프로브(서열번호6)로 이용한 실시간 PCR을 수행한 결과, 상기의 pOS2 플라스미드 카피수에 의하여 증폭되는 실시간 PCR의 상관계수가 0.99이상으로 나타나(도 9) 정량분석용 표준플라스미드로 이용 가능함을 확인하였다.
[실시예6]
상기 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3에서 제작한 프라이머와 프로브의 특이성및 표준플라스미드의 정량성을 이용하여 유전자변형 벼의 후대 동형접합 계통 선별 가 능성을 확인하였다.
실시간 PCR 분석
상기에서 수득한 GFP 형질전환 계통의 T0, T1세대 벼, 천연형 벼 게놈 DNA 25 ng와 각 5 단계별 카피수로 희석한 pOS2 표준플라스미드 200, 1250, 10,000, 200,000, 2,500,000 copies/2.5㎕와 표준플라스미드를 첨가하지 않은 NTC(no template control)를 주형으로 하여 1) CytC-F1265(서열번호1)/CytC-R1345(서열번호2)와 GFP-F203(서열번호4)/GFP-R303 프라이머(서열번호5), 2) CytC-F1265(서열번호1)/CytC-R1345(서열번호2)와 P35S 1-5'(서열번호7)/P35S 1-3' 프라이머(서열번호8) 각 1.25 μM과 프로브(CytC-1292(서열번호3), GFP-232(서열번호6), P35S-Taq(서열번호9)) 각 0.1 μM을 첨가하여 표5와 같은 실시간 PCR을 실시하였다.
(1) 표준플라스미드를 이용한 동형접합체 선별법 확인
T0 세대에서 GFP 형질전환 벼내 도입된 GFP 유전자의 삽입수를 확인하기위하여 TO 세대에서 각 형질전환 벼로부터 분리한 DNA를 주형으로 하여 CytC-F1265 프라이머(서열번호1)와 CytC-R1345 프라이머(서열번호2) 및 CytC-1292 프로브(서열번호3) 세트, GFP-F203 프라이머(서열번호4)와 GFP-R303 프라이머(서열번호5) 및 GFP-232 프로브(서열번호6)로 이용한 실시간 PCR을 각각 3반복으로 수행하였다. 벼 내재유전자인 CytC는 염색체상에 단일유전자로 존재함이 이미 알려져 있으므로 CytC 증폭 카피수를 기준으로 하여 도입된 GFP 유전자의 카피수를 나누게 되면 GFP 유전자의 삽입 카피수를 확인할 수 있다. 다시 말해서 T0 세대 벼에서는 CytC 유전자는 염색체쌍에 1개씩 존재하므로 만일 GFP 유전자가 한쪽 염색체에 1개 도입되면 CytC:GFP=2:1이 되며 CytC 카피수를 기준으로 GFP 카피수를 나누면 0.5가 된다. GFP 형질전환 T0 세대 벼의 GFP 삽입수를 분석한 결과 표6에 제시한 바와 같이 10개체 중 6개체가 단일카피로 삽입되었음을 확인하였다.
[표 6]
형질전환 벼(T0) 증폭 카피수 GFP/Ccs GFP 삽입수
Ccs GFP
Pglb-GFP 25 33,094 15,621 0.47 단일
Pglb-GFP 27 33,536 17,128 0.51 단일
Pglb-GFP 28 27,304 15,214 0.56 단일
Pglb-GFP 29 27,693 13,807 0.50 단일
Pglb-GFP 30 29,908 15,375 0.51 단일
Pglb-GFP 31 33,250 30,941 0.93 2
Pglb-GFP 32 30,228 15,273 0.51 단일
Pglb-GFP 33 33,029 196,072 5.94 12
Pglb-GFP 34 35,669 241,139 6.76 13
Pglb-GFP 35 28,374 89,679 3.16 6
상기의 T0 GFP 유전자 형질전환 벼 중에서 단일 카피로 삽입된 Pglb-GFP 29 형질전환체의 종자를 발아시켜 T1 형질전환체를 육성하여 잎으로부터 DNA에 대하여 실시간 PCR에 의한 동형접합체 선별 가능성을 검토하였다. T0에서 단일카피로 삽입된 GFP 유전자는 T1세대가 되면 멘델의 유전법칙에 의하여 GFP 동형접합체: GFP 이형접합체: GFP 비삽입체= 1:2:1로 분리된다. 따라서 GFP T1세대에서 내재유전자인 CytC와 GFP 유전자 증폭카피수가 동형접합체의 경우는 1:1, 이형접합체의 경우는 1:0.5로 나타날 것이다. 도1에서 제시한 바와 같이 GFP 형질전환 운반체에는 바스타저항성 유전자를 마커 유전자로 이용되고 있으므로 0.6% 바스터 제초제 처리에 의하여 우선 Pglb-GFP 29 형질전환체의 종자를 발아 후 GFP 유전자가 유전되지 않은 계통은 제거하였고 GFP 동형접합체와 GFP 이형접합체 계통만 육성하여 DNA를 분 리한 다음, 상기의 표5 조건과 같이 실시간 PCR을 수행한 결과, 표7과 같이 7개체 중 2개체가 동형접합체로 선발되었다. 이는 pOS2 표준플라스미드를 이용한 실시간 PCR에 의해 내재유전자와 도입유전자의 카피수의 비에 의한 후대 동형접합체 선별이 가능함을 확인하였고 동시에 본 분석법에 의해 유전자변형 벼 개발 육성시 육종모본으로 선별해야 하는 동형접합체를 선별하는데 바로 적용하여 활용할 수 있음을 시사하고 있다.
[표 7]
형질전환 벼(T1) 증폭카피수 GFP/Ccs 동형/이형접합체
Ccs GFP
Pglb-GFP 29-3 55,137 23,125 0.42 이형접합체
Pglb-GFP 29-4 64,403 25,640 0.40 이형접합체
Pglb-GFP 29-5 48,795 41,309 0.85 동형접합체
Pglb-GFP 29-6 45,706 18,022 0.39 이형접합체
Pglb-GFP 29-8 42,036 17,720 0.42 이형접합체
Pglb-GFP 29-12 61,998 56,151 0.91 동형접합체
Pglb-GFP 29-13 59,607 27,978 0.47 이형접합체
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 유전자변형 벼 검정용 PCR 프라이머와 프로브 및 표준플라스미드는 각 유전자변형 벼를 특이적으로 검출할 수 있어, 현재 유통 중이거나 수입되는 농산물 및 식품 중의 유전자변형 벼를 정성 및 정량적으로 검정하는 GMO 판별에 이용할 수 있으며 GM 벼 개발시 육종모본 선발을 위한 동형접합체 선별에 활용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 유전자변형 벼를 검정할 수 있는 서열번호 1의 PCR 프라이머 CytC-F1265.
  2. 유전자변형 벼를 검정할 수 있는 서열번호 2의 PCR 프라이머 CytC-R1345.
  3. 제 1 과 2항의 PCR 프라이머 세트를 동시에 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법.
  4. PCR 프라이머 CytC-F1265(서열번호1)와 PCR 프라이머 CytC-R1345(서열번호2)으로 유전자변형 벼를 정성 및 정량적으로 검정할 수 있는 프로브 CytC-1292(서열번호 3).
  5. 유전자변형체를 검정할 수 있는 서열번호 4의 PCR 프라이머 GFP-F203(서열번호4).
  6. 유전자변형체를 검정할 수 있는 서열번호 5의 PCR 프라이머 GFP-R303(서열번호5).
  7. 제 5 과 6항의 PCR 프라이머 세트를 동시에 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법.
  8. PCR 프라이머 GFP-F203(서열번호4)과 PCR 프라이머 GFP-F303(서열번호5)으로 유전자변형체를 정성 및 정량적으로 검정할 수 있는 프로브 GFP-232(서열번호 6).
  9. 서열번호 1, 2, 4, 5의 프라이머인 CytC-F1265, CytC-R1345, GFP-F203, GFP-R303을 동시 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법.
  10. 벼의 내재유전자인 CytC, 도입유전자인 GFP와 컬리플라워모자이크 바이러스 CaMV35S 프로모터 부위에 대한 각각의 PCR 산물을 연결하여 pCRII(Invitrogen K4600) 벡터에 삽입하여 제작한 유전자변형 벼의 정성 및 정량 검정과 동형접합체 선별에 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pOS2.
  11. PCR 프라이머 세트 CytC-F1265(서열번호1)과 CytC-R1345(서열번호2) 및 프로브 CytC-1292(서열번호3)와 플라스미드 pOS2를 동시에 사용하여 유전자변형체의 정성 및 정량 검정과 동형접합체를 선별하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법.
  12. PCR 프라이머 세트 GFP-F203(서열번호4)과 GFP-R303(서열번호5) 및 프로브 GFP-232(서열번호6)와 플라스미드 pOS2를 동시에 사용하여 유전자변형체의 정성 및 정량 검정과 동형접합체를 선별하는 것을 특징으로 하는 PCR 검정방법.
  13. GFP-F203(서열번호4)과 GFP-R303(서열번호5)로 이루어지는 유전자변형체 검출용 키트.
  14. 제 11항 또는 제12항에 있어서, 유전자변형체는 벼임을 특징으로 하는 PCR 검정방법.
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