KR100624667B1 - 유전자 재조합체의 정량법 및 그것에 이용하는 표준 분자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PCR법을 이용한 유전자 재조합체의 검출 방법에 관한 것이다.
복수의 유전자 재조합체의 계통을 포함하는 집단 중의 유전자 재조합체 전체의 존재비, 및 각 계통의 집단 중의 개별적 존재비를 정확하게 정량할 수 있는 유전자 재조합체의 정량적 검지 방법이 제공된다.
본 발명은 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열 및 상기 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 분자를 표준 분자로 하여, 재조합체가 포함될 가능성이 있는 시료 중에 대하여 상기 특이적인 DNA 서열 및 내재성 DNA 서열에 대하여 각각 정량적 PCR을 실행하고, 그들의 분자수 존재비를 결정하는 것을 포함하는 방법이다.
유전자, 재조합체, 내재성 DNA 서열, 정량적 PCR, 프라이머, 표준 분자, 올리고뉴클레오티드
Description
본 발명은 PCR(polymerase chain reaction)법을 이용한 유전자 재조합체의 검출 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 PCR법을 이용한 유전자 재조합체 특이적 DNA 서열의 분자생물학적 검지 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 여러 가지 재조합 DNA 서열을 포함하는 여러 가지 유전자 재조합체 계통을 포함하는 집단에서의 각 유전자 재조합체 계통의 존재비를 검지하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그와 같은 유전자 재조합체의 분자생물학적 검지 방법에서 사용되는 표준 분자에 관한 것이다.
세계적으로 유전자 재조합 기술을 이용하여 개발된 유전자 재조합체의 실용화가 진행되고 있다. 이미 실용화되어 있는 유전자 재조합체로는 인터페론 생산균 등으로 대표되는 유전자 재조합 미생물, 해충 저항성 옥수수 등으로 대표되는 유전자 재조합 농작물이 알려져 있다. 예를 들면, 지금까지 개발된 유전자 재조합 농작물에서는 도입 유전자로서, Bacillus
thuringiensis 유래 CryIA(b) 단백질 코드 영역(이하 cryIA(b)라고 함) 등의 해충 저항성 유전자, 또는 포스피노트리신 아세틸 전이효소(PAT) 단백질 코드 영역(이하 pat라고 함) 등의 제초제 내성 유전자 등 이 사용되고 있다. 그리고, 이들 도입 유전자는 상기 농작물 중에서 발현될 수 있도록, 여러 가지 DNA 서열과 조합한 발현 유닛으로서 도입되어 있다.
여기서 사용가능한 DNA 서열로는 코올리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosic virus) 유래 35S 프로모터(이하 CaMV 35S 프로모터라고 함), 옥수수 유래 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 유전자(PEPC)의 프로모터, 옥수수의 칼슘의존 단백질 키나제(CDPK)의 프로모터 등의 프로모터, 옥수수의 알코올 디하이드로게나아제 1S 유전자의 6번째 인트론(intron)을 포함하는 영역(Adh1-S IVS6), 옥수수의 알코올 디하이드로게나아제 1S 유전자의 2번째 인트론을 포함하는 영역(Adh1-S IVS2), PEPC의 9번째 인트론(PEPC#9), 옥수수 열쇼크 단백질 70(hsp70)의 인트론부 등의 인트론, 및 아그로박테리움ㆍ투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래 노팔린 신타아제 터미네이터(이하 NOS 터미네이터라고 함), 코올리플라워 모자이크 바이러스 유래 35S 터미네이터 등의 터미네이터를 들 수 있다. 실제로 유통되고 있는 유전자 재조합 농작물로는 옥수수의 경우 Novartis사의 Bt11 계통의 후대(後代) 품종이나, Novartis사의 Event176 계통의 후대 품종, Monsanto사의 MON810 계통의 후대 품종, Monsanto사의 GA21 계통의 후대 품종, Aventis사의 T25 계통의 후대 품종 등을 들 수 있다. 또한 콩으로서는 Monsanto사의 Roundup Ready Soy 계통의 후대 품종 등을 들 수 있다. 이들에 도입된 재조합 DNA 서열의 구성은 도 1에 나타내는 바와 같다.
유전자 재조합체는 일반적으로 산업상 바람직한 형질을 원래의 생물에 부여 할 목적으로 개발되는 것이다. 그 주된 방법은 원래 그와 같은 형질을 가지는 다른 생물로부터, 상기 형질을 발현하는 유전자를 단리하여, 상기 유전자를 대상 생물에 발현가능한 형태로 도입하는 것이다. 따라서, 유전자 재조합체 유래의 DNA 중에는 이와 같이 도입된 재조합 DNA 서열이 포함되어 있다.
예를 들면 유전자 재조합 농작물은 앞서 설명한 해충 저항성 외에, 제초제 내성, 기타 농작물로서 바람직한 형질을 부여할 목적으로 개발되는 것이며, 해충 저항성이나 제초제 내성 등에 관계하는 유전자를 원래의 농작물 속에서 발현가능한 형태로 도입함으로써 생산된다. 따라서 유전자 재조합 농작물 유래의 DNA 중에는 이와 같이 도입된 재조합 DNA 서열이 포함되어 있다.
그러나, 이러한 농작물이 실제로 상품화될 때는 유전자 재조합 농작물의 후대 교배종인 것이 많다. 이에 따라, 도입한 재조합 DNA 서열이 그와 같은 상업농작물 중에 안정적으로 존재하는 것을 확인할 필요가 있다.
또, 유럽공동체(EU)에 의해 유전자 재조합체 및 그 가공식품의 표시에 관한 규칙(Regulation (EC) No. EC/258/97, Council Regulation (EC) No. 1139/98)이 정해지고, 일본국에서도 유전자 재조합 농작물 및 그 가공품의 표시에 관한 제도가 정해진 것을 계기로 해서, 식품 관련 업계 등에서는 식품 원료 농작물이나 식품 중의 재조합체의 유무와 함량에 관한 정보를 필요로 하고 있다.
이러한 점에서, 식품, 사료 및 이들 원료 농작물 중의 유전자 재조합체의 유무나 함량, 특히 원료 중의 존재비를 확인하는 기술이 요구되고 있다. 또, 복수 계통의 유전자 재조합체가 포함된다고 예상되는 경우에는 이들을 따로따로 검지하 고, 또한 그들의 존재비를 계통마다 명확히 할 수 있는 기술이 요망된다. 즉 유전자 재조합체를 각 계통별로 고감도이고 또한 정량적으로 검지하기 위한 실용적인 기술개발이 요망되고 있다.
유전자 재조합체를 검지하는 기술로서, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)법[Science Vol.230, 1350-1354(1985), Science Vol.239, 487-491(1988)]을 이용한 분자생물학적 기술이 유효하다고 하는 예는 다수 보고되어 있지만, 이들은 유전자 재조합체의 유무를 정성적으로 판별하는 것이며, 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비에 관한 정보를 제공하는 것이 아니다(예를 들면, Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol.203, 339-344(1996), Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., Vol.87, 307-367(1996), Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol.93, Jahrg., Heft 2, 35-38(1997), Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol.205, 442-445(1997), Zeitschrift fur Ernahrungwissenscaft Vol.36, 155-160(1997), BGVV Hefte 1, 115-117(1997), Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., Vol.88, 164-175(1997), Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., Vol.88, 515-524(1997), Food Additives and Contaminants, Vol.15, No.7, 767-774(1998), Lebensm. -Wiss. u. -Technol., Vol.31, 664-667(1998), Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol.206, 203-207(1998), Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol.206, 237-242(1998), Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol.207, 264-267(1998), BioSci. Biotecnol. Biochem. Vol.62, No.7, 1461-1464(1998), Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol.95, Jahrg., Heft 2, 44-48(1999), Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol.95, Jahrg., Heft 2, 48-51(1999), Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol.95, Jahrg., Heft 2, 52-56(1999), Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol.95, Jahrg., Heft 7, 275-278(1999), Journal of AOAC International Vol.82, No.4, 923-928(1999), GIT Labor-Fachzetschrift, 2/99, 156-160(1999), Bio Industry Vol.16, No.4, 17-21(1999), Eur. Food Res. Technol. Vol.209, 77-82(1999), Analytica Chimica Acta Vol.393, 177-179(1999), Food Control Vol.10, 339-349(1999), Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.47, No.12, 5038-5043(1999), Journal of Food Hygienic Society of Japan, Vol.41, No.2, 137-143(2000)를 참조).
시료 중의 유전자 재조합체의 존재비에 관한 정보를 제공할 수 있는 기존의 기술 보고도 콩, 옥수수로부터의 재조합 DNA 서열 단편의 정량적 검지 기술에 관한 보고로서 이미 몇 가지가 존재한다.
예를 들면, Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol.95, Jahrg., Heft 2, 57-59(1999)이나, Eur. Food. Res. Technol, Vol.209, 83-87(1999)에서, 경쟁적 PCR에 의한 재조합 콩의 정량적 검지 기술이 보고되어 있다. 그러나, 검지 대상은 유전자 재조합 콩 한 계통에만 한정되어 있다. 또한, 경쟁적 PCR을 이용하기 때문에, 상대적으로 정량 정밀도가 떨어지는 측면이 있고, 이에 더하여 내부 표준을 이용하지 않기 때문에, 시료로부터 추출한 DNA 용액의 순도나 수량이 정량 결과에 영향을 미칠 수 있다.
또, Z. Lebensm Unters Forsch A, Vol.207, No.3, 207-213(1998)에는 경쟁적 PCR에 의한 유전자 재조합 옥수수의 정량적 검지 기술이 보고되어 있지만, 상기와 같이 검지 대상은 유전자 재조합 옥수수 한 계통에만 한정되어 있다. 또한, 상기와 같이, 경쟁적 PCR을 이용하고 있는 점과, 내부 표준을 이용하고 있지 않은 점이 정량 결과의 신뢰성을 불충분하게 만든다.
Food Control Vol.10, 353-358(1999)에서는 경쟁적 PCR에 의한 유전자 재조합 옥수수와 유전자 재조합 콩의 정량적 검지 기술이 보고되어 있지만, 모두 한 계통만의 검지에 한정되어 있고, 또 상기와 같이 경쟁적 PCR을 이용하고 있는 점과, 내부 표준을 이용하고 있지 않은 점이 정량 결과의 신뢰성을 불충분하게 만든다.
경쟁적 PCR보다도 정량 정밀도가 우수한 DNA 서열의 정량 분석법으로는 형광 프로브 등을 이용한 정량적 PCR(실시간 PCR, 인라인 PCR 등으로도 불린다)가 알려져 있고, 이것을 이용한 재조합 DNA 서열의 정량적 검지 기술에 관한 보고도 이미 몇 가지가 존재한다.
예를 들면, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.47, No.12, 5261-5266(1999)에서, 형광 프로브를 이용한 정량적 PCR에 의한 재조합 콩, 옥수수의 정량이 가능하다고 보고되어 있다. 이 보고에서는 또한, 내부 표준법을 채용하고 있어 정량 결과의 신뢰성이 향상되어 있다. 그러나, 검지 대상은 유전자 재조합 콩에 대해 1계통, 유전자 재조합 옥수수에 대해 1계통에 한정되어 있다.
또, Food Control Vol.10, 385-389(1999)에서도, 형광 프로브를 이용한 정량적 PCR에 의한 유전자 재조합 콩의 정량적 검지 기술과, 경쟁적 PCR에 의한 유전자 재조합 콩의 정량적 검지 기술의 두 가지가 보고되어 있다. 이 보고에 있어서도, 내부 표준법을 채용하고 있어 정량 결과의 신뢰성이 향상되어 있다. 또, 전술한 보고와는 달리, 표준 분자로서 내부 표준용 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 DNA와 검지 대상 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 DNA를 사용하고 있지만, 이들이 별개로 공급되기 때문에, 플라스미드 DNA의 희석의 방법이나, 반응계에의 첨가량의 차이가 정량 결과에 영향을 미칠 가능성이 남아 있다. 또, 검지 대상은 유전자 재조합 콩 한 계통에 한정되어 있다. Chemie in Labor und Biotechnik. Vol.50, Jahrg., Heft 1, 6-8(1999)도 상기 보고와 동일하다.
또한, 현재 표준물질로서 유통되고 있는 유전자 재조합체가 옥수수에서 2계통, 콩에서 1계통에 불과하다는 사실 때문에, 많은 분석자가 상기 이외의 계통을 분석하는 것은 매우 곤란한 상황에 있다.
또, 재조합 DNA 서열로부터 생산되는 단백질을 Enzyme Linked Immuno Sorvent Assay(ELISA)법을 이용하여 측정함으로써, 유전자 재조합체의 함량을 정량하는 기술도 보고되어 있지만[Food Control Vol.10, 367-374(1999)], 이것도 특정한 1계통만을 정량적으로 검지하는 기술이다.
이상 나타낸 바와 같이, 이미 보고되어 있는 유전자 재조합체의 정량적 검지 기술은 극히 한정된 계통만을 정량적으로 검지하는 기술이거나, 정량 정밀도가 결여되어 있는 기술이다.
그러나 한편, 일반적으로 유통되는 농작물은 유통 단계에서 여러 가지 품종이 혼합된 상태이기 때문에, 이들 특정한 1계통만을 검지하는 기술을 이용하더라도, 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비를 정량적으로 논의하는 것은 매우 곤란하 다. 예를 들면, 일본 국내에서 유통되는 유전자 재조합 옥수수의 경우는 2000년 7월 현재, 7계통에 달하기 때문에, 시료 중의 특정한 1계통의 유전자 재조합 옥수수를 정량하는 것만으로는 분석이 불충분하다. 따라서, 정량 정밀도가 결여되어 있는 기술이 정량 분석법으로서 불충분한 것은 물론이지만, 특정한 1계통만을 정량적으로 검지하는 기술도 실용성이 결여되어 있는 것이라고 할 수 있다.
검지 대상이 되는 계통수를 제한하는 요인 중 하나로서, 분석용 표준 시료가 충분히 공급되어 있지 않은 것을 들 수 있다. 각각의 특정 계통의 유전자 재조합체만을 포함하고, 그 이외의 계통을 일체 포함하지 않은 순수한 표준 시료의 입수는 매우 곤란하며, 현재 일반 분석자에게 표준 시료로서 공급되는 유전자 재조합체는 옥수수의 경우 2계통, 콩의 경우 1계통에 불과하다. 실제로 앞서 언급한 선행하는 정량적 검지 기술에 관한 보고에서는 검지 대상이 모두 표준 시료를 입수할 수 있는 계통에 한정되어 있다(이것은 앞서 언급한 문헌, 예를 들면 Food Control Vol.10, 385-389(1999)에서도 지적되어 있다). 즉, 표준 시료의 입수가능성이 상기 검지 기술의 적용가능 범위를 한정하는 결과를 초래하고 있다.
나아가서, 각각의 유전자 재조합체의 계통에 도입된 재조합 DNA 서열은 계통간에 그 종류나 게놈당의 카피(copy)수가 다르기 때문에, 이러한 효과를 엄밀히 감안하지 않고 단순히 특정한 계통만이 시료 중에 함유되어 있다고 가정하여 분석을 한 경우, 실제의 유전자 재조합체의 존재비와는 동떨어진 분석 결과를 얻기 쉽다. 즉, 모든 유전자 재조합체의 계통이 분석용 표준 시료로서 제공되었다고 해도, 재조합 DNA 서열의 계통간의 다양성을 감안할 수 있는 수단을 고안하지 않는 한, 실 용적인 유전자 재조합체의 정량적 검지 기술이라고 간주할 수는 없다.
이상 언급한 바와 같이, 유전자 재조합체를 고감도이고 또한 정량적인 실용적 검지 기술의 개발이 요망되고, 활발히 기술개발이 시도되고 있지만, 시료의 일반적 유통 형태나 표준 시료의 입수 가능성 및 재조합 DNA 서열의 계통간의 다양성이 재조합 DNA 서열 및/또는 유전자 재조합체의 분자생물학적 검지 기술의 개발 및 보급을 어렵게 하고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 복수의 유전자 재조합체 계통의 재조합 DNA 서열 계통간의 다양성을 엄밀히 감안하면서, 복수의 유전자 재조합체 계통을 포함하는 집단 중의 유전자 재조합체 전체의 존재비를 정확하게 정량할 수 있는, 유전자 재조합체의 분자생물학적인 정량적 검지 방법을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명의 목적은 복수의 유전자 재조합체 계통의 재조합 DNA 서열의 계통간의 다양성을 엄밀히 감안하면서, 복수의 유전자 재조합체의 계통을 포함하는 집단 내 각 계통의 집단 중의 개별적 존재비를 정확하게 정량할 수 있는, 유전자 재조합체의 분자생물학적 정량적 검지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 정량적 검지 방법에 사용할 수 있는, 복수의 유전자 재조합체 계통의 재조합 DNA 서열 계통간의 다양성을 엄밀히 감안하면서 정량할 수 있도록 설계된 표준 시료로서의 재조합 DNA분자, 특히 용이하게 무한공급할 수 있는 특징을 가진 재조합 DNA 분자를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 동일 분자 중에 5종류의 유전자 재조합 옥수수 계통 특이적 DNA 서열과, 2종류의 계통 특이적은 아니지만 유전자 재조합체에 자주 사용되는 DNA 서열을 포함하고, 추가로 1종류의 옥수수 내재성 유전자의 DNA 서열도 포함하는 분자, 및 동일 분자 중에 1종류의 유전자 재조합 콩 계통 특이적 DNA 서열과, 1종류의 콩 내재성 유전자의 DNA 서열을 포함하는 분자, 또한 동일 분자 중에 1종류의 유전자 재조합 콩 계통 특이적 DNA 서열과, 1종류의 콩 내재성 유전자의 DNA 서열을 포함하며, 또 2종류의 계통 특이적은 아니지만 유전자 재조합체에 자주 사용되는 DNA 서열도 포함하는 분자를 제작하고, 이들을 PCR법에서의 표준 분자로서 사용함으로써, 종래의 재조합 DNA 서열의 정성적 및 정량적 검지 방법이 현저하게 개선되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은
하나 이상의 유전자 재조합체 계통을 포함하는 시료에서의 유전자 재조합체의 존재비를 정량하기 위한 정량적 검지 방법으로서,
(i) 상기 시료 중의 재조합체에 유래하는 DNA 시료 중에 존재할 가능성이 있는 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열, 및 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 분자를 표준 분자로서 이용하여, 상기 DNA 시료 중의 상기 특이적인 DNA 서열 및 내재성 DNA 서열에 대하여 각각 정량적 PCR 반응을 실행하는 단계,
(ii) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계,
(ii) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는 것,
(iii) 이하의 식(I)에 따라서 상기 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비를 결정하는 것
을 포함하는 상기 방법이다.
(시료 중의 유전자 재조합체의 존재비)=
100×[(시료 중의 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수)/(시료 중의 내재성 유전자의 분자수)]/(정량비)(%) (I)
[상기 식에서, (정량비)는 각 유전자 재조합체 계통에 대해 이하의 식(II)에 의해 미리 계산되는 값 중의 임의의 값이다.
(정량비)=(각 유전자 재조합체 계통 중의 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수)/(유전자 재조합체 중의 내재성 DNA 서열의 분자수) (II)]
특히, 본 발명은
하나 이상의 유전자 재조합체의 계통을 포함하는 시료 중의 각 유전자 재조합체 계통의 존재비를 정량하기 위한 정량적 검지 방법으로서,
(i) 상기 시료 중의 유전자 재조합체에 유래하는 DNA 시료 중에 존재할 가능성이 있는, 각 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열, 및 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 분자를 표준 분자로 하여, 상기 DNA 시료 중의 상기 각 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열 및 상기 내재성 DNA 서열에 대하여 각각 정량적 PCR 반응을 하는 단계,
(i) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 각 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계,
(ii) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계, 및
(iii) 이하의 식(III)에 따라서 상기 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비를 결정하는 단계
를 포함하는 상기 방법이다.
(시료 중의 각 유전자 재조합체 계통의 존재비)= 100×[(시료 중 각 유전자 재조합체에 대응하는 재조합 DNA 서열의 분자수)/(시료 중 내재성 DNA 서열의 분자수)]/(정량비)(%) (III)
[상기 식에서, (정량비)는 전술한 식(II)에 의해 계산된다].
또한, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 유전자 재조합체 계통에 특이적인 재조합 DNA 서열, 및 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종에 공통인 하나 이상의 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자이다. 특히, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 2 이상의 유전자 재조합체 계통의 각각에 특이적인 재조합 DNA 서열, 및 상기 유전자 재조합체에 대응하는 2 이상의 비재조합체에 공통의 한 이상의 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자이다.
도 1은 각 유전자 재조합체의 계통에 도입된 재조합 DNA 서열의 구성과, 분자생물학적 분석용 프라이머의 설계 위치를 나타낸다. 유전자 재조합체의 계통 특 이적 DNA 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍은 복수의 종류의 DNA 서열에 걸친 영역을 증폭하도록 설계되었다. 계통 특이적은 아니지만 유전자 재조합체에 자주 사용되는 DNA 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍은 해당하는 모든 계통에 반응할 수 있도록 설계되었다.
도 2는 T25 계통 후대 품종 검지용으로 설계된 프라이머 쌍의 특이성 확인 시험 결과를 나타낸다. T25 계통 후대 품종 이외의 시료로부터 추출된 DNA에 대해서는 증폭 반응은 관찰되지 않고, T25 계통 후대 품종으로부터 추출된 DNA에 대하여만 증폭 산물이 인지되었다. 증폭 산물의 분자량은 설계와 일치한다.
도 3은 NOS 터미네이터 검지용으로 설계된 프라이머 쌍 및 프로브의 특이성확인 시험 결과를 나타낸다. 실험은 11종류의 주형 DNA에 대해 행했다. 도 1에 나타낸 바와 같이 NOS 터미네이터는 Bt11 계통 후대 품종, GA21 계통 후대 품종, Roundup Ready Soy 계통 후대 품종에 도입되어 있다. 실험 결과, 이들 3품종으로부터 추출된 주형 DNA에 대해서만 증폭 산물이 인지되고, 이들 이외의 주형 DNA를 반응에 제공한 경우는 증폭 산물이 인지되지 않기 때문에, 설계대로의 특이성이 확인되었다.
도 4는 PCR 산물의 통합 모식도를 나타낸다.
도 5는 옥수수용 표준 분자의 염기 서열을 나타낸다. 도면 중에 통합된 각 증폭 대상 DNA 서열의 위치를 나타낸다. 실험에 사용한 프라이머가 결합하는 부분, 프로브가 결합하는 부분에 관해서도 각각 도면 중에 나타내었다.
도 6은 별도의 옥수수용 표준 분자의 염기 서열을 나타낸다. 도면 중에 통 합된 각 증폭 대상 DNA 서열의 위치를 나타낸다. 실험에 사용한 프라이머가 결합하는 부분, 프로브가 결합하는 부분에 관해서도 각각 도면 중에 나타내었다.
도 7은 플라스미드 pMul4 및 pMul5의 모식도를 나타낸다. pMul4에서는 도 5에 나타낸 DNA가 벡터에 삽입되어 있다. pMul5에서는 도 6에 나타낸 DNA 서열이 벡터에 삽입되어 있다.
도 8은 콩용 표준 분자의 염기 서열을 나타낸다. 도면 중에 통합된 각 증폭 대상 DNA 서열의 위치를 나타낸다. 실험에 사용한 프라이머가 결합하는 부분, 프로브가 결합하는 부분에 관해서도 각각 도면 중에 나타내었다.
도 9는 콩용 표준 분자의 염기 서열을 나타낸다. 도면 중에 통합된 각 증폭 대상 DNA 서열의 위치를 나타낸다. 실험에 사용한 프라이머가 결합하는 부분, 프로브가 결합하는 부분에 관해서도 각각 도면 중에 나타내었다.
도 10은 플라스미드 pMulSL의 모식도를 나타낸다. 벡터에 삽입되어 있는 서열은 도 8에 나타낸 DNA 서열이다.
도 11은 플라스미드 pMulSL2의 모식도를 나타낸다. 벡터에 삽입되어 있는 서열은 도 9에 나타낸 DNA 서열이다.
도 12는 옥수수 의사 혼입 시료 중에 포함되는 유전자 재조합 옥수수를 확인했다. (A) 시료 중에서 Bt11 계통 후대 품종, (B) GA21 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종이 검출되었다. 양성 대조로서 pMul4 BamHI 소화물을 이용했다.
도 13은 옥수수 종자 1개로부터 추출한 DNA를 이용하여 정량적 PCR을 행하고, 식(II)에 따라서 정량비를 확인한 결과를 나타낸다. 도면 중의 화살표는 T25 계통 후대 품종의 F1 종자가 나타낸다고 예상되는 값을 가리킨다.
도 14는 옥수수 표준 재조합 DNA 서열에 대한 정량적 PCR 과정에서의 (사이클수-형광량)의 그래프를 나타낸다.
도 15는 옥수수 표준 재조합 DNA 서열에 대한 정량적 PCR에서 얻어진 검량선을 나타낸다. 검량선은 도 14로부터 유도된다.
도 16은 콩 종자 1개로부터 추출한 DNA를 이용하여 정량적 PCR을 행하고, 식(II)에 따라서 정량비를 확인한 결과를 나타낸다.
이하에서는 유전자 재조합체의 예로서 유전자 재조합 농작물에 대해 본 발명을 설명하는데, 본 발명을 적용할 수 있는 대상으로는 농작물에 한정되지 않고, 유전자 재조합 동식물 전반, 유전자 재조합 미생물 등의 기타 유전자 재조합체를 제외하는 것이 아니다. 본 발명의 하나의 실시 양태에서는 여러 가지 유전자 재조합체를 특이적으로 검지하기 때문에, 피검식물 유래의 핵산으로부터 PCR법에 의해서 재조합 DNA 서열을 검지한다. 따라서, 우선 유전자 재조합체 계통 특이적인 DNA 서열을 검지하기 위한 프라이머 쌍이나, 계통 특이적은 아니지만 유전자 재조합체에 자주 사용되는 DNA 서열을 검지하기 위한 프라이머 쌍, 유전자 재조합체와 비유전자 재조합체를 막론하고 상기 농작물에 특이적으로 존재하는 DNA 서열을 검지하기 위한 프라이머 쌍 등을 설계해야 한다.
또, 상기 피검식물체 시료는 게놈 DNA 등의, 그 식물체 유래의 핵산을 추출할 수 있는 것이면 되고, 예를 들면, 생 종자(raw seed)나, 건조 종자, 옥수수 그 리트(corn grits), 콩가루 등의 가공품 등을 들 수 있다. 이러한 시료는 필요에 따라 파쇄하거나 하여 이용할 수 있다.
본 발명에서는 하나 또는 둘 이상의 유전자 재조합체 계통이 존재할 가능성이 있는 시료에 대해, 시료 중 재조합 DNA 서열의 분자수, 시료 중 내재성 유전자의 분자수, 및 각 유전자 재조합체에 대해 계산된 정량비에 따라, 시료 중 유전자 재조합체의 존재비, 특히 시료 중 각 유전자 재조합체 계통의 개별적 존재비를 산출할 수 있다.
본 발명에서는 이하의 순서에 의해, 유전자 재조합체의 존재비가 산출된다.
(i) 시료 중에 존재할 가능성이 있는 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열 및 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 분자를 표준 분자로서 정량적 PCR 반응을 하는 단계,
(i) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계,
(ii) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계, 및
(iii) 이하의 식(I)에 따라서 상기 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비를 결정하는 단계
를 포함하는 상기 방법이다.
(시료 중의 유전자 재조합체의 존재비)=
100×[(시료 중 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수)/(시료 중 내재성 유전자의 분자수)]/(정량비)(%) (I)
[상기 식에서, (정량비)는 각 유전자 재조합체 계통에 대해 이하의 식(II)에 의해 미리 계산되는 값의 조중의 임의의 값이다:
(정량비)=(각 유전자 재조합체 계통 중 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수)/(유전자 재조합체 중 내재성 DNA 서열의 분자수) (II)]
특히, 각 유전자 재조합체 계통의 개별 존재비를 검지하는 경우에는 식(I) 대신에 이하의 식(III)이 사용된다:
(시료 중 각 유전자 재조합체 계통의 존재비)=
100×[(시료 중 각 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수)/(시료 중 내재성 DNA 서열의 분자수)]/(정량비)(%) (III)
여기에서, 본 명세서에서 "DNA 서열"이라는 말은 "DNA 서열 또는 그의 부분 영역"이라고 호환적으로 사용된다. 따라서, 예를 들면 "유전자 재조합체 계통 특이적 DNA 서열"이란, 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열의 전장(全長) 또는 하나 이상의 그의 부분 영역을 의미한다. 다른 문맥에 있어서도 동일하다. 또한 "유전자 서열"의 의미에 관해서도 동일하다.
본 명세서에서의 "유전자 재조합체"는 외래 유전자가 도입된 생물 개체 전체, 외래 유전자가 도입된 생물 개체의 일부, 예를 들면, 그것의 기관(器官), 조직편(組織片), 및 세포(배양 세포를 포함함), 그와 같은 생물 개체에 유래하는 종자, 화분, 배(胚)도 포함한다.
또, "정량적 PCR"이란 일반적으로 증폭 반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량 하기 위한, PCR을 이용한 일련의 반응을 의미한다. 정량적 PCR에는 기준이 되는 내재 서열을 사용하는 내부 표준법, 증폭 반응에 있어서 경쟁하는 분자를 사용하는 경쟁법이 포함되지만, 본 발명에서는 내부 표준법이 사용되며, 또한 각 서열의 분자수를 정확하고 또한 간편하게 결정하기 위해서 표준 분자라고 불리는 기준이 되는 주형 DNA 서열을 이용한 PCR을 사용하고, 반응 중 임의의 시점에서 반응의 진행상황, 즉 증폭의 정도가 모니터된다. 따라서, 본 명세서에서 "정량적 PCR"이란, 증폭 반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한 PCR로서, 반응 중 임의의 시점에서 증폭 대상의 분자에 대해 증폭을 모니터할 수 있는 PCR을 의미한다. 정량을 행하기 위해서는 일반적으로 그와 같은 PCR과, 반응 개시 시의 주형 DNA 분자수와 그 증폭의 지표가 되는 시그널을 관련짓는 검량선(檢量線)이 조합된다. 이 검량선은 분자수가 알려진 표준 분자를 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 시료 DNA, 프라이머, 프로브, PCR 반응 조건, 및 재조합 DNA 서열의 분자수, 내재성 유전자의 분자수, 및 정량비의 산출 방법을 이하에 상세하게 설명한다.
피검 식물체 시료 유래의 핵산은 바람직하게는 상기 식물체 시료의 게놈 DNA 이다. 피검 식물체 시료로부터의 핵산의 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, PCR에 제공할 수 있는 품질이 얻어지는 방법이면 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 예를 들면 QIAGEN Plant Maxi Kit(QIAGEN GmbH) 등의 시판 키트를 이용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방법을 바꿀 수도 있다.
이러한 방법에 의해 추출한 핵산은 PCR법의 주형으로서 이용하는 데 알맞은 상태, 예를 들면, 완충액에 용해시킨 상태로 유지하는 것이 바람직하다. 또, 얻어진 핵산의 순도는 공지된 방법에 의해서 평가할 수 있고, 예를 들면, 230nm, 260nm, 280nm에서의 흡광도를 측정함으로써 순도의 검정을 행할 수 있다. 이 경우에, 260nm/230nm의 값이 2보다 크고, 260nm/280nm의 값이 1.8 내지 2.0인 것이 PCR법을 실행하기 위해 바람직하다.
또한, 조제된 DNA 용액이 PCR법에 충분할 정도로 정제되어 있고, 또한 분해되 않은 것을 확인하기 위해서, 상기 식물체 게놈에 내재적으로 포함되어 있는 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 PCR법에 의한 증폭이 일어나는 것을 확인할 수도 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 피검 식물체 유래의 핵산을 이용하여 PCR법을 행하는데, 여기서 이용하는 프라이머는 재조합 DNA 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 영역을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍이다. 이로써, 재조합 DNA 서열의 구조에 따라서 상기 재조합 DNA 서열을 특이적으로 검지할 수 있다. 이러한 프라이머 쌍은 검지하고자 하는 유전자 재조합체에 따라서 아래와 같은 방법으로 설계할 수 있다.
여기에서, 검지의 대상이 되는 유전자 재조합체는 앞서 설명한 바와 같은 유전자 재조합체이며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 어떠한 유전자 재조합체이더라도 도입된 재조합 DNA 서열의 구성이 명확해지면 검지 대상으로 삼을 수 있다. 이러한 유전자 재조합체는 반드시 유전자 도입을 행한 세대일 필요는 없고, 그 후대 품종일 수도 있다.
먼저, 검지하고자 하는 유전자 재조합체에 포함되는 재조합 DNA 서열의 염기 서열을 입수한다. 이 염기 서열은 재조합 DNA 서열의 전체 서열일 필요는 없고, 증폭의 대상이 되는 영역의 부근의 염기 서열이면 된다. 이러한 염기 서열의 대부분은 공지된 문헌으로부터 입수할 수 있다. 공지된 문헌에서 염기 서열을 입수할 수 없더라도 염기 서열의 일부에 대한 정보가 있으면, 통상의 방법에 의해 스스로 실험적으로 염기 서열을 알 수 있다. 계통 특이적인 프라이머 쌍의 설계에 있어서는 복수 종류의 DNA 서열에 걸친 영역(예를 들면, CaMV 35S 프로모터로부터 cryIA(b)에 걸친 영역 등)을 선정하면 일반적으로 특이성이 높은 것을 선택하는 것이 용이해진다. 각 프라이머 쌍은 증폭 대상이 되는 DNA 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 한, 어떠한 것이라도 상관없지만, 증폭 단편이 80bp 내지 200bp 인 것이 바람직하고, 또한 각 프라이머의 GC 함량이 40% 내지 60%인 것이 보다 바람직하고, 또한 각 프라이머가 분자 내 고차 구조를 형성하지 않는 것, 프라이머끼리 연속한 3염기 이상의 염기쌍을 형성하지 않는 것이 특히 바람직하다.
예를 들면, 앞서 설명한 Bt11 계통의 후대 품종, Event176 계통의 후대 품종, MON810 계통의 후대 품종, GA21 계통의 후대 품종, T25 계통의 후대 품종, Roundup Ready Soy 계통의 후대 품종을 각각 특이적으로 검지하는 경우에는 도 1에 도시한 바와 같은 영역으로부터 프라이머를 설계할 수 있다.
또, 정량적 PCR법에 의해 프라이머 쌍이 증폭하는 영역의 반응 개시 시의 분자수를 정량할 수 있음이 이미 공지되어 있다. 이미 몇 가지의 정량적 PCR법이 알려져 있지만, 많은 경우 프라이머 쌍에 사이에 끼워진 영역의 서열에 상보적인 프 로브를 제작할 필요가 있다. 프로브는 증폭에 의해서 생긴 분자수에 대응한 시그널을 생성하는 것이면 되고, 예를 들면, PCR 도중에 DNA의 이중 사슬(double strand) 형성 반응 및 이중 사슬로부터 단일 사슬로의 괴리(乖離) 반응, 또는 핵산의 신장(伸長) 반응을 검지할 수 있는 적절한 물질을 사용할 수 있다. 일반적으로는 프로브로서 형광 표지된 핵산이 사용된다. 특히, 프로브는 PCR에 의한 증폭 반응에 있어서 폴리머라아제의 신장 반응에 사용되는 조건 하에 주형 DNA에 특이적으로 하이브리다이즈하여 DNA 사슬의 신장, 즉 주형 DNA의 증폭에 따라 형광량을 변화시키는 것으로서, 그 변화가 증폭 정도의 지표가 되는 것이 바람직하고, 특히, 주형 DNA의 증폭에 따라 분해되어 형광 물질을 유리하고, 그 결과 반응 혼합물 중의 형광량을 증가시키며, 또한 그 형광량의 증가가 증폭 정도의 지표가 되는 것이 바람직하다. 이러한 프로브를 사용함으로써, PCR 반응에서의 증폭의 진행을 실시간으로 간편하게 모니터할 수 있다. 그와 같은 형광 표지 프로브는 당업자에 잘 알려져 있으며, 그러한 성질을 갖는 적절한 서열의 형광 표지 프로브를 합성할 수도 있다. 또한, 프로브는 대응하는 프라이머 쌍 보다도 10℃ 정도 Tm 값이 높은 것, 전장이 18염기 내지 25염기 정도인 것, 말단에 G를 갖지 않는 것 등이 바람직하다. 본 발명의 방법 중 하나의 실시 양태에서는 증폭에 따라 분해되고, 그에 따라 형광량이 증가하여, 그 형광량의 증가가 증폭의 지표가 되는 프로브가 사용된다.
이상과 같이 하여 설계되는 프라이머 쌍을 이용하여, 피검 식물체 시료 유래의 핵산을 주형으로 하여 정성적 PCR을 실행할 수 있다. 또, 이상과 같이 설계되 는 프라이머 쌍과 프로브를 이용하고, 피검 식물체 시료 유래의 핵산을 주형으로 하여 정량적 PCR을 실행할 수 있다. 이 경우의 반응액은 당업자라면 용이하게 조제할 수 있기 때문에 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 주형이 되는 핵산, 프라이머 쌍, PCR 완충액, dNTP, 염화마그네슘, DNA 폴리머라아제 등을 각각 적절한 양으로 사용하여 조제할 수 있다. 예를 들면, 시료로부터의 추출 DNA를 50ng 정도 사용하고, 프라이머의 최종 농도 0.2∼0.5μM 정도로 하고, 반응계의 전량을 25㎕로 만들어 반응을 행할 수 있다. PCR의 온도 조건에 관해서도 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 95℃에서 10분간 유지한 후, 이후 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초를 1사이클로 하여 40사이클을 반복하여 행하고, 40사이클 종료 후에 72℃에서 7분 유지한 후, 4℃로 유지할 수 있지만, 당업자이면 용이하게 최적 조건을 설정할 수 있기 때문에, 각 단계의 온도 및 시간은 적절하게 변경된다. 또, 이러한 반응은 공지된 장치를 이용하여 행할 수 있다.
시료 중의 재조합 DNA 서열의 분자수는 정량적 PCR을 실행함으로써 얻을 수 있다. 정량적 PCR은 단순히 증폭 대상 DNA 서열의 초기량을 측정하는 것만으로는 그 값이 직접 유전자 재조합체의 함량을 나타내지 않는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 도 1에 나타낸 바와 같이, 유전자 재조합체에 도입된 DNA 서열군은 계통간에 매우 다종 다양할 뿐 아니라, 상기 식물체 게놈당 도입 카피수에 관해서도 다양하기 때문에, 단순히 존재비를 계산할 수 없다. 예를 들면, cryIA(b)의 코드 영역은 Event176 계통, Bt11 계통, 그리고 MON810 계통에도 도입되어 있지만, 각각의 개발자에 의하면 Event176 계통에는 게놈당 2카피 이상이 도입되어 있고, Bt11 계통에 는 1카피가, MON810 계통에는 1카피 이상이 도입되어 있다. 나아가서, PCR법은 반응계 중의 오염물에 의한 반응 저해를 받기 쉽다.
따라서, 본 발명에서 시료 중의 재조합 DNA 서열의 분자수는 예를 들면, 이미 알고 있는 양의 표준 분자를 내부 표준으로서 이용하여 정량적 PCR을 실행함으로써 검량선을 제작하며 시료에 관해서도 동일한 정량적 PCR을 실행하고, 상기 검량선을 이용하여 결정한다.
내재성 DNA 서열의 분자수에 관해서도 동일한 방법으로 결정할 수 있다. 한편, 순수한 유전자 재조합체에 대해, 미리 그들의 유전자 재조합체 중의 재조합 DNA 서열의 분자수와 내재성 DNA 서열의 분자수를 정량적 PCR에 의해서 측정하고, 이들 측정값의 비로서 "정량비"가 정의된다. 이 정량비는 유전자 재조합체의 각 계통에 도입되어 있는 재조합 DNA 서열의 분자수나 종류에 의존하여 각각 고유의 값을 취하기 때문에, 식(1)을 이용한 유전자 재조합체의 존재비로 정량치를 변환함으로써 재조합 DNA 서열의 계통간의 다양성을 엄밀히 감안할 수 있는 것이다. 본 발명의 방법은 이러한 정량비를 사용함으로써, 시료 DNA 용액 중에 포함될 수 있는 PCR 저해인자 등의 반응계 자체에 대한 교란 인자나, DNA 추출 시의 수량의 차이 등에 의한 정량치의 에러를 회피할 수 있게 한다.
이 정량비는 시료 중에 포함될 가능성이 있는 모든 유전자 재조합체 계통에 대해 산출되는 것이 바람직하지만, 일부에 대하여만 정량비가 얻어질 수도 있다. 정량비의 값은 PCR의 증폭 대상 영역이나 유전자 재조합체의 계통에 의존하여 고유의 값을 취하기 때문에, 일단 정량비의 값을 알 수 있으면, 이후는 이 값을 계수로 서 이용함으로써, 증폭 대상 DNA 서열의 반응 초기량과 내부 표준 서열의 반응 초기량으로부터 본래의 시료 중 유전자 재조합체의 존재비를 알 수 있다.
이러한 내부 표준으로는 예를 들면, 옥수수가 공유하는 특이적인 내재성 DNA 서열, 특히 내재성 유전자 서열이나, 콩이 공유하는 특이적인 내재성 DNA 서열, 특히 내재성 유전자 서열을 이용하여 행할 수도 있고, 인공적으로 구축한 표준 분자를 사용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 알맞은 표준 분자는 하나 이상의 유전자 재조합체 계통에 특이적이다, 바람직하게는 2 이상의 유전자 재조합체 계통의 각 계통에 특이적인 하나 이상의 재조합 DNA 서열, 및 대응하는 생물종에 공통되는 하나 이상의 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 재조합 DNA 분자이다. 또, 유전자 재조합체 계통의 각 계통에 특이적은 아니지만, 유전자 재조합체에 범용되는 하나 이상의 재조합 DNA 서열, 및 대응하는 생물종에 공통되는 하나 이상의 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 재조합 DNA 분자도 본 발명에 이용할 수 있다. 본 발명의 재조합 DNA 분자는 상기의 서열 이외에 적절한 숙주 내에서 복제시키기 위한 여러 가지 서열, 또는 이 표준 분자를 가지는 숙주를 선발하기 위한 표지 유전자(marker gene), 기타를 추가로 포함할 수도 있다. 필요하면 적절한 제한 효소를 사용함으로써, 또는 PCR법에 의해서 일부를 증폭함으로써, 이 재조합 DNA 분자로부터 표준 분자로서 사용할 수 있는 최소 영역만을 얻을 수도 있다. 그러나, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 PCR 처리되는 분자수를 용이하게 제어할 수 있다고 하는 특성을 가지고 있지 않으면 안된다. 예를 들면, 본 발명의 재조합 DNA 분자의 전체 염기 서 열이 알려져 있거나 또는 분자량이 알려져 있는 경우, PCR 처리되는 재조합 DNA 분자의 분자수를 제어할 수 있다. 재조합 DNA 분자의 염기 서열이나 분자량은 필요에 따라 측정할 수도 있다.
내재성 DNA 서열로는 전술한 바와 같이 예를 들면, 옥수수가 공유하는 특이적인 내재성 유전자 서열 또는 그 부분 영역이나, 콩이 공유하는 특이적인 내재성 유전자 또는 그의 부분 영역을 이용할 수 있다. 유전자 재조합체에 공통되는 재조합 DNA 서열로는 예를 들면 CaMV35S 프로모터 서열, Nos 터미네이터 서열 또는 이들의 일부를 이용할 수 있다. 각 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열로는 예를 들면 각각의 계통에 도입된 유전자에게 유래하는 DNA 서열을 이용할 수 있다.
이러한 표준 분자는 당업자에 잘 알려져 있는 분자생물학적 기술을 이용하여 구축할 수 있다. 예를 들면, 제한 효소 절단 단편을 순차 클로닝함으로써 구축할 수도 있으며, 테일드(tailed) 프라이머를 이용한 PCR 산물의 통합을 반복함으로써 구축할 수도 있다. 바람직하게 이 표준 분자는 적절한 숙주, 예를 들면 미생물, 동물세포, 식물세포 내에서 자기복제 가능한 재조합 DNA 분자로서 구축된다. 표준 분자가 플라스미드로서 구축되는 경우는 슈퍼코일 형성이 PCR의 반응계를 불안정하게 할 경우가 있기 때문에, 제한 효소로 절단하여 직선형 분자로서 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 증폭 대상의 DNA 서열을 절단하지 않는 한, 임의의 제한 효소로 절단할 수 있다.
특히, 본 발명의 하나의 실시 양태에서 이 표준 분자는 내재성 DNA 서열로서, 콩의 le1 유전자 서열의 일부분을 가지고, 검출할 재조합 DNA 서열로서 Roundup Ready Soy 계통 특이적 DNA 서열을 가진다. 본 발명의 다른 실시 양태에서 이 표준 분자는 내재성 DNA 서열로서 옥수수의 zSSIIb 유전자 서열의 일부를 가지고, 검출할 재조합 DNA 서열로서 GA21, T25, MON810, Event176, Bt11의 각 계통에 특이적인 DNA 서열, 즉, m-epsps-NOS 터미네이터 서열 영역, pat-35S 터미네이터 영역, adh1-1S-cryIA(b) 서열 영역, cryIA(b)-PEPC#9 서열 영역, cryIA(b)-NOS 터미네이터 서열 영역을 가진다. 이들 실시 양태에서 표준 분자는 대장균 내에서 자기복제 가능한 DNA 분자이다.
본 발명에서의 정량적 PCR 및 그것에 의한 목적 DNA 서열의 분자수의 결정은 보다 구체적으로, 예를 들면 아래와 같이 행할 수 있다.
(i) 검량선의 작성
여러 가지 분자수의 표준 분자, 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열 또는 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여, 상기 내재성 DNA 서열 또는 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열의 증폭에 따라 형광량을 증가시키는 프로브의 존재 하에서 PCR을 실행한다. 각 분자수의 표준 분자를 반응 개시 시의 주형 DNA로서 사용하는 반응에 대하여, 각각 형광량을 일정한 사이클수마다 모니터한다[도 14(A), 14(B)]. 다음에 형광량의 증가가 사이클수에 대하여 지수함수 관계에 있는 영역에서, 형광량 증가(ΔRn)의 임계값을 설정한다. 예를 들면, 도 14에서 ΔRn은 10-1로 설정되어 있다. 다음에, PCR 사이클수를 종축에 취하고, 반응 개시 시의 주 형 DNA 분자수를 횡축에 취하여, 이 임계값에 도달하는 PCR 사이클수를 반응 개시 시의 DNA 주형 분자수에 대하여 플롯하여 검량선을 얻을 수 있다(도 15).
(ii) 시료 DNA의 PCR
DNA 시료 중에 존재할 가능성이 있는, 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열, 및 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열에 관해서, 상기 DNA 시료 중의 상기 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열 및 상기 내재성 DNA 서열에 대하여 각각 정량적 PCR 반응을 실행한다. 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열은 각 유전자 재조합체 계통에 특이적이더라도, 2 이상의 유전자 재조합체 계통에 공통일 수도 있다. 이 경우, 각 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열 및 내재성 DNA 서열에 대한 PCR을 동일한 반응 혼합물 속에서 실행할 수도 있고, 별개의 반응 혼합물 속에서 실행할 수도 있지만, 주형 DNA 분자가 양반응에서 동일한 것이 보증되어야 한다.
(iii) 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열 및 내재성 DNA 서열의 분자수 결정
전술한 바와 같이 각각의 서열에 대하여 PCR을 실행하고, 증폭의 지표가 되는 시그널을 모니터하여, 그 시그널이 (i)에서 정한 임계값에 도달했을 때의 PCR 사이클수를 측정한다. 다음에, 얻어진 사이클수를 (i)에서 작성한 검량선을 이용하여 반응 개시 시의 분자수로 환산한다.
이미 (i)의 검량선이 얻어져 있는 경우는 그 검량선을 이용하여 전술한 (ii) 이후의 순서를 행하면 된다.
시료 중 재조합체 특이적 DNA 서열의 분자수, 내재성 DNA 서열의 분자수 및 각 재조합체 계통에 대하여 정량비가 얻어졌으면, 전술한 식(I) 또는 식(III)에 따라서, 시료 중의 유전자 재조합체 전체에 대한 존재비 또는 각 계통별 존재비를 계산할 수 있다. 식(I) 또는 식(III)에 있어서, 정량할 재조합 DNA 서열로서 유전자 재조합체의 계통 특이적 DNA 서열을 선택할 수도 있으며, 계통 특이적은 아니지만 유전자 재조합체에 자주 사용되는 DNA 서열을 선택할 수도 있다.
전자를 선택한 경우는 시료 중의 각 계통의 존재비를 정확하게 알 수 있기 때문에, 모든 유전자 재조합체 계통에 대하여 분석을 반복한 후에, 얻어진 각 계통마다 시료 중의 존재비를 가산함으로써, 시료 중의 총체적인 유전자 재조합체의 존재비를 정확하게 정량할 수 있다. 이러한 방법은 많은 경우, 분석 시료가 유통 단계에서 복수 계통의 혼합물인 유통 실태에 대하여 바람직한 분석법이라고 할 수 있다.
후자를 선택한 경우에는 동시에 복수의 계통의 대략적인 존재비를 알 수 있기 때문에, 적은 시험 회수로 시료 중의 총체적인 유전자 재조합체의 대략적인 존재비를 간편하게 정량하는 데 바람직한 표준 시료로서 사용할 수 있다. 이 경우, 식(I)에서의 정량비로서는 시료 중에 존재할 가능성이 있는 유전자 재조합체 계통에 대하여 계산되는 정량비 중 임의의 값을 선택할 수 있지만, 이들 중에서 최소의 정량비를 이용하는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써, 유전자 재조합체의 존재비로서 가능성이 있는 최대치를 어림할 수 있기 때문이다.
(실시예)
이하 실시예에 의해 자세히 본 발명을 설명하지만, 이들 실시예는 설명을 위한 것이며, 본 발명의 기술적 범위는 이들에 한정되지 않는다.
또, 이하의 실시예에서는 다음에 나타내는 시료, 시약 및 장치를 사용했다.
(1) 시료
옥수수(Zea
mays)는 다음 6품종의 건조 종자를 이용했다.
유전자 재조합 옥수수: Bt11 계통 후대 품종, Event176 계통 후대 품
종, MON810 계통 후대 품종, T25 계통 후대 품종,
GA21 계통 후대 품종
비유전자 재조합 옥수수: Dairyland 1412
콩(Glycine
max)는 다음 2품종의 건조 종자를 이용했다.
유전자 재조합 콩 : Roundup Ready Soy 계통 후대 품종
비유전자 재조합 콩 : Murayutaka종
쌀(Oryza
sativa)는 다음 품종의 건조 종자를 이용했다.
비유전자 재조합 쌀 : Kinuhikari종
밀(Triticum
aestivum)은 다음 품종의 건조 종자를 이용했다.
비유전자 재조합 밀 : Haruyutaka종
보리(Hordeum
vulgare)은 다음 품종의 건조 종자를 이용했다.
비유전자 재조합 보리 : Harrington종
(2) 시약
시료으로부터의 DNA 추출에는 이하의 시약을 사용했다.
라우릴황산나트륨(SDS)(시약 특급)(Sigma Chemical Co.)
QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit(QIAGEN GmbH)
QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN GmbH)
DNA의 전기영동에는 이하의 시약을 사용했다.
아세트산(시약 특급)(와코준야쿠: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
트리스[하이드록시메틸]아미노메탄(Tris)(시약 특급)(Sigma Chemical Co.)
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(시약 특급)(Sigma Chemical Co.)
아가로오스 분말 "LO3「TaKaRa」"(TaKaRa Shuzo Co., Ltd.)
에티듐브로마이드(Sigma Chemical Co.)
피콜 400(Sigma Chemical Co.)
브롬페놀블루(Sigma Chemical Co.)
자일렌시아놀(Sigma Chemical Co.)
DNA 표지 "λ HindIII 소화물"(New England Biolabs Inc.)
DNA 표지 "1kb 래더"(New England Biolabs Inc.)
DNA 표지 "100bp 래더"(New England Biolabs Inc.)
정성적 PCR에는 이하의 시약을 사용했다.
DNA 폴리머라아제 "AmpliTaq Gold"(PE Biosystems)
×10PCR 버퍼 II(PE Biosystems)
플라스미드 제작 및 정제에는 이하의 시약을 사용했다.
DNA 폴리머라아제 "AmpliTaq Gold"(PE Biosystems)
×10PCR 버퍼 II(PE Biosystems)
DNA 폴리머라아제 "KOD"(TOYOBO Co., Ltd.)
×10PCR 버퍼 II(TOYOBO Co., Ltd.)
TOPO TA Cloning Kit with TOP10F' Cells(Invitrogen Co.)
효모 추출물(Difco Laboratories)
트립톤 펩톤(Difco Laboratories)
NaCl(시약 특급)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
한천 분말(Syoei Kanten Ltd.)
D[-]-α-Aminobenzylpenicillin(Ampicilin) Sodium Salt(Sigma Chemical Co.)
QIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN GmbH)
에탄올(시약 특급)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
2-프로판올(시약 특급)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
트리스[하이드록시메틸]아미노메탄(Tris)(시약 특급)(Sigma Chemical Co.)
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(시약 특급)(Sigma Chemical Co.)
제한 효소 "HindIII"(TaKaRa Shuzo Co., Ltd.)
제한 효소 "BamHI"(TOYOBO Co., Ltd.)
제한 효소 "SmaI"(New England Biolabs Inc.)
제한 효소 "SrfI"(New England Biolabs Inc.)
페놀(시약 특급)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
클로로포름(시약 특급)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
이소아밀 알코올(시약 특급)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
정량적 PCR에는 이하의 시약을 사용했다.
TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Biosystems)
(3) 장치
시료로부터의 DNA 추출에는 이하의 장치를 사용했다.
분쇄기 "Multi Beads Shocker MB301"(Yasui Kikai Co.)
분쇄기 "DM-6"(Yu Chi Machinery Co., Ltd.)
터치믹서 "Tube mixer"(Yamato Scientific Co., Ltd.)
초순수 제조장치 "CPW-200"(ADVANTEC Toyo Kaisya Ltd.)
인큐베이터 "Thermo Minder SD mini"(TAITEC Co.)
원심분리기 "himac CT13"(Hitachi Koki Co., Ltd.)
원심분리기 "himac CF15D2"(Hitachi Koki Co., Ltd.)
원심분리기 "AllegraTM 6KR"(Beckman Coulter, Inc.)
분광광도계 "DU7400"(Beckman Coulter, Inc.)
DNA의 전기영동에는 이하의 장치를 사용했다.
전기영동 장치 "Mupid 2"(Advance Co., Ltd.)
화상해석 장치 "Molecular ImagerR FX"(BioRad Laboratories Inc.)
정성적 PCR에는 이하의 장치를 사용했다.
thermal cycler "PTC-200"(MJ Research Inc.)
thermal cycler "PCR System 9700"(PE Biosystems)
플라스미드 제작 및 정제에는 이하의 장치를 사용했다.
진탕 배양기 "Thermostat Shaking Incubator AT24R"(Thomas Kagaku Co., Ltd.)
thermal cycler "PTC-200"(MJ Research Inc.)
thermal cycler "PCR System 9700"(PE Biosystems)
원심분리기 "himac CT13"(Hitachi Koki Co., Ltd.)
원심분리기 "himac CF15D2"(Hitachi Koki Co., Ltd.)
정량적 PCR에는 이하의 장치를 사용했다.
정량적 PCR 장치 "ABI PRISM 7700 Sequence Detector System"(PE Biosystems)
정량적 PCR 장치 "ABI PRISM 5700 Sequence Detector System"(PE Biosystems)
(4) 기타
프라이머의 합성은 Greiner Japan K.K.에 위탁했다.
프로브의 합성은 PE Biosystems Japan K.K.에 위탁했다.
DNA 염기 서열의 확인은 Greiner Japan K.K.에 위탁했다.
실시예 1 DNA의 추출
옥수수, 콩, 쌀, 밀, 보리로부터의 DNA 추출은 이하의 순서로 행했다. 먼저 분쇄기 "DM-6"(Yu Chi Machinery Co., Ltd.)로 시료를 분말상으로 분쇄한 후에, 분쇄물 500-1,000mg을 계량하여, QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit(QIAGEN GmbH)을 프로토콜에 따라 사용하여 분쇄물로부터 DNA를 추출했다.
한 알의 옥수수나 콩으로부터 DNA를 추출할 경우에는 먼저 1% SDS 용액으로 표면을 잘 세정한 후, 분쇄기 "Multi Beads Shocker MB301"(Yasui Kikai Co.)를 이용하여 분쇄하고, 분쇄물을 전량 DNA 추출 처리했다. 이 경우의 DNA 추출은 QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN GmbH)을 프로토콜에 따라 사용하여 실행했다.
실시예 12, 실시예 13, 실시예 14에서 후술하는 의사(擬似) 혼입 시료로부터의 DNA 추출에 대해서는 이하의 순서로 행했다. 여기서는 옥수수의 경우를 예로 들지만, 콩에 대하여도 동일한 방법으로 행한다. 먼저 유전자 재조합 옥수수와 비유전자 재조합 옥수수를 각각 1% SDS 용액으로 세정한 후, 건조시켰다. 그 후 따로따로 분쇄기 "DM-6"(Yu Chi Machinery Co., Ltd.)를 이용하여 분쇄한 후, 각각의 분쇄물을 각 1g씩 계량하고, 유전자 재조합 옥수수와 비유전자 재조합 옥수수를 분쇄기 "DM-6"(Yu Chi Machinery Co., Ltd.)를 이용하여 혼합했다. 혼합된 시료로부터 500-1,000mg를 계량하여, QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit(QIAGEN GmbH)을 프로토콜에 따라 사용하여 분쇄물로부터 DNA를 추출했다.
모든 추출 DNA 용액으로부터 각각 1㎕을 1㎕의 10×loading 버퍼(20% Ficoll 400, 0.1M EDTA, 1.0% SDS, 0.25% 브롬페놀블루, 0.25% Xylene Cyanol)와 혼합한 후 전기영동 처리하고, 추출 과정에서의 분해가 일어나지 않는 것을 확인했다. 즉, 전기영동은 전기영동 장치 "Mupid 2"(Advance Co., Ltd.)를 사용하고, 100mL 접촉 50㎍의 에티듐브로마이드(Sigma Chemical Co.)를 포함하는 0.8% 아가로오스겔을 사용하고 TAE 버퍼(0.04M Tris, 0.04M 아세트산, 0.001M EDTA) 속에서 100V, 15분의 조건으로 행했다. 전기영동 후, 겔 중의 DNA의 상태를 화상해석 장치 "Molecular ImagerR FX"(BioRad Laboratories Inc.)를 사용하여 확인했다.
또, 모든 추출 DNA 용액으로부터 각각 1㎕을 흡광도 측정에 제공하여, 농도 및 순도를 확인했다. 즉, 49㎕의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA(pH8.0)으로 50배 희석한 시료의 230nm, 260nm, 280nm의 흡광도를 분광광도계 "DU7400"(Beckman Coulter, Inc.)를 이용하여 측정하여, 1A260 Unit = 50㎍/ml로서 산출했다.
모든 추출 DNA는 -20℃에서 보존했다.
실시예 2 검지할 영역의 선정(프라이머 쌍 및 프로브의 설계)
각 유전자 재조합체 계통 후대 품종으로부터 추출한 DNA를 주형으로 하고, 표 1에 나타낸 시퀀스용 프라이머로부터 재조합 DNA 서열의 시퀀스를 결정했다.
표 1. 서열분석용 프라이머
표 1(계속)
〈서열표 프리 텍스트〉
SEQ ID NO: 1∼14: PCR 프라이머
유전자 재조합체 계통 특이적 DNA 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍은 도입 되어 있는 DNA 서열에 있어서, 복수 종류의 DNA 서열에 걸친 영역을 증폭하도록 설계했다. 즉, Bt11 계통 후대 품종에 대해서는 cryIA(b)-NOS 터미네이터 사이, 및 adh1-S IVS6-cryIA(b) 사이, Event176 계통 후대 품종에 대해서는 cryIA(b)-PEPC#9
사이, MON810 계통 후대 품종에 대해서는 hsp70-cryIA(b) 사이, T25 계통 후대 품종에 대해서는 pat-35S 터미네이터 사이, GA21 계통 후대 품종에 대해서는 m-epsps-NOS 터미네이터 사이, 및 OTP-m-epsps 사이, Roundup Ready Soy 계통 후대 품종에 대해서는 CPT4-CP4-epsps 사이를 증폭하도록 프라이머를 설계했다.
또한 계통 특이적은 아니지만 유전자 재조합체에 자주 사용되는 DNA 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍은 CaMV 35S 프로모터 서열 내부 또는 NOS 터미네이터 서열 내부를 증폭하도록 프라이머를 설계했다.
또한, 상기 생물이 가지는 특이한 내재성 유전자의 DNA 서열로서, 옥수수에 대해서는 zSSIIb 유전자의 내부 서열을, 콩에 대해서는 le1 유전자의 내부 서열을 선정하고, 이들 시퀀스를 게놈 데이터베이스 검색에 의해 취득하여 프라이머를 설계했다.
각 프라이머 쌍의 사이에는 프라이머의 Tm 값보다 10℃ 정도 높은 Tm 값을 가지는 프로브를 설계했다. (표 2A 및 표 2B)
표 2A. 옥수수용 프라이머/프로브
표 2A(계속)
〈서열표 프리 텍스트〉
SEQ ID NO: 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 77, 78, 79, 80: PCR 프라이머
SEQ ID NO: 17: 옥수수 zSSIIB용 프로브
SEQ ID NO: 20: CaMV 35S 프로모터용 프로브
SEQ ID NO: 23: NOS 터미네이터용 프로브
SEQ ID NO: 26: Event176용 프로브
SEQ ID NO: 29: Bt11용 프로브
SEQ ID NO: 32: GA21용 프로브
SEQ ID NO: 35: T25용 프로브
SEQ ID NO: 38: MON810용 프로브
SEQ ID NO: 41: Bt11용 프로브
SEQ ID NO: 44: GA21용 프로브
표 2B. 콩용 프라이머/프로브
표 2B(계속)
〈서열표 프리 텍스트〉
SEQ ID NO: 45, 46, 48, 49: PCR 프라이머
SEQ ID NO: 47: 콩 le1용 프로브
SEQ ID NO: 50: Roundup Ready Soy 용 프로브
실시예 3 프라이머 쌍의 특이성 확인(정성적 PCR)
실시예 2에서 설계한 프라이머 쌍이, 정성적 PCR 에서 목적으로 하는 서열만을 특이적으로 검지할 수 있는지 여부를 확인했다.
옥수수 시료로는 Bt11 계통 후대 품종, Event176 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종, GA21 계통 후대 품종, T25 계통 후대 품종, 비유전자 재조합 옥수수 Dairyland 1412를, 콩 시료로는 Roundup Ready Soy 계통 후대 품종, 비유전자 재조합 콩 Murayutaka 종을 이용하여, 각각의 시료로부터 실시예 1에 따라서 합계 8종 류의 DNA를 추출했다.
또, 실제의 분석 시료에는 옥수수나 콩 이외의 주요 곡식이 혼재하고 있을 가능성도 있기 때문에, 쌀(Kinuhikari 종), 밀(Haruyutaka 종), 보리(Harrington 종)로부터도 실시예 1에 따라서 합계 3종류의 DNA를 추출했다.
PCR의 주형으로서, 상기 합계 11종류의 DNA, 음성(陰性) 대조로서 증류수를 사용하여 정성적 PCR을 실시했다. 반응은 thermal cycler "PTC-200"(MJ Research Inc.)를 이용하여 행했다. 또, 이 실험에서 PCR 반응 용액 각각의 프라이머 최종 농도는 모두 0.5μM이 되도록 조제했다. 주형이 되는 시료로부터의 추출 DNA는 반응계당 25ng이 되도록 조제하고, PCR용 효소는 DNA 폴리머라아제 "AmpliTaq Gold"(PE Biosystems)를 이용하고, 반응계당 0.625 Unit이 되도록 조제했다. 반응 버퍼는 ×10PCR 버퍼 II(PE Biosystems)를 2.5㎕ 이용하고, MgCl2는 반응계당 1.5mM, dNTP는 200μM이 되도록 조제했다. 반응계의 액량은 25㎕이 되도록 증류수의 액량을 조정했다.
반응 조건은 95℃에서 10분간 유지한 후, 이후 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초를 1사이클로 하여 40사이클을 반복하여 행하고, 40사이클 종료 후에 72℃에서 7분 유지한 후, 4℃로 유지했다.
반응 종료 후, 반응액 중 5㎕을 분취하고 1㎕의 10×loading 버퍼와 혼합하고, 전기영동 장치 "Mupid 2"(Advance Co., Ltd.)를 이용하여, TAE 버퍼 중에서 100V, 15분의 조건으로 3% 아가로오스겔에 의한 전기영동을 행한 후, 에티듐브로마 이드(Sigma Chemical Co.)로 15분간 염색한 후, PCR 증폭 산물의 유무를 화상해석 장치 "Molecular ImagerR FX"(BioRad Laboratories Inc.)에 의해서 확인했다.
실험 결과의 일례를 도 2에 나타낸다. T25 계통 후대 품종 검지용으로 설계된 프라이머 쌍이 T25 계통 후대 품종만을 특이적으로 검지하여, 다른 시료와는 교차 반응하지 않는다는 것이 확인되었다.
동일한 방식으로 확인된 모든 시험 결과를 표 3에 통합했다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 모든 프라이머 쌍이 대상으로 하는 유전자 재조합체 계통의 후대 품종만 특이적으로 검지할 수 있는 것이 확인되었다.
표 3. 프라이머 쌍 및 프로브의 특이성
표 3(계속)
실시예 4 프라이머 쌍 및 프로브의 특이성 확인(정량적 PCR)
실시예 2에서 설계한 프라이머 쌍 및 프로브가 정량적 PCR에서 목적으로 하는 서열만을 특이적으로 검지할 수 있는지 여부를 확인했다.
실시예 3과 마찬가지로, 옥수수 시료로는 Bt11 계통 후대 품종, Event176 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종, GA21 계통 후대 품종, T25 계통 후대 품종, 비유전자 재조합 옥수수 Dairyland 1412를, 콩 시료로는 Roundup Ready Soy 계통 후대 품종, 비유전자 재조합 콩 Murayutaka 종을 이용하여, 각각의 시료로부터 실시예 1에 따라서 합계 8종류의 DNA를 추출했다.
또, 실제의 분석 시료에는 옥수수나 콩 이외의 주요 곡물이 혼재하고 있을 가능성도 있기 때문에, 쌀(Kinuhikari 종), 밀(Haruyutaka 종), 보리(Harrington 종)로부터도 실시예 1에 따라서 합계 3종류의 DNA를 추출했다.
PCR의 주형으로서, 상기 합계 11종류의 DNA, 음성 대조로서 증류수를 사용하여 정량적 PCR을 실시했다. 반응은 정량적 PCR 장치 "ABI PRISM 7700 Sequence Detector System"(PE Biosystems)를 이용하여 행했다. 또, 이 실험에 있어서, PCR 반응 용액 각각의 프라이머 최종 농도는 모두 0.5μM, 프로브의 최종 농도는 모두 0.2μM이 되도록 조제했다. 주형이 되는 시료로부터의 추출 DNA는 반응계당 50ng이 되도록 조제하고, TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Biosystems; 이하, 마스터믹스라고 함)는 반응계당 12.5㎕이 되도록 조제했다. 반응계의 액량은 25㎕로 했다.
반응 조건은 반응액을 50℃에서 2분간 유지한 후, 95℃에서 10분간 유지하고, 이후 95℃ 30초, 59℃ 1분을 1사이클로 하여 40사이클을 반복하여 행하고, 40사이클 종료 후는 25℃로 유지했다.
반응 과정에서는 각 반응 웰 중의 형광량을 경시적(經時的)으로 계측을 계속했다. 따라서 반응 종료 후에 반응 웰마다의 형광량의 경시적인 변화를 해석함으로써 형광량의 증가가 있었던 웰을 특정할 수 있다. 형광량은 PCR 증폭에 따르는 프로브의 분해에 의해서 증가하기 때문에, 형광량의 증가가 인지된 웰에서는 PCR 증폭이 일어나고 또한 프로브가 분해되어 있는 것으로 간주된다.
실험 결과의 일례를 도 3에 나타낸다. NOS 터미네이터 검지용으로 설계된 프라이머 쌍 및 프로브가 Bt11 계통 후대 품종, GA21 계통 후대 품종, Roundup Ready Soy 계통 후대 품종만을 특이적으로 검지하고, 다른 시료와는 교차 반응하지 않는 것이 확인되었다.
동일한 방식으로 확인된 모든 시험 결과를 표 4에 통합했다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 모든 프라이머 쌍 및 프로브가 대상으로 삼는 유전자 재조합체 계통의 후대 품종만 특이적으로 검지할 수 있는 것이 확인되었다.
표 4. 프라이머 쌍 및 프로브의 특이성
표 4(계속)
실시예 5 표준 분자의 제작(옥수수)
실시예 2에서 선정된 검지할 영역의 통합은 도 4에 모식적으로 나타내는 순서에 따라서 행했다.
즉, 표 5에 나타낸 tailed 프라이머를 이용하여 대응하는 유전자 재조합체 계통으로부터 추출한 DNA를 주형으로 한 PCR을 순차 행하여, 분자 말단에 다른 검지할 영역과 상보적인 서열을 가지는 PCR 산물을 얻었다.
PCR은 주형이 되는 옥수수 DNA를 10ng, tailed 프라이머를 각 0.5μM, DNA 폴리머라아제 "KOD"(TOYOBO Co., Ltd.)를 0.156 Unit, dNTP을 160μM, MgCl2를 1.5mM, ×10PCR 버퍼 II(TOYOBO Co., Ltd.)를 2.5㎕ 혼합한 것에 증류수를 가하여, 전량 25㎕의 반응계로 만들었다.
반응 조건은 98℃에서 1분간 유지한 후, 이후 98℃ 30초, 54℃ 30초, 74℃ 1분을 1사이클로 하여 35사이클을 반복하여 행하고, 35사이클 종료 후에 74℃에서 2분 유지한 후, 4℃로 유지했다.
얻어진 PCR 산물은 인접시키고자 하는 영역을 증폭시킨 PCR 산물과 함께 PCR을 이용한 통합 반응에 제공했다. 즉, 앞서 증폭한 각각의 PCR 산물을 0.25㎕씩, DNA 폴리머라아제 "KOD"(TOYOBO Co., Ltd.)를 0.156 Unit, dNTP을 160μM, MgCl2를 1.5mM, ×10PCR 버퍼 II(TOYOBO Co., Ltd.)를 2.5㎕에 증류수를 가하여 전량 24.5㎕의 반응계로 만들고, 우선 프라이머 없는 PCR 증폭을 행했다.
반응 조건은 98℃에서 1분간 유지한 후, 이후 98℃ 30초, 56℃ 30초, 74℃ 1분을 1사이클로 하여 8사이클을 반복 행하였을 때 반응을 정지했다.
그 후, 최외부의 프라이머를 각각 0.5μM 가한 후, 다시 PCR 증폭을 행하여 2개의 영역이 통합된 증폭 산물을 얻었다.
이 두번째 반응 조건은 98℃에서 1분간 유지한 후, 이후 98℃ 30초, 56℃ 30초, 74℃ 1분을 1사이클로 하여 35사이클을 반복하여 행하고, 35사이클 종료 후에 74℃에서 2분 유지한 후, 4℃로 유지했다.
동일한 통합 반응을 반복하여, 도 5 및 도 6에 나타내는 분자를 얻었다. 도 5에 나타내는 분자는 염기번호 1번으로부터 151번에 zSSIIb(GENBANK 접수번호 AF019297) 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 152번으로부터 252번에 CaMV 35S 프로모터증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 275번으로부터 425번에 NOS 터미네이터 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 441번으로부터 581번에 GA21 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 582번으로부터 730번에 T25 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 731번으로부터 843번에 MON810 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 844번으로부터 951번에 Event176 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 952번으로부터 1102번에 Bt11 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열이 통합되어 있다. 이 영역의 서열을 SEQ ID NO: 57에 나타내었다. 도 5의 분자의 염기 서열을 SEQ ID NO: 73에 기재했다.
또, 도 6에 나타내는 분자는 염기번호 1번으로부터 151번에 zSSIIb 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 152번으로부터 252번에 CaMV 35S 프로모터 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 275번으로부터 425번에 NOS 터미네이터 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 441번으로부터 573번에 GA21 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 574번으로부터 722번에 T25 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 723번으로부터 835번에 MON810 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 836번으로부터 943번에 Event176 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 944번으로부터 1071번에 Bt11 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열이 통합되어 있다. 도 6의 분자의 염기 서열을 SEQ ID NO: 74에 나타내었다.
표 5.
표 5(계속)
〈서열표 프리 텍스트〉
SEQ ID NO: 51∼72: PCR 프라이머
SEQ ID NO: 73∼74: 옥수수 유전자 재조합체의 정량적 검출을 위한 표준 분자의 증폭 영역
SEQ ID NO: 75: 콩 유전자 재조합체의 정량적 검출을 위한 표준 분자의 증폭 영역
상기의 통합 분자는 DNA 폴리머라아제 "AmpliTaq Gold"(PE Biosystems)에 의한 재증폭 후, TOPO TA Cloning Kit with TOP10F' Cells(Invitrogen Co.)를 이용하 여 플라스미드 벡터에 결찰하여, 대장균 숙주 벡터계를 이용하여 용이하게 무한 공급을 가능하도록 했다.
즉, 상기 통합 분자 1㎕을 주형으로 하여, 실시예 3과 동일한 조건으로 PCR 증폭을 행한 후, 반응액 1㎕와 키트에 포함되는 플라스미드 벡터 pCR2.1 TOPO 1㎕, 염용액 버퍼 1㎕을 혼합하고, 실온에서 5분간 정치한 후, 반응액 2㎕을 키트에 포함되는 대장균주 TOP10F' Cells와 혼합하여 얼음 상에서 5분간 정치 후 42℃ 30초의 열충격을 가하여 형질전환을 행했다.
형질전환체를 포함하는 용액 100㎕을 LB(ampicillin) 플레이트〔1L 당의 조성: 트립톤 펩톤(Difco Laboratories) 10g, 효모 추출물(Difco Laboratories) 5g, NaCl(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5g, 한천 분말(Syoei Kanten Ltd.) 15g, D[-]-α-아미노벤질페니실린(Ampicilin)나트륨(Sigma Chemical Co.) 50mg〕에 살포하고, 37℃ 하룻밤 정치하여 형질전환체를 얻었다.
얻어진 형질전환체는 각각의 콜로니에 대하여 콜로니 다이렉트(colony direct) PCR을 실행하고, 올바른 형질전환체를 선택했다. 즉, M13 포워드(forward) 프라이머, M13 리버스(reverse) 프라이머를 각각 0.5μM, DNA 폴리머라아제 "AmpliTaq Gold"(PE Biosystems)를 0.625 Unit, 반응 버퍼는 ×10PCR 버퍼 II(PE Biosystems)를 2.5㎕ 이용하고, MgCl2는 반응계당 1.5mM, dNTP는 200μM이 되도록 조제했다. 이것에 증류수를 가하여, 전량 25㎕의 반응계로 만들고, 이 용액에 이쑤시개로 뽑아 올린 콜로니를 현탁했다.
반응 조건은 95℃에서 5분간 유지한 후, 이후 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 90초를 1사이클로 하여 35사이클을 반복하여 행하고, 35사이클 종료 후에 72℃에서 90초 유지한 후, 4℃로 유지했다.
얻어진 PCR 증폭 산물을 아가로오스겔 전기영동 처리하여, 설계와 합치하는 증폭 산물이 인지된 콜로니에 대하여 40mL의 LB(ampicillin) 액체 배지〔1L당 조성: 트립톤 펩톤(Difco Laboratories) 10g, 효모 추출물(Difco Laboratories) 5g, NaCl(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5g, D[-]-α-아미노벤질페니실린(Ampicilin)나트륨(Sigma Chemical Co.) 50mg〕속에서 37℃로 하룻밤 배양했다.
대량 배양한 대장균 형질전환체로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN GmbH)을 이용하여 플라스미드를 추출했다. 플라스미드의 추출은 키트에 첨부된 프로토콜에 따랐다.
얻어진 플라스미드는 염기 서열에 에러가 없는 것을 확인하고 표준 분자로 사용했다(pMul4 및 pMul5: 도 7). 이 플라스미드 pMul4를 유지하는 대장균 E.coli-ASN-pMul4 및 플라스미드 pMul5를 유지하는 대장균 E.coli-ASN-pMul5는 모두 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 도1쵸메 1반 3고, 우편번호 305-8566)(현, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁센터, 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 도1-1-1 쥬오 다이6, 우편번호 305-8566)에 2000년 10월 12일부로 기탁되고, 각각 수탁번호 FERM BP-7319 및 FERM BP-7320가 부여되어 있다.
이들 분자를 정량적 PCR에 사용할 때에는 제한 효소 BamHI로 절단, 직쇄화된 분자를 이용했다. 이후의 실시예에서는 pMul4의 BamHI 소화물(pMul4 BamHI 소화물)을 표준 분자로서 이용했다.
실시예 6 표준 분자의 제작(콩)
실시예 5와 마찬가지로, 실시예 2에서 선정된 검지할 영역의 통합은 도 4에 모식적으로 나타내는 순서에 따라서 행했다.
즉, 표 5에 나타낸 tailed 프라이머를 이용하여 대응하는 유전자 재조합체 계통으로부터 추출한 DNA를 주형으로 한 PCR을 순차 행하여, 분자 말단에 다른 검지할 영역과 상보적인 서열을 가지는 PCR 산물을 얻은 후, 얻어진 PCR 산물은 인접시키고자 하는 영역을 증폭시킨 PCR 산물과 함께 PCR을 이용한 통합 반응에 제공했다.
상기에 관한 상세한 실험 조건은 모두 실시예 5의 조건과 동일했다.
통합 반응의 결과, 도 8 및 도 9에 나타내는 분자를 얻었다. 도 8에 나타내는 분자는 염기번호 1번으로부터 121번에 Roundup Ready Soy 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 122번으로부터 239번에 le1(GENBANK 접수번호 K00821 M30884) 증폭 대상 DNA 서열이 통합되어 있다. 도 8의 분자의 염기 서열을 SEQ ID NO: 75에 기재했다.
또, 도 9에 나타내는 분자는 염기번호 1번으로부터 121번에 Roundup Ready Soy 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 122번으로부터 239번에 le1 증폭 대상 DNA 서열, 염기번호 240번으로부터 419번에 425번에 NOS 터미네이터 증폭 대 상 DNA 서열, 염기번호 428번으로부터 528번에 CaMV 35S 프로모터 증폭 대상 DNA 서열이 통합되어 있다. 도 9의 분자의 염기 서열을 SEQ ID NO: 75에 기재했다.
〈서열표 프리 텍스트〉
SEQ ID NO: 75, 76: 콩 유전자 재조합체의 정량적 검출을 위한 표준 분자의 증폭 영역
실시예 5와 마찬가지로, 상기의 통합 분자는 TOPO TA Cloning Kit with TOP10F' Cells(Invitrogen Co.)를 이용하여 플라스미드 벡터에 결찰하고, 대장균 숙주 벡터계를 이용하여 용이하게 무한 공급을 가능하게 했다. 형질전환체로부터 얻어진 플라스미드는 염기 서열에 에러가 없는 것을 확인하여 표준 분자로 하였다(pMulSL 및 pMulSL2: 도 10, 도 11). 이 플라스미드 pMulSL을 유지하는 대장균 E.coli-ASN-pMulSL 및 플라스미드 pMulSL2를 유지하는 대장균 E.coli-ASN-pMulSL2는 모두 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 도1쵸메 1반 3고, 우편번호 305-8566)(현, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁센터, 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 도1-1-1 쥬오 다이6 우편번호 305-8566)에 2000년 10월 12일자로 기탁되고, 각각 수탁번호 FERM BP-7321 및 FERM BP-7322가 부여되어 있다.
이들 분자를 정량적 PCR에 사용할 경우에는 제한 효소 BamHI로 절단, 직쇄화한 분자를 이용했다. 이후의 실시예에서는 pMulSL의 BamHI 소화물(pMulSL BamHI 소화물)을 표준 분자로서 사용했다.
실시예 7 정성분석의 양성 대조로서의 사용
Bt11 계통 후대 품종, GA21 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종의 각 1 g으로부터 추출한 DNA를 등량 혼합하고, DNA 농도가 20ng/㎕이 되도록 조제했다. 이 DNA 용액을 옥수수 의사 혼입 시료로 사용하고, 시료 중의 유전자 재조합 옥수수의 유무를, 표준 분자를 양성 대조로 한 정성적 PCR에 의해 확인했다.
실험 기기, 반응액의 조성 등의 실험 조건은 실시예 3과 동일했다. 정성적 PCR은 표 2에 나타낸 모든 프라이머 쌍에 대하여 실시했다. PCR의 주형으로는 상기에서 조제한 DNA 용액, 양성 대상으로서 실시예 5에 나타낸 표준 분자 pMul4 BamHI 소화물, 음성 대조로서 증류수를 사용했다. 표준 분자 pMul4 BamHI 소화물은 반응계당 500분자가 되도록 첨가했다.
반응 종료 후는 실시예 3과 마찬가지로, 반응액 중 5㎕을 분취하여 3% 아가로오스겔을 이용한 전기영동을 행하고, 에티듐브로마이드 염색 후, PCR 증폭 산물의 유무를 화상해석 장치에 의해서 확인했다.
실험 결과, 도 12에 도시한 바와 같이, 시료 중에 유전자 재조합 옥수수로서 Bt11 계통 후대 품종, GA21 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종이 포함되는 것이 확인되었다. 또, 표준 분자 pMul4 BamHI 소화물이 정성분석의 양성 대조로서 적합하게 사용할 수 있음이 확인되었다.
특히 GA21 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종에 대해서는 현재 표준 시료가 시판되고 있지 않기 때문에, 일반 분석자는 양성 대조를 입수할 수 없다.
실시예 8 정량비의 결정(예비 시험-옥수수)
옥수수는 잡종 강세의 하이브리드이기 때문에, 정확한 정량비를 얻기 위해서 는 유전적으로 균질한 F1 종자 집단 내지 이것과 동등한 종자 집단을 필요로 한다. 따라서, 최초에 예비 시험으로서 이들 종자의 유전적 균질함을 정량적 PCR에 의해 확인했다.
이 예비 실험의 시료로서 Bt11 계통 후대 품종, Event176 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종, GA21 계통 후대 품종에 대해서는 각각의 F1 종자를 이용했다. T25 계통 후대 품종에 대해서는 F1 종자가 입수할 수 없었기 때문에 F2 종자를 이용했다. 이하에 실험을 상세하게 기술한다.
상기 5품종 각각 대하여 8입자의 종자 한 개씩 개별적으로 DNA를 추출하여, 실시예 5에 나타낸 pMul4 BamHI 소화물을 표준 시료로 하여 추출 DNA 중의 검지할 영역(실시예 2에서 선정한 것)의 분자수를 측정했다. 즉, 옥수수 내재성 유전자 zSSIIb 증폭 대상 DNA 서열에 대해서는 상기 5품종 각각으로부터 추출된 DNA를 주형으로 하고 정량적 PCR을 실행함으로써, 시료 중 이 영역의 분자수를 측정하고, CaMV 35S 프로모터의 증폭 대상 DNA 서열에 대해서는 Bt11 계통 후대 품종, Event176 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종, T25 계통 후대 품종의 각각으로부터 추출된 DNA를 주형으로 하고 정량적 PCR을 실행함으로써, 시료 중의 이 영역의 분자수를 측정했다. 동일한 방식으로, NOS 터미네이터의 증폭 대상 DNA 서열에 대해서는 Bt11 계통 후대 품종, GA21 계통 후대 품종의 각각으로부터 추출된 DNA를 주형으로 하고 정량적 PCR을 실행함으로써, 시료 중 이 영역의 분자수를 측정했다. 얻어진 측정값은 식(II)에 따라서 정량비로서 산출했다(도 13).
이 실험은 정량적 PCR 장치 "ABI PRISM 7700 Sequence Detector System"(PE Biosystems)를 이용하여 행했다. 또, 이 실험에서 PCR 반응 용액 각각의 프라이머 최종 농도는 CaMV 35S 프로모터 정량용, NOS 터미네이터 정량용, zSSIIb 정량용 모두 0.5μM, 프로브의 최종 농도는 CaMV 35S 프로모터 정량용, NOS 터미네이터 정량용, zSSIIb 정량용 모두 0.2μM이 되도록 조제했다. 주형이 되는 시료로부터의 추출 DNA는 반응계당 50ng이 되도록 조제하고, TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Biosystems; 이하 마스터믹스라고 함)는 반응계당 12.5㎕이 되도록 조제했다. 반응계의 액량은 25㎕로 하여, 동일한 반응을 항상 4회 병행하여 실시하여 얻어진 측정값으로부터 평균 측정값을 산출했다.
반응 조건은 반응액을 50℃에서 2분간 유지한 후, 95℃에서 10분간 유지하고, 이후 95℃ 30초, 59℃ 1분을 1사이클로 하여 40사이클을 반복하여 행하고, 40사이클 종료 후는 25℃로 유지했다.
CaMV 35S 프로모터를 정량하기 위해서, 표준 재조합 DNA 서열로서 반응계당 250분자, 1000분자, 50000분자가 되도록 3단계의 농도로 조제한 표준 분자 pMul4 BamHI 소화물, 또는 시료로서 각 한 알의 시료로부터 추출한 DNA 용액(전체 8점/품종), 또는 음성 대조로서 연어 정소(精巢) DNA 용액의 합계 12종류의 DNA 용액을 별도의 반응 튜브에 취하고, 이들 반응 튜브에 상기 최종 농도가 되도록, CaMV 35S 프로모터 정량용 프라이머 쌍과 CaMV 35S 프로모터 정량용 프로브, 마스터믹스를 혼합하여 반응액으로 만들었다.
마찬가지로, NOS 터미네이터를 정량하기 위해서, 표준 재조합 DNA 서열로서 반응계당 250분자, 1000분자, 50000분자가 되도록 3단계의 농도에 조제한 표준 분 자 pMul4 BamHI 소화물, 또는 시료로서 각 한 알의 시료로부터 추출한 DNA 용액(전체 8점/품종), 또는 음성 대조로서 연어 정소 DNA 용액의 합계 12종류의 DNA 용액을 별도의 반응 튜브에 취하고, 이들 반응 튜브에 상기 최종 농도가 되도록, NOS 터미네이터 정량용 프라이머 쌍과 NOS 터미네이터 정량용 프로브, 마스터믹스를 혼합하여 반응액으로 만들었다.
마찬가지로, 내재성 유전자 zSSIIb를 정량하기 위해서, 표준 재조합 DNA 서열로서 반응계당 250분자, 1000분자, 50000분자가 되도록 3단계의 농도에 조제한 표준 분자 pMul4 BamHI 소화물, 또는 시료로서 각 한 알의 시료로부터 추출한 DNA 용액(전체 8점/품종), 또는 음성 대조로서 연어 정소 DNA 용액의 합계 12종류의 DNA 용액을 별도의 반응 튜브에 취하고, 이들 반응 튜브에 상기 최종 농도가 되도록, zSSIIb 정량용 프라이머 쌍과 zSSIIb 정량용 프로브, 마스터믹스를 혼합하여 반응액으로 만들었다.
반응 과정에서는 PCR 증폭에 따르는 프로브의 분해를 형광량의 증가로서 경시적으로 계측을 계속했다. 따라서, 정량 표준으로서 반응에 제공한 3점(×4회 반복)의 시료에 대하여(사이클수-형광량)의 그래프(도 14)를 그리면, 반응 개시 시의샘플 중의 증폭 대상 DNA 서열의 분자수와, 반응 튜브로부터 방출되는 형광량이 일정량에 도달할 때까지 걸린 시간과의 상관식을 얻을 수 있다(도 15). 이것을 검량선으로 함으로써 반응 개시 시의 정량 샘플 중의 CaMV 35S 프로모터의 증폭 대상 DNA 서열의 분자수 및 NOS 터미네이터의 증폭 대상 DNA 서열의 분자수, zSSIIb의 증폭 대상 DNA 서열의 분자수를 알 수 있다(표 6).
표 6. zSSIIB, CaMV 35S 프로모터, NOS의 각 DNA 서열의 분자수
표 6(계속)
도 13에 나타낸 바와 같이, Bt11 계통 후대 품종, Event176 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종, GA21 계통 후대 품종에 대해서는 8입자의 종자로부터 얻어진 DNA에 대하여 대략 일정한 정량비가 산출되어, 시료가 유전적으로 균질한 F1 집단인 것이 확인되었다. 그러나, F1 종자가 입수할 수 없었던 T25 계통 후대 품종에 대해서는 예상대로 도입된 DNA 서열의 유무에 대하여 멘델(Mendel) 법칙에 따르는 분산이 인지되었다. 따라서, T25 계통 후대 품종에 대해서는 F1 집단과 동등한 유전자 구성을 가지는 것이 확인된 종자(도 13 중에 화살표로 나타낸 것)만을 선별하여, 이 집단을 유전적으로 균질한 F1 종자 집단과 동등한 종자 집단으로서 이후의 실험에서 사용하는 것으로 했다.
실시예 9 정량비의 결정(예비 시험-콩)
실시예 8과 마찬가지로, 콩에 대하여도 예비 시험을 실시했다. 예비 시험의 시료로서 Roundup Ready Soy 계통 후대 품종의 F1 종자를 이용했다.
실시예 8과 마찬가지로, Roundup Ready Soy 계통 후대 품종의 F1 종자 8입자에 대하여 각각의 입자로부터 DNA를 추출하여, 실시예 6에 나타낸 pMulSL BamHI 소 화물을 표준 시료로 하여 추출 DNA 중의 검지할 영역(실시예 2에서 선정한 것)의 분자수를 측정했다.
즉, 추출된 DNA를 주형으로 한 정량적 PCR을, 콩 내재성 유전자 le1의 증폭 대상 DNA 서열, Roundup Ready Soy 계통 특이적 DNA 서열 각각 대하여 행함으로써, 시료 중의 각각의 영역의 분자수를 측정했다. 실험의 결과 얻어진 측정값은 식(II)에 따라서 정량비로서 산출했다(도 16).
또한, 실험 기기, 반응액의 조성 등의 실험 조건은 실시예 8과 동일했다. 단, 프라이머, 프로브는 콩 내재성 유전자 le1의 증폭 대상 DNA 서열, Roundup Ready Soy 계통 특이적 증폭 대상 DNA 서열 각각에 대응한 것을 이용했다.
실험 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, Roundup Ready Soy 계통 후대 품종에 대해서는 8입자의 종자로부터 얻어진 DNA에 대하여 대략 일정한 정량비가 산출되어, 시료가 유전적으로 균질한 F1 집단인 것이 확인되었다. 따라서, 이 집단을 이후의 실험에서 사용하는 것으로 했다.
실시예 10 정량비의 결정(옥수수)
예비 시험의 결과로서 얻어진 유전적으로 균질한 F1 종자 집단 내지 이것과 동등한 종자 집단을 이용하여 정량비를 결정하는 본 시험을 실시했다. 즉, 각 품종에 대하여, 이들 유전적으로 균질한 집단으로부터 추출된 DNA를 주형으로서 예비 시험과 동일의 방법을 이용하여 실시예 5에 나타낸 pMul4 BamHI 소화물을 표준 시료로서 추출 DNA 중의 검지할 영역(실시예 2에서 선정한 것)의 분자수를 정량했다.
본 시험에서는 예비 시험으로 정량한 증폭 대상 DNA 서열뿐 아니라 품종 특 이적 증폭 대상 DNA 서열에 대하여도 실시했다. 이들 품종 특이적 증폭 대상 DNA 서열에 대해서는 각각 대응하는 품종에 대하여 시료 중의 대상 영역의 분자수를 측정했다.
또한, 실시예 9와 마찬가지로, 프라이머, 프로브를 정량하는 대상마다 변경한 것 이외에는 실험기기, 반응액의 조성 등의 실험 조건은 실시예 8과 동일했다.
예비 시험과 같이, 얻어진 측정값은 식(II)에 따라서 정량비로서 산출했다. 즉, CaMV 35S 프로모터의 증폭 대상 DNA 서열, NOS 터미네이터의 증폭 대상 DNA 서열, 품종 특이적 증폭 대상 DNA 서열의 분자수를, 각각 동일한 시료에 있어서 측정한 zSSIIb 증폭 대상 DNA 서열의 분자수로 나눔으로써, 각각의 고유의 정량비를 얻었다. (표 7)
표 7. 옥수수 유전자 재조합 계통(X)에서의 정량비(Kx)
또한, 내재성 유전자 zSSIIB 증폭용 프라이머에 대해서는 대조 증폭 서열의 길이가 짧은 2조의 프라이머(SSIIb 2-5'/SSIIb 2-3', SSIIb 3-5'/SSIIb 3-3')도 설계했다. 이들을 내재성 유전자 증폭용 프라이머로서 이용한 경우의 정량비에 대하여도 구하였다(표 8, 표 9).
표 8. SSIIb 2-5'/SSIIb 2-3'에 의한 정량비
표 9. SSIIb 3-5'/SSIIb 3-3'에 의한 정량비
실시예 11 정량비의 결정(콩)
콩에 대하여도 예비 시험의 결과로서 얻어진 유전적으로 균질한 종자 집단을 이용하여 정량비를 결정하는 시험을 실시했다. 즉, 각 품종에 대하여, 이들 유전적으로 균질한 집단으로부터 추출된 DNA를 주형으로서 예비 시험과 동일한 방법을 이용하여 실시예 6에 나타낸 pMulSL BamHI 소화물을 표준 시료로서 추출 DNA 중의 콩 내재성 유전자 le1의 증폭 대상 DNA 서열, Roundup Ready Soy 계통 특이적 DNA 서열에 대하여 각각의 분자수를 측정했다.
또, 실시예 9와 마찬가지로, 프라이머, 프로브를 정량하는 대상마다 변경한 이외는 실험기기, 반응액의 조성 등의 실험 조건은 실시예 8과 동일했다.
예비 시험과 마찬가지로, 얻어진 측정값은 식(II)에 따라서 정량비로서 산출했다. 즉, Roundup Ready Soy 계통 특이적 DNA 서열의 분자수를, 동일한 시료에 있어서 측정한 콩 내재성 유전자 le1의 증폭 대상 DNA 서열의 분자수로 나눔으로써 고유의 정량비를 얻었다. (표 10)
표 10. 콩 유전자 재조합 계통(X)에서의 정량비(Kx)
실시예 12 의사 혼입 시료를 이용한 정량
각각의 유전자 재조합체 계통의 분쇄물을 비유전자 재조합 계통의 분쇄물에 혼합하고, 의사 혼입 시료를 작성했다. 이들 의사 혼입 시료에 대하여, 실제로 유전자 재조합체의 존재비의 정량을 실시하여 정량 분석법의 능력을 확인했다.
즉, 유전자 재조합체 계통, 및 비유전자 재조합체 계통의 종자를 이용하여, 실시예 1에 기재한 방법으로 의사 혼입 시료를 제작하고, 이들로부터 DNA를 추출했다. 의사 혼입 시료로서, 옥수수에 대해서는 Bt11 계통 후대 품종, Event176 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종, T25 계통 후대 품종 각각 대하여, 0.1%, 1%, 5%(중량비)가 되도록 제작된 합계 12종류의 혼합물을 준비했다.
이들 의사 혼입 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여, 실시예 5에서 제작한 표준 분자를 제한 효소 BamHI로 절단, 직쇄화한 분자(pMul4 BamHI 소화물)를 이용하여 정량적 PCR을 실행함으로써 각각의 의사 혼입 시료에 대하여 내재성 유전자의 증폭 대상 DNA 서열 부분 서열과 재조합 DNA 서열의 증폭 대상 DNA 서열 부분서열의 분자수를 측정하고, 실시예 10, 실시예 11에서 결정한 정량비를 이용하여 유 전자 재조합체의 존재비를 구했다.
어느 대상을 정량할 경우에도, PCR 반응 용액 각각의 프라이머 최종 농도는 0.5μM, 정량용 프로브의 최종 농도는 0.2μM이 되도록 조제했다. 주형이 되는 시료로부터의 추출 DNA는 반응계당 50ng이 되도록 조제하고, 마스터믹스는 반응계당 12.5㎕이 되도록 조제했다. 반응계의 액량은 25㎕로 하고, 동일한 반응을 항상 4회 병행 실시하여 얻어진 측정값으로부터 평균 측정값을 산출했다.
반응 조건은 반응액을 50℃에서 2분간 유지한 후, 95℃에서 10분간 유지하고, 이후 95℃ 30초, 59℃ 1분을 1사이클로 하여 40사이클을 반복해서 행하고, 40사이클 종료 후는 25℃로 유지했다.
각 증폭 대상 DNA 서열을 정량하기 위해서, 표준 재조합 DNA 서열로서 반응계당 10분자, 50분자, 250분자, 1000분자, 50000분자가 되도록 5단계의 농도로 조제한 표준 분자 pMul4 BamHI 소화물, 또는 시료로서 0.1%, 1%, 5% 의사 혼입 시료로부터 추출한 DNA 용액, 또는 음성 대조로서 연어 정소 DNA 용액의 합계 9종류의 DNA 용액을 별도의 반응 튜브에 취하고, 이들 반응 튜브에 상기 최종 농도가 되도록 프라이머 쌍과 정량용 프로브, 마스터믹스를 혼합하여 반응액으로 만들었다.
반응 과정에서는 PCR 증폭에 따르는 프로브의 분해를 형광량의 증가로서 경시적으로 측정을 계속했다. 따라서, 표준 재조합 DNA 서열로서 반응에 제공한 5점(×4회 반복)의 시료에 대하여(사이클수-형광량)의 그래프를 그리면, 반응 개시 시 시료 중 증폭 대상 DNA 서열의 분자수와, 반응 튜브로부터 방출되는 형광량이 일정량에 도달할 때까지 걸린 시간과의 상관식을 얻을 수 있다. 이것을 검량선으로 함으로써 반응 개시 시 시료 중의 각 증폭 대상 DNA 서열의 분자수를 알 수 있다(표 11).
표 11. 각 증폭 대상 DNA 서열의 분자수
표 11(계속)
얻어진 DNA 서열의 분자수에 관한 측정값은 실시예 10, 실시예 11에서 결정된 정량비의 값과 식(I)을 이용하여 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비로 변환할 수 있다. 변환을 실시한 결과를 표 10에 나타낸다. 어느 경우에나 유전자 재조합체 계통 후대 품종을 중량비로 0.1% 내지 1% 내지 5% 포함하는 의사 혼입 시료가 양호하게 정량될 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 13 표준 분자를 이용한 유전자 재조합체 존재비의 정량(1)
3계통의 유전자 재조합 옥수수를 포함하는 의사 혼입 시료를 준비하고, CaMV 35S 프로모터와 옥수수가 가지는 특이한 내재성 유전자인 zSSIIb를 타겟으로 한 정량적 PCR을 실행하고, 이 시료 중의 유전자 재조합 옥수수 존재비를 정량했다. 표준물질로서, 실시예 5에 나타낸 pMul4 BamHI 소화물을 이용했다.
여기서 사용한 옥수수 의사 혼입 시료는 유전자 재조합 옥수수로서, Bt11 계통 후대 품종, Event176 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종의 분쇄물을 각 1%(중량비)씩, 비유전자 재조합 옥수수 품종으로서 Dairyland 1412의 분쇄물을 97%(중량비)가 되도록 혼합한 것(1% mix), 및 Bt11 계통 후대 품종, Event176 계통 후대 품종, MON810 계통 후대 품종의 분쇄물을 각 5%(중량비)씩, 비유전자 재조합 옥수수 품종으로서 Dairyland 1412의 분쇄물을 85%(중량비)가 되도록 혼합한 것(5% mix)이다.
또한, 이 실험에서는 실제의 분석 상황을 모방하여, 실험 시에 분석자가 이들 3종의 계통의 유전자 재조합체가 각각 어느 정도 시료 중에 존재하는가 하는 정보를 사전에 일체 알 수 없는 상황을 상정했다.
이 경우도, PCR 반응 용액 각각의 프라이머 최종 농도는 CaMV 35S 프로모터 정량용, zSSIIb 정량용 모두 0.5μM, 프로브의 최종 농도는 CaMV 35S 프로모터 정 량용, zSSIIb 정량용 모두 0.2μM이 되도록 조제했다. 주형이 되는 시료로부터의 추출 DNA는 반응계당 50ng이 되도록 조제하고, 마스터믹스는 반응계당 12.5㎕이 되도록 조제했다. 반응계의 액량은 25㎕로 하여, 동일한 반응을 항상 4회 반복으로 실시하여 얻어진 측정값으로부터 평균 측정값을 산출했다.
반응 조건은 반응액을 50℃에서 2분간 유지한 후, 95℃에서 10분간 유지하고, 이후 95℃ 30초, 59℃ 1분을 1사이클로 하여 40사이클을 반복하여 행하고, 40사이클 종료 후는 25℃로 유지했다.
CaMV 35S 프로모터를 정량하기 위해서, 표준 재조합 DNA 서열로서 반응계당 10분자, 50분자, 250분자, 1000분자, 50000분자가 되도록 5단계의 농도로 조제한 표준 분자 pMul4 BamHI 소화물, 또는 시료로서 옥수수 의사 혼입 시료로부터 추출한 DNA 용액, 또는 음성 대조로서 연어 정소 DNA 용액의 합계 7종류의 DNA 용액을 별도의 반응 튜브에 취하고, 이들 반응 튜브에 상기 최종 농도가 되도록 CaMV 35S 프로모터 정량용 프라이머 쌍과 CaMV 35S 프로모터 정량용 프로브, 마스터믹스를 혼합하여 반응액으로 만들었다.
마찬가지로, 내재성 유전자 zSSIIb를 정량하기 위해서, 표준 재조합 DNA 서열로서 반응계당 10분자, 50분자, 250분자, 1000분자, 50000분자가 되도록 5단계의 농도로 조제한 표준 분자 pMul4 BamHI 소화물, 또는 시료로서 옥수수 의사 혼입 시료로부터 추출한 DNA 용액, 또는 음성 대조로서 연어 정소 DNA 용액의 합계 7종류의 DNA 용액을 별도의 반응 튜브에 취하고, 이들 반응 튜브에 상기 최종 농도가 되도록, zSSIIb 정량용 프라이머 쌍과 zSSIIb 정량용 프로브, 마스터믹스를 혼합하여 반응액으로 만들었다.
반응 과정에서는 PCR 증폭에 따르는 프로브의 분해를 형광량의 증가로서 경시적으로 계측을 계속했다. 따라서, 정량 표쥰으로서 반응에 제공한 5점(×4회 반복)의 시료에 대하여(사이클수-형광량)의 그래프를 그리면, 반응 개시 시의 샘플 중의 증폭 대상 DNA 서열의 분자수와, 반응 튜브로부터 방출되는 형광량이 일정량에 도달할 때까지 걸린 시간과의 관계를 검량선으로 함으로써 반응 개시 시의 정량 샘플 중 CaMV 35S 프로모터의 증폭 대상 DNA 서열의 분자수 및 zSSIIb의 증폭 대상 DNA 서열의 분자수를 알 수 있다(표 12).
여기서 정량 장치로 이용한 ABI PRISM 7700 Sequence Detector System(PE Biosystems)는 96점의 시료에 대하여 동시에 반응을 행할 수 있기 때문에, 상기 시험은 1회의 정량적 PCR을 실행함으로써 달성된다.
얻어진 DNA 서열의 분자수에 관한 측정값은 실시예 10에서 결정된 정량비의 값과 식(I)을 이용하여 시료 중의 CaMV 35S 프로모터를 가지는 유전자 재조합 옥수수의 존재비로 변환할 수 있다. 단, 이 실험에서는 어느 계통의 유전자 재조합체가 어느 정도 시료 중에 존재하는가 하는 정보를 사전에 알 수 없기 때문에, 3종류의 정량비 모두에 대하여 개별적으로 계산하여, 환산치로서 표현하게 되지만, 일회의 정량적 PCR에 의해서 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비를 알 수 있었다(표 12).
표 12. 유전자 재조합체 존재비의 정량(1)
*1: Bt11, Event176, MON810 각 1%를 포함하는 의사 혼입 시료(유전자 재조합 옥수수를 합계 3% 포함함)
*2: Bt11, Event176, MON810 각 5%를 포함하는 의사 혼입 시료(유전자 재조합 옥수수를 합계 15% 포함함)
실시예 14 표준 분자를 이용한 유전자 재조합체 존재비의 정량(2)
실시예 13에서 정량에 제공한 옥수수 의사 혼입 시료와 동일한 시료에 대하여, 3종류의 계통 특이적인 DNA 서열과 옥수수가 가지는 특이한 내재성 유전자인 zSSIIb를 타겟으로 한 정량적 PCR을 실행하고, 이 시료 중의 유전자 재조합 옥수수 존재비를 계통마다 정량한 후, 얻어진 각각의 정량치를 가산하여, 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비를 구했다. 실시예 13와 같이, 표준 물질로서 실시예 5에 나타낸 pMul4 BamHI 소화물을 이용했다.
이 실험에 있어서도, 실제의 분석 상황을 모방하여, 실험 시에 분석자가 이들 3종의 계통의 유전자 재조합체가 어느 정도 시료 중에 존재하는가 하는 정보를 사전에 일체 알 수 없다고 하는 상황을 상정했다.
반응액의 조성, 반응 조건, 해석 방법은 실시예 13과 동일한 방식으로, CaMV 35S 프로모터를 정량하는 대신에, Bt11 계통 후대 품종 특이적 서열의 정량, Event176 계통 후대 품종 특이적 서열의 정량, MON810 계통 후대 품종 특이적 서열의 정량을 각각 실시했다. 즉, 이 실험에서는 zSSIIb를 포함하여 합계 4종류의 증폭 대상 DNA 서열에 대하여 각각 정량적 PCR을 실시했다. 따라서 이 시험에서는 ABI PRISM 7700 Sequence Detector System(PE Biosystems)를 합계 3회 가동시켜 실시했다.
각각의 증폭 대상 DNA 서열의 반응 개시 시 샘플 중의 분자수와, 반응 튜브로부터 방출되는 형광이 일정량에 도달할 때까지 걸린 시간과의 관계를 검량선으로 함으로써 반응 개시 시의 정량 샘플 중의 증폭 대상이 된 계통 특이적 DNA 서열의 분자수 및 zSSIIb의 증폭 대상 영역의 분자수를 알 수 있었다(표 13).
실시예 13과 같이, 얻어진 DNA 서열의 분자수에 관한 측정값은 실시예 10에서 결정된 정량비의 값과 식(I)을 이용하여 시료 중 유전자 재조합 옥수수의 각 계통의 존재비로 변환할 수 있다. 이 실험에서는 계통에 특이적인 DNA 서열을 정량하기 때문에, 실시예 13에 나타낸 바와 같은 값의 폭이 생길 여지는 없다. 따라서, 분석을 위해 복수회의 정량적 PCR 장치를 가동할 필요가 있지만, 상기 방법에 의해서 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비를 보다 정확하게 알 수 있었다(표 13).
표 13. 유전자 재조합체 존재비의 정량(2)
*1: Bt11, Event176, MON810 각 1%를 포함하는 의사 혼입 시료(유전자 재조합 옥수수를 합계 3% 포함함)
*2: Bt11, Event176, MON810 각 5%를 포함하는 의사 혼입 시료(유전자 재조합 옥수수를 합계 15% 포함함)
본 발명의 방법에 의해, 복수의 유전자 재조합체 계통이 존재하고 있다고 생각되는 시료에 있어서, 재조합체 계통의 유무, 및 존재비가 미지인 그 시료 중의 재조합체의 존재비를 간편하게 조사할 수 있고, 또한 집단 중의 재조합체의 존재비를 정확하게 정량할 수 있으며, 특히 특정한 유전자 재조합체 계통의 존재비가 미지인 시료 중에서 그 특정한 재조합체 계통의 존재비를 정확하게 정량할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 재조합 DNA 서열의 정량에 제공하는 영역과 상기 생물종의 내재성 유전자의 DNA 서열을 동일 분자 중에 가지는 표준 분자를 사용한다. 이 표준 분자에는 항상 정량에 제공하는 영역이 도입 형태에 따른 정수비로 존재하기 때문에, 상기 식(II)에 기재된 정량비를 양호한 재현성으로 구할 수 있고, 따라서 본 발명의 방법은 시료 중에서 특정한 재조합체 계통의 존재비를 정확하게 정량할 수 있다.
또, 정량비가 결정된 이후의 분석에서는 표준 시료로서의 순수한 유전자 재조합체는 필요하지 않게 되기 때문에, 일반 분석자에 의한 표준 시료의 입수에 관계된 어려움이 해소된다.
또한, 본 발명의 유전자 재조합체 검지용 표준 분자가 공급됨으로써, 넓은 적용 범위를 가진 정확한 분석법을 널리 이용할 수 있게 되는 유전자 재조합체에 대한 분자생물학적 분석법의 실용성 향상으로 이어진다.
<110> Asahi Breweries, Ltd.
Nippon Flour Mills Co., Ltd.
National Food Research Institute
<120> Method of quantifying genetic modification and
standard molecule to be used therein
<130> Y1I0978
<140>
<141>
<150> JP 2000-326738
<151> 2000-10-26
<160> 80
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 1
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<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 2
tggattttgg ttttaggaat tagaaa 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
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<211> 25
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:probe for
Event176
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 27
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 28
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<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:probe for Bt11
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Fam-a
<220>
<221> modified_base
<222> (29)
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<400> 29
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 30
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<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 31
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<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:probe for GA21
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Fam-c
<220>
<221> modified_base
<222> (27)
<223> t-Tamra
<400> 32
ngaatttccc cgatcgttca aacattn 27
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 33
gccagttagg ccagttaccc a 21
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 34
tgagcgaaac cctataagaa ccct 24
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:probe for T25
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Fam-c
<220>
<221> modified_base
<222> (26)
<223> t-Tamra
<400> 35
natgcccgct gaaatcacca gtctcn 26
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 36
gatgccttct ccctagtgtt ga 22
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 37
ggatgcactc gttgatgttt g 21
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:probe for
MON810
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Fam-a
<220>
<221> modified_base
<222> (26)
<223> a-Tamra
<400> 38
ngataccaag cggccatgga caacan 26
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 39
caatgcgttc tccaccaagt act 23
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 40
aaaagaccac aacaagccgc 20
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:probe for Bt11
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Fam-c
<220>
<221> modified_base
<222> (27)
<223> a-Tamra
<400> 41
ngaccatgga caacaaccca aacatcn 27
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 42
atccggttgg aaagcgactt 20
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 43
gaagcctcgg caacgtca 18
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:probe for GA21
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Fam-a
<220>
<221> modified_base
<222> (20)
<223> g-Tamra
<400> 44
naggatccgg tgcatggccn 20
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 45
gccctctact ccaccccca 19
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 46
gcccatctgc aagccttttt 20
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:probe for soy
le1
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Fam-a
<220>
<221> modified_base
<222> (26)
<223> c-Tamra
<400> 47
ngcttcgccg cttccttcaa cttcan 26
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 48
cctttaggat ttcagcatca gtgg 24
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 49
gacttgtcgc cgggaatg 18
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:probe for
Roundup Reay Soy
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> Fam-a
<220>
<221> modified_base
<222> (19)
<223> c-Tamra
<400> 50
ngcaaccgcc cgcaaatcn 19
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 51
catttggaga ggtcgatttc tctcttg 27
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 52
gagagaaatc gacctctcca aatgaaa 27
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 53
tatcacatca atgcccgggc gaatcctgtt gccgg 35
<210> 54
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 54
ggcaacagga ttcgcccggg cattgatgtg atatct 36
<210> 55
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 55
aaactaggat aaatcgcaag accggca 27
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 56
tcggggaagc tctgagcgaa accctat 27
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 57
ggcctaactg gcggatgcac tcgttga 27
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 58
acgagtgcat ccgccagtta ggccagt 27
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 59
ggagaaggca tcgactgact actccac 27
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 60
gagtagtcag tcgatgcctt ctcccta 27
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 61
tgctggtgaa cacggcaaca ggattca 27
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 62
atcctgttgc cgtgttcacc agcagca 27
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 63
cggcgacaag tcgcccatct gcaagcc 27
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 64
ttgcagatgg gcgacttgtc gccggga 27
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 65
aaactaggat aaatccggtt ggaaagc 27
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 66
ttccaaccgg atttatccta gtttgcg 27
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 67
tgccgaggct tctgagcgaa accctat 27
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 68
gggtttcgct cagaagcctc ggcaacg 27
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 69
tgctggtgaa catcaatgcg ttctcca 27
<210> 70
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 70
agaacgcatt gatgttcacc agcagca 27
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 71
ggagtagagg gcttatccta gtttgcg 27
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PCR primer
<400> 72
aaactaggat aagccctcta ctccacc 27
<210> 73
<211> 1102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:amplification
region of the standard molecule for quantitative
detection of maize transformants
<400> 73
ctcccaatcc tttgacatct gctccgaagc aaagtcagag cgctgcaatg caaaacggaa 60
cgagtggggg cagcagcgcg agcaccgccg cgccggtgtc cggacccaaa gctgatcatc 120
catcagctcc tgtcaccaag agagaaatcg acctctccaa atgaaatgaa cttccttata 180
tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 240
tatcacatca atgcccgggc gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 300
ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 360
tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 420
tagcgcgcaa actaggataa atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 480
attgccaaat gtttgaacga tcggggaaat tcgtcgaagc ttcttctaga gcttaattct 540
tgacgaaagt gctcagcaca tcgaagtagt cggggaaggt ctgagcgaaa ccctataaga 600
accctaattc ccttatctgg gaactactca cacattatta tagagagaga tagatttgta 660
gagagagact ggtgatttca gcgggcatgc ctgcaggtcg actcagatct gggtaactgg 720
cctaactggc ggatgcactc gttgatgttt gggttgttgt ccatggccgc ttggtatctg 780
cattacaatg aaatgagcaa agactatgtg agtaacactg gtcaacacta gggagaaggc 840
atcgactgac tactccactt tgtgcagaac agatctagag ctcctacacc tgatcgatgt 900
ggtagtcggt cacgtcggtc ttcaggccga tctggttgct gctggtgaac acggcaacag 960
gattcaatct taagaaactt tattgccaaa tgtttgaacg atcctgatct tcagtactca 1020
gcctcgaagg taacttcggc aggcacaaac tcaatacggt caatgtacac ttcattgcca 1080
gaattgaaca catgagcgct aa 1102
<210> 74
<211> 1071
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:amplification
region of the standard molecule for quantative
detection of maize transformants
<400> 74
ctcccaatcc tttgacatct gctccgaagc aaagtcagag cgctgcaatg caaaacggaa 60
cgagtggggg cagcagcgcg agcaccgccg cgccggtgtc cggacccaaa gctgatcatc 120
catcagctcc tgtcaccaag agagaaatcg acctctccaa atgaaatgaa cttccttata 180
tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 240
tatcacatca atgcccgggc gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 300
ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 360
tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 420
tagcgcgcaa actaggataa atccggttgg aaagcgactt ggaccccggc agcttgacgg 480
tgccggagat ctccttgatg ggctgcagca cgatctcctc ggcgccggcc atgcaccgga 540
tccttccgcc gttgctgacg ttgccgaggc ttctgagcga aaccctataa gaaccctaat 600
tcccttatct gggaactact cacacattat tatagagaga gatagatttg tagagagaga 660
ctggtgattt cagcgggcat gcctgcaggt cgactcagat ctgggtaact ggcctaactg 720
gcggatgcac tcgttgatgt ttgggttgtt gtccatggcc gcttggtatc tgcattacaa 780
tgaaatgagc aaagactatg tgagtaacac tggtcaacac tagggagaag gcatcgactg 840
actactccac tttgtgcaga acagatctag agctcctaca cctgatcgat gtggtagtcg 900
gtcacgtcgg tcttcaggcc gatctggttg ctgctggtga acatcaatgc gttctccacc 960
aagtacttca acttctgggt tactcaagca gttgtatgga atgcattcgt tgatgtttgg 1020
gttgttgtcc atggtcgact ctagaggatc cgcggcttgt tgtggtcttt t 1071
<210> 75
<211> 239
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:amplification
region of the standard molecule for quantitative
detection of soy transformants
<400> 75
cctttaggat ttcagcatca gtggctacag cctgcatgct tcacggtgca agcagccggc 60
ccgcaaccgc ccgcaaatcc tctggccttt ccggaaccgt ccgcattccc ggcgacaagt 120
cgcccatctg caagcctttt tgtgtcaggg gcatagaagg tgaagttgaa ggaagcggcg 180
aagctggcaa cgctaccggt ttctttgtcc caaatgtgga tgggggtgga gtagagggc 239
<210> 76
<211> 528
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:amplification
region of the standard molecule for quantitative
detection of soy transformants
<400> 76
cctttaggat ttcagcatca gtggctacag cctgcatgct tcacggtgca agcagccggc 60
ccgcaaccgc ccgcaaatcc tctggccttt ccggaaccgt ccgcattccc ggcgacaagt 120
cgcccatctg caagcctttt tgtgtcaggg gcatagaagg tgaagttgaa ggaagcggcg 180
aagctggcaa cgctaccggt ttctttgtcc caaatgtgga tgggggtgga gtagagggct 240
tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga 300
ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata acgtcatgca ttacatgtta attattacat 360
gcttaacgta attcaacaga aattatatga taatcatcgc aagaccggca acaggattcg 420
cccgggcatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct 480
tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagagg 528
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCR primer
<400> 77
tcccaatcct ttgacatctg ct
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCR primer
<400> 78
gacaggagct gatggatgat cag
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCR primer
<400> 79
ccaatccttt gacatctgct cc
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCR primer
<400> 80
gatcagcttt gggtccgga
Claims (44)
- 하나 이상의 유전자 재조합체 계통을 포함하는 시료에서의 유전자 재조합체의 존재비를 정량하기 위한 정량적 검지 방법으로서,(i) 상기 시료 중의 유전자 재조합체에 유래하는 DNA 시료 중에 존재할 가능성이 있는 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열, 및 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 분자를 표준 분자로 하고, 상기 DNA 시료 중의 상기 특이적인 DNA 서열 및 내재성 DNA 서열에 대하여 각각 정량적 PCR을 실행하는 단계,(ii) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계,(ii) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계, 및(iii) 이하의 식(I)에 따라서 상기 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비를 결정하는 단계를 포함하는 정량적 검지 방법:(시료 중 유전자 재조합체의 존재비)=100×[(시료 중 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수)/(시료 중 내재성 DNA 서열의 분자수)]/(정량비)(%) (I)[상기 식에서, (정량비)는 각 유전자 재조합체 계통에 대하여 이하의 식(II)에 의해 미리 계산되는 값의 조 중의 임의의 값임:(정량비)=(각 유전자 재조합체 계통 중 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수)/(유전자 재조합체 중 내재성 DNA 서열의 분자수) (II)].
- 하나 이상의 유전자 재조합체의 계통을 포함하는 시료 중의 각 유전자 재조합체 계통의 존재비를 정량하기 위한 정량적 검지 방법으로서,(i) 상기 시료 중의 유전자 재조합체에 유래하는 DNA 시료 중에 존재할 가능성이 있는 각 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열, 및 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열을 동일 분자 상에 포함하는 분자를 표준 분자로 하고, 상기 DNA 시료 중의 상기 각 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열 및 상기 내재성 DNA 서열에 대하여 각각 정량적 PCR을 실행하는 단계,(i) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 각 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계,(ii) 상기 정량적 PCR 반응의 결과에 의거하여, 상기 시료 중에 존재하는 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계, 및(iii) 이하의 식(III)에 따라서 상기 시료 중의 유전자 재조합체의 존재비를 결정하는 단계를 포함하는 정량적 검지 방법:(시료 중 각 유전자 재조합체 계통의 존재비)= 100×[(시료 중 각 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수)/(시료 중 내재성 DNA 서열의 분자수)]/(정 량비)(%) (III)[상기 식에서, (정량비)는 이하의 식(II)에 의해 계산됨:(정량비)=(각 유전자 재조합체 계통 중 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수)/(유전자 재조합체 중 내재성 DNA 서열의 분자수) (II)].
- 제1항 또는 제2항에 있어서,정량적 PCR에 의한 시료 중에 존재하는 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열의 분자수 및 상기 시료 중에 존재하는 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는 단계가,(i) 시료 중에 존재할 가능성이 있는 유전자 재조합체 계통에 특이적인 DNA 서열, 및 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열에 관해서, 상기 DNA 시료 중의 상기 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열 및 상기 내재성 DNA 서열에 대하여 각각 정량적 PCR 반응을 실행하는 단계,(ii) PCR 중에 증폭의 지표가 되는 시그널을 모니터하여, 그 시그널이 상기 (i)에서 정한 임계값에 도달했을 때의 PCR 사이클수를 측정하고, 이어서 얻어진 상기 사이클수를 미리 제작된 검량선을 이용하여 반응 개시 시의 분자수로 환산하는 단계를 포함하며,상기 검량선이 PCR 개시 시의 증폭 대상 DNA 서열의 분자수와 그 증폭의 지표가 되는 시그널과의 관계를 나타내는 것인정량적 검지 방법.
- 제3항에 있어서,DNA 서열의 증폭의 지표가 되는 시그널이 형광이며, 상기 형광이 형광 표지 프로브에 유래하고, 상기 형광이 PCR에 의한 DNA 서열의 증폭에 따르는 상기 프로브의 분해에 기인하여 변화되는 것인 정량적 검지 방법.
- 제3항에 있어서,상기 검량선이,(a) 소정의 분자수의 표준 분자에 대하여, 유전자 재조합체 계통 특이적 DNA 서열 영역 또는 상기 유전자 재조합체에 대응하는 생물종이 공유하는 내재성 DNA 서열 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여, 상기 내재성 DNA 서열 또는 유전자 재조합체 계통 특이적 DNA 서열 영역의 증폭에 따라 형광량을 증가시키는 프로브의 존재 하에서 PCR을 실행하는 단계,(b) 각 분자수의 상기 표준 분자를 반응 개시 시의 주형 DNA로 하는 반응에 대하여, 각각 형광량을 일정한 사이클수마다 모니터하는 단계,(c) 형광량의 증가가 사이클수에 대하여 지수함수 관계에 있는 영역에서, 형광량 증가(ΔRn)의 임계값을 설정하는 단계,(d) PCR 사이클수를 종축에 취하고, 반응 개시 시의 증폭 대상 DNA 서열 영역 분자수를 횡축에 취하고, 이 임계값에 달하는 PCR 사이클수를 반응 개시 시의 DNA 주형 분자수에 대하여 플롯하는 단계에 의해서 얻어지는 정량적 검지 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 15 또는 16에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 18 또는 19에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 21 또는 22에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 24 또는 25에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 27 또는 28에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 30 또는 31에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 33 또는 34에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 36 또는 37에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 39 또는 40에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 42 또는 43에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 45 또는 46에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,3'-말단 서열로서 SEQ ID NO: 48 또는 49에 기재된 서열을 가지는 프라이머가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 17에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 20에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 23에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 26에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 29에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 32에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 35에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 38에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 41에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 44에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 47에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 50에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 유전자 재조합체에 특이적인 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 77 또는 78에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,SEQ ID NO: 79 또는 80에 기재된 서열로 표시되는 프로브가 상기 내재성 DNA 서열의 분자수를 결정하는데에 이용되는 정량적 검지 방법.
- 서열번호 73의 서열을 포함하는, 수탁번호 FERM BP-7319의 대장균에 함유되어 있는 플라스미드 pMul4인, 세포 내에서 자기 복제 가능한 재조합 DNA 분자.
- 서열번호 74의 서열을 포함하는, 수탁번호 FERM BP-7320의 대장균에 함유되어 있는 플라스미드 pMul5인, 세포 내에서 자기 복제 가능한 재조합 DNA 분자.
- 서열번호 75의 서열을 포함하는, 수탁번호 FERM BP-7321의 대장균에 함유되어 있는 플라스미드 pMulSL인, 세포 내에서 자기 복제 가능한 재조합 DNA 분자.
- 서열번호 76의 서열을 포함하는, 수탁번호 FERM BP-7322의 대장균에 함유되어 있는 플라스미드 pMulSL2인, 세포 내에서 자기 복제 가능한 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서,상기 표준 분자가 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 분자인 방법.
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