MXPA03003731A - Metodos de deteccion cuantitativa de recombinantes geneticos y moleculas estandard para los metodos. - Google Patents

Metodos de deteccion cuantitativa de recombinantes geneticos y moleculas estandard para los metodos.

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Abstract

La presente invencion se relaciona con un metodo para detectar un recombinante genetico utilizando el metodo de la PCR. Se proporciona, por lo tanto, un metodo para la deteccion cuantitativa de la relacion de contenido total de los recombinantes geneticos y puede cuantificarse la relacion de contenido individual del recombinante genetico en una poblacion que contiene una pluralidad de lineas recombinantes geneticas. El metodo de la presente invencion comprende efectuar la PCR para la secuencia de ADN especifica para el recombinante y la secuencia de ADN endogena compartida por las especies correspondiente al recombinante utilizado, como una molecula estandar, una molecula que contiene la secuencia de ADN especifica para el recombinante y la secuencia de ADN endogena compartida por las especies sobre la molecula sola, y determinar la relacion de contenido del numero de moleculas de la misma.

Description

METODOS DE DETECCION CUANTITATIVA DE RECOMBINANTES GENETICOS Y MOLECULAS ESTANDAR PARA LOS METODOS Campo Técnico de la Invención La presente invención se relaciona con un método para detectar un recombinante genético mediante el uso de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) . Particularmente, la presente invención se relaciona con un método de biología molecular para detectar una secuencia de ADN que es especifica para un recombinante genético utilizando PCR. De manera más especifica, la presente invención se relaciona con un método para detectar la relación del contenido de cada línea recombinante genética que puede existir en una población que contenga varios recombinantes genéticos que alberguen varias secuencias de ADN recombinantes. Además, la presente invención se relaciona con una molécula estándar la cual es utilizada en un método de biología molecular para detectar el recombinante genético.
Antecedentes de la Invención El uso práctico mundial de recombinantes genéticos, los cuales son producidos utilizando técnicas recombinantes genéticas, está en progreso. Como los recombinantes genéticos que ya han sido usados prácticamente, han sido reconocidos microorganismos recombinantes genéticos como aquéllos representados por bacterias productoras de interferon y cultivos recombinantes genéticos como aquéllos representados por el maíz resistente a insectos. Por ejemplo, un gen resistente a insectos, como la región que codifica para la proteína CrylA(b) (aquí posteriormente, crylA(b)) de Bacillus thuringiensis o un gen resistente a los herbicidas como la región que codifica para la protelna fosfinotricin acetil transferasa (PAT) (aquí posteriormente, pat) ha sido utilizado en los cultivos recombinantes genéticos desarrollados anteriormente. En esos casos, esos transgenes fueron introducidos como unidades de expresión combinadas con varias secuencias de ADN de modo que los transgenes puedan expresarse en los cultivos. Las secuencias de ADN que pueden ser utilizadas incluyen al promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (aquí posteriormente, promotor CaMV35S) , el promotor del gen de la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPC) del maíz, el promotor de la proteína cinasa dependiente del calcio (CDPK) del maíz, intrones como la región que contiene el sexto intrón del gen del alcohol deshidrogenasa 1S del maíz (Adhl-S IVS6) , la región que contiene el segundo intrón del gen del alcohol deshidrogenasa 1S del maíz (Adhl-S IVS2) , el 9no intrón de PEPC {PEPC#9) o la región del intrón de la proteína del choque término 70 (hsp70) del maíz, y terminadores como el terminador de la nopalina sintasa (aquí posteriormente, terminador NOS) de Agrobacterium tumefaciens o el terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor. Los cultivos recombinantes genéticos distribuidos comercialmente en la actualidad incluyen, por ejemplo, las variedades de la progenie de la línea Btll de Novartis, las variedades de la progenie de Event 176 de Novartis, las variedades de la progenie de la línea MON810 de Monsanto, las variedades de la progenie de la línea GA21 de Monsanto y las variedades de la progenie de la línea T25 de Aventis, para el maíz. Para la soya, ellos incluyen, por ejemplo, las variedades de la progenie de la línea de Soya Roundup Ready. Las construcciones de ADN que han sido introducidas en esas variedades son mostradas en la Figura 1. De manera general, un recombinantes genético ha sido desarrollado para impartir una propiedad industrialmente preferible a un organismo original en comparación con el organismo original. El objetivo principal para tal propósito es aislar un gen que exprese la propiedad de un organismo que exhiba intrínsecamente la propiedad, e introducir el gen en el organismo de interés, de modo que el gen pueda ser expresado en el organismo. De este modo, los ADN de recombinantes genéticos incluyen aquellas secuencias de ADN recombinantes que han sido introducidas en los recombinantes . Por ejemplo, los cultivos recombinantes genéticos han sido desarrollados para impartir las propiedades preferibles como productos agrícolas, como resistencia a insectos asi como resistencia a herbicidas y similares, cultivos los cuales son producidos introduciendo el gen responsable de la resistencia a insectos o resistencia a herbicidas y similares en los cultivos originales, en una forma donde el gen puede ser expresado en los cultivos. De este modo, los ADN de los recombinantes genéticos incluye esas secuencias de ADN recombinantes que han sido introducidas en los recombinantes . Sin embargo, cuando esos cultivos son comercializados en realidad, es probable que los cultivos sean híbridos de la progenie de los cultivos recombinantes genéticos. Por lo tanto, deberá confirmarse que las secuencias de ADN introducidas existan de manera estable en esos cultivos. Adicionalmente, la Comunidad Europea (CE) ha promulgado las regulaciones que afectan al etiquetado de recombinantes genéticos y alimentos procesados producidos de ellos (Regulación (CE) No. EC/258/97, Regulación del Consejo (CE) No. 1139/98), y la regulación afecta al etiquetado de los recombinantes genéticos y alimentos procesados producidos de ellos también fue expedida en Japón, la cual surgió de la necesidad de la industria de los alimentos y su campo relacionado para la información acerca de la existencia del contenido de recombinantes en cultivos o en alimentos . De este modo, existe la necesidad de una técnica que permita la determinación de la existencia de recombinantes genéticos o el contenido de ellos en alimentos, forrajes y en los cultivos originales de los mismos, particularmente la relación de contenido de los mismos en los materiales crudos . Cuando se espera que esté contenida una pluralidad de líneas recombinantes genéticas, es deseable una técnica que haga posible detectarlas individualmente y que definan la relación de contenido de cada línea, es decir, es deseado el desarrollo de una técnica práctica que tenga alta sensibilidad y cuantitividad para detectar la línea individual de recombinantes genéticos . Aunque existen muchos reportes que demuestran que es ventajoso utilizar las técnicas de biología molecular utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Science Vol . 230, 1350-1354 (1985), Science Vol . 239, 487-491 (1988) ) para detectar recombinantes genéticos, esas técnicas determinan cualitativamente si los recombinantes genéticos existen o no y no generan información acerca de la relación de contenido de los recombinantes genéticos contenidos en las muestras (véase, por ejemplo, Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol. 203, 339-344 (1996), Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., Vol. 87, 307-367 (1996), Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol. 93, Jahrg. , Herf 2, 35-38 (1997), Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol. 205, 442-445 (1997), Zeitschrift fur Emahrungwissenscaft Vol. 36, 155-160 (1997) , BGW Hefte 1, 115-117 (1997), Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., Vol. 88, 164-175 (1997), Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., Vol 88, 515-524 (1997), Food Aditives and Contaminants, Vol. 15, NO. 7, 767-774 (1998), Lebensm. -Wiss. U. -Technol . , Vol. 31, 664-667 (1998), Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol. 206, 203-207 (1998), Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol. 206, 237-242 (1998), Z. Lebensm Unters Forsch A., Vol. 207, 264-267 (1998), BioSci. Biotecnol . Biochem. Vol. 62, No. 7 1461-14645 (1998) , Deutsche Lebensmittel-Rundscb.au, Vol. 95, Jahrg., Heft 2, 44-48 (1999), Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol. 95, Jahrg., Heft 2, 48-51 (1999), Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol. 95, Jahrg., Heft 2, 52-56 (1999), Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol. 95, Jahrg., Heft 7, 275-278 (1999) , Journal of AOAC International Vol.82, No. 4, 923-928 (1999), GIT Labor Fachzetschrift, 2/99, 156-160 (1999), Bio Industry Vol. 16, No. 4, 17-21 (1999), Eur. Food Res.
Technol. Vol. 209, 77-82 (1999), Analytica Chimica Acta Vol. 393, 177-179 (1999), Food Control Vol . 10, 339-349 (1999), Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 47, No. 12, 5038-5043 (1999) , Journal of Food Hygienic Society of Japan, Vol. 41, No. 2, 137-143 (2000)). Existen varios reportes de técnicas conocidas que pueden proporcionar la información de relación de contenido de cada recombinante genético contenido en la muestra asi como los reportes de técnicas para determinar cuantitativamente las secuencias de ADN recombinante de la soya y el maíz. Por ejemplo, Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Vol. 95, Jahrg., Heft 2, 57-59 (1999), y Eur. Food. Res. Technol, Vol. 209, 83-87 (1999) reportan técnicas de detección cuantitativa para soya utilizando PCR competitiva. Esas técnicas, sin embargo, se limitaron únicamente a una sola línea de soya recombinante genética. Además, la exactitud de la cuantificación fue relativamente baja debido al uso de la PCR competitiva y, la pureza y rendimiento de la solución de ADN extraída de muestras afectó el resultado de cuantificación debido a que no utilizó un estándar interno. La técnica de detección cuantitativa para el maíz recombinante genético utilizando PCR competitiva también fue reportada en Z. Lebensm Unters Forsch A, Vol. 207, No. 3, 207-213 (1998), pero el objetivo de la detección también se limitó únicamente a una sola línea de maíz recombinante genético el cual es similar al caso mencionado anteriormente. Además, de manera similar al caso descrito anteriormente, la PCR competitiva y la ausencia del estándar interno hizo la conflabilidad del resultado de la cuantificación insuficiente . Food Control Vol . 10, 353-358 (1999) reporta una técnica de detección cuantitativa utilizando la PCR competitiva para el maíz recombinante genético y la soya recombinante genética, pero ambas técnicas se limitaron únicamente a una sola línea respectivamente. Además, el uso de PCR competitiva y la ausencia de un estándar interno hicieron la conflabilidad del resultado de la cuantificación insuficiente, como se describió anteriormente. La PCR cuantitativa utilizando una sonda fluorescente y similar (también referida como PCR en tiempo real o PCR en línea etc.) es conocida como un análisis cuantitativo que es superior a la PCR competitiva en la exactitud de cuantificación. Existen varios reportes con respecto a las técnicas de detección cuantitativa utilizando PCR cuantitativa para secuencias de ADM recombinantes . Por ejemplo, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 47, No. 12, 5261-5266 (1999) reporta que la cuantificación de soya y maíz recombinante puede ser efectuada por PCR cuantitativa con sondas fluorescentes. En estos reportes, se empleó el procedimiento del estándar interno, el cual mejoró la conflabilidad del resultado de la cuantificación. El objetivo de la detección, sin embargo, fue una sola línea para la soya recombinante genética y también una sola línea para el maíz recombinante genético. Food Control Vol . 10, 385-389 (1999) también reporta dos técnicas, las técnicas de detección cuantitativas para la soya recombinante genética utilizando PCR cuantitativa con sondas fluorescentes y las técnicas de detección cuantitativas para soya recombinante genética utilizando PCR competitiva. También se utilizaron procedimientos de estándar interno en esos reportes, lo cual mejoró la conflabilidad del resultado de la cuantificación. En contraste con los reportes referidos anteriormente, el ADN plasmídico que contiene una secuencia de ADN para el estándar interno y el ADN plasmídico que contiene la secuencia de ADN objetivo a ser examinada fueron utilizados como una molécula estándar. Sin embargo, debido a que ambos plásmidos fueron proporcionados por separado, seguía existiendo la posibilidad de que la forma de diluir el ADN plasmídico y la cantidad de ADN plasmídico agregada al sistema de reacción afectará el resultado de la cuantificación. Nuevamente, el objetivo de la detección se limitó a una sola línea de soya recombinante genética. Chemie in Labor und Biotechnik. Vol . 50, Jahrg. , Heft 1, 6-8 (1999) es similar a los reportes mencionados anteriormente . Además, puesto que los recombinantes genéticos que se encuentran comercialmente disponibles como materiales estándar son únicamente dos líneas para el maíz y una línea para la soya, es muy difícil el análisis para analizar otras líneas . También se reportó una técnica para cuantificar el contenido de recombinantes genéticos, donde la proteína expresada de una secuencia de ADN recombinante es determinada por Ensayo Inmunosorbente Ligado a Enzima (ELISA) , pero esta técnica también fue la técnica de cuantificacion cuantitativa para una sola línea particular.
Sumario de la Invención Como se describió anteriormente, las técnicas de detección cuantitativas reportadas anteriormente para recombinantes genéticos son aquéllas que detectan cuantitativamente solo líneas limitadas o aquéllas que carecen de exactitud en la cuantificacion. Por otro lado, es muy difícil examinar cuantitativamente la relación de contenido de recombinantes genéticos en una muestra cuando las técnicas para detectar solo una particular de esas líneas, debido a que los cultivos que son distribuidos convencionalmente están en el estado donde varias variedades son mezcladas durante el proceso de distribución. Por ejemplo, las líneas de maíz recombinante genético distribuidas en Japón eran hasta 7 líneas en Julio, 2000. Por lo tanto, el análisis sería insuficiente si únicamente se determinara cuantitativamente una sola línea particular del maíz recombinante genético en la muestra. De este modo, se comprende que debe hacerse notar que la técnica para detectar una sola línea particular así como la técnica que carece de exactitud de cuantificación es insuficiente como un método de análisis cuantitativo y carece de utilidad real . Uno de los factores que limitan el número de líneas objetivo a ser detectadas es el suministro insuficiente de los estándares de ensayo. Es muy difícil obtener una muestra estándar pura que contenga únicamente una sola línea particular de recombinantes genéticos y que no contengan ninguna otra línea. Los recombinantes genéticos proporcionados actualmente como muestras estándar para análisis convencionales son únicamente dos líneas para el maíz y una línea para la soya. En realidad, en los reportes previos mencionados anteriormente con respecto a las técnicas de detección cuantitativas, todos los objetivos se limitaron a aquéllos para los cuales las muestras estándar respectivas pueden estar disponibles (Esto también se mencionó en las referencias referidas anteriormente, por ejemplo, en Food Control Vol . 10, 385-389 (1999)). A saber, la disponibilidad de muestras estándar conduce al resultado de que la aplicabilidad de las técnicas de detección mencionadas anteriormente es limitada. Adicionalmente, puesto que el tipo y número de copias de la secuencia de ADN recombinante introducida por genoma en cada línea de recombinantes genéticos difiere entre las lineas, si el análisis se lleva a cabo asumiendo que únicamente están contenidas líneas particulares en la muestra sin considerar los efectos de esas diferencias, es probable obtener resultados alejados de la relación de contenido real de los recombinantes genéticos. De este modo, aún si son proporcionadas todas las líneas recombinantes genéticas como muestras estándar para el análisis, esas técnicas no podrían ser consideradas como técnicas de detección cuantitativa reales para recombinantes genéticos, a menos que figuren cualesquier medios para tomar en cuenta la diversidad de secuencias de ADN recombinantes entre las líneas. Como se mencionó, anteriormente, es deseable desarrollar una técnica de detección práctica, sensible y cuantitativa para recombinantes genéticos y el desarrollo de las mismas ha sido intentado activamente, pero el desarrollo y popularización de las técnicas de detección por biología molecular para secuencias de ADN recombinantes y/o recombinantes genéticos son difíciles debido a las formas de distribución convencionales, la disponibilidad de las muestras estándar y la diversidad de las secuencias de ADN recombinantes entre lineas. En consecuencia, el objeto de la presente invención es proporcionar un método de biología molecular para detectar recombinantes genéticos, donde la relación de contenido total exacta de recombinantes genéticos en una población que contiene una pluralidad de lineas de recombinantes genéticos puede ser determinada cuantitativamente, tomando estrictamente en cuenta la diversidad de las secuencias de ADN recombinantes entre la pluralidad de líneas recombinantes genéticas . Particularmente, el objeto de la presente invención es proporcionar un método de biología molecular para detectar recombinantes genéticos, donde la relación de contenido individual exacta de cada uno de los recombinantes genéticos en una población que contiene una pluralidad de líneas de recombinantes genéticos puede ser determinada cuantitativamente tomando estrictamente en cuenta la diversidad de las secuencias de ADN recombinantes entre la pluralidad de lineas recombinantes genéticas . Otro objeto de la presente invención es proporcionar una molécula de ADN recombinante como muestra estándar utilizada para el método de detección cuantitativa mencionado anteriormente, la cual tiene especialmente la propiedad de poder ser suministrada de manera ilimitada, donde la molécula está diseñada de modo que la cuantificación pueda ser efectuada tomando en cuenta estrictamente la diversidad de las secuencias de ADN recombinantes entre la pluralidad de líneas recombinantes genéticas. Los inventores de la presente invención produjeron una molécula que contiene, sobre una sola molécula, cinco secuencias de ADN especificas de la línea del maíz recombinante genético, dos secuencias de ADN, las cuales son frecuentemente utilizadas para recombinantes genéticos, pero que no son específicas de la línea, y una secuencia de ADN adicional del gen del maíz endógeno, una molécula que contiene, sobre una sola molécula, una secuencia de ADN específica de la línea de soya recombinante genética y una secuencia de ADN del gen de soya endógeno, y una molécula que contiene, sobre una sola molécula, una secuencia de ADN específica de la línea de soya recombinante genética, una secuencia de ADN del gen de la soya endógeno y dos secuencias de ADN que son frecuentemente usadas para los recombinantes genéticos, pero que no son específicas de la línea, y se encontró que los métodos de detección cualitativo y cuantitativa anteriores pueden ser mejorados notablemente utilizando esas moléculas como moléculas estándar en la PCR, lo cual permite a los inventores establecer la presente invención. En consecuencia, la presente invención es un método de detección cuantitativa para determinar cuan itativamente una relación de contenido de un recombinante genético en una muestra que contiene al menos una línea recombinante genética, que comprende: (i) efectuar una PCR cuantitativa para una secuencia de ADN específica para los recombinantes genéticos, que puede existir en una muestra de ADN derivada de recombinantes genéticos en la muestra y PCR cuantitativa para una secuencia de ADN endógena compartida por las especies correspondientes al recombinante genético utilizando, como molécula estándar una molécula que contiene, sobre una sola molécula, la secuencia de ADN específica para el recombinante genético y la secuencia de ADN endógena; (ii) determinar el número de secuencias de ADN específicas para los recombinantes genéticos en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; (iii) determinar el número de secuencias de ADN endógenas en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; y (iv) determinar la relación de contenido de los recombinantes genéticos de acuerdo a la fórmula (I) : (relación de contenido de los recombinantes genéticos en la muestra) = 100 x [ (el número de moléculas de la secuencia de ADN específica para los recombinantes genéticos en la muestra) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógena en la muestra) ] / (relación de cuantificación) (%) (I) cuando la relación de cuantificación es cualquiera de los valores que son precalculados de acuerdo a la fórmula (II) = (relación de cuantificación) (%) = (el número de moléculas de la secuencia de ADN específica para un recombinante genético de la línea recombinante genética individual) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógena en el recombinante genético) (II) .
De manera más especifica, la presente invención es un método de detección cuantitativa para determinar cuantitativamente una relación de contenido individual o línea recombinante genética individual en una muestra que contiene al menos una línea recombinante genética, que comprende : (i) efectuar una PCR cuantitativa para una secuencia de ADN específica para la línea recombinante genética individual que puede existir en una muestra de ADN derivada de recombinantes genéticos en la muestra y la PCR cuantitativa para una secuencia de ADN endógena compartida por las especies correspondientes a los recombinantes genéticos utilizando, como molécula estándar, una molécula que contiene, sobre una sola molécula, la secuencia de ADN específica para la línea recombinante genética individual y la secuencia de ADN endógena; (ii) determinar el número de secuencias de ADN especificas para la línea recombinante genética individual en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; (iii) determinar el número de secuencias de ADN endógenas en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; y (iv) determinar la ¦ relación de contenido recombinante genético de acuerdo a la fórmula (III) : (relación de contenido de la línea recombinante genética individual en la muestra) = 100 x [ (el número de moléculas de la secuencia de ADN correspondientes a cada recombinante genético en la muestra) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógena en la muestra) ] / (relación de cuantificación) (%) (III) donde la relación de cuantificación es calculada de acuerdo a la fórmula (II) identificada anteriormente. La molécula de ADN recombinante de la presente invención es la molécula de ADN recombinante caracterizada porque contiene, sobre una sola molécula una secuencia de ADN específica para las líneas del recombinante genético, y al menos una secuencia de ADN endógena compartida por las especies correspondientes a los recombinantes genéticos . De manera particular, la molécula de ADN de la presente invención es la molécula de ADN recombinante, caracterizada porque contiene, sobre una sola molécula, dos o más secuencias de ADN específicas para la línea individual de recombinantes genéticos, respectivamente, y al menos una secuencia de ADN endógena compartida por dos o más no transformantes correspondientes a los recombinantes genéticos .
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la construcción de la secuencia de ADN recombinante introducida en cada línea recombinante genética y la ubicación de los cebadores diseñados para el análisis por biología molecular, respectivamente. Cada par de cebadores para amplificar la secuencia de ADN especifica para cada línea recombinante genética fue diseñado de modo que pudiera amplificar la región que se extiende sobre la pluralidad de secuencias de ADN. El par de cebadores para amplificar la secuencia de ADN que no es específica de la línea, pero que se utiliza frecuentemente para recombinantes genéticos, fue diseñado de modo que pudiera reaccionar con todas las líneas correspondientes . La Figura 2 muestra el resultado de la prueba de verificación de especificidad utilizando el par de cebadores diseñados para detectar la variedad de la progenie de la línea T25. La reacción de amplificación no fue observada para el ADN extraído de muestras diferentes de aquéllas de las variedades de la progenie de la línea T25 y el producto amplificado fue observado únicamente con el ADN extraído de las variedades de la progenie de la línea T25. El peso molecular del producto amplificado fue consistente con el diseñado . La Figura 3 muestra los resultados de la prueba de verificación de especificidad utilizando el par de cebadores y la sonda diseñada para detectar el terminador NOS. Los experimentos se efectuaron con 11 patrones de ADN. Como puede observarse en la Figura 1, el terminador NOS es introducido en las variedades de la progenie de la linea Btll, las variedades de la progenie de la línea Eventl76 y las variedades de la progenie de la línea de Soya Roundup Ready. Los resultados experimentales mostraron que los productos amplificados fueron observados únicamente en los ADN patrón extraídos de esas tres variedades, y no se observaron otros patrones de ADN fueron sometidos a la reacción, lo cual confirmó la especificidad diseñad . La Figura 4 muestra el esquema del procedimiento para combinar los productos de la PCR. La Figura 5 muestra la secuencia nucleotídica de la molécula estándar para el maíz. Las ubicaciones de cada objetivo de la amplificación en las secuencias de ADN combinadas se mostraron en la figura. Las regiones de unión de los cebadores y la sonda utilizados en el experimento también fueron mostradas en la figura. La Figura 6 muestra la secuencia nucleotídica de otra molécula estándar para el maíz. Las ubicaciones de las secuencias de ADN combinadas para cada objetivo de la amplificación fueron mostradas en la figura. Las regiones de unión de los cebadores y las sondas utilizadas en el experimento también fueron mostradas en la figura. La Figura 7 muestra los esquemas de los plásmidos pMul4 y pMulB . Para el pMul4 , el ADN mostrado en la Figura 5 fue insertado en el vector. Para el pMul5, la secuencia de ADN mostrada en la Figura 6 fue insertada en el vector. La Figura 8 muestra la secuencia nucleotídica de la molécula estándar para la soya. Las ubicaciones de cada objetivo de la amplificación en las secuencias de ADN combinadas fueron mostradas en la figura. Las regiones de unión de los cebadores y las sondas utilizadas en los experimentos también fueron mostradas en la figura. La Figura 9 muestra la secuencia nucleotídica de la molécula estándar para la soya. Las ubicaciones de cada objetivo de la amplificación en las secuencias de ADN combinadas fueron mostradas en la figura. Las regiones de unión de los cebadores y sondas utilizadas en el experimento, también fueron mostradas en la figura.
La Figura 10 muestra el esquema del plásmido pMulSL. La secuencia introducida en el vector es la secuencia de ADN mostrada en la Figura 8. La Figura 11 muestra el esquema del plásmido pMulSL2. La secuencia introducida en el vector es la secuencia de ADN mostrada en la Figura 9. La Figura 12 confirmó el maíz recombinante genético contenido en la muestra de maíz ciego. Fueron detectadas las variedades de la progenie de la línea Btll (A) y las variedades de la progenie de la línea GA21 y la línea MON810 (B) . Se utilizó 'la digestión de p ul4 con BamHI como control . La Figura 13 muestra el resultado que confirma la relación de cuantificación efectuando la PCR, utilizando el ADN extraído de una sola semilla de maíz, y calculando la relación de acuerdo a la fórmula (II) . Las flechas en la figura indican los valores predichos que la semilla Fl de las variedades de la progenie de la línea T25 pueden exhibir. La Figura 14 muestra la gráfica de (ciclos -intensidad de fluorescencia) durante la PCR cuantitativa para la secuencia de ADN recombinante estándar del maíz. La Figura 15 muestra la curva estándar obtenida por la PCR cuantitativa para la secuencia de ADN recombinante estándar del maíz. La curva estándar fue derivada de la Figura 1 . La Figura 16 muestra el resultado que confirma la relación de cuantificación conduciendo la PCR utilizando el ADN extraído de una sola semilla de soya y el cálculo de la relación de cuantificación de acuerdo a la fórmula (II) .
Modalidades Preferidas de la Invención La presente invención será ilustrada en la siguiente descripción por cultivos recombinantes genéticos como ejemplos de recombinantes genéticos, pero la aplicación de la presente invención no se limita a cultivos, y la presente invención no excluye otros recombinantes genéticos, incluyendo animales, plantas, microorganismos y similares recombinantes genéticos. En unas modalidades de la presente invención, las secuencias de ADN recombinantes son detectadas utilizando el método de PCR con ácidos nucleicos de plantas de prueba para detectar específicamente varios recombinantes genéticos. En consecuencia, se requiere diseñar el par de cebadores para detectar la secuencia de ADN que sea específica para la línea recombinante genética, el par de cebadores para detectar la secuencia de ADN que no es específico de la línea, pero que es frecuentemente utilizado para recombinantes genéticos y el par de cebadores para detectar una secuencia de ADN que sea especifica para los cultivos que puedan ser un recombinante genético o no recombinante . Las muestras de plantas de prueba pueden ser cualesquier muestras de las cuales pueden ser extraídos los ácidos nucleicos, como el ADN genómico, incluyendo semillas verdes, semillas secas, materiales procesados como granos de maiz y harina de soya. Esas muestras pueden ser utilizadas después de la molienda, si es necesario. De acuerdo a la presente invención, es posible determinar la relación de contenido de los recombinantes genéticos, especialmente la relación de contenido del recombinante genético individual, en la muestra, que pueda posiblemente contener una o dos o más lineas recombinantes genéticas, sobre la base del número de moléculas de las secuencias de ADN recombinantes, el número de moléculas del gen endógeno, y la relación de cuantificación calculada para el recombinante genético individual en la muestra. De acuerdo a la presente invención, la relación de contenido de un recombinante genético se calcula por el siguiente procedimiento: (i) efectuar la PCR cuantitativa utilizando una molécula como molécula estándar, la cual contiene, sobre una sola molécula, una secuencia de ADN específica de los recombinantes genéticos que puede existir en una muestra y una secuencia de ADN endógena compartida por las especies correspondientes al recombinante genético; (ii) determinar el número de secuencias de ADN específicas para los recombinantes genéticos en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; (iii) determinar el número de secuencias de ADN endógenas en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; y (iv) determinar la relación de contenido de los recombinantes genéticos de acuerdo a la fórmula (I) : (relación de contenido de los recombinantes genéticos en la muestra) = lOOx [ (el número de moléculas de la secuencia de ADN específica para los recombinantes genéticos en la muestra) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógenas en la muestra) ]/ (relación de cuantificación) (%) (I) donde la relación de cuantificación es cualquiera de los valores que sea precalculado de acuerdo a la fórmula (II) : (relación de cuantificación ) (%) = (el número de moléculas de la secuencia de ADN específica para un recombinante genético de la línea recombinante individual) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógena en el recombxnante genético) (II) Particularmente, cuando la relación de contenido individual de cada recombxnante genético determinada, se utilizará la fórmula (II) en lugar de la fórmula (I) : (relación de contenido de la línea recombxnante genética individual en la muestra) = 100 x [ (el número de moléculas de la secuencia de ADN específica para el recombxnante genético individual en la muestra) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógena en la muestra) ]/ (relación de cuantificación) (%) (III) El término "secuencia de ADN" y "secuencia de ADN o región parcial de la misma" como se utilizan aquí son utilizados de manera intercambiable. De este modo, por ejemplo, una "secuencia de ADN específica para una línea recombxnante genética" significa un ADN de longitud completa o al menos una región parcial del mismo, todos los cuales son específicos para la línea recombxnante genética. Esto es similar en otro contexto . Esto también se aplica al significado de "secuencia genética" . El término "recombxnante genético" incluye al organismo completo en el cual ha sido introducido un gen exógeno o una porción del organismo en el cual ha sido introducido un gen exógeno como son los órganos, explantes de tejidos, células (incluyendo células de cultivo) , semillas, pólenes o embriones de esos organismos . El término "PCR cuantitativa" significa de manera general, una serie de reacciones que utilizan PCR para cuantificar el ADN patrón que existía al inicio de la reacción de amplificación. La PCR cuantitativa incluye el Método del Estándar Interno, el cual emplea una secuencia endógena como estándar y el método competitivo el cual emplea una molécula que compite por la reacción de amplificación. En la presente invención, fueron empleados el método interno y la PCR donde el ADN patrón es referido como una molécula estándar y que sirve como estándar para determinar el número de moléculas de cada secuencia de manera exacta y fácil, y el progreso de la reacción, a saber el grado de amplificación es verificado en cualquier momento durante la reacción. De este modo, la "PCR Cuantitativa" utilizada aquí se refiere a la PCR para determinar cuantit tivamente la cantidad del ADN patrón que existía al inicio de la reacción, donde la molécula objetivo a ser amplificada puede ser verificada por su amplificación en cualquier momento durante la reacción. Para la cuantificación, esa PCR y una curva estándar se combinan generalmente donde la curva estándar puede asociar el número de moléculas de ADN que existían al inicio de la reacción con la señal que indica el grado de amplificación de la molécula. La curva estándar puede ser generada utilizando una molécula estándar de la cual se conoce un número. La muestra de ADN, los cebadores, la sonda, las condiciones para la PCR, y el número de moléculas de ADN recombinan es , el número de moléculas de gen endógeno, y los métodos para calcular la relación de cuantificación, que pueden ser utilizados en la presente invención serán descritos con detalle aquí posteriormente . Los ácidos nucleicos de las plantas de prueba son preferiblemente el ADN genomico de las plantas de prueba. Los métodos para extraer los ácidos nucleicos de las plantas de prueba no están limitados y pueden ser utilizados cualesquier métodos para extraer ácidos nucleicos de muestras de plantas de prueba en tanto se obtenga suficiente calidad para la PCR. Por ejemplo, puede ser utilizado un equipo comercialmente disponible como el QIAGEN Plant Maxi Kit (QIAGEN GmbH) . Adicionalmente, los métodos pueden ser modificados, si es necesario . Los ácidos nucleicos extraídos por esos métodos son mantenidos preferiblemente en una forma que sea adecuada para ser utilizada como patrón en PCR, por ejemplo, en forma de una solución en un amortiguador. La pureza de ácidos nucleicos obtenidos puede ser estimada por métodos conocidos, por ejemplo determinando la absorbancia a 230 nm, 260 nm y 280 nm. De esa manera, es preferible efectuar un método de PCR en el que la relación de 260 nm/230 nm sea de más de 2 y la relación de 260 nm /280 nm sea de entre 1.8 y 2. La amplificación por PCR puede ser efectuada utilizando los cebadores correspondientes al gen endógeno para ser confirmado de modo que la solución de ADN preparada sea purificada lo suficiente para ser sometida al PCR y no se degrade. La PCR se efectúa utilizando de este modo los ácidos nucleicos obtenidos de plantas de prueba. El cebador utilizado en la PCR es el par de cebadores que pueden amplificar la región que contiene toda la secuencia de ADN recombinante o una parte de la misma. Utilizando esos cebadores, es posible detectar específicamente una secuencia de ADN recombinante dependiente de la estructura de la secuencia de ADN recombinante . Esos pares de cebadores pueden ser diseñados como se describió anteriormente dependiendo de los recombinantes genéticos a ser detectados. El recombinante genético objetivo a ser detectado puede ser cualquiera de los recombinantes genéticos mencionados anteriormente y los tipos de los mismos no están limitados . Cualquier recombinante genético puede ser el objetivo de la detección en tanto sea determinado el constructo de la secuencia de ADN introducida. Ese recombinante genético puede no restringirse a la generación donde la introducción del gen se efectuó sino que puede ser una variedad de su progenie. En primer lugar, deberá obtenerse la secuencia nucleotídica del ADN recombinante contenida en el recombinante genético a ser probado . La secuencia nucleotídica no es necesariamente toda la secuencia de ADN recombinante y puede ser una secuencia nucleotídica ubicada en la vecindad de la región objetivo. Muchas de esas secuencias nucleotídicas están disponibles en la literatura conocida. Aún si la secuencia nucleotídica no está disponible en la literatura conocida, la secuencia puede ser obtenida por un experimento si la información de la secuencia nucleotídica parcial de la misma está disponible. En el diseño de un par de cebadores específicos de la línea, sería fácil seleccionar el par con alta especificidad seleccionando la región que se extiende sobre la pluralidad de tipos de secuencias de ADN (por ejemplo, la región que se extiende desde el promotor CaMV 35S hasta cryIA (b) ) . Cada par de cebadores puede ser cualquier par de cebadores en tanto pueda amplificar específicamente la secuencia de ADN objetivo, pero es preferible que el segmento amplificado sea de entre 80 pb y 200 pb y el contenido de GC de cada cebador sea de entre el 40% al 60%, respectivamente, y es más preferible que cada cebador no forme estructuras intramoleculares de orden superior y no forme apareamientos de bases sobre tres o más nucleótidos contiguos . Por ejemplo, los cebadores pueden ser diseñados de la región mostrada en la Figura 1, cuando las variedades de la progenie de la línea Btll, las variedades de la progenie de la línea Eventl76, las variedades de la progenie de la línea MON810, las variedades de la. progenie de la línea GA21, las variedades de la progenie de la línea T25 o las variedades de la progenie de la línea de Soya Roundup Ready pretendan ser detectadas específica e individualmente. También se sabe que el número de regiones amplificadas que existían al inicio de la reacción, y que se amplificaron con los cebadores, puede ser cuantificado por el método de PCR cuantitativa. Han sido conocidos varios métodos de PCR cuantitativa, pero en muchos casos se requiere preparar una sonda complementaria a la región que es abarcada por el par de cebadores . La sonda puede ser cualquier sonda que genere una señal correspondiente al número de moléculas que fueron producidas por la amplificación, por ejemplo una sustancia que sea adecuada para detectar, durante la PCR, la formación de ADN de doble hebra o la reacción de disociación de doble hebra a una sola hebra, o la reacción de extensión de los ácidos nucleicos. De manera general, son utilizados ácidos nucleicos marcados con fluorescencia para las sondas . Específicamente, se prefiere que la sonda pueda hibridarse específicamente al ADN patrón bajo las condiciones utilizadas por la reacción de extensión por la polimerasa durante la reacción de amplificación por PCR pueda producir los cambios en la intensidad de la fluorescencia dependiendo de la extensión de la hebra de ADN, es decir, la amplificación del ADN patrón, y los cambios preferiblemente indican el grado de amplificación, de manera más preferible, la sonda se degrada dependiendo de la amplificación del ADN patrón para liberar un fluoróforo, lo cual conduce al incremento de la intensidad de la fluorescencia en la mezcla de reacción y además el incremento en la intensidad de la fluorescencia es preferiblemente el Indice del grado de amplificación. Utilizando esas sondas, el progreso de la amplificación durante la PCR puede ser verificada fácilmente en tiempo real . Esas sondas marcadas con fluorescencia son conocidas por aquellos expertos en la técnica, y las sondas fluorescentes adecuadas que tengan esas propiedades también pueden ser sintetizadas. Adicionalmente, se prefiere que la sonda tenga un valor de Tm de aproximadamente 10°C mayor que el par de cebadores correspondientes y la longitud completa de la sonda es, de manera preferible de aproximadamente 18 nucleótidos y de aproximadamente 25 nucleótidos, y que la sonda no tenga una G en su terminal . En una modalidad de los métodos de la presente invención, se utilizó una sonda donde la sonda se degrada a medida que progresa la amplificación, lo cual produce un incremento en la intensidad de la fluorescencia, y el incremento en la intensidad de la fluorescencia es el indicador de la amplificación. La PCR cualitativa puede ser efectuada utilizando los ácidos nucleicos de la muestra de planta de prueba como patrón utilizando el par de cebadores como se describió anteriormente. Además, la PCR cuantitativa puede ser efectuada utilizando los ácidos nucleicos de la muestra de planta de prueba como patrón y utilizar el par de cebadores y la sonda así diseñados. No existe ninguna limitación para la mezcla de reacción, debido a que la mezcla de reacción puede ser fácilmente preparada por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede ser preparada utilizando una cantidad apropiada de ácidos nucleicos patrón, el par de cebadores, la solución amortiguadora de PCR, dNTP, cloruro de magnesio, ADW polimerasa, etc. Por ejemplo, pueden ser utilizados aproximadamente 50 ng de ADN extraído de la muestra, y la reacción puede ser efectuada con una concentración de cebador final de aproximadamente 0.2-0.5 µ? en un volumen total de 25 µ? . Las condiciones para la PC tampoco están limitadas y pueden ser efectuadas manteniendo 10 minutos a 95 °C, 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 58°C, 30 segundos a 72 °C, y manteniendo 7 minutos a 72°C después de 40 ciclos y manteniendo a 4°C. Aquellos expertos en la técnica podrían optimizar fácilmente las condiciones y de este modo, la temperatura y el tiempo para cada paso pueden ser cambiadas de manera opcional. Además, esa reacción puede ser efectuada utilizando un dispositivo bien conocido. El número de moléculas de ADN recombinante en la muestra puede ser obtenido efectuando una PCR cuantitativa. Con respecto a la PCR cuantitativa, se sabe que el valor obtenido por la determinación de la cantidad inicial de las secuencias de ADN objetivo a ser amplificadas no siempre indica directamente el contenido de recombinantes genéticos . Por ejemplo, como se indicó en la Figura 1, puesto que las secuencias de ADN introducidas en los recombinantes genéticos difieren en gran medida entre líneas y el número de copias por genoma de planta de cada recombinante genético tiene diversidad, y la relación de contenido no puede ser calculada simplemente. Por ejemplo, la región codificadora para crylA(b) es introducida en la línea Eventl76 y la línea Btll, así como la línea ON810, y los desarrolladores reportan que han sido introducidas dos o más copias en Eventl76, una copia para Btll y ha sido introducida al menos una copia en MON810. Adicionalmente, la PCR probablemente sea inhibida por contaminantes en el sistema de reacción. De acuerdo a la presente invención, el número de moléculas de secuencia de ADN recombinantes es determinado por, por ejemplo, preparando una curva estándar efectuando una PCR cuantitativa utilizando una cantidad conocida de un estándar interno, efectuando la PCR cuantitativa similar para la muestra y determinando el número de moléculas utilizando la curva estándar. El número de moléculas de la secuencia endógena puede ser determinado por un procedimiento similar. Por otro lado, para un recombinante genético puro, el número de moléculas de la secuencia de ADN en el recombinante genético y el número de moléculas de la secuencia de ADN interno son predeterminados por PCR cuantitativa para definir la relación de esos valores determinados como la "relación de cuantificación" . Puesto que la relación de cuantificación representa el único valor dependiendo del número y tipo de secuencias de ADN recombinantes que han sido introducidas en cada recombinante genético, la diversidad de secuencias de ADN recombinantes entre las líneas es tomada estrictamente en cuenta convirtiendo el valor cuantitativo en la relación de contenido del recombinante genético utilizando la fórmula (1) . De acuerdo a la presente invención, se vuelve posible evitar los errores en los valores determinados debido a que, por ejemplo, el factor que trastorna al sistema de reacción en si, como el inhibidor de la PCR, puede estar contenido en la solución de ADN muestra y las diferencias de rendimiento durante la extracción del ADN. La relación de cuantificación es calculada preferiblemente para cada uno de todos los recombinantes genéticos que pueden estar posiblemente contenidos en la muestra, pero también es aceptable que la relación de cuantificación sea obtenida únicamente para una parte de ellos. Una vez obtenido el valor de la relación de cuantificación, puede ser obtenida la relación de contenido del recombinante genético de la muestra original a partir de la cantidad inicial de la secuencia de ADN objetivo a ser amplificada y la cantidad inicial de la secuencia estándar interna al inicio de la reacción utilizando el valor de la relación de cuantificación como un coeficiente, debido a que el valor de la relación de cuantificación es único para la región objetivo a ser amplificada por PCR y la linea de recombinantes genético . Ese estándar interno puede ser, por ejemplo, secuencias de ADN internas específicas que son compartidas por el maíz, especialmente, una secuencia genética interna, una secuencia de ADN interna específica son compartidas por la soya, especialmente, una secuencia genética interna o una molécula estándar construida artificialmente. La molécula estándar adecuada para la presente invención es la molécula de ADN recombinante que incluye, sobre una sola molécula, al menos una secuencia de ADN recombinate que es específica para al menos, 1, de manera preferible 2 o más líneas de recombinantes genéticos y al menos una secuencia de ADN interno que son compartidas por las especies correspondientes a las recombinaciones . Una molécula de ADN recombinante que contiene, sobre una sola molécula, al menos un ADN recombinante que no es específico para cada línea de recombinate genético pero que se utiliza frecuentemente para recombinantes genéticos también puede ser utilizada al menos una secuencia de ADN interna compartida por las especies correspondientes en la presente invención. La molécula de ADN recombinante puede contener además varias secuencias a ser utilizadas para la reproducción o replicación en un hospedero adecuado o un gen marcador para seleccionar hospederos que alberguen a la molécula estándar y además a las secuencias mencionadas anteriormente. Unicamente la región mínima que puede ser utilizada como molécula estándar también puede ser obtenida de la molécula de ADN recombinante utilizando enzimas de restricción apropiadas o amplificando la parte de la molécula por PCR. La molécula de ADN recombinante de acuerdo a la presente invención, sin embargo, deberá tener la característica de que el número de moléculas a ser sometidas a PCR puede ser fácilmente controlado. Por ejemplo, cuando toda la secuencia nucleotidica de acuerdo a la presente invención es conocida o el peso molecular es conocido, el número de moléculas a ser aplicadas a la PCR puede ser controlado. La secuencia nucleotidica o el peso molecular de las moléculas de ADN recombinantes puede ser determinado, si es necesario. Como secuencia de ADN interna, por ejemplo, puede ser utilizada la secuencia genética interna específica compartida por el maíz o parte de la misma, o la secuencia genética interna específica compartida por la soya o parte de ella, como se describió anteriormen e. Como secuencia de ADN recombinantes que es compartida por los recombinantes genéticos, una puede ser utilizada, por ejemplo, la secuencia del promotor CaMV 35S, la secuencia de terminador Nos y una parte de las mismas. Como secuencia de ADN específica para la línea recombinate individual, por ejemplo, puede ser utilizada la secuencia de ADN derivada del gen individual que ha sido introducido en cada línea.
Esa molécula estándar puede ser construida de acuerdo a las técnicas de biología molecular las cuales son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la molécula puede ser construida clonando secuencialmente los fragmentos de restricción o combinando repetidamente productos de la PCR utilizando cebadores añadidos. De manera preferible, la molécula es construida como una molécula de ADN recombinante que es capaz de autoreproducirse o autoreplicarse en hospederos adecuados como lo son microorganismos, células animales y células de plantas. Cuando la molécula estándar es construida, como un plásmido, es preferible utilizar esta como una molécula lineal después de escindir esta por una enzima de restricción debido a que la formación de la superhélice puede desestabilizar el sistema de reacción de la PCR. En esos casos, pueden ser utilizadas cualesquier enzimas de restricción para la escisión en tanto las enzimas no escindan la secuencia de ADN objetivo a ser amplificada. De manera particular, en una modalidad de la presente invención, la molécula estándar contiene una parte de la secuencia del gen leí de la soya como secuencia de ADN interno, y contiene la secuencia de ADN específica de la línea de Soya Roundup Ready como ADN recombinante a ser detectado. En otra modalidad de la presente invención, la molécula estándar contiene una parte de la secuencia del gen zSSIIb del maíz como estándar interno y contiene la secuencia de ADN específica para las líneas GA21, T25, MON810, Eventl76 y Btll, es decir, la región terminadora -epsps-NOS , la región terminadora pat-35S, la región adhl-lScrylA (b) , la región cxyTA (b) -PEPC#9 y a región terminadora crylA(b) -NOS, respectivamente. En esas modalidades, las moléculas estándar son las moléculas de ADN que pueden autorreproducirse o autorreplicarse en Escherichia. coli . De manera particular, la PC cuantitativa de acuerdo a la presente invención y la determinación del número de moléculas de la secuencia de ADN de interés puede ser efectuada, por ejemplo, de acuerdo a lo siguiente. (i) Preparación de la curva estándar La PCR se efectúa utilizando diferentes números de moléculas estándar, los cebadores para amplificar la secuencia de ADN específica para la línea recombinate genética de la secuencia de ADN interna compartida por las especies correspondientes al recombinante bajo la presencia de la sonda que incrementa la intensidad de la fluorescencia dependiendo del progreso de la amplificación de la secuencia de ADN interna o de la amplificación de la secuencia de ADN específica para el recombinante genético. La intensidad de la fluorescencia es verificada cada número predeterminado de veces de ciclos por cada reacción que utiliza el número definido de moléculas estándar como el ADN patrón que existió al inicio de la reacción (Figura 14 (A) , (B) ) . Entonces se determina el umbral de incremento de la fluorescencia (ARn) en la fase, donde se observa una relación exponencial entre la intensidad de la fluorescencia y el número de ciclos. Por ejemplo, ARn se fija en 10-1 en la Figura 14. El número de ciclos de la PCR que alcance el umbral puede ser graficado contra el número de moléculas del patrón de ADN que existía al inicio de la reacción tomando el numero de ciclos de PCR como el eje vertical y el número de moléculas del ADN patrón que existen al inicio de la reacción como un eje horizontal para generar la curva estándar (Figura 15) . (ii) PCR para los ADN muestra Con respecto a la secuencia de ADN específica para una linea de un recombinante genético y una secuencia de ADN interna compartida por las especies correspondientes al recombinante genético, que puedan estar contenidas en la muestra, se efectúa la PCR cuantitativa para la secuencia de ADN especxfica para el recombinante genético en la muestra y para la secuencia de ADN interna, respectivamente. La secuencia de ADN específica para recombinantes genéticos puede ser la secuencia que sea especifica para cada una de las líneas recombinantes genéticas o puede ser compartida comúnmente por dos o más líneas recombinantes genéticas . La PCR de la secuencia de ADN específica para cada recombinante genético y para la secuencia de ADN interna puede ser efectuada la misma reacción o una reacción separada, en tanto se asegure que la molécula de ADN patrón sea idéntica en ambas reacciones . (iii) Determinación del número de moléculas de la secuencia de ADN específica para los recombinantes genéticos y el número de moléculas en las secuencias de ADN internas . La PCR puede ser efectuada para cada secuencia individual como se describió anteriormente, verificando las señales como indicadoras de la amplificación para determinar el número de ciclos donde la señal alcanza el umbral definido en el paso (i) . A continuación el número de ciclos obtenido es convertido al número de moléculas que existían al inicio de la reacción utilizando la curva estándar generada del paso (i) - Cuando la curva estándar como se definió en (i) ya ha sido obtenida, la curva estándar puede ser utilizada para los procedimientos después del paso (ii) . Una vez obtenido el número de moléculas de la secuencia de ADN específica recombinante en la muestra, se obtiene el número de moléculas de la secuencia de ADN interna y la relación de cuantificación para cada recombinante individual, la relación de contenido total de recombinantes genéticos y la relación de contenido individual de cada línea contenida en la muestra puede ser calculada de acuerdo a la fórmula (I) o la fórmula (III) mencionadas anteriormente. En la fórmula (I) o la fórmula (III) , puede ser seleccionada cualquier secuencia de ADN que sea específica para cada una de las líneas recombinantes genéticas o la secuencia de ADN que no sea específica de la línea pero que sea utilizada frecuentemente para recombinantes genéticos como la secuencia de ADN recombinate a ser cuantificada . Cuando es seleccionada la primera, la relación de contenido total de los recombinantes genéticos en la muestra puede ser cuantificada de manera exacta sumando la relación de contenido de cada línea en la muestra después de analizar de manera repetida todas las líneas recombinantes genéticas, debido a que la relación de contenido individual de cada línea individual en la muestra puede ser definida exactamente . Ese método puede ser un método adecuado en muchos casos para un modo de distribución donde las muestras a ser analizadas sean una mezcla de la pluralidad de líneas en el canal de distribución. Cuando es seleccionada la última, debido a que la relación de contenido aproximado puede ser determinada simultáneamente para una pluralidad de líneas, esta puede ser una muestra estándar adecuada para cuantificar convenientemente la relación de contenido total aproximada de todos los recombinantes genéticos en la muestra. En esos casos, cualquier valor de las relaciones de cuantificación calculadas para las lineas recombinantes genéticas puede ser seleccionado como la relación de cuantificación en la fórmula (I) , pero es preferible utilizar la relación de cuantificación mínima entre esos valores . Esto hará posible estimar el valor máximo posible como la relación de contenido de los recombinantes genéticos .
(Ejemplo) Los siguientes ejemplos pueden ilustrar la presente invención pero esos ejemplos son únicamente para explicación y el alcance de la presente invención no deberá ser limitado a esos ejemplos. En los siguientes ejemplos, se emplearon las siguientes muestras, reactivos y dispositivos. (1) Muestras Se utilizaron las semillas secas de las siguientes seis variedades de maíz (Zea mays) : Maíz recombinante genético: variedades de la progenia de la línea BT 11, línea Eventl76, línea MON810, línea T25 y línea GA21. Maíz no recombinante: Dairyland 1412 Se utilizaron semillas secas de las siguientes dos variedades de soya [Glycine max) : Soya recombinante genética: variedades de la progenie de Soya Roundup Ready. Soya no recombinante : especie Murayutaka Se utilizaron las semillas secas de la siguiente variedad de arroz {Oryza sativa) : Arroz no recombinante : especie Kinuhikari Se utilizaron las semillas secas de la siguiente variedad de trigo (Triticum aestivum) : Trigo no recombinante : especie Haruyutaka Se utilizaron las semillas secas de la siguiente variedad de cebada [Hordeum vnlgare) : Cebada no recombinate: especie Harrington (2) Reactivos Se utilizaron los siguientes reactivos para extracción de ADN : Lauril sulfato de sodio (SDS) (react garantizado) (Sigma Chemical Co . ) QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit (QIAGEN GmbH) QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN GmbH) Se utilizaron los siguientes reactivos para electroforesis : Acido acético (reactivo garantizado) (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) Tris [hidroximetil] aminometano (Tris) (reactivo garantizado) (Sigma Chemical Co.) Acido etilen-diamin-tetraacético (EDTA) (reactivo garantizado) (Sigma Chemical Co . ) Polvo de agarosa "L03 pTaKaRaJ " (TaKaRa Shuzo Co., Ltd) Bromuro de etidio (Sigma Chemical Co.) Ficoll 400 (Sigma Chemical Co.) Azul de bromofenol (Sigma Chemical Co.) Xilen cianol (Sigma Chemical Co.) Marcador de ADN "digestión de HindIII de lambda" (New England Bxolabs Inc.) Marcador de ADN "escalera de 1 kb" (New England Bxolabs Inc . ) Marcador de ADN "escalera de 100 pb" (New England Bxolabs Inc.) Se utilizaron los siguientes reactivos para la PCR cualitativa : ADN polimerasa "AmpliTaq Gold" (PE Biosystems) Amortiguador de PCR II X10 (PE Biosystems) SE utilizaron los siguientes reactivos para producir y purificar plásmidos : ADN polimerasa "AmpliTaq Gold" (PE Biosystems) Amortiguador de PCR II X10 (PE Biosystems) ADN polimerasa "KOD" (TOYOBO Co . , Ltd) Amortiguador de PCR II X10 (TOYOBO Co., Ltd) Equipo de Clonación TOPO TA con Células TOP10F' (Invitrogen Co . ) Extracto de levadura (Difco Laboratories) Triptona Peptona (Difco Laboratories) NaCl (reactivo garantizado) (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) Polvo de agar (Syoei Kanten Ltd.) Sal sódica de D [-] -a-Aminobencilpenicilina (Ampicilina) (Sigma Chemical Co.) QIAGEN Plasma Maxi Kit (QIAGEN GmbH) Etanol (reactivo garantizado) (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) 2-propanol (reactivo garantizado) (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) Tris [hidroximetil] amxnometano (Tris) (reactivo garantizado) (Sigma Chemical Co . ) Acido etilen-diamin-tetraacético (EDTA) (reactivo garantizado) (Sigma Chemical Co.) Enzima de Restricción nHindlXX" (TaKaRa Shuzo Co. , Ltd. ) Enzima de Restricción "BamHl" (TOYOBO Co., Ltd) Enzima de Restricción "Smal" (New England Biolabs Inc . ) Enzima de Restricción "Srfl" (New England Biolabs Inc . ) Fenol (reactivo garantizado) (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) Cloroformo (reactivo garantizado) (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) Alcohol isoamílico (reactivo garantizado) (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) Se utilizaron los siguientes reactivos para la PCR cuantitativa : TagMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems) (3) Dispositivos Se utilizaron los siguientes dispositivos para la extracción de ADN de muestras : Granulador "Muíti Beads Shocker MB301" (Yasui Kikai Co. ) Granulador "DM-6" (Yu Chi Machinery Co . , Ltd. ) Mezclador de contacto "Tube Mixer" (Yamato Scientific Co . , Ltd.) Ultradesmineralizador "CPW-200" (ADVANTEC Toyo Kaisya Ltd. ) Incubador "Thermo Minder SD mini" (TAITEC Co.) Centrífuga "himac CT13" (Hitachi Koki Co., Ltd.) Centrífuga "himac CF15D2" (Hitachi Koki Co., Ltd.) Centrífuga "AllegraTM 6KR" (Beckman Coulter, Inc.) Espectrofotómetro "DU7400" (Beckman Coulter, Inc.) Se utilizaron los siguiente dispositivos para la estroforesis de ADN: Aparato de electroforesis "Mupid 2" (Advance Co . , Ltd) Analizador de imágenes "Molecular ImagerR FX" (BioRad Laboratories Inc . ) Se utilizaron los siguientes dispositivos para la PCR cualitativa: Ciclador Térmico "PCT-200" (MJ Research Inc.) Ciclador Térmico "PCR System 9700" (PE Biosystems) Se utilizaron los siguientes dispositivos para producir y purificar plásmidos : Incubador con agitación "Thermostat Shaking Incubator AT24R" (Thomas Kagaku Co . , Ltd.) Ciclador Térmico WPCT-200" (MJ Research Inc.) Ciclador Térmico "PCR System 9700" (PE Biosystems) Centrífuga "himac CT13" (Hitachi oki Co., Ltd.) Centrífuga " imac CF15D2" (Hitachi Koki Co., Ltd.) Se utilizaron los siguientes dispositivos para la PCR cuantitativa: Aparato de PCR cuantitativa "ABI PRISM 7700 Sequence Detector System" (PE Biosystems) Aparato de PCR cuantitativa "ABI PRISM 5700 Sequence Detector System" (PE Biosystems) (4) Otros La síntesis de cebador fue consignada a Greiner Japan K.K. La síntesis de sonda fue consignada a PE Biosystems Japan K.K. La verificación de las secuencias de ADN fue consignada a Greiner Japan K.K.
Ejemplo 1 Extracción de ADN La extracción del ADN del maíz, soya, arroz, trigo, cebada se llevó a cabo de acuerdo a los siguientes procedimientos. En primer lugar, las muestras fueron trituradas hasta polvo por medio del granulador "DM-6" (Yu Chi Machinery Co., Ltd.), a continuación se pesaron 500-1,000 mg de productos triturados y los ADN fueron extraídos de los productos triturados utilizando el QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit (QIAGEn GmbH) de acuerdo al protocolo del fabricante. Al extraer ADN de un solo grano de maíz o soya, la superficie del grano fue lavada primero bien con SDS al 1% antes de triturar por medio del granulador "Muíti Beads Shocker MB301" (Yasui Kikai Co.), y a continuación todo el producto triturado fue utilizado para la extracción del ADN . La extracción del ADN de las muestras ciegas descritas en los Ejemplos 12, 13 y 14 se llevó a cabo de acuerdo al siguiente procedimiento. Este será descrito para el maíz como un ejemplo, pero puede llevarse a cabo el procedimiento similar para la soya. En primer lugar el maíz recombinante genético y el maíz no recombinante fueron lavados con una solución de SDS al 1%, respectivamente, antes del secado. Después de eso, son triturados por separado por medio del granulador "DM-6" (Yu Chi Machinery Co., Ltd.) y se pesó 1 g de cada uno de los productos triturados, el maíz recombinante genético y el maíz no recombinante fueron mezclados utilizando el granulador "DM-6" (Yu Chi Machinery Co., Ltd.) . Se pesaron 500-1,000 g de la muestra mezclada y se extrajo el ADN de los productos triturados utilizando QIAGEN Dneasy Plant Maxi Kit (QIAGEN GmbH) de acuerdo al protocolo del fabricante. 1 µ? de cada una de todas las soluciones de ADN extraídas fue sometido a electroforesis después de mezclar con 1 µ? de amortiguador de carga lOx (Ficoll 400 al 20%, EDTA 0.1 M, SDS al 1.0%, azul de bromofenol 0.25, Xylene Cyanol al 0.25%) para confirmar que no ocurrió la degradación durante el proceso de extracción. A saber, la electroforesis se llevó a cabo utilizando el aparato de electroforesis "Mupid 2" (Advance Co., Ltd) y un gel de agarosa al 0.8% que contenía 50 µg de bromuro de etidio (Sigma Chemical Co.) en amortiguador TAE (Tris 0.04 M, Acido Acético 0.04 M, EDTA 0.001 M) a 100V durante 15 minutos . Los ADN en el gen fueron confirmados por medio del analizador de imágenes "Molecular ImagerR FX" (BioRad Laboratories Inc . ) Adicionalmente, se sometió 1 µL de cada una de todas las soluciones de ADN extraído a espectrofotometría para determinar la concentración y la pureza de las mismas. A saber, la absorbancia de la muestra a 230 nm, 260 nm, 280 nm que fue diluida con 49 µL de amortiguador TE para llevar a una dilución de 50 veces y la concentración y la pureza de las mismas se calcularon utilizando una Unidad de 1 A26o = 50 µg. Todo el ADN extraído fue almacenado a -20°C.
Ejemplo 2. Selección de las regiones para la detección (Diseño de los pares de cebadores y sondas) Las secuencias de ADN recombinantes son determinadas utilizando el ADN extraído de cada una de las variedades de progenies de las líneas recombinantes genéticas con los cebadores de secuenciamiento mostrados en la Tabla 1.
Tabla 1. Cebador de Secuenciamiento Cebador SEQ ID NO Secuencia Nucleotídica (5'- >3') crylA 1-5' 1 TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCA A T35S 2-3' 2 TGG ATT TTG GTT TTA GGA ATT AGA AA adhl 1-5' 3 GCA CTG AAT TTG TGA ACC C NOS ter 1-3' 4 CTA TAT TTT GTT TTC TAT CGC P35S-5' 5 ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T NOS ter 2-3' 6 TTA CC TAG TTT GCG CGC TA rAct pro-5' 7 ATC TTT GGC CTT GGT AGT TTG NOS ter-3' 8 ATT GCG GGA CTC TAA TCA TAA P35S-5' 9 ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T T35S-3' 10 ACT AAG GGT TTC TTA TAT GCT CAA CA CM01 11 CAC TAC AAA TGC CAT CAT TGC GAT A CR01 12 GAT GTT TGG GTT GTT GTC CAT CaM03-5' 13 CCT TCG CAA GAC CCT CC TCT ATA EPSPS01-3' 14 ATC CTG GCG CCC ATG GCC TGC ATG Tabla 1. (continuación) <Texto Libre del Listado de Secuencia> SEQ ID NO: 1 - 14: cebador de PCR El par de cebadores para amplificar la secuencia de ADN que es especifica para la línea recombinante genética fue diseñado para amplificar la región que se extiende sobre la pluralidad de secuencias de ADN contenida en la secuencia de ADN introducida. A saber, el par de cebadores fueron diseñados para amplificar el terminador crylA(b) - Nos y adhl-S-crylA(b) para las variedades de la progenie de la línea Btll, crylA(b) - PEPC#9 para las variedades de la progenie de la línea Eventl76, hspl0-cryIA (b) para las variedades de la progenie de la línea MON810, pat - 355 para las variedades de la progenie de la línea T25,. m-epsps - NOS y OPT - m-epsps para las variedades de la progenie de la línea GA21 y CPT4 - CP4-epsps para las variedades de la progenie de la línea de Soya Roundup Ready. El par de cebadores para amplificar la secuencia de ADN que no es específica de la línea pero que se utiliza frecuentemente para los recombinantes genéticos fue diseñado para amplificar una secuencia interna de la secuencia promotora CaMV35S o una secuencia interna de la secuencia terminadora NOS. Adicionalmente, se seleccionó una secuencia interna del gen zSSIIb para el maíz o la secuencia interna del gen leí para la soya como secuencia de ADN del gen endógeno específico que posee el organismo. Esas secuencias se obtuvieron buscando sobre una base de datos de genomas para diseñar los cebadores. Se diseñó la sonda que tenía el valor de Tm de aproximadamente 10 °C mayor que los valores de Tm de los cebadores entre los cebadores (Tablas 2A y 2B) .
Tabla 2A. Cebadores/Sondas para el maíz SEO ID NO Cebador/Sonda Región amplificada Longitud Objetivo de la amplificada Amplificación 15 SSIIb 1-5' zSSIIb/sentido 151 pb 16 SSIIb 1-3' zSSIIb/antisentido 17 SSIIb-Taq maiz intrínseco 18 P35S 1-5' 35S-pro/sentido 101 pb 19 P35S 1-3' 35S-pro/antisentido 20 P35S Taq CaM35S-pro 21 NOS ter 2-5' NOS-ter/sentido 151 pb 22 NOS ter 2-3' NOS-ter/antisentido 23 NOS-Taq NOS ter 24 E176 2-5' cryIA (b) /sentido 100 pb 25 E176 2-3' PEPC#9 intrón/antisentido 26 E176-Taq Eventl76 27 Btll 2-5' cryIA (b) /sentido 151 pb 28 Btll 2-3' NOSter/antisentido Tabla 2A. Cebadores/Sondas para el maíz (continuación) SEQ ID NO Cebador/Sonda Región amplificada Longitud Objetivo de la amplificada Amplificación 29 Btll-Taq Btll 30 GA21 2-5' -epsps/sentido 141 pb 31 GA21 2-3' NOS ter/antisentido 32 GA21-Taq GA21 33 T25 1-5' pat/sentido 149 pb 34 T25 1-3' 35S-ter/antisentido 35 T25-Taq T25 36 810 2-5' hspl0/sentido 113 pb 37 M810 2-3' cryIA (b) /antisentido 38 M810-Taq MON810 39 Btll 3-5' adhl-S IVS6/sentido 128 pb 40 Btll 3-3' cryIA (b) /antisentido 41 Btll 2-Taq Btll 42 GA21 3-5' OTP/sentido 133 pb 43 GA21-3-3' m-epsps/antisentido 44 GA21 2-Taq GA21 77 SSIIb 2-5' zSSIIb/sentído 133 pb 78 SSIIb 2-3' zSSIIb/ ntisentido 79 SSIIb 3-5' zSSIIb/sentido 114 pb 80 SSIIb 3-3' zSSIIb/antisentido Tabla 2A. Continuación SEQ ID NO 15 CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C 16 TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG 17 5'-Fam-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-Tamra-3' 18 ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T 19 CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T 20 5'-Fam-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-Tamra-3' 21 GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG 22 CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T 23 5' -Fam-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-Tamra-31 24 TGT TCA CCA GCA GCA ACC AG 25 ACT CCA CTT TGT GCA GAA CAG ATC T 26 5' -Fam-CCG ACG TGA CCG ACT ACC ACA TCG A-Tamra-3' 27 TTA GCG CTC ATG TGT TCA ATT CT 28 CGG CAA CAG GAT TCA ATC TTA A 29 5 ' -Fam-ACA TTG ACC GTA TTG AGT TTG TGC CTG CC-Tamra-3 ' 30 GAC CTT CCC CGA CTA CTT CGA 31 ATC GCA AGA CCG GCA ACA 32 5'-Fam-CGA ATT TCC CCG ATC GTT CAA ACA TTT-Tamra-3' 33 GCC AGT TAG GCC ACT TAC CCA 34 TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT 35 5'-Fam-CAT GCC CGC TGA AAT CAC CAG TCT CT-Tamra-3' Tabla 2A. Continuación <Texto libre del listado de secuencia> SEQ ID NOS: 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 27, 28 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 77, 78, 79, 80 cebador PCR SEQ ID NO: 17: Sonda para zSSIIE de maíz SEQ ID NO: 20: Sonda para promotor CaMV 35S SEQ ID NO: 23: Sonda para terminador NOS SEQ ID NO Sonda para Eventl76 SEQ ID NO Sonda para Btll SEQ ID NO Sonda para GA21 SEQ ID NO Sonda para T25 SEQ ID NO Sonda para MON810 SEQ ID NO Sonda para Btll SEQ ID NO Sonda para GA21 Tabla 2B. Cebadores/Sondas para la soya SEQ ID Cebador/Sonda Región diseñada Longitud NO Objetivo de la amplificada amplificación 45 Leln 02-5' lel/sentido 118 pb 46 Leln2-3' leí/antisentido 47 Lel-Taq Intrínseca de la soya 48 RRS 01-5' CTP4/sentido 121 pb 49 RRS 01-3' CP4-epsps/antisentido 50 RRS-Taq Soya Roundup Ready 18 P35S 1-5' 35S-pro/sentido 101 pb 19 P35S 1-3' 35S-pro/antisentido 20 P35S-Taq CaM35S-pro 21 NOS ter 2-5' NOS-ter/sentido 151 pb 22 NOS ter 2-3' NOS-ter/antisentido 23 NOS-Taq NOS ter Tabla 2B. (Continuación) SEQ ID NO Secuencia nucleotídica (5'->3') 45 GCC CTC TAC TCC ACC CCC A 46 GCC CAT CTG CAA GCC TTT TT 47 5' -Fam-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-Tamra-3' 48 CCT TTA GGA TTT CAG CAT CAG TGG 49 GAC TTG TCG CCG GGA ATG 50 5'-Fam-CGC AAC CGC CCG CAA ATC C-Tarara-3' 18 ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T 19 CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T 20 5' -Fam-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-Tamra-3 ' 21 GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG 22 CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T 23 5' -Fam-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-Tamra-3 ' <Texto libre del listado de secuencia> SEQ ID NOS: 45, 46, 48, 49: cebador de PCR SEQ ID NO: 47: Sonda para leí de soya SEQ ID NO: 50: Sonda para Soya Roundup Ready Ejemplo 3: Confirmación de la Especif cidad de Pares de Cebadores (PCR Cualitativa) Se hizo la confirmación de sí los pares de cebadores diseñados en el Ejemplo 2 eran capaces de detectar específicamente únicamente sus secuencias objetivo en la PCR cualitativa . Como muestras de maíz, se utilizaron las variedades de la progenie de la línea Btll, línea Eventl76, línea MON810, línea GA21 y línea T25 y un maíz no recombinante, Dairyland 1412. Como muestras de soya, se utilizaron una variedad de la progenie de la línea de Soya Roundup Ready y una soya no recombinante, Murayutaka. En total, se extrajeron ocho tipos de ADN de las muestras individuales de la misma manera que en el Ejemplo 1. Puesto que existía la posibilidad de contaminación con cultivos principales diferentes al maíz y soya en muestras de ensayo reales, también se extrajeron tres tipos de ADN de arroz (especie Kinuhikari) , trigo (especie Haruyutaka) y cebada (especie Harrington) , respectivamente, de la misma manera que en el Ejemplo 1. Los once tipos en el ADN total extraído anteriormente, fueron utilizados como patrones de PCR y se utilizó agua destilada como control negativo en la PCR cualitativa. La reacción se efectuó utilizando el Ciclador Térmico "PTC-200" (MJ Research Inc.). En el experimento, cada uno de los cebadores fue utilizado en la solución de PCR a una concentración final de 0.5 µ?. El ADN extraído de las muestras individuales (patrones) fue utilizado en una cantidad de 25 ng por sistema de reacción. Como una enzima de PCR, se utilizó la ADN polimerasa vAmpliTaq Gold" (PE Biosystems) en una cantidad de 0.625 Unidades por sistema de reacción. Como amortiguador de reacción, se utilizó Amortiguador de PCR II xlO (PE Biosystems) en un volumen de 2.5 µ?-? , y se utilizaron MgCl2 y d TP en concentraciones de 1.5 mM y 200 µ?, respectivamente, por sistema de reacción.
El sistema de reacción se aforó hasta 20 µ?, con agua destilada . Las condiciones de reacción empleadas fueron las siguientes: manteniendo durante 10 minutos a 95°C, 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 58°C y 30 segundos a 72°C, seguidos por mantenimiento durante 7 minutos a 72 °C y manteniendo a 4°C. Después de concluida la reacción, se tomó una muestra de 5 µ?? de la solución de reacción, mezclada con 1 µ?? de un amortiguador de carga lOx, y a continuación se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 3% en amortiguador TAE a 100V durante 15 minutos utilizando un aparato de electroforesis "Mupid 2" (Advance Co., Ltd.). Después de que el gel fue teñido con bromuro de etidio (Sigma Chemicals Co.) durante 15 minutos, se confirmó la presencia de los productos de la amplificación por PCR utilizando un analizador de imágenes "Molecular ImagerR FX" (BioRad Laboratories Inc . ) . Un ejemplo de los resultados del experimento se muestra en la Figura 2. Se confirmó que los pares de cebadores diseñados para la detección de la variedad de la progenie de la linea T25 eran capaces de detectar específicamente solo la variedad de la progenie de la línea T25 y no mostraron reacción cruzada con otras muestras. Todos los resultados confirmados de la misma manera se resumen en la Tabla 3. Como se muestra en la Tabla 3, se confirmó que todos los pares de cebadores eran capaces de detectar específicamente solo sus variedades de progenie objetivo de las líneas recombinantes genéticas, respectivamente .
Tabla 3. Especificidades de los pares de cebadores y las sondas Tabla 3 (Continuación) Soya Roundup Ready, +: positiva, -: Negativa Ejemplo 4: Confirmación de la Especificidad de los Pares de Cebadores y Sondas (PCR Cuantitativa) Se hizo la confirmación de sí los pares de cebadores y los cebadores diseñados en el Ejemplo 2 eran capaces de detectar específicamente únicamente sus secuencias objetivo en la PCR cuantitativa. Como en el caso del Ejemplo 3, como muestras de maiz, se utilizaron las variedades de la progenie de la línea Btll, línea Eventl76, línea MON810, línea GA21 y línea T25 y un maíz no recombinante , Daixyland 1412; y, como muestras de soya, se utilizaron una variedad de la progenie de la línea de Soya Roundup Ready y una soya no recombinante, Murayutaka . En total se extrajeron ocho tipos de ADN de las muestras individuales de la misma manera que en el Ejemplo 1. Puesto que existía una posibilidad de contaminación con cultivos principales diferentes al maíz y soya en muestras de ensayo reales, también se extrajeron tres tipos de ADN del arroz (especie Kinuhikari) , trigo (especie Haruyutaka) y cebada (especie Harrington) , de la misma manera que en el Ejemplo 1.
Los 11 tipos en el ADN total extraído anteriormente, fueron utilizados como patrones de PCR y se utilizó agua destilada como control negativo en la PCR cuantitativa. La reacción se efectuó utilizando un aparato de PCR cuantitativa ¾ABI PRISM 7700 Sequence Detector System" (PE Biosystems) . En el experimento, cada uno de los cebadores fue utilizado a una concentración final de 0.5 µ?, y el cebador fue utilizado en una concentración final de 0.2 µ? en la solución de reacción. El ADN extraído de la muestra individual (patrón) fue utilizado en una cantidad de 50 ng por sistema de reacción, y se utilizó un TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems; aqui posteriormente referido simplemente como "Master Mix") en un volumen de 12.5 µL por sistema de reacción. El sistema de reacción se aforó hasta 25 µL . Las condiciones de reacción empleadas fueron las siguientes: mantenimiento de la solución de reacción durante 2 minutos a 50 °C y a continuación 10 minutos a 95°C, 40 ciclos de 30 segundos a 95°C y 1 minuto a 59°C, seguidos por mantenimiento a 25 °C. Durante la reacción, también se midió con el tiempo la intensidad de la fluorescencia en cada paso de reacción. Los pozos que mostraron aumento en la intensidad de la fluorescencia pueden ser identificados analizando el curso temporal del cambio en la intensidad de la fluorescencia en cada pozo después de completar la reacción. La intensidad de la fluorescencia se incrementó como resultado de la degradación de la sonda en asociación con la amplificación por PCR. En consecuencia, en un pozo en el cual se observó el incremento de la intensidad de la fluorescencia, se consideró que ocurre la amplificación por PCR y la sonda se degradó. Un ejemplo de los resultados del experimento se muestra en la Figura 3. Se confirmó que los pares de cebadores y la sonda diseñada para la detección de terminador NOS fueron capaces de detectar específicamente solo las variedades de la progenie de la linea Btll, linea Eventl76 y línea de la Soya Roundup Ready y no mostraron reacción cruzada con otras muestras . Todos los resultados confirmados de la misma manera son resumidos en la Tabla 4. Como se muestra en la Tabla 4, se confirmó que todos los cebadores y sondas fueron capaces de detectar específicamente solo sus variedades de progenie objetivo de las líneas recombinantes genéticas, respectivamente.
Tabla 4. Especificidades de las sondas y los pares de cebadores Tabla 4 (Continuación) : Soya Roundup Ready, +: positiva, -: negativa Ejemplo 5: Producción de Moléculas Estándar (Maíz) La integración de las regiones a ser detectadas que fueron seleccionadas en el ejemplo 2 se efectuó de acuerdo al procedimiento mostrado esquemáticamente en la Figura 4. A saber, la PCR se efectuó utilizando los cebadores atados mostrados en al Tabla 5 y el ADN extraído de las líneas recombinantes genéticas correspondientes como patrones sucesivamente para dar productos de la PCR que tienen sobre su término otras secuencias complementarias a las regiones objetivo a ser detectadas. La PCR se efectuó utilizando un sistema de reacción que contiene 10 ng de ADN de maíz como patrón, 0.5 µ? de cada cebador atado, 0.156 Unidades de ADN polimerasa "KOD" (TOYOBO Co., Ltd.), 160 µ? de dNTP, 1.5 mM de MgCl2 y 2.5 µL de amortiguador de PCR II xlO (TOYOBO Co., Ltd.), que se aforaron hasta un volumen total de 25 L con agua destilada. Las condiciones de reacción empleadas fueron las siguientes: manteniendo durante 1 minuto a 98 °C y a continuación 35 ciclos de 30 segundos a 98°C, 30 segundos a 5 °C y 1 minuto a 74°C, seguidos por mantenimiento durante 2 minutos a 74°C y manteniendo a 4°C. Cada uno de los productos de la PCR resultante, junto con uno de los productos de la PCR en el cual una región va a estar adyacente en la región contenida en ese producto de la PCR fue amplificado, fue sometido a una reacción de integración utilizando PCR. A saber, se mezclaron 0.25 µ? de los productos de PCR individuales amplificados anteriormente con 0.156 Unidades de ADN polimerasa wKOD" (TOBOYO Co., Ltd.), 160 µ? de dNTP, 1.5 mM de MgCl2 y 2.5 µL de amortiguador de PCR II X10 (TOBOYO Co. Ltd.), los cales se aforaron a un volumen» total de 24.5 µL con agua destilada. Primero, el sistema de reacción fue sometido a amplificación por PCR sin ningún cebador. Las condiciones de reacción empleadas fueron las siguientes: manteniendo durante 1 minuto a 98°C y a continuación 8 ciclos de 30 segundos a 98 °C, 30 segundos a 56°C y 1 minuto a 74°C, punto en el cual se determinó el tiempo de reacción. A continuación, se agregaron los cebadores más externos individuales al sistema de reacción en una cantidad de 0.5 µ?, y se efectuó además la amplificación por PCR para dar un producto de amplificación que tiene las dos regiones combinadas . Las condiciones de reacción empleadas en la segunda reacción fueron como sigue: manteniendo durante 1 minuto a 98 °C y a continuación 35 ciclos de 30 segundos a 98°C, 30 segundos a 56°C y 1 minuto a 74°C, seguido por mantenimiento durante 2 minutos a 74°C y manteniendo a 4°C. Repitiendo la reacción de integración de manera similar, se produjeron las moléculas mostradas en las Figuras 5 y 6. La molécula mostrada en la Figura 5 tiene una secuencia de ADN de zSSIXb (Número de acceso del GENBANK AF019297) del objetivo de la amplificación integrado entre los nucleótidos 1 a 151, una secuencia de ADN del promotor CaMV 35S del objetivo de la amplificación integrado entre los nucleótidos 152 a 252, una secuencia de ADN de terminador NOS del objetivo de la amplificación integrado entre los nucleótidos 257 a 425, una secuencia de ADN especifica de la línea GA21 del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 441 a 581, una secuencia de ADN específica de la línea T25 del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 582 a 730, una secuencia de ADN específica de la línea MON810 del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 731 a 843, una secuencia de ADN específica de la línea Eventl76 del objetivo de la amplificación integrada de los nucleótidos 844 a 951 y una secuencia de ADN específica de la línea Btll del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 952 a 1102. La secuencia de esta región es mostrada en la SEQ ID NO: 57. La secuencia nucleotídica de la molécula de la Figura 5 es mostrada en la SEQ ID NO: 73. La molécula mostrada en la Figura 6 tiene una secuencia de ADN de zSSJZfo del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 1 a 151, una secuencia de ADN del promotor CaMV35S del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 152 a 252 , una secuencia de ADN de terminador NOS del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 275 a 425, una secuencia de ADN específica de la línea GA21 del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 441 a 573, una secuencia de ADN específica de la línea T25 del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 574 a 722, una secuencia de ADN específica de la línea MON810 del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 723 a 835, una secuencia de ADN específica de la línea Eventl76 del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 836 a 943 y una secuencia de ADN específica de la línea Btll del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 944 a 1071. La secuencia nucleotídica de la molécula de la Figura 6 se muestra en la SEQ ID NO: 74.
Tabla 5 SEQ ID Cebador NO: 51 SSIIB-P35S-5' CAT TTG GAG AGG TGG ATT TCT CTC TTG 52 SSIIB-P35S-3' GAG AGA AAT CGA CCT CTC CAA ATG AAA 53 P35S-SrfI-NOS-5' TAT CAC ATC AAT GCC 033 GCG AAT CCT GIT GGC G3 54 P35S-SrfI-NOS-3 ' G3C AAC AGG ATT 03C C03 Q3C ATT GAT GTG ATA TCT Tabla 5 Pro : Promotor Tabla 5 (Continuación) SEQ ID NO: Región Combinada 51 SSllb+35S Pro 52 SSllb+35S Pro 53 35S Pro+NOS 54 35S Pro+NOS 55 N0S+GA21 56 GA21+T25 57 T25+M810 58 T25+M810 59 M810+E176 60 M810+E176 61 E176+Btll 62 E176+Btll 63 lel+RRS 64 lel+RRS 65 N0S+GA21 66 N0S+GA21 67 GA21+T25 68 GA21+T25 69 E176+Btll Tabla 5 (Continuación) <Texto Libre de Listado de Secuencia> SEQ ID NOs : 51-72: cebadores de PCR; SEQ ID NOs: 73 -74: Regiones objetivo para la amplificación de las moléculas estándar a ser utilizadas para la detección cuantitativa de recombinantes genéticos del maiz; y SEQ ID NO: 75: Una región objetivo para la amplificación de una molécula estándar a ser utilizada para la detección cuantitativa de recombinantes genéticos de soya. Cada una de las moléculas integradas preparadas anteriormente fue reamplificada utilizando ADN polimerasa "Amplitaq Gold" (PE Biosystems) , y ligada en un vector plasmídico utilizando TOPO TA Cloning Kit con células TOP 10F' (Invitrogen Co.) . Se utilizó un sistema de vector hospedero de E.coli, de modo que las moléculas puedan ser suministradas de manera fácil e infinita.
A saber, se sometió ?µ??? de cada una de las moléculas integradas preparadas anteriormente (patrón) a amplificación por PCR bajo las mismas condiciones que en el Ejemplo 3. Después de la reacción, se mezcló l L de la solución de reacción con ?µ?. de vector plasmídico pCR2.1 TOPO y 1 µ?? de amortiguador salino, y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos . Se mezclaron dos µ?? de solución de reacción con cepas E.coli Células TOP10F' incluidas en el equipo, se dejó reposar sobre hielo durante 5 minutos, y a continuación se sometió a tratamiento de choque térmico a 42 °C durante 30 segundos para efectuar la transformación . Se cultivaron 100 µ?? de solución que contenía los transformantes sobre una placa de LB (ampicilina) [composición por L: 10 g de triptona peptona (Difco Laboratories) , 5 g de extracto de levadura (Difco Laboratories), 5 g de NaCl ( ako Puré Chemical Industries, Ltd.), 15 g de polvo de agar (Syoei Kanten Ltd.) y 50 mg de D- [-] -a-aminobencilpenicilina sódica (ampicilina) (Sigma Chemical Co.)], y a continuación se dejó reposar a 37 °C durante la noche para dar los transformantes . Cada colonia de los transformantes resultantes fue sometida a PCR directa de la colonia para seleccionar los transformantes correctos. A saber, se mezclaron el cebador hacia adelante M13 y el cebador hacia atrás o inverso 13 (0.5 µ? cada uno) con 0.625 Unidades de ADN polimerasa "AmpliTaq Gold" (PE Biosystems) y 2.5 µ? de amortiguador de PCR II X10 (PE Biosystems) como un amortiguador de reacción. A cada sistema de reacción también se agregó MgCl2 y dNTP en concentraciones de 1.5 mM y 200 µ? respectivamente. El sistema de reacción se aforó hasta un volumen total de 25 µ?? de agua destilada. La colonia fue retirada con un palillo y a continuación suspendida en el sistema de reacción. Las condiciones de reacción empleadas fueron las siguientes: manteniendo durante 5 minutos a 95°C, 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C y 90 segundos a 72 °C, seguido por mantenimiento durante 90 segundos a 72 °C y manteniendo a 4°C. Los productos de la amplificación por PCR resultante fueron sometidos a electroforesis sobre gel de agarosa. Las colonias que contenían los productos de la amplificación se había encontrado que conformaban al diseño pretendido fueron cultivadas en 40 mL de medio liquido LB (ampicilina) [composición por L: 10 g de triptona peptona (Difco Laboratories) , 5 g de extracto de levadura (Difco Laboratories) , 5 g de NaCl (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) y 50 mg de D [-] -oc-aminobencilpenicilina sódica (Ampicilina) (Sigma Chemical Co.)] a 37°C durante la noche. Los plásmidos fueron extraídos de un cultivo a gran escala de trasformantes de E. coli utilizando QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN GmbH) . La extracción de los plásmidos se efectúo siguiendo el protocolo unido al equipo. Los plásmidos resultantes confirmaron la secuencia nucleotídica correcta y se utilizaron como moléculas estándar (pMul4 y pMul5: Figura 7). Ambos de E. coli-ASN-pMul4 que contiene el plásmido pMul4 y E . coli-ASN-pMul5 que contiene el plásmido pMul5 han sido depositados en el Instituto de Investigación de Ciencia Biotecnología e Industrial, Instituto de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministro Internacional de Comercio e Industria, en 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragiken, 305-8566 Japón (actualmente llamado "Institución Administrativa Independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depósito de Organismos para Patentes Internacionales", en 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Tsukuba Central 6, 305-8566 Japón) bajo los Nos. de Acceso FERM BP-7319 y FERM BP-7320 en Octubre 12, 2000. Cuando esas moléculas fueron utilizadas en la PCR cuantitativa, fueron utilizadas en forma de una molécula linearizada preparada por digestión con enzima de restricción BamHI . En los siguientes ejemplos, se utilizó una digestión de pMul4 con BamHI (aquí posteriormente, digestión de pMul4 con BamHI) como la molécula estándar.
Ejemplo 6: Producción de la Molécula Estándar (Soya) La integración de las regiones objetivo a ser detectadas que han sido seleccionadas en el Ejemplo 2 se efectuó de acuerdo al procedimiento mostrado esquemáticamente en la Figura 4 , como en el caso del Ej emplo 5. A saber, la PCR se efectuó utilizando los cebadores atados mostrado en la Tabla 5 y el ADN extraído de la línea recombinante genética correspondiente (un patrón) para dar un producto de la PCR que tiene sobre el término otra secuencia complementaria a la región a ser detectada. El producto de la PCR resultante junto con el producto de la PCR en el cual la región es adyacente a la región contenida en ese producto de la PCR que amplificó, se sometió a la reacción de integración utilizando PCR. Las condiciones detalladas empleadas en el experimento anterior fueron las mismas que se emplearon en el Ej emplo 5. Como resultado de la reacción de integración, se obtuvieron las moléculas mostradas en las Figuras 8 y 9. La molécula mostrada en la Figura 8 tiene una secuencia de ADN específica de la línea de Soya Roundup Ready del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 1 y 121 y una secuencia de ADN de leí (No. de Acceso del GENBANK K00821 M30884) del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 122 a 239. La secuencia nucleotídica de la molécula de la Figura 8 se muestra en la SEQ ID NO : 75. La molécula mostrada en la Figura 9 tiene una secuencia de ADN específica de la línea de Soya Roundup Ready del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 1 y 121, una secuencia de ADN de leí a ser amplificada entre los nucleótidos 122 a 239, una secuencia de ADN de terminador NOS del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 240 a 419 y una secuencia de ADN del promotor CaMV 35S del objetivo de la amplificación integrada entre los nucleótidos 428 a 528. La secuencia nucleotídica de la molécula de la Figura 9 se muestra en la SEQ ID NO: 75. <Texto Libre del Listado de Secuencia> SEQ ID NOs : 75 y 76: Regiones objetivo para la amplificación de moléculas estándar a ser utilizadas para la detección cuantitativa de recombinantes genéticos de soya.
Cada una de las moléculas integradas preparadas anteriormente fue ligada en un vector plasmídico utilizando el Equipo de Clonación TOPO TA con Células TOP 10F' (Invitrogen Co.) y se utilizó un sistema de vector hospedero de E. coli, de modo que la molécula podría ser suministrada de manera rápida e infinita, de la misma manera que en el Ejemplo 5. Los plásmidos resultantes confirmaron la secuencia nucleótida correcta y se utilizaron como moléculas estándar (pMulSL y pMulSL2: Figuras 10 y 11). Ambas de E.coli-ASN-pMulSL que contiene al plásmido pMulSL y E . coli-ASN-pMulS12 que contiene el plásmido pMulSL2 han sido depositadas en Instituto de Investigación de Ciencia Biotecnologica e Industrial, Instituto de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministro Internacional de Comercio e Industria, en 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305-8566 Japón (actualmente llamado "Institución Administrativa Independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depósito de Organismos para Patentes Internacionales", en 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Tsukuba Central 6, 305-8566 Japón) bajo los Nos. de Acceso FERM BP-7321 y FERM BP-7322 en Octubre 12, 2000. Cuando esas moléculas se utilizaron en la PCR cuantitativa, fueron utilizadas en forma de una molécula linearizada preparada por digestión con la enzima de restricción BamHI . En los siguientes ejemplos, se utilizó una digestión de pMulSL con BamHI (aquí posteriormente, digestión de pMulSL con BamHI, como la molécula estándar.
Ejemplo 7: Uso como Control Positivo para Análisis Cualitativo Se mezclaron juntas las muestras de ADN extraídas de 1 g de cada una de las variedades de la progenie de las líneas Btll, línea GA21 y línea MON810 en iguales cantidades. Se preparó una solución de ADN utilizando la mezcla de ADN en una concentración de ADN de 20 ng/uL. La solución de ADN fue utilizada como una muestra ciega de maíz, y la presencia de maíz recombinante genético en la muestra se examinó por PCR cualitativo utilizando la molécula estándar como control positivo . Los dispositivos y condiciones (por ejemplo composiciones de las soluciones de reacción) empleados en los experimentos fueron los mismos que se emplearon en el Ejemplo 3. La PCR Cualitativa se condujo para todos los pares de cebadores mostrados en la Tabla 2. En el experimento, la solución de ADN preparada anteriormente fue utilizada como patrón de PCR, la molécula estándar de pMul4 digerido con BamHI descrita en el Ejemplo 5 fue utilizada como control positivo, y se usó agua destilada como control negativo. La molécula estándar de pMul4 digerido con BairiHI fue utilizada en una cantidad de 500 moléculas por sistema de reacción. En el caso del Ejemplo 3, después de completar la reacción, se tomaron muestras de 5 µ?_ de la solución de reacción y se sometieron a electroforesis sobre gel de agarosa al 3% y se tiñieron con bromuro de etidio, y la presencia de un producto de la amplificación por PCR fue confirmada utilizando un analizador de imágenes. Como un resultado el experimento, como se muestra en la Figura 12 , se confirmó que las variedades de la progenia Btll, línea GA21 y línea MON810 estaban contenidas en la muestra como maíz recombinante genético. También se confirmó que la molécula estándar pMul4 digerido con BarriHI podría ser utilizada como un control positivo para el análisis cualitativo. En particular, con respecto a la variedad de la progenie de la línea GA21 y la línea MON810, puesto que actualmente no se encuentra comercialmente disponible una muestra estándar, los controles positivos para esas líneas aún no están disponibles para los analistas comunes.
Ejemplo 8: Determinación de la Relación de Cuantificación (Prueba Preliminar-Maíz) Puesto que el maíz es un híbrido heterótico, se requiere una población de semilla Fl uniforme genéticamente o una población de semillas equivalentes a ésta para determinar una relación de cuantificación correcta. De este modo, como prueba preliminar, se confirmó primero la uniformidad genética de las semillas por PCR cuantitativa. Como muestras de la prueba primaria, se utilizaron las semillas Fl para las variedades de la progenie de la línea Btll, línea Eventl76, línea MOM810 y línea GA21. Para la variedad de la progenie de la línea T25, aunque no estuvieron disponibles las semillas Fl, se utilizaron semillas F2 en su lugar. Los detalles del experimento se describen a continuación. Se extrajo el ADN de cada una de ocho semillas de las cinco variedades individuales anteriores, y los números de moléculas de las regiones objetivo a ser detectadas (las cuales fueron seleccionadas en el Ejemplo 2) en el ADN extraído fueron determinados utilizando pMul4 digerido con BairiHl descrito en el Ejemplo 5 como muestra estándar.- A saber, para la secuencia de ADN del gen endógeno del maíz zSSIIb a ser amplificada, se efectuó una PCR cuantitativa utilizando el ADN extraído de cada una de las cinco variedades como un patrón para determinar el número de moléculas de la región en la muestra. Para la secuencia de ADN del promotor CaMV 35S a ser amplificada, se efectuó una PCR cuantitativa utilizando el ADN extraído de cada una de las variedades de la progenie de la linea Btll, línea Eventl76, la línea MON810 y línea T25 como patrón para determinar el número de moléculas de la región de la muestra. Para la secuencia de ADN del terminador NOS a ser amplificada, se efectúa una PCR cuantitativa utilizando el ADN extraído de cada una de las variedades de la progenie de la línea Btll y la línea GA21 como patrón para determinar el número de moléculas de la región en la muestra. Los valores de la medición dados por el experimento fueron utilizados para calcular la relación de cuantificacion para las líneas individuales de acuerdo a la fórmula (II) (Figura 13) . Los experimentos se efectuaron utilizando un aparato de PCR cuantitativa "Sistema Detector de Secuencia ABI PRISM 7700" (PE Biosystems) . En el experimento, la concentración final de cebador de cada solución de PCR fue de 0.5 µ? para todos los cebadores utilizados para la cuantificacion del promotor CaMV 35S, del terminador NOS y el zSSIIb; y la concentración final de la sonda fue de 0.2 µ? para todas las sondas utilizadas para la cuantificación del promotor CaMV 35S, el terminador NOS y el zSSIIb. El ADN extraído de cada muestra como patrón fue utilizada en una cantidad de 50 ng por sistema de reacción, y se utilizó un Mezcla Maestra de PCR Taqman Universal (PE Biosystems; simplemente referido aguí posteriormente como "Mezcla Maestra") en un volumen de 12.5 µ?? por sistema de reacción.
Cada sistema de reacción se aforó a 25 µ??. La misma reacción se efectuó por tetraplicado y los valores medidos fueron promediados . Las condiciones empleadas en la reacción fueron las siguientes : manteniendo la solución de reacción durante 2 minutos a 50°C y a continuación durante 10 minutos a 95°C, 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C y 1 minuto a 59°C, seguidos por mantenimiento a 25 °C. Para la determinación cuantitativa del promotor CaMV 35S, se cargó un tubo de reacción con cada uno de los 12 tipos de muestras que consistían de : la molécula estándar pMul4 digerida con Bamñl. preparada en tres concentraciones (250 moléculas, 1,000 moléculas y 50,000 moléculas por sistema de reacción) como una secuencia de ADN recombinante estándar; las soluciones de ADN extraídas de semillas individuales (ocho muestras en total por cada variedad) como muestras de prueba; y una solución de ADN de esperma de salmón como control negativo. Se agregó un par de cebadores y una sonda para la cuantificación del promotor CaMV 35S y Mezcla Maestra a cada uno de los tubos de prueba a las concentraciones finales indicadas anteriormente para dar una solución de reacción. De manera similar, para la determinación cuantitativa del terminador NOS, se cargó un tubo de reacción con cada uno de los 12 tipos de muestras que consistían de: la molécula estándar pMul4 digerida con BarriEl preparada en tres concentraciones (250 moléculas, 1,000 moléculas y 50,000 moléculas por sistema de reacción) como una secuencia de ADN recombinante estándar; las soluciones de ADN extraídas de semillas individuales (ocho muestras en total por cada variedad) como muestras de prueba; y una solución de ADN de esperma de salmón como control negativo. Se agregó un par de cebadores y una sonda para la cuantificación del terminador NOS y Mezcla Maestra a cada uno de los tubos de prueba a las concentraciones finales indicadas anteriormente para dar una solución de reacción. De manera similar, para la determinación cuantitativa del gen endógeno zSSIIb, se cargó un tubo de reacción con cada uno de los 12 tipos de muestras que consistían de : la molécula estándar pMul4 digerida con BoiríEI preparada en tres concentraciones finales (250 moléculas, 1,000 moléculas y 50,000 moléculas por sistema de reacción) como una secuencia de ADN recombinante estándar; las soluciones de ADN extraídas de semillas individuales (ocho muestras en total por cada variedad) como muestras de prueba; y una solución de ADN de esperma de salmón como control negativo. Se agregó un par de cebadores y una sonda para la cuantificación del zSSIIb y Mezcla Maestra a cada uno de los tubos de prueba a las concentraciones finales indicadas anteriormente para dar una solución de reacción. Durante la reacción, el grado de degradación de la sonda causado por la amplificación por PCR fue determinado con el tiempo en términos del incremento en la intensidad de la fluorescencia. En consecuencia, generando una gráfica (ciclos-intensidad de la fluorescencia) para los tres tipos de muestras proporcionadas como estándares para la cuantificación (x 4) (véase la Figura 14) , puede obtenerse una función de correlación entre el número de moléculas de una secuencia de ADN objetivo a ser amplificada y el tiempo requerido para que la intensidad de la fluorescencia alcance un valor específico (véase la Figura 15) . Utilizando la función de correlación como curva estándar, puede determinarse el número de moléculas de la secuencia de ADN de promotor CaMV 35S a ser amplificada, la secuencia de ADN del terminador NOS a ser amplificada y la secuencia de ADN de zSSIIb a ser amplificada presente en una muestra de cuantificación al inicio de la reacción. (Tabla 6) Tabla 6. El número de moléculas de zSSIIB, promotor CaMV 35S y NOS, respectivamente Muestra zSSIIb CaMV NOS Btll #1 34700 31800 #2 56500 43000 #3 26200 27000 #4 38400 29400 #5 38100 29600 #6 34000 30300 #7 32300 28900 #8 31800 31200 T25 #1 35200 11500 #2 40900 21600 #3 29800 200 #4 33700 12300 #5 22900 18000 #6 27100 0 #7 304000 9400 #8 44300 100 Tabla 6. El número de moléculas de zSSIIB, promotor CaMV 35S y NOS, respectivamente (continuación) Muestra zSSIIb CaMV NOS Eventl76 #1 37000 33800 #2 38800 40000 #3 33800 34300 #4 32800 32300 #5 36800 33500 #6 31500 31800 #7 36000 35000 #8 36300 34500 MON810 #1 30600 13700 #2 34700 14100 #3 32900 11900 #4 30700 14600 #5 30300 12500 #6 33600 14400 #7 31600 13100 #8 25000 10300 GA21 #1 15100 27600 #2 14700 29300 #3 14100 28500 #4 17400 33700 Tabla 6. El número de moléculas de zSSIIB, promotor CaMV 35S y NOS, respectivamente (continuación) Como se muestra e la Figura 13, para las variedades de la progenie la linea Btll, linea Eventl76, línea MON810 y línea GA21, las relaciones de cuantificación fueron casi constantes entre las muestras de ADN de las ocho semillas, y se confirmó que las muestras de semilla eran poblaciones Fl genéticamente uniformes. Para la variedad de la progenie de la línea T25 de las cuales no estuvieron disponibles semilla Fl, sin embargo, la secuencia de ADN integrada mostró una distribución de la progenie que sigue las leyes de Mendel como se esperaba. De este modo, la variedad de la progenie de la línea T25, únicamente las semillas que se había confirmado tenían la estructura genética idéntica a la de la población Fl (marcadas con flechas en la Figura 13) fueron seleccionadas, y se utilizó una población de las semillas en los experimentos posteriores como la población de semillas equivalente a una población de semillas genéticamente uniforme.
Ejemplo 9: Determinación de la relación de Cuantificación (Prueba Preliminar-Soya) La prueba preliminar se efectuó en soya de la misma manera que en el Ejemplo 8. Las semillas Fl de una variedad de la progenie de la línea de Soya Roundup Ready fueron utilizadas como las muestras para la prueba preliminar. Se extrajo el ADN de las ocho semillas Fl de la variedad de la progenie de la linea de Soya Roundup Ready de la misma manera que en el Ejemplo 8, y los números de moléculas de las regiones objetivo a ser detectadas (que hablan sido seleccionadas en el Ejemplo 2) en las muestras de ADN extraídas fueron determinados utilizando la digestión de pMulSL digerida con BamHI descrita en el Ejemplo 6 como una muestra estándar. ? saber, se efectuó una PCR cuantitativa utilizando el ADN extraído como patrón para una secuencia de ADN del gen endógeno de la soya leí del objetivo de la amplificación y una secuencia de ADN específica para la línea de Soya Roundup Ready del objetivo de la amplificación por separado, se determinaron los números de moléculas de las regiones individuales en las muestras. Los valores de medición obtenidos en el experimento fueron utilizados para calcular las relaciones de cuantificación de acuerdo a la fórmula (II) (Figura 16) . Los dispositivos y condiciones (por ejemplo composiciones de soluciones de reacción) empleadas en el experimento son las mismas que aquéllas del Ejemplo 8, excepto que se utilizaron los cebadores y sondas correspondientes a la secuencia de ADM del gen endógeno de la soya Leí a ser amplificada y la secuencia de ADM específica de la línea de Soya Roundup Ready a ser amplificada. Como resultado del experimento, como se muestra en la Figura 6 para la variedad de la progenie de la línea de Soya Roundup Ready, las relaciones de cuantificación calculada fueron casi constantes entre las muestras de ADN de las ocho semillas, y se confirmó que las muestras de semilla eran una población Fl genéticamente uniforme, las cuales fueron utilizadas en experimentos posteriores.
Ejemplo 10: Determinación de la Relación de Cuantificación (Maíz) La prueba para determinar la relación de cuantificación fue efectuada utilizando las poblaciones de semillas Fl genéticamente uniformes y la población de semillas equivalente obtenida en las pruebas preliminares .
Por cada variedad, se determinó el número de moléculas de las regiones objetivo a ser detectadas (seleccionadas en el Ejemplo 2) en el ADN extraído utilizando muestras de ADN extraídas de poblaciones genéticamente uniformes como patrón y la digestión de pMul4 con BamHI descrito en el Ejemplo 5 como muestra estándar de la misma manera que la prueba preliminar . En la prueba, además de las secuencias de ADN del el objetivo de la amplificación cuantificada en la prueba preliminar, también se examinaron secuencias de ADN específicas de la variedad del objetivo de la amplificación. Para las secuencias de ADN específicas de la variedad del objetivo de la amplificación, se determinaron los números de moléculas de las regiones objetivo en la muestra para las variedades individuales correspondientes . Como en el caso del Ejemplo 9, los dispositivos y condiciones (por ejemplo, composiciones de soluciones de reacción) empleadas en el experimento fueron las mismas que aquellas del Ejemplo 8, excepto que se utilizaron diferentes cebadores y sondas para los diferentes objetivos a ser amplificados . Como en el caso de la prueba preliminar, los valores de la medición fueron utilizados para calcular las relaciones de cuantificación de acuerdo a la fórmula (II) . A saber, cada uno de los números de moléculas de secuencias de ADN del promotor CaMV 35S del objetivo de la amplificación, la secuencia de ADN de terminador NOS del objetivo de la amplificación y las secuencias de ADN objetivo específicas de la variedad fueron divididas por el número de moléculas de secuencia de ADN de zSSIIb del objetivo de la amplificación las cuales fueron determinadas, respectivamente, en muestras idénticas para dar las relaciones de cuantificación únicas a las secuencias de ADN individuales (Tabla 7) .
Tabla 7 · Relación de Cuantificación ( x) de la línea recombinante genética del maíz (X) Como el cebador a ser utilizado para la amplificación del gen endógeno zSSIIb, se utilizaron dos conjuntos de cebadores diseñados para una secuencia más corta del objetivo de la amplificación (SSIIB 2-5'/SSIB 2-3' y SSIIb3-5 ' /SSIB 3-3')· Las relaciones de cuantificación determinadas utilizando esos cebadores como los cebadores para la amplificación del gen endógeno también fueron determinadas. (Tablas 8 y 9) .
Tabla 8. Relación de cuantificación por SSIIb 2- 5'/SSHb 2-3' Tabla 9. Relación de Cuantificación por SSIIb 3 5'/SSIIb 3-3' Ejemplo 11: Determinación de la relación de Cuantificación (Soya) Para la soya, la prueba para determinar la relación de cuantificación también se efectuó utilizando la población de semillas genéticamente uniformes obtenidas en la prueba preliminar. Por cada variedad, se determinaron los números de moléculas de la secuencia objetivo de ADN a ser amplificada del gen endógeno de la soya leí en el ADN extraído y la secuencia de ADN especifica de la línea de Soya Roundup Ready por separado utilizando el ADN extraído de la población genéticamente uniforme como patrón y la digestión de pMulSL con BamHI como muestra estándar en la misma manera que en la prueba preliminar. Como en el caso del Ejemplo 9, los dispositivos y condiciones (por ejemplo, composiciones de soluciones de reacción) empleadas en el experimento fueron las mismas que aquéllas del Ejemplo 8, excepto que se utilizaron diferentes cebadores y sondas para los objetivos diferentes. Los valores de la medición fueron utilizados para calcular las relaciones de cuantificación de acuerdo a la fórmula (II) de la misma manera que en la prueba preliminar. A saber, el número de moléculas de la secuencia de ADN específica para la línea de Soya Roundup Ready fue dividido por el número de la secuencia de ADN a ser amplificada del gen endógeno de la soya leí determinada en la muestra para dar las relaciones de cuantificación de la secuencia de ADN específicas de la línea de Soya Roundup Ready única para la línea (Tabla 8) .
Tabla 8. Relación de cuantificación (Kx) de la línea recombinante genética de soya (X) Ejemplo 12: Cuantificación utilizando muestras ciegas. Un producto triturado de cada una de las líneas recombinantes genéticas fue mezclado con un producto triturado de una línea no recombinante para preparar una muestra ciega. La muestra ciega fue realmente determinada sobre la relación de contenido de las líneas recombinantes genéticas individuales para evaluar la eficacia del método de análisis cuantitativo actual . A saber, las muestras ciegas fueron preparadas utilizando semillas de líneas recombinantes genéticas y una linea no recombinante como se describió en el Ejemplo, y se extrajo el ADN de las muestras ciegas. En la prueba para el maíz, como muestras ciegas, se prepararon un total de 12 tipos de muestras las cuales contenían 0.1%, 1% y 5% (en peso) de cada una de las semillas de las variedades de la progenie de la línea Btll, línea Eventl76, línea MON810 y línea T25, respectivamente. Se efectuó la PCR Cuantitativa utilizando el ADN extraído de cada muestra ciega como patrón y la molécula estándar preparada en el Ejemplo 5 la cual fue linearizada por digestión con la enzima de restricción BairíRI (digestión de pMul4 con BauiHI) para determinar los números de moléculas de la secuencia de ADN amplificada del gen endógeno y la secuencia parcial de ADN a se amplificada de las secuencias de ADN recombinadas por separado en la muestra ciega. La relación de contenido del recombinante genético en la muestra fue determinada a partir de los resultados utilizando la relación de cuantificación determinada en el Ejemplo 10 u 11. En la reacción de cuantificación de cada objetivo, cada uno de los cebadores y la sonda a ser utilizadas para la cuantificación fueron utilizadas en la solución de reacción de PCR a concentraciones finales de 0.5 µ? y 0.2 µ?, respectivamente. El ADN extraído de una muestra (como patrón) y la Muestra Maestra se utilizaron en cantidades de 50 ng y 12.5 µ??, respectivamente, para el sistema de reacción. El sistema de reacción se aforó hasta 25 µ??. Se efectuó la misma reacción por triplicado, y las mediciones resultantes fueron promedias . Las condiciones de reacción empleadas fueron las siguientes : manteniendo la solución de reacción durante 2 minutos a 50°C y a continuación durante 10 minutos a 95°C, 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 40 ciclos de 30 segundos a 95°C y 1 minuto a 59°C seguidas por mantenimiento a 25°C. En la determinación cuantitativa de cada una de las secuencias de ADN objetivo a ser amplificadas, se cargó un tubo de reacción con cada uno de 9 tipos de muestras que consistían de : la molécula estándar de la digestión de pMul4 con BairiRI preparada en cinco concentraciones (10, 50, 250, 1,000 y 50,000 moléculas por sistema de reacción); las soluciones de ADN extraídas de las muestras ciegas al 0.1%, 1% y 5% como muestras de prueba; y la solución de ADN de esperma de salmón. Se agregaron un primer par de cebadores, una sonda para la cuantificación y Mezcla Maestra al tubo de reacción a las concentraciones descritas anteriormente para dar una solución de reacción. Durante la reacción, se determinó el grado de degradación de la sonda causado por la amplificación por PCR con el tiempo en términos del incremento en la intensidad fluorescente. En consecuencia, generando una gráfica (ciclos-intensidad de fluorescencia) para las cinco muestras proporcionadas como las secuencias de ADN recombinantes estándar (x 4) , puede obtenerse una función de correlación entre el número de moléculas de una secuencia de ADN a ser amplificada y el tiempo requerido para la intensidad de fluorescencia emitida desde el sistema de reacción para alcanzar un valor específico. Utilizando la función de correlación como una curva estándar, pueden ser determinados los números de moléculas de las secuencias de ADN objetivo a ser aplicadas en las muestras de la presente al comienzo de la reacción. (Tabla 9) .
Tabla 9. El número de cada secuencia de ADN objetivo para la amplificación Muestra zSSIIb CaMV 0.1% de Btll 34378.45 43.67 1% de Btll 44943.75 574.30 5% de Btll 42690.63 2375.83 0.1% de T25 48665.87 23.88 1% de T25 48664.95 186.42 5% de T25 61333.30 1040.07 Tabla 9. (Continuación) Muestra zSSIIb CaMV 0.1% de Eventl76 96960.50 91.73 1% de Eventl76 63402.34 704.80 5% de Eventl76 31765.13 1607.65 0.1% de MON810 40662.60 14.85 1% de MOW810 44822.75 202.26 5% de MON810 31624.09 641.39 Tabla 9. (Continuación) Tabla 9. (continuación) Los valores de medición para los números de moléculas de las secuencias de ADN pueden ser convertidos en la relación de contenido de los recombinan es genéticos individuales de acuerdo a la fórmula (I) utilizando las relaciones de cuantificación dadas en los Ejemplos 10 y 11. Los resultados de la conversión se muestran en la Tabla 8. En cualquier caso, se encontró que las muestras ciegas contenían variedades de progenie de las líneas de recombinante genéticas en una cantidad del 0.1%, 1% ó 5% pueden ser determinadas cuantitativamente de manera satisfactoria.
Ejemplo 13: Cuantificación de la Relación de Contenido del Recombinante Genético utilizando una Molécula Estándar (1) Se prepararon muestras ciegas cada una de las cuales contenían tres tipos de líneas recombinantes genéticas del maiz. La PCR cuantitativa dirigida al promotor CaMV 35S y un gen endógeno específico zSSIIb del maíz se efectuó en las muestras ciegas para determinar las relaciones de contenido de líneas recombinantes genéticas del maíz en las muestras. Como el material estándar, se utilizó la digestión de pMul4 con BamH.1 descrita en el Ejemplo 5. Las muestras del maíz ciegas utilizadas en el experimento fueron las siguientes: una muestra que contenía productos triturados de las variedades de la progenie de la línea Btll, línea Eventl76 y línea MON810 como recombinantes genéticos del maíz, cada una en una cantidad del 1% (en peso) y un producto triturado de Dairyland 1412 en una cantidad del 97% (en peso) como un mayor recombinante (mezcla 1%) ; y una muestra que contenía productos triturados de las variedades de la progenie de la lineal Btll, línea Eventl76 y línea MON810 como recombinantes genéticos del maíz cada una cantidad del 5% (en peso) y un producto triturado de Dairyland 1412 en una cantidad del 85% (en peso) como un mayor recombinante (mezcla 5%) . En el experimento, para simular situaciones reales de análisis, se asumió que a los analistas no se les dio información acerca del contenido de ninguno de los tres tipos de lineas recombinantes genéticas del maiz en las muestras. Nuevamente, en las soluciones de reacción de PCR, la concentración final del cebador fue de 0.5 µ? para cada uno de los cebadores para el análisis del promotor CaMV 35S y los cebadores para el análisis de zSSIIb; la concentración final de la sonda fue de 0.2 µ? para cada una de las sondas para el análisis del promotor CaMV 35S y la sonda para el análisis de zSSIIb. El ADN extraído de las muestras individuales (patrón) y Mezcla Maestra fueron agregados en cantidad de 50 ng y 12.5 µ??, respectivamente, por sistemas de reacción. El sistema de reacción se aforo a 25 µ??. Se formo la misma reacción por triplicado y las mediciones resultantes fueron promediadas . Las condiciones de reacción empleadas fueron las siguientes : manteniendo la solución de reacción durante 2 minutos a 50 °C y a continuación durante 10 minutos a 95°C, 40 ciclos de 30 segundos a 95°C y 1 minuto a 59°C seguidas por mantenimiento a 25 °C.
En la determinación cuantitativa del promotor CaMV 35S, fue cargado un tubo de reacción con cada uno de los 7 tipos de muestras que consistían de : una molécula estándar de la digestión ~ de pMul4 BamHl preparada en cinco concentraciones (10, 50, 250, 1,000 y 50,000 moléculas por sistema de reacción) como una secuencia de ADN recombinante estándar; una solución de ADN extraída de cada una de las muestras siegas del maíz, muestra de prueba y una solución de ADN de esperma de salmón con un control negativo. Se agregaron un par de cebadores para la cuantificación del promotor CaMV 35S, una sonda para la cuantificación del promotor CaMV 35S y mezcla maestra al tubo de reacción a las concentraciones finales descritas anteriormente para dar la solución de reacción. De manera similar, una determinación cuantitativa del gen endógeno zSSIIb, fue cargado a un tubo de reacción con cada uno de los 7 tipos de muestras que consistían de: la molécula estándar de la digestión de pMul4 con BairiñI preparada en cinco concentraciones (10, 50, 250, 1,000 y 50,000 moléculas por sistema de reacción) como una secuencia de ADN recombinante estándar; una solución de ADN extraída de cada una de las muestras ciegas del maíz, muestra patrón; y una solución de ADN de esperma de salmón como control negativo. Se agregaron un par de cebadores para la cuantificación de zSSIIb, una sonda para la cuantificación de zSSIIb y Mezcla Maestra al tubo de reacción en las concentraciones finales descritas anteriormente para dar una solución de reacción. Durante la reacción, se determinó el grado de degradación de la sonda causado por la amplificación por PCR sobre el tiempo en términos del incremento de la intensidad de la fluorescencia. En consecuencia, generando una gráfica (ciclos - intensidad de la fluorescencia) para las cinco muestras proporcionadas como la secuencia de ADN recombinante estándar (X 4) , puede obtenerse una función de correlación entre el número de moléculas de una secuencia de ADN objetivo a ser amplificada y el tiempo requerido para controlar la intensidad de la fluorescencia del tiempo de reacción emitida desde el tubo de reacción al alcance de un valor específico. Utilizando la función de correlación como una curva estándar, se determinaron los números de moléculas de secuencias de ADN del promotor CaMV 35S a ser amplificadas y la secuencia de ADN de zSSIIb a ser amplificada presente en la muestra al principio de la reacción (Tabla 10) . Los aparatos utilizados para la determinación cuantitativa, el Sistema Detector de Secuencias ABI PRISM 7700 (PE Biosystems) es capaz de conducir las reacciones para 96 muestras simultáneamente. En consecuencia, la prueba mencionada anteriormente puede ser producida en un pase de PCR cuantitativa utilizando el aparato. Los valores de medición de los números de moléculas de secuencia de ADN pueden ser convertidos a la relación de contenido de los recombinantes genéticos de inhibidores que contienen el promotor CaMV 35S de acuerdo a la fórmula (I) utilizando las relaciones de cuanti ficación dadas en el Ejemplo 10. En el experimento, puesto que no se dio información acerca del contenido de ninguna de las lineas recombinantes genéticas en las muestras, fue necesario calcular las relaciones de cuantificación y expresarlas como valores convertidos para los tres tipos de líneas recombinantes genéticas. Sin embargo, las relaciones de contenido de las líneas recombinantes genéticas en las muestras podrían ser determinadas únicamente en un pase de PCR cuantitativa, de manera ventajosa (Tabla 10) .
Tabla 10. Cuantificación de la relación de contenido de los recombinantes genéticos (1) *1: Una muestra ciega que contenida 1% de Btll, Eventl76 MON810, respectivamente (que contenia 3% de maiz recombinant genético en total) *2 : Una muestra ciega que contenía 5% de, Btll, Eventl76 y MON810, respectivamente (que contenía 15% de maíz recombinante genético en total) Ejemplo 14: Cuantificacion de la Relación del Contenido del Recombinante Genético utilizando la Molécula Estándar (2) Las mismas muestras ciegas preparadas en el Ejemplo 13 fueron sometidas a PCR cuantitativa dirigida a las secuencias de ADN específicas para los tres tipos de líneas de maíz recombinantes genéticos, respectivamente, y un gen endógeno específico de zSSIIb del maíz para determinar la relación de contenida de líneas de maíz recombinantes genéticas individuales en la muestra. Los resultados y la suma de las relaciones de cuantificación obtenidas se utilizaron para determinar la relación de contenido de los recombinantes genéticos en las muestras. Como en el caso del Ejemplo 13, se utilizó la digestión de pMul4 de BamHI en el Ejemplo 5 como el material estándar. En el experimento, para simular situaciones de análisis real, se asumió que al analista no se le dio información a cerca del contenido de ninguno de los tres tipos de líneas recombinantes genéticas del maíz en las muestras .
Las composiciones de la soluciones de reacción, las condiciones para la reacción y los métodos de análisis fueron las mismas que se emplearon en el Ejemplo 13, excepto que las secuencias específicas para las variedades de la progenie de la línea Btll, línea Eventl76, y la línea MON810 fueron cuantificadas por separado en lugar del promotor CaMV 35S. A saber, en el experimento, se sometió un total de cuatro tipos de las secuencias de ADN objetivo a ser amplificadas incluyendo zSSIIb para PCR cuantitativa por separado. Por lo tanto, en el experimento, se hizo funcionar tres veces en total el Sistema Detector de Secuencias ABI PRISM 7700 (PE Biosystems ) . La correlación entre el número de moléculas de las secuencias de ADN objetivo individuales a ser amplificadas presentes al inicio de la reacción da el tiempo requerido para que la intensidad de la fluorescencia emitida de los tubos de reacción alcanzara un valor específico fue representado como una curva estándar. Utilizando la curva estándar, pudieron determinarse los números de secuencias de ADN objetivo específicas de las líneas individuales a ser amplificadas en las muestras de ensayo al inicio de la reacción y el número de la reacción objetivo a ser amplificada de zSSIIb (Tabla 11) . - Como en el caso del Ejemplo 13, los valores para la medición de los números de moléculas de secuencias de ADN pueden ser convertidos en la relación de contenido de líneas de maíz recombinantes genéticas individuales a la muestra de acuerdo a la fórmula (I) utilizando la relación de cuantificación determinada en el Ejemplo 10. En el experimento, puesto que la determinación cuantitativa se hizo sobre secuencias de ADN específicas para las líneas recombinantes genéticas, no hubo preocupación de que los valores de la medición pudieran variar, lo cual se encontró en el Ejemplo 13. El método descrito anteriormente permitió determinar la relación de contenido de los recombinantes genéticos individuales en las muestras más exactamente, aunque el aparato de PCR cuantitativo tubo que ser puesto a funcionar varias veces para efectuar la determinación (Tabla 11) .
Tabla 11. Cuantificación de la relación de contenido de los recombinantes genéticos (2) *1 : Una muestra ciega que contenida 1% de Btll, Eventl76 y MON810, respectivamente (que contenía 3% de maíz recombinante genético en total) *2 : Una muestra ciega que contenía 5% de Btll, Eventl76 y MON810, respectivamente (que contenía 15% de maíz recombinante genético en total) De acuerdo al método de la presente invención, la presencia de posibles líneas recombinantes genéticas en la muestra en la cual se sospecha la presencia de al menos una línea recombinante genética puede ser determinada: la relación de contenido de las líneas recombinantes genéticas en la muestra en la cual esa relación de contenido es desconocida es una manera más simple; la relación de contenido de una recombinante genético en una población puede ser determinada exactamente; y, en particular, la relación del contenido de cierta línea recombinante genética en una muestra en la cual la relación de contenido de la línea es desconocido puede ser determinada exactamente. En particular, el método de la presente invención introduce una molécula estándar que tiene en la molécula ambas regiones a ser utilizadas para la determinación cuantitativa de las secuencias de ADN recombinantes y una secuencia de ADN de un gen endógeno compartido con las especies correspondientes a las secuencias de ADN recombinantes. Puesto que la molécula estándar usualmente contiene las regiones a ser utilizadas para la determinación cuantitativa en una proporción integral dependiendo del patrón de las regiones introducidas, la relación de cuantificación representada por la fórmula (II) puede ser determinada con buena reproducibilidad . En consecuencia, el método de la presente invención permite la determinación de la relación de contenido de las líneas recombinantes genéticas especificas individuales en la muestra exactamente . Puesto que los recombinantes genéticos en forma pura se vuelven necesarios después de la determinación de las relaciones de cuantificación cualquier dificultad para obtener las moléculas estándar para el análisis puede ser eliminada. Además, proporcionando las moléculas estándar para la detección de recombinantes genéticos de acuerdo a la presente invención, la utilidad práctica de los ensayos de biología molecular para recombinantes genéticos para los cuales métodos analíticos exactos con una aplicabilidad están ampliamente disponibles puede ser mejorada. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método de detección cuantitativa para determinar cuantitativamente la relación de contenido de un recombinante genético en una muestra que contiene al menos una linea recombinante genética, caracterizado porque comprende : (i) efectuar una PCR cuantitativa para una secuencia de ADN específica para los recombinantes genéticos, que puede existir en una muestra de ADN derivada de recombinantes genéticos en la muestra y PCR para una secuencia de ADN endógena compartida por las especies correspondientes al recombinante genético utilizando, como molécula estándar una molécula que contiene, sobre una sola molécula, la secuencia de ADN especifica para el recombinante genético y la secuencia de ADN endógena; (ii) determinar el número de secuencias de ADN específicas para los recombinantes genéticos en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; (iii) determinar el número de secuencias de ADN endógenas en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; y (iv) determinar la relación de contenido de los recombinantes genéticos de acuerdo a la fórmula (I) : (relación de contenido de los recombinantes genéticos en la muestra) = 100 x [(el número de moléculas de la secuencia de ADN específica para los recombinantes genéticos en la muestra) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógena en la muestra) ] / (relación de cuantificación) (%) (I) donde la relación de cuantificación es cualquiera de los valores que son precalculados de acuerdo a la fórmula (II) : (relación de cuantificación) (%) = (el número de moléculas de la secuencia de ADN específica para un recombinante genético de la línea recombinante genética individual) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógena en el recombinante genético) (II) · 2. Un método de detección cuantitativa para determinar cuantitativamente una relación de contenido individual de una línea recombinante genética individual en una muestra que contiene al menos una línea recombinante genética, caracterizado porque comprende: (i) efectuar una PCR cuantitativa para una secuencia de ADN específica para la línea recombinante genética individual que puede existir en una muestra de ADN derivada de recombinantes genéticos en la muestra y para una secuencia de ADN endógena compartida por las especies correspondientes a los recombinantes genéticos utilizando, como molécula estándar, una molécula que contiene, sobre una sola molécula, la secuencia de ADN específica para la línea recombinante genética individual y la secuencia de ADN endógena; (ii) determinar el número de secuencias de ADN específicas para la línea recombinante genética individual en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; (iii) determinar el número de secuencias de ADN endógenas en la muestra sobre la base del resultado de la PCR cuantitativa; y (iv) determinar la relación de contenido del recombinante genético de acuerdo a la fórmula (III) : (relación de contenido de la linea recombinante genética individual en la muestra) = 100 x [ (el número de moléculas o la secuencia de ADN correspondientes a cada recombinante genético en la muestra) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógena en la muestra) ] / (relación de cuantificación) (%) (III) donde la relación de cuantificación es cualquier valor precalculado de acuerdo a la fórmula (II) (relación de cuantificación) (%) = (el número de moléculas de la secuencia de ADN específica para un recombinante genético de la línea recombinante genética individual) / (el número de moléculas de la secuencia de ADN endógena en el recombinante genético) (II) . 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la determinación del número de secuencia de ADN específica para la línea recombinante genética y el número de secuencia de ADN endógena en la muestra comprende (i) efectuar la PCR cuantitativa para la secuencia de ADN específica a la línea recombinante genética la cual puede existir en la muestra y la PCR cuantitativa para la secuencia de ADN endógeno compartida por las especies correspondientes al recombinante genético; y (ii) verificar periódicamente una señal la cual es un indicador de la amplificación en la PCR, determinar un número de ciclos de PCR en el cual la señal alcanza un umbral predefinido y a continuación convertir el número a un número de moléculas el cual existe al principio de la reacción utilizando una curva estándar; (iii) donde la curva estándar representa una relación entre el número de la secuencia de ADN a ser amplificada y la señal la cual es un indicador de la amplificación. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la señal que es indicadora de la amplificación es la fluorescencia, derivándose la fluorescencia de una sonda marcada con fluorescencia y siendo la fluorescencia capaz de cambiar dependiendo de la degradación de la sonda, dependiendo de la amplificación de la secuencia de ADN por la PCR. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la curva estándar se obtiene por (a) efectuar la PCR para una molécula estándar utilizando cebadores para amplificar la secuencia de ADN especifica para la línea recombinante genética o la secuencia de ADN interna compartida por las especies correspondientes al recombinante bajo la presencia de una sonda el cual incrementa la intensidad de fluorescencia dependiendo del progreso de la amplificación de la secuencia del ADN interna o de la amplificación de la secuencia de ADN especifica al recombinante genético; (b) verificar periódicamente la intensidad de la fluorescencia cada número predeterminado de veces de ciclos para cada reacción el cual utiliza un número definido de moléculas estándar como un ADN patrón el cual existe al comienzo de la reacción; (c) determinar un umbral de incremento de fluorescencia (ÁRn) en la fase donde una relación exponencial es observada entre la intensidad de la fluorescencia y el número de ciclos; y (d) graficar un número de ciclos de PCR llegando al umbral contra el número de moléculas del patrón de ADN el cual existe al comienzo de la reacción, tomando un número de ciclos de PCR como el eje vertical y el número de moléculas del ADN patrón existente al comienzo de la reacción como el eje horizontal. 6. Una molécula de ADN recombinante, caracterizada porque contiene, sobre una sola molécula, una secuencia de ADN especifica para una linea de recombinantes genéticos y al menos una secuencia de ADN endógena compartida por las especies correspondientes a los recombinantes genéticos . 7. Una molécula de ADN recombinante , caracterizada porque contiene, sobre una sola molécula, dos o más secuencias de ADN específicas para la línea individual de recombinantes genéticos, respectivamente, y al menos una secuencia de ADN endógeno compartida por dos o más no transformantes correspondientes a los recombinantes genéticos . 8. Una molécula de ADN recombinante, que es capaz de autorreplicarse o autorreproducirse de una célula hospedera y que se caracteriza porque comprende una molécula recombinante de conformidad con la reivindicación 6 ó 7. 9. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porgue es el plásmido pMul4 contenido en E.coli FERM BP-7319. 10. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es el plásmido pMul5 contenido en E.coli FERM BP-7320. 11. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es el plásmido pMulSL contenido en E.coli FERM BP-7321. 12. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porgue es el plásmido pMulSL2 contenido en E.coli FERM BP-7322. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula estándar es la molécula de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-12. 14. Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 15 o NO: 16 como la secuencia 3 ' -terminal . 15. Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 18 o NO: 19 como la secuencia 3 ' -terminal . 16. Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 21 o NO: 22 como la secuencia 3 ' -terminal . 17. Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 24 o NO: 25 como la secuencia 3 '-terminal. 18. Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 27 o NO: 28 como la secuencia 3 '-terminal. 19. Un oligonucleotido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 30 o NO: 31 como la secuencia 3 '-terminal. 20. Un oligonucleotido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 33 o NO: 34 como la secuencia 3 ' -terminal . 21. Un oligonucleotido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 36 o NO: 37 como la secuencia 3 ' -terminal . 22. Un oligonucleotido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 39 o NO: 0 como la secuencia 3 '-terminal. 23. Un oligonucleotido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 42 o NO: 43 como la secuencia 3 ' -terminal . 24. Un oligonucleotido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 5 o NO: 46 como la secuencia 3 '-terminal. 25. Un oligonucleotido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o NO: 49 como la secuencia 3 ' -terminal . 26. Un oligonucleotido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 17. Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 20. 28 Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO : 23. 29 Un oligonucleótido, carácterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 26. 30 Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 29. 31 Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 32. 32 Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO : 35. 33 Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 38. 34 Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 41. 35 Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO : 44. 36 Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 47. 37 Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende 1a secuencia de la SEQ ID NO : 50. 38. Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 77 o NO: 78 como la secuencia 3 ' -terminal . 39. Un oligonucleótido, caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 79 o NO: 80 como la secuencia 3 '-terminal.
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