CN100336909C - 一种植物双元杂交表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物双元杂交表达载体及其应用。该植物双元杂交表达载体，由启动子载体和功能基因表达载体组成；所述启动子载体包括目的启动子与转录激活因子编码基因的融合序列；所述功能基因表达载体包括所述目的基因与所述转录激活因子的调控元件的融合序列。本发明还提供了利用该植物双元杂交表达载体进行植物转基因杂交育种的方法。该植物双元杂交表达载体还可用于筛选启动子和鉴定目的基因功能。本发明可用于定向改造和设计植物的性状，可缩短植物杂交育种和改良品种的周期，保证了杂交良种的纯度。

Description

一种植物双元杂交表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中一种植物双元杂交表达载体及其应用，特别涉及一种植物双元杂交表达载体，利用该植物双元杂交表达载体进行植物转基因杂交育种的方法和该植物双元杂交表达载体在筛选启动子和鉴定目的基因功能中的应用。

背景技术

在酵母、昆虫、植物以及哺乳动物等生物中，均存在一类转录激活因子(transcriptional activator)，能够激活基因的转录。这类激活因子的结构都基本相似，由一个DNA结合区(结构域)(DNA-binding domain，DBD)和一个转录激活区(结构域)(transcriptional activation domain，AD)组成，可以同转录组分的操纵子结合并激活转录反应。其中酵母蛋白Gal4(Allen，L.& Raymond F.(1984).Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae Gal4 gene. Molecular andCellular Biology 4，260-267；Johnston，M.(1987).A model fungal generegulation mechanism：the Gal4 genes of Saccharomyces Cerevisiae.Microbiol.Rev.1987，51，458-476)就是一个典型的转录激活因子，它由881个氨基酸组成，N端1-147位氨基酸含细胞核定位序列和与酵母启动子上游激活序列结合的结构域，它与酵母细胞启动子上游激活区序列结合；C端768-881位氨基酸含转录激活结构域，可激活起始转录。为增强转录激活因子激活转录的能力，常在DNA结合区加入一段负电荷蛋白(Giniger，E.，Varnum，S.M.& Ptashne M.(1985).SpecificDNA binding of Gal4，appositive regulatory protein of yeast.Cell 40，767-774)。按照Ivan Sadowski(1988)的方法，可将从庖疹病毒中克隆的高酸性蛋白VP16(Dalrymple，M.A.，McGeoch，D.J.，Davison，A.J.& Preston C.M.，DNA sequenceof the herpes simplex virus type I gene whose product is responsible fortranscriptional activation of immediate early promoters.Nucleic AcidsResearch，1984，13(21)，7865-7879)的基因与Gal4的DNA特异结合区(Gal4 DBD)构建成融合基因。在疱疹病毒中，VP16通过其末端氨基酸序列结合宿主编码蛋白，该蛋白可以识别启动子DNA序列，从而快速激活转录病毒早期表达基因(Triezenberg，S.J.，LaMarco，KL.& McKnight，SL.，(1988).Evidence of DNA：proteininteractions that mediate HSV-1 immediate early gene activation by VP16.GenesDevelopment.2，730-742；Preston，CM.，Frame，MC.& Campbell，M.E.M.，(1988).A complex formed between cell components and an HSV structural polypeptidebinds to a viral immediate early gene regulatory DNA sequence.Cell 52，425-434)。研究表明，Gal4(DBD)-VP16融合蛋白可以高效地激活目的基因的转录(Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.，Ptashne，M.，(1988).GAL4-VP16 isan unusually potent transcriptional actibator.Nature.335，563-4)。

多年来人们对这类转录因子做了大量深入的研究，并广泛应用到酵母、昆虫、动物细胞(Fischer，JA.，iniger，E.，Maniatis，T.& Ptashne，M.(1988).GAL4 activatestranscription in Drosophila. Nature 332，853-856；Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.，Ptashne，M.，(1988). GAL4-VP16 is an unusually potenttranscriptional actibator.Nature.335，563-564)以及植物体系(Wilde RJ.CookeSE，Brammar WJ.，et al，(1994).Control of gene expression in plant cells usinga VP16 chimeric protein. Plant Molecular Biology 24，381-388；Guyer，D.，Tuttle，A.，Rouse，S.，Volrath，S.，Johnson，M.，Potter，S.，Gorlach，J.，Goff，S.，Crossland，L.and Ward，E.，(1998).Actibation of Latent Transgenesin Arabidopsis Using a Hybrid Transcription Factor.Genetics，149，633-639)的研究中。利用转录激活因子的特点，人们建立了各种双元杂交表达系统，比如现在广泛应用的酵母双杂交系统、动物细胞培养系统中的双元表达体系等，能够有效地在转录水平调节基因表达，研究目标基因的特性和功能。

在以往的研究中，人们更注重于将双元表达系统用于理论研究，常常利用转录激活因子双元杂交系统调控基因的特异性表达或表达水平，从而更容易地研究目的基因尤其是致死基因在生物体中的功能。

酵母HAP1(Heme Activator Protein 1)是另一个Gal4转录因子家族的成员，它有保守的Zn2Cys6集团。HAP1能够结合许多基因的UASs(upstream activationsequences)区，并激活这些基因的转录。利用HAP1的DNA结合区和VP16构建融合蛋白(HAP1-VP16)同样也能提高它在植物中表达效率和与UAS的结合能力(Hach A，HonT，Zhang L.The coiled coil dimerization element of the yeast transcriptionalactivator Hap1，a Gal4 family member，is dispensable for DNA binding butdifferentially affects transcriptional activation.Biol Chem 2000 Jan7；275(1)：248-54.)。许多实验证明它在植物中可以高效地激活与其调控元件UAS融合的目的基因的转录(Fred Berger，Jim Haseloff，John Schiefelbein and LiamDolan，Positional information in root epidermis is defined duringembryogenesis and acts in domains with strict boundaries.Current Biology8：421-430，1998；G Cnops，X Wang，P Linstead，M Van Montagu，M VanLijsebettens，and L Dolan，Tornadol and tornado2 are required for thespecification of radial and circumferential pattern in the Arabidopsis root.Development 127：3385-3394，2000)。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种植物双元杂交表达载体。

本发明所提供的植物双元杂交表达载体，由启动子载体和功能基因表达载体组成；所述启动子载体包括目的启动子与转录激活因子编码基因的融合序列；所述功能基因表达载体包括所述目的基因与所述转录激活因子的调控元件的融合序列。

所述目的启动子可为组成型、诱导型或组织特异性表达启动子。

所述转录激活因子可为具有与Gal4相同或相似功能的所有具有DNA结合结构域和转录激活结构域的转录激活因子如酵母的HAP1，酵母的GCN4，E.coli的LexA，HIV的tat等，以及其它具有相似转录激活活性功能的基因；优选为Gal4和HAP1转录激活因子，尤其优选为Gal4(DBD)-VP16和HAP1-VP16。

所述功能基因表达载体可包括一个目的基因或多个目的基因；在多基因表达载体中，串联的每个基因的上游都有Gal4的调控元件(Gal4OP)或HAP1的调控元件(UAS)。

所述目的基因可以是任何可以利用的基因，如RDG基因。RDG基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。序列1由1631个碱基组成。

所述功能基因表达载体和所述启动子载体可含有相同或不同的筛选标记。

本发明的第二个目的是提供一种建立在植物双元杂交表达载体之上，有效的植物转基因杂交育种方法。

本发明所提供的植物转基因杂交育种方法，包括以下步骤：

1)将所述功能基因表达载体和所述启动子载体分别转化植物，获得独立的父本和母本转基因植株；

2)所述父本和母本转基因植株进行杂交，得到杂交后代。

父本既可以是被启动子表达载体转化的植株，也可以是被功能基因表达载体转化的植株，母本也同样，但优选为父本为被所述启动子表达载体转化的植株，母本为被所述功能基因表达载体转化的植株。

所述功能基因表达载体和所述启动子载体分别选用不同筛选标记基因(分别用于父本和母本)，在杂交后代中，通过筛选与母本不同的父本选择标记即可快速选出杂交后代种子。

本发明的第三个目的是提供一种建立在植物双元杂交表达载体基础上的，较方便地筛选启动子和鉴定目的基因功能的方法。

本发明提供的筛选启动子的方法包括以下步骤：

1)将待鉴定启动子及报告基因克隆到植物双元杂交表达载体的启动子载体中，得到启动子检测载体；

2)利用启动子检测载体转化植物或瞬间表达系统，并通过报告基因的表达来鉴定启动子的功能。

pSGF和pSGG(物理图谱如图2)是有代表性的启动子检测载体。启动子检测载体可按照如下方法构建：将转录因子相应的调控元件与报告基因(GUS或GFP)融合后与转录因子构建在同一载体中，在转录因子的上游引入多克隆位点(HindIII，SpeI，KpnI)，将新克隆的启动子插入到多克隆位点，在转化植物或瞬间表达系统中通过检测报告基因的表达鉴定启动子功能。

本发明所提供的鉴定目的基因功能的方法，包括以下步骤：

1)将所述功能基因表达载体和所述启动子载体分别转化植物，获得独立的父本和母本转基因植株；所述功能基因表达载体中的功能基因为待检测基因；

2)所述父本和母本转基因植株进行杂交，得到转基因杂交后代，观察杂交后代，判定待检测基因的功能。

为了更高效地研究不同启动子和功能基因，可在所述启动子检测载体和所述功能基因表达载体中分别引入LR重组位点得到植物高效启动子检测载体，如pSGAF、pSGAG(如图4)，和植物高效单基因表达载体，如pSZC，pSZN，pHUG-1，pKUG-1(如图5)以及植物高效多基因表达载体，如pYLVS-LR、pYLSV-LR、pYLVUS-1，pYLSUV-1(如图6)。这样，将所有目的启动子和功能基因分别克隆到含有LR重组位点的中间载体后，可以很容易地通过LR重组反应，将目的启动子和基因分别克隆到所述双元杂交表达载体中，从而提高了克隆效率，可以高通量地对启动子和功能基因进行研究。

本发明的原理如图1所示，双元杂交表达载体由启动子载体和功能基因表达载体组成：将所述功能基因与转录因子Gal4/HAP1的调控元件(Gal4OP/UAS)融合，构建成植物功能基因表达载体；将克隆的启动子与转录激活因子的DNA结合区及转录激活区Gal4(DBD)-VP16/HAP1-VP16的基因片段融合构建成启动子载体，为了能够快速高效地检测启动子功能，在上述基本结构后面，加上了与Gal4调控元件融合的报告基因GUS或GFP序列。将启动子载体和目的基因载体分别转化植物，获得转基因亲本，所转入的目的基因在亲本中不表达，不影响亲本性状。分别以获得的启动子和功能基因转化植株为亲本进行杂交，在杂交后代中，转录激活因子的DNA结合区与相应的调控元件结合，该转录因子的激活区便激活目的基因的转录，使目的基因在杂交后代中表达，从而确定目的基因的功能，最终获得所需目的转基因植物。

本发明在转录因子双元表达调控思想的基础上，巧妙地设计了相关的载体系统和选择标记，将启动子系统和功能基因分别克隆到双元系统的两个载体上，并分别转化植物，然后，通过不同组合的杂交，高效率地研究目的启动子和目的基因的功能，并通过父本选择标记有效地筛选出杂交后代，使双元杂交体系在作物育种和改良中的应用成为可能。

本发明利用双元杂交表达载体分别转化植物，以获得独立的父本和母本转基因植物。分别以两个不同转化植株为亲本进行杂交，在杂交后代中，转录因子的DNA结合区与调控元件(Gal4OP或UAS)结合，该转录因子活性区能够激活目的基因的转录，使目的基因在杂交后代中表达，从而表现目的基因的功能。在多基因表达载体中，串联的每个基因的上游都有Gal4/OP或UAS，因此，当杂交后转录因子可同时激活多个基因的表达，可以同时观察不同目的基因在植物体内的相互作用。利用本方法对作物品种进行改良和育种，可以大大提高育种效率和成功率。

同时，将目的启动子和功能基因分别转入父本和母本植株中，启动子和功能基因通过不同组合进行杂交，可高效快速地研究植物启动子和基因的功能，避免重复转化植物，缩短植物育种和改良品种的周期。

另外，双元杂交表达载体选用不同筛选基因(分别用于父本和母本)，在杂交后代中，通过筛选与母本不同的父本选择标记即可快速选出杂交后代种子，有效地选出具有优良性状的杂交后代，完全去除来自母本自交的非杂交种子的污染，有效地保证了杂交良种的纯度，从而大大提高育种效率，很好地解决了杂交育种中非杂交种子混杂影响种子质量与纯度的问题。

本发明首次将水稻矮化基因(水稻赤霉素突变基因)转化拟南芥或水稻，与启动子转化的拟南芥或水稻株系杂交后，后代出现了矮化现象(图9)，证明了该双元杂交系统在植物体系中是可以应用的；而且，通过该双元杂交表达载体，可以对植物的品质和特性定向地进行改良。利用本发明的技术，水稻矮化基因使杂交后代植株株高变矮，在分子水平上克服了植物杂种优势中植株过高而易倒伏的缺点，将促进杂交育种技术的应用。

本发明的双元杂交表达载体可应用于水稻杂交育种的研究及水稻启动子和功能基因的研究。特别是随着水稻全基因组芯片研究的展开，使在短期内克隆一系列可诱导或可特异表达的启动子以及重要基因成为可能，结合双元杂交表达系统将这些新克隆的启动子和功能基因引入目前普遍应用的水稻母本和父本中，不仅可以快速研究启动子和基因的功能，而且还可以将已鉴定的启动子和功能基因通过不同的组合直接应用到杂交水稻中，结合大田杂交育种技术，对作物进行定向改造，加快改良水稻品种速度，缩短育种周期。

通过本发明的方法，可以实现在分子水平上对植物的性状进行设计，即基于杂交技术的植物性状的分子设计；可以充分利用功能基因资源，跨越普通杂交育种的种间障碍，体现分子水平上育种的优势。该方法在植物功能基因组研究以及作物分子育种等方面有广阔的应用前景。

附图说明

图1为使用双元杂交表达载体进行植物转基因杂交育种方法的原理示意图

图2为启动子检测载体pSGF和pSGG的物理图谱

图3为玉米Ubiquitin启动子(UP)检测载体pSGPG及其报告基因GFP或GUS在UP的调控下在洋葱表皮细胞中的表达。

图4为植物高效启动子检测载体pSGAG和pSGAF

图5为植物高效单基因表达载体pSZC、pSZN、pHUG-1和pKUG-1的结构图谱

图6为植物高效多基因表达载体pYLVSR-LR、pYLSVR-LR、pYLVUS-1和pYLSUV-1的结构图谱

图7为RDG部分氨基酸序列及5’端突变示意图

图8为含RDG基因的双元杂交表达载体pSBR23和pSHR6的结构图谱

图9A为转化植株杂交得到的后代-拟南芥

图9B为转化植株杂交得到的后代-水稻

图10为拟南芥杂交后代Northern-blotting检测结果

图11为Gal4 DBD-VP16转化拟南芥(父本)Western检测结果

图12为RT-PCR法检测水稻杂交后代的基因表达

具体实施方式

实施例1、几种植物表达载体的构建

1、启动子检测载体的构建

以穿梭载体pBI121为基本载体，按常规方法在转基因区RB和LB之间加入；启动子Pnos，潮霉素基因aphIV和基因的终止子Tnos，随后的HindIII，SpeI，KpnI位点是被检测的启动子的插入位点，在该启动子插入位点下游是Gal4(DBD)和VP16的融合基因序列GVP16及其终止子Tnos，再下游则是报告基因的表达区，包括Gal4的调控元件，报告基因GUS或GFP序列及其终止子Tnos，结果如图2所示，构建了含报告基因GUS序列的启动子检测载体pSGG和含GFP序列的启动子检测载体pSGF。其中，载体的选择标记基因为潮霉素基因aphIV(植物)和卡那霉素基因(细菌)。

该结构转入植物后，在被检测启动子的作用下表达的GVP16转录因子与其调控元件结合调控报告基因的表达(图3)，通过观察报告基因的表达，可推测出启动子的功能。

为了高效率地检测不同的启动子，通过PCR扩增载体pDEST14(Invitrogen公司产品)上含有LR重组位点的片段(attR1-Cm^r-ccdB-attR2)并在两端分别引入酶切位点HindIII和KpnI，酶切回收后，插入到上述启动子检测载体pSGG和pSGF的多克隆位点HindIII和KpnI之间，构建成植物高效启动子检测载体pSGAG和pSGAF，如图4所示，其中，Cm^r为氯霉素筛选基因。该载体可以方便快捷地利用LR重组反应将克隆在中间载体的启动子转入到启动子检测载体中。

2、植物单基因高效表达系统载体的构建

利用穿梭载体pZP222，通过HindIII和XbaI位点将Gal4OP/TATA顺序插入到多克隆位点，再利用KpnI和EcoI将Tnos插入。TMVΩ-attR1-Cm^r-ccdB-attR2-9xMyc-6xHis-2xIgG binding domain片段(见序列2)则是通过KpnI位点和钝化的XbaI位点克隆到该载体中，构建成C端有多肽及抗原标记的载体pSZC(如图5)。其中9xMyc，6xHis为多肽标签，表达后的Myc或His多肽可与相应的抗体结合，用于鉴定表达的目的基因，而2xIgG binding domain可与抗体IgG结合，更便于蛋白质的分离。TMVΩ为转录增强子，ccdB基因的表达会使普通的大肠杆菌致死，而大肠杆菌DB3.1则可正常存活。该基因的加入可以将未发生LR重组反应的载体在普通大肠杆菌中筛除。pSZN的构建与pSZC相似，除了以TMVΩ-2xIgG bindingdomain-6xHis-9xMyc-attR1-Cm^r-ccdB-attR2片段替换TMVΩ-attR1-Cm^r-ccdB-attR2-9xMyc-6xHis-2xIgG binding domain(参考序列2，两个片段元件序列相同，元件顺序变化)片段外，其它方法相同(如图5)。

通过PCR方法从pBHG载体中扩增UAS-1片段(pBHG载体中包含HAP1和UAS-1元件，该载体的母体为pPZP200。Hajdukiewicz P.Plant Mol.Biol.25，989-994；KimKS，Guarente L. Nature 342(6246)：200-203)，并在两端引入SacI和SpeI位点，插入到pKOS和pHOS(pKOS和pHOS是以pPZP200为母体改造而成)上相应酶切位点，构建成pHUG-1，pKUG-1载体(如图5)。

3、植物多基因高效表达载体的构建

利用ClaI和KpnI位点，将pSZC的Gal4/OP和TMVΩ-attR1-Cm^r-ccdB-attR2-9xMyc-6xHis-2xIgGbinding domain片段克隆到Li Lin等构建的植物多基因表达载体系统中的供体载体pYLVS和pYLSV(Lin，L.，Liu，YG.，Xu，XP. & Li，BJ.(2003).Efficientlinking and transfer of multiple genes by a multigene assembly andtransformation vector system. PNAS，100(10)：5962-5967)中，如图6所示，得到植物多基因高效表达载体pYLVS-LR和pYLSV-LR。通过LoxP位点重组反应，逐一将不同的功能基因克隆到受体载体pYLTAC747(Lin，L.，Liu，YG.，Xu，XP. & Li，BJ.(2003).Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigeneassembly and transformation vector system. PNAS，100(10)：5962-5967)上，然后可同时转入植物体，观察不同基因的相互作用。利用该载体，可以同时将串连的多个功能基因同时转入植物体内，不必作多次转入便可以观察到植物体内不同基因的相互作用。

利用同样的原理，以pYLVS为母体，在SacI和EcoRI位点间插入UAS-1，在KpnI和ApaI位点间插入attR1-CmR-ccdB-attR2-T35S，得到pYLVUS-1；同时，以pYLSV为母体，在SacI和EcoRI位点间插入UAS-1，在KpnI和ApaI位点间插入attR1-CmR-ccdB-attR2-T35S，得到pYLSUV-1。UAS-1来源于pBHG，长160bp；attR1-CmR-ccdB-attR2-T35S来源于pHOS。由此，我们将HAP1的调控元件UAS和LR重组位点分别构建到载体pYLVS和pYLSV中，构建成多基因表达载体pYLVUS-1和pYLSUV-1载体(如图6)。

实施例2、Ubiquitin启动子检测载体的构建及其功能检测

将玉米Ubiquitin启动子克隆到含报告基因GUS序列的启动子检测载体pSGG或含GFP序列的启动子检测载体pSGF中，得到载体pSGPG(图3)。载体pSGPG包含有Gal4 OP/TATA和报告基因(GUS或GFP)以及Gal4 DBD-VP16融合基因。利用BIO-RAD公司Model PDS-1000/He Biolistic particle delivery system将载体pSGPG转化洋葱表皮细胞。转化所采用的参数为：真空度为28 inches·Hg、轰击距离9cm、氦气压力为1，100psi、金粉颗粒直径1.0μm。轰击后的洋葱表皮于22℃培养过夜，进行GUS染色(Kim MK，Choi JW，Jeon JH，et al.(2002).Specimen block counter-stainingfor localization of GUS expression in transgenic arabidopsis and tobacco.Plant Cell Rep.21(1)，35-9)。

培养24小时后进行GUS染色观察GUS的表达或用荧光显微镜观察GFP的表达。结果如图3所示，观察到GUS和GFP基因的表达，表明利用启动子检测载体分析新克隆启动子是可行的。

实施例3、转基因杂交法培育矮化拟南芥和矮化杂交水稻

1、植物材料及生长条件

野生型拟南芥菜品种(Arabidopsis thaliana，)为哥伦比亚生态型(Columbiaecotype)。拟南芥菜种子经表面消毒(Ang，L.H.and Deng，X.W.(1994).Regulatoryhierarchy of photomorphogenic loci：allele-specific and light-dependentinteraction between the HY5 and COP1 loci. Plant Cell，6，613-628)后，放于MS(1％蔗糖)培养基上(Murashige，T.，and Skoog，F.(1962). A revised mediumfor rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant.15，473-497)，于4℃放置4天，移至长日照生长箱中在22℃条件下培养8天后，幼苗被转入土中，在长日照生长室中生长。

用于分离基因的水稻品种为9311，种子经表面消毒后放于MS(3％蔗糖)培养基上，取生长10天的幼苗为材料提取总RNA。

用于转基因的水稻栽培品种为龙特甫(Japonica rice variety Longtefu)和华恢7号(Japonica rice variety Huahui7)。经消毒后诱导愈伤组织(Y.Hiei，T.Komari，T.Kubo，Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens，PlantMol.Biol.35(1997)205-218)，用于基因转化。

2、水稻矮化基因(RDG)的克隆及其载体构建

(1)水稻矮化基因(RDG)的克隆

为进一步检测该植物转基因杂交育种方法在植物系统中的可行性，根据拟南芥菜和小麦等植物基因序列(Peng，J.(1997).The arabidopsis GAI gene defines asignaling pathway that negatively regulates gibberellin responses.GenesDevelopment，11，3194-3205；Peng，J.Richards，D.et al，(1999).‘GreenRevolution’genes encode mutant gibberellin response modulators.Nature 400，256-261；Fujioka，S.et al.(1988).The dominant non-gibberellin-respondingdwarf mutant(D8)of maize accumulates native gibberellins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，9031-9035)，在水稻数据库中找到与赤霉素代谢相关RGA基因，该基因编码520个氨基酸。根据该序列，将包括5’非编码区到V84为止的330bp核苷酸敲除，获得突变基因，突变后的基因以M106为起始密码子，将此突变基因命名为RDG(具有序列表中序列1的核苷酸序列)。

提取水稻总RNA(参见Qiagen公司RNA提取方法)，进行反转录，以反转录cDNA为摸板，以引物1：CTAGATCGTGTCGCACCTGGCCACGG，引物2：CACGTGGACTAGT GTCCCAAAAAC为引物进行PCR扩增，PCR产物被克隆到TOPO载体中(Invitrogen，Carlsbad，CA)，进行序列测定，结果表明得到RDG基因片段。

(2)双元杂交表达载体的构建

该RDG基因片段中含有XbaI和SpeI位点，酶切消化后与Gal4OP/TATA连接构建到pBI121载体(美国Clonetech公司产品)中，得到RDG功能基因表达载体pSBR23(图8)。将玉米Ubiquitin启动子通过HindIII和BamHI位点与Gal4 DBD-VP16连接构建到pBI121载体(美国Clonetech公司产品)中，得到启动子载体pSHR6(图8)。载体pSBR23包含有Gal4OP/TATA和RDG，转化植物以除草剂(PPT 15mg/L)为筛选标记。载体pSHR6包含有Ubiquitin启动子调控的Gal4DBD-VP16融合基因，转化植物以潮霉素(Hyg 20mg/L)为筛选标记。

3、植物转化

载体pSBR23和pSHR6参照拟南芥菜转化方法(Wang，X.，Kang，D.，Feng S.etal，(2002).CSN1 N-terminal-dependent activity is required for Arabidopsisdevelopment but not for Rub1/Nedd8 deconjugation of cullins：Astructure-function study of CSN1 subunit of COP9 signalosome.Mol.Biol.Cell13，646-655)分别转化拟南芥菜；参照水稻转化方法(Y.Hiei，T.Komari，T.Kubo，Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens，Plant Mol.Biol.35(1997)205-218)分别转化水稻栽培品种龙特甫和华恢7号；转化植株分别以潮霉素(20mg/L)和除草剂(15mg/L)筛选，获得第一代转化植株。

4、Gal4 DBD-VP16转化拟南芥植株蛋白提取及Western检测

取pSHR6转化的第一代拟南芥植株组织研磨后加入蛋白提取液(50mM Tris-HCl，pH7.4、10mM NaCl、1.5mM MgCl₂、1mm EDTA、10％甘油、1mm DTT、1mm PMSF、1×蛋白酶抑制剂(Roche，Basel，Switzerland)，提取物在4℃离心10min，吸取上清，再重复离心一次。利用Bradford assay(Bio-Rad)进行蛋白浓度定量。取15％SDS-PAGE胶浓度电泳，转膜，Gal4 DBD抗血清(Santa Cruz生物技术公司)和二抗抗鼠IgG(Sigma公司)分别按照1∶2000和1∶5000稀释，进行Western检测。检测结果如图11所示，表明pSHR6(含有Gal4 DBD-VP16融合基因)转化植株在18KDa处有特异蛋白的表达，而野生型植株没有特异条带出现，取检测阳性植株进行植物杂交。图11中，1为蛋白分子量标准，2为野生型负对照，3-6为Gal4 DBD-VP16转化植株。

5、杂交

取51株pSBR23转化的第一代拟南芥植株为母本，以步骤4鉴定的45株pSHR6转化的第一代拟南芥阳性植株为父本进行植物杂交，获得51组杂交后代种子。杂交种子在含有潮霉素平板上筛选，10天后将抗性幼苗移入土中，22℃长日照生长室生长至成熟植株。结果如图9A所示，表明抗性杂交后代植株明显比母本和父本表型矮化，图9A中，左侧植株为母本，右侧植株为父本，中间植株为拟南芥杂交后代。

将两载体pSBR23和pSHR6分别转化水稻栽培品种龙特甫和华恢7号，获得第一代转化植株，以转化pSHR6的龙特甫为母本，以转化pSBR23的华恢7号为父本进行杂交，获得一组杂交后代种子。杂交水稻种子在田间生长至抽穗期，根据水稻不同品种的麦芒特征去除非杂交后代(因杂交种子在常规田间发芽时不适合用抗生素筛选，而且该实验所选择的水稻品种麦芒特征明显)，待水稻抽穗后测量株高，同时以未转入基因的龙特甫和华恢7号杂交后代作参照。结果如图9B所示，转基因杂交后代明显比非转基因的杂交后代植株矮。图9B中从左至右的顺序为：龙特甫，转基因水稻的杂交后代，非转基因水稻的杂交后代，华恢7号。分别转入RDG和启动子的父本和母本的生长状况同非转基因的水稻相似，且所有统计及拍照植株样品均生长在同一田块中。

按照上述步骤1-4的方法进行的其它水稻品种(秀水，中花11，龙特甫)之间相互杂交的杂交结果也证明了该技术方法的可行性。

6、杂交拟南芥植株Northern检测

杂交后代拟南芥植株叶片在液氮中研磨，参照RNeasy kit(Qiagen，Valencia，CA)方法提取RNA。电泳后转膜，以杂交母本为对照，RDG为探针，取抗性植株叶片进行Northern检测，检测结果如图10所示，表明杂交后代有RDG转录。图10中，1-4为杂交后代，5为RDG转化植株(母本)。

7、杂交水稻植株的RT-PCR检测

杂交后代水稻植株叶片在液氮中研磨，参照RNeasy kit(Qiagen，Valencia，CA)方法提取RNA。以5’CCACTTCTACGAGTCCTGCC 3’和5’CTGTTTGTAGGCATTGGAGC 3’为突变的水稻矮化基因(RDG)的引物，以RT-PCR法检测杂交后代中RDG基因的表达，检测结果如图12，表明矮化的杂交后代(2号，5号)中RDG的表达可以被检测到，而高的杂交后代(1号，3号，4号)中没有检测到RDG基因，4号样品中扩增出的小片段为非特异性条带。图12中，1-5为杂交后代植株，6为非转基因水稻龙特甫(阴性对照)，7为RDG基因的PCR产物(阳性对照)。

8、植物杂交结果的分析

在杂交拟南芥的51组杂交后代种子中，经筛选，有2组未获得抗性植株，在49组抗性植株中，杂交后代表型矮化率为0％有4组；矮化率在20-59％有9组；矮化率在60-79％有19组；矮化率在80-99％有16组；矮化率在100％有1组(见表1)。出现杂交后代表型不均一的原因是在植物转化时，基因随机插入，基因插入位点不同表达不同，由于母本中的矮化基因处于未转录状态，因此无法在RNA和蛋白水平检测其表达情况，杂交时只能采取随机抽取的方法，杂交结果中出现的杂交无矮化表型，可能是因为母本基因插入位点不同产生基因沉默，所以在杂交结果中会出现0矮化率；矮化率为20-99％是因为为尽快检测双元杂交体系的可行性，在实验中，选用了第一代转化植株分别为母本和父本，由于未得到纯合子，若转化植株外源基因拷贝数不同时，在杂交后代中会出现后代分离，所以使在同一母本和父本杂交后代中出现有的表现矮化，有的无矮化表型。

水稻不同品种的杂交后代出现明显的杂种优势，杂交后代的株高明显高于亲本，这种株高过高的现象将影响作物的抗逆性。本发明将水稻矮化基因载体和启动子载体分别转化龙特甫、中花11、秀水、华恢7号等水稻栽培品种，应用第一代转基因植物进行不同组合的杂交，杂交后代中出现一些矮化植株。根据杂交组合的特点和杂种后代麦芒的表型特征分辨出是否杂交稻，然后测量株高，统计杂交后代中的矮化植株的比例约为18.6％(表2)。由于用于杂交的亲本是转基因水稻的T1代，为杂合体，杂交后代会出现分离，所以同时包含两个转化基因的植株比例应为25％，实际比例低于25％的理论值，是由于转入的外源基因并非都有表达，有些因在植物基因组中的插入位点或其它调控因素不能表达。在分子水平上检测转化基因的表达结果也证明这个问题(图12)。

以上结果证明了将双元杂交系统引入植物杂交体系是切实可行，而且可在短期内快速且大量地检测新克隆的启动子和基因的功能。而且利用这个系统和水稻矮化基因可以改变杂交后代的株高，使杂交水稻的株高同亲本相似，从而在保证其它杂种优势的同时，减低株高，增强抗倒伏能力。这个特性在农业生产实践中很有应用价值。

                                          表1.以第一代转基因拟南芥植物为亲本杂交结果统计

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
																		杂交种子	14	21	13	10	28	30	23	25	9	11	21	16	25	21	19	23	15
再生植株	12	18	0	6	23	25	18	6	4	0	12	11	16	16	15	16	10
																		矮化植株	7	15	0	4	19	19	8	6	1	0	9	3	15	14	0	13	7
矮化率(％)	58	83	0	66	83	76	44	100	25	0	75	27	94	88	0	81	70
	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30	31	32	33	34
																		杂交种子	19	16	23	13	31	15	15	23	13	22	6	17	22	30	20	18	10
再生植株	13	14	17	7	21	10	13	15	9	14	0	12	18	19	17	14	7
																		矮化植株	12	9	13	5	18	9	8	11	0	13	0	10	13	11	13	11	0
矮化率(％)	92	64	76	71	85	90	62	73	0	93	0	83	72	58	62	79	0

																			35	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47	48	49	50	51
杂交种子	8	17	11	9	16	22	15	10	13	19	21	13	12	15	16	17	9
																		再生植株	5	11	7	5	13	17	11	7	8	15	12	7	7	10	12	13	7
矮化植株	3	9	6	0	10	13	10	4	3	11	9	2	5	9	4	8	6
																		矮化率(％)	60	81	86	0	77	76	91	57	38	73	75	29	71	90	33	62	86

表2.杂交水稻(龙特甫×华恢7号)后代植株的株高

植株编号	82	83	84	85	86	326	327	328	329	330	331	332	333	334	335
																株高(cm)	126	127	127	128	126	131	123	126	131	122	130	118	63	133	131
																植株编号	336	337	338	339	340	341	342	343	344	345	346	347	348	349	350
植株株高	133	133	118	125	128	123	80	136	62	132	126	124	128	121	129
植株编号	351	352	353	354	355	356	357	358	359	360	361	362	363	矮化率
																植株株高	116	81	126	130	74	116	121	136	90	129	132	83	63	18.6％

                                  序列表

<160>2

<210>1

<211>1631

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tcgtgtcgca cctggccacg gacaccgtgc actacaaccc ctcggacctc tcctcctggg      60

tcgagagcat gctttccgag ctcaacgcgc cgctgccccc tatcccgcca gcgccgccgg     120

ctgcccgcca tgcttccacc tcgtccactg tcaccggcgg cggtggtagc ggcttctttg     180

aactcccagc cgctgccgac tcgtcgagta gcacctacgc cctcaggccg atctccttac     240

cggtggtggc gacggctgac ccgtcggctg ctgactcggc gagggacacc aagcggatgc     300

gcactggcgg cggcagcacg tcgtcgtcct catcgtcgtc ttcctctctg ggcggtgggg     360

cctcgcgggg ctctgtggtg gaggctgctc cgccggcgac gcaaggggcc gcggcggcga     420

atgcgcccgc cgtgccggtt gtggtggttg acacgcagga ggctgggatc cggctggtgc     480

acgcgttgct ggcgtgcgcg gaggccgtgc agcaggagaa cttcgcggcc gcggaggcgc     540

tggtcaagca gatccccacg ctggccgcgt cccagggcgg cgccatgcgc aaggtcgctg     600

cctacttcgg cgaggccctc gcccgccgcg tgtaccgctt ccgccccgcg gacagcaccc     660

tcctcgacgc cgccttcgcc gaccttctgc acgcccactt ctacgagtcc tgcccctacc     720

tcaagttcgc ccacttcacc gcaaatcaag ccatcctcga ggctttcgcc ggctgccacc     780

gcgtccacgt cgtcgacttc ggcatcaagc aggggatgca atggccagct ctcctccagg     840

ccctcgccct tcgtcccggc ggccccccat cgttccgcct caccggcgtc ggccccccgc     900

agccggacga gaccgacgcc ttgcagcagg tgggttggaa gcttgcccag ttcgcgcaca     960

ccattcgcgt cgacttccag taccggggac tcgtcgccgc cactctcgcg gacttggagc    1020

cgttcatgct gcagccggag ggcgaggcgg acgcgaacga ggagcctgag gtgatcgccg    1080

tcaactcggt gttcgagctg caccggctgc tcgcgcagcc cggcgcgctg gagaaggtcc    1140

tgggcacggt gcacgcggtg cggccaagga tcgtcaccgt ggtagagcag gaggccaacc    1200

acaactccgg ctcattcctc gaccggttca ccgagtcgct gcactactac tccaccatgt    1260

tcgattccct cgagggcggc agctccggcc aggccgagct ctctccgccg gctgccgggg    1320

gcggcggtgg cacggaccag gtcatgtccg aggtgtacct cggccggcag atctgcaacg    1380

tcgtggcgtg cgagggcgcg gagcgcacgg agcgccacga gacgctgggg cagtggcgca    1440

accgcctcgg ccgcgccggc ttcgagcccg tgcacctggg ctccaatgcc tacaaacagg    1500

cgagcacgct cctcgcgctt ttcgccggcg gcgacggcta ccgggtggag gagaaggagg    1560

gctgcctcac gctgggctgg cacacgcgcc cgctcatcgc cacctcggca tggcgcgtcg    1620

ccgcggcgtg a                                                         1631

<210>2

<211>3405

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cgaatccaag cttcgtaccc tccgctcgga ggacagtact ccgctcggag gacagtactc      60

cgctcggagg acagtactcc gctcggagga cagtactccg ctcgaggaca gtactccgct     120

cggaggacag tactccgctc ggaggacagt actccggggg atcctctagc ccactatcct     180

tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgcttctag     240

acgcggtacc ggtctagagt atttttacaa caattaccaa caacaacaaa caacaaacaa     300

cattacaatt actatttaca attacaagtt tgtacaaaaa agctgaacga gaaacgtaaa     360

atgatataaa tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa aaaacagact acataatact     420

gtaaaacaca acatatccag tcactatggc ggccgcgggt gatgctgcca acttagcggc     480

cgctaagttg gcagcatcac ccgacgcact ttgcgccgaa taaatacctg tgacggaaga     540

tcacttcgca gaataaataa atcctggtgt ccctgttgat accgggaagc cctgggccaa     600

cttttggcga aaatgagacg ttgatcggca cgtaagaggt tccaactttc accataatga     660

aataagatca ctaccgggcg tattttttga gttatcgaga ttttcaggag ctaaggaagc     720

taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa     780

agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct     840

ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt     900

tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg caatgaaaga     960

cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac    1020

tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat    1080

atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat    1140

tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa    1200

cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca    1260

aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct gtgatggctt    1320

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gtaatctaga ggatccggct tactaaaagc cagataacag tatgcgtatt tgcgcgctga    1440

tttttgcggt ataagaatat atactgatat gtatacccga agtatgtcaa aaagaggtgt    1500

gctatgaagc agcgtattac agtgacagtt gacagcgaca gctatcagtt gctcaaggca    1560

tatatgatgt caatatctcc ggtctggtaa gcacaaccat gcagaatgaa gcccgtcgtc    1620

tgcgtgccga acgctggaaa gcggaaaatc aggaagggat ggctgaggtc gcccggttta    1680

ttgaaatgaa cggctctttt gctgacgaga acagggactg gtgaaatgca gtttaaggtt    1740

tacacctata aaagagagag ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt    1800

gacacgcccg ggcgacggat ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa    1860

gtctcccgtg aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc    1920

accgatatgg ccagtgtgcc ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac    1980

cgcgaaaatg acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct ggggaatata aatgtcaggc    2040

tccgttatac acagccagtc tgcaggtcga ccatagtgac tggatatgtt gtgttttaca    2100

gtattatgta gtctgttttt tatgcaaaat ctaatttaat atattgatat ttatatcatt    2160

ttacgtttct cgttcagctt tcttgtacaa agtggttgag ctcaagcttg cgggccgctc    2220

tagaactagt ggtgaacaaa agttgatttc tgaagaagat ttgaacggtg aacaaaagct    2280

aatctccgag gaagacttga acggtgaaca aaaattaatc tcagaagaag acttgaacgg    2340

atcctctaga ggtgaacaaa agttgatttc tgaagaagat ttgaacggtg aacaaaagct    2400

aatctccgag gaagacttga acggtgaaca aaaattaatc tcagaagaag acttgaacgg    2460

atcctctaga ggtgaacaaa agttgatttc tgaagaagat ttgaacggtg aacaaaagct    2520

aatctccgag gaagacttga acggtgaaca aaaattaatc tcagaagaag acttgaacgg    2580

atccactagt ggatcccccg ggctgcagcc tagggattac gatatcccaa cgaccgccag    2640

tcatcaccat caccatcacc tggaagttct gttccagggg cccgagctta agacggccgc    2700

cctagcgcaa cacgatgaag ccgtagacaa caaattcaac aaagaacaac aaaacgcgtt    2760

ctatgagatc ttacatttac ctaacttaaa cgaagaacaa cgaaacgcct tcatccaaag    2820

tttaaaagat gacccaagcc aaagcgctaa ccttttagca gaagctaaaa agctaaatga    2880

tgctcaggcg ccgaaagtag acaacaaatt caacaaagaa caacaaaacg cgttctatga    2940

gatcttacat ttacctaact taaacgaaga acaacgaaac gccttcatcc aaagtttaaa    3000

agatgaccca agccaaagcg ctaacctttt agcagaagct aaaaagctaa atgatgctca    3060

ggcgccgaaa gtagacgcga attcgagctc ggtatgatcc tagaggacgt ctcgaggtac    3120

cgcccgggcg agctcggaax xxgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt    3180

gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca    3240

tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt    3300

cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa    3360

attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcxxxxg aattc                    3405

Claims (7)

1、一种植物双元杂交表达载体，由启动子载体和功能基因表达载体组成，其特征在于，所述启动子载体包含启动子与转录激活因子编码基因的融合序列；所述功能基因表达载体包含目的基因与所述转录激活因子的调控元件的融合序列；所述的目的基因为序列1所示的RDG基因。

2、根据权利要求1所述的植物双元杂交表达载体，其特征在于：所述的转录激活因子为Gal4、HAP1、Gal4(DBD)-VP16或HAP1-VP16。

3、根据权利要求1、2所述的植物双元杂交表达载体，其特征在于：所述功能基因表达载体和所述启动子载体分别选用不同筛选标记基因。

4、一种利用权利要求1-3中任一所述的植物双元杂交表达载体进行植物杂交育种的方法，包括以下步骤：

1)将功能基因表达载体和启动子载体分别转化植物，获得独立的父本和母本转基因植株；

2)将所述父本和母本转基因植株进行杂交，得到转基因杂交后代。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述父本为被所述启动子载体转化的植株，所述母本为被所述功能基因表达载体转化的植株。

6、根据权利要求4、5所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述转基因杂交后代为矮化水稻。

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