CN1318106A

CN1318106A - 来源于拟南芥属的尿嘧啶通透酶用作除草剂靶基因

Info

Publication number: CN1318106A
Application number: CN 99810964
Authority: CN
Inventors: J·Z·莱文; S·L·波特; G·J·巴兹瑟维斯克; E·R·沃德; P·波纳斯寇尼
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2001-10-17
Also published as: EP1114168A2; AU6082399A; WO2000015809A2; WO2000015809A3; CA2340332A1; JP2002525061A

Abstract

本发明涉及一种从拟南芥中分离的编码幼苗生长所需蛋白质的基因。本发明也包括利用该蛋白质发现新除草剂的方法，这是基于该基因对于正常生长和发育的重要性。本发明也能在筛选试验中用来鉴定是可能的除草剂的抑制剂。本发明也可用于除草剂耐受性植物、植物组织、植物种子和植物细胞的开发。

Description

来源于拟南芥属的尿嘧啶通透酶用作除草剂靶基因

本发明涉及一种从拟南芥属(arabidopsis)中分离的编码幼苗生长所必需的蛋白质的基因。本发明也包括利用该蛋白质作为除草剂靶标的方法，这是基于该基因对于正常生长和发育的重要性。本发明也可作为筛选试验用于鉴定是可能的除草剂的抑制剂。本发明也可用于除草剂耐受性植物、植物组织、植物种子和植物细胞的开发。

用除草剂控制农田中不希望的植被如杂草的应用几乎已普遍实施。除草剂市场每年超过150亿美元。尽管如此广泛的应用，杂草的控制对于农民仍是一个重要且高代价的问题。

除草剂的有效使用需要完善的管理。例如，施用的时间和方法及杂草植物的生长阶段对于用除草剂获得良好的杂草控制是关键的。由于多种杂草种耐受除草剂，所以新的有效除草剂的生产变得越来越重要。现在能用采用重组DNA技术的高通量筛选发现新型除草剂。发现为植物生长和发育所必需的代谢酶能通过标准分子生物学技术重组产生，并能在筛选新型酶活性抑制剂中用作除草剂的靶标。通过这种筛选发现的新型抑制剂然后可作为除草剂来抑制不希望的植被。

遗憾的是，具有较高效能、较广杂草谱和在土壤中较快降解的除草剂也可能具有较大的作物植物毒性。解决该问题的一个办法是产生对除草剂有抗性或耐受性的作物。耐受除草剂的作物杂种或变种使得能用除草剂消灭杂草，而无损害作物的危险。耐受性的产生使得能在以前由于作物对除草剂敏感而避免或限制其应用(例如种子出土前施用)的情况下对作物施用除草剂。例如，Anderson等人的美国专利号4,761,373涉及对多种咪唑啉酮或磺酰胺除草剂有抗性的植物。这种抗性由一种改变的乙酰羟酸合酶(AHAS)赋予。Goodman等人的美国专利号4,975,374涉及含有编码突变谷氨酰胺合成酶(GS)的基因的植物细胞和植物，其耐受已知可抑制GS的除草剂如膦丝菌素和甲硫氨酸磺酰亚氨的抑制。Bedbrook等人的美国专利号5,013,659涉及表达突变乙酰乳酸合酶的植物，该酶使植物耐受磺酰脲除草剂的抑制。Somers等人的美国专利号5,162,602公开了耐受环己二酮和芳氧基苯氧基丙酸除草剂的植物。这种耐受性由一种改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予。

尽管有上述进展，但仍存在固有的和新出现的关于不希望的或有害的植被生长(例如杂草)的问题。而且，由于人口持续增长，食物缺乏将越来越严重。因此，一直需要但仍未发现有效且经济的新的除草剂。定义

为清楚起见，在本说明书中使用的某些术语定义如下：

嵌合：用来指一种DNA序列(如载体或基因)，其包含超过一种不同来源的DNA序列，它们通过重组DNA技术融合在一起，产生一种非天然存在的DNA序列。

辅因子：酶催化反应中所需的天然反应物，如有机分子或金属离子。辅因子包括，例如，NAD(P)、核黄素(包括FAD和FMN)、叶酸、钼蝶呤(molybdopterin)、硫胺素、生物素、硫辛酸、泛酸和辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸、吡哆醛磷酸、泛醌、甲基萘醌类。任选地，辅因子能再生并重新使用。

DNA改组：DNA改组是一种在DNA分子中优选地随机引入突变或重排或在两种或多种DNA分子间优选地随机产生DNA序列交换的方法。DNA改组产生的DNA分子是一种改组DNA分子，它是由至少一种模板DNA分子衍生的非天然存在的DNA分子。改组DNA编码一种相对于模板DNA所编码的酶而言改变的酶，优选地相对于模板DNA所编码的酶具有改变的生物活性。

酶活性：在此是指酶催化底物转化为一种产物的能力。酶的底物包括酶的天然底物，还包括也能被该酶转化为一种产物或产物类似物的天然底物的类似物。酶活性的测定方法包括例如，在一段时间之后测定反应产物的量，或在一段时间之后测定反应混合物中残留的底物的量。酶活性的测定方法也包括，在一段时间后测定反应混合物中残留的未用的反应辅因子的量，或在一段时间后测定反应混合物中消耗的辅因子的量。酶活性的测定方法也包括，在一段时间后测定反应混合物中残留的自由能或高能分子供体(例如ATP、磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸或磷酸肌酸)的量，或在一段时间后测定反应混合物中消耗的自由能或高能分子供体(例如ADP、丙酮酸、乙酸或肌酸)的量。

表达：是指内源基因或转基因在植物中的转录和/或翻译。例如，对于反义构建体，表达可以仅指反义DNA的转录。

基因：是指一种编码序列或相关的调节序列，其中该编码序列可转录为RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA。调节序列的实例是启动子序列、5’和3’非翻译序列。可能存在的其他元件是例如内含子。

目的……基因：是指当转移给植物时赋予该植物一种希望的特性的任何基因，这些特性如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、病害抗性、或对其他害虫的抗性、除草剂耐受性、提高的营养价值、改善的在工业加工中的表现或改变的繁殖能力。“目的基因”也可以是转移给植物以在该植物中产生具商业价值的酶或代谢物的基因。

除草剂：一种用来杀死或抑制植物、植物细胞、植物种子或植物组织生长的化学物质。

异源DNA序列：与被导入的宿主细胞不天然相关的一种DNA序列，包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。

同源DNA序列：与被导入的宿主细胞天然相关的一种DNA序列。

同一性：序列同一性的百分数用基于动态编程算法的计算机程序确定。在本发明范围中优选的计算机程序包括BLAST(基本局部对比搜索工具)搜索程序，其用来搜索所有可获得的序列数据库，而不论查询条件是蛋白质还是DNA。该搜索工具的BLAST 2.0版(缺口BLAST)已在因特网上公开(当前http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。与总体对比相反，它使用搜索局部的试探性算法，因此能探明只共有分离区域的序列之间的关系。BLAST搜索中指定的得分具有明确的统计学解释。

抑制剂：一种化学物质，其能灭活蛋白质如生物合成酶、受体、信号转导蛋白、结构基因产物或植物生长或存活所必需的转运蛋白的酶活性。在本发明说明书中，抑制剂是一种可灭活源自植物的4788的酶活性的化学物质。

等基因的：除了可在转基因的存在与否方面不同之外，遗传学上相同的植物。

分离的：在本发明说明书中，分离的DNA分子或分离的酶是经人工而存在于其天然环境之外的DNA分子或酶，因此不是一种天然产物。分离的DNA分子或酶可以纯化的形式存在，或存在于非天然环境如转基因宿主细胞中。

标记基因：一种编码选择性或可筛选性状的基因。

成熟蛋白质：通常导向于细胞器如叶绿体，且转运肽已被从其上切除的蛋白质。

最小启动子：启动子元件，特别是TATA元件，其为无活性的，或可在无上游激活的情况下具有大大降低的启动子活性。在适当转录因子的存在下，最小启动子负责允许转录。

改变的酶活性：不同于植物中天然存在的酶(即在未直接或间接人工操作这种活性时天然存在的酶活性)的酶活性，其耐受可抑制天然存在的酶活性的抑制剂。

有效连接/相关：如果如下两种序列如此排列使得调节DNA序列影响编码一种RNA或蛋白质的DNA序列的表达，那么认为该调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“有效连接”或“相关”。

植物：是指任何植物，特别是种子植物。

植物细胞：植物的结构与生理学单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可能为分离的单细胞或培养细胞的形式，或者作为高级组织单位如植物组织或植物器官的一部分。

植物材料：是指叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、合子、胚、种子、插条、细胞或组织培养物或其他任何部分或植物的产物。

前蛋白：通常导向细胞器如叶绿体且仍含有其转运肽的蛋白质。

重组DNA分子：用重组DNA技术连接在一起的DNA序列的组合。

重组DNA技术：用来连接DNA序列的方法，例如，如Sambrook等人，1989，冷泉港，NY：冷泉港实验室出版社所述。

选择性标记：一种基因，其在植物细胞中的表达给予该细胞一种选择有利性。与未转化的细胞的生长相比，用选择性标记基因转化的细胞所具有的选择有利性可能是由于其在负选择剂(如抗生素或除草剂)存在下生长的能力。与未转化的细胞相比，转化细胞具有的选择有利性也可能是由于其增强的或新的利用添加的化合物作为养分、生长因子或能源的能力。选择性标记基因也指在植物细胞中的表达给予该细胞负选择和正选择有利性的基因或基因组合。

显著提高：大于测定技术中固有误差限度的酶活性的提高，优选地在抑制剂存在下比野生型酶活性提高约2倍或更多，更优选地提高约5倍或更多，最优选地提高约10倍或更多。

显著低于：意思是酶反应产物的量大于测定技术中固有误差的限度，优选地在不含抑制剂时比野生型酶活性降低约2倍或更多，更优选地降低约5倍或更多，最优选地降低约10倍或更多。

最广义地来说，当在此对核苷酸序列使用时，术语“基本类似”意思是一种对应于参照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相应的序列编码一种具有与参照核苷酸序列编码的多肽基本相同的结构和功能的多肽，例如，只发生不影响多肽功能的氨基酸改变。希望地，基本类似的核苷酸序列编码参照核苷酸序列所编码的多肽。术语“基本类似”特别包括已改变序列来优化在特定细胞中表达的核苷酸序列。基本类似的核苷酸序列与参照核苷酸序列之间同一性的百分数希望地为至少65％，更希望地为至少75％，优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，再更优选地至少99％。使用Smith-Waterman序列对比算法进行序列对比(见，例如，Waterman,M.S.《计算生物学介绍：图谱、序列与基因组》。Chapman&Hall.伦敦：1995.ISBN 0-412-99391-0，或http:∥www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html)。按下列参数使用localS程序1.16版：匹配：1，错配罚：0.33，开放罚区间(open-gap):2，扩展罚区间(extended-gap):2。与参照核苷酸序列“基本类似的”核苷酸序列在下列条件下可与参照核苷酸序列杂交：7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA,50℃，用2×SSC、0.1％SDS在50℃下洗涤；更希望的是7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA,50℃，用1×SSC、0.1％SDS在50℃下洗涤；更希望的是7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA,50℃，用0.5×SSC、0.1％SDS在50℃下洗涤；优选的是7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mMEDTA,50℃，用0.1×SSC、0.1％SDS在50℃下洗涤；更优选的是7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA,50℃，用0.1×SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤。

当在此对蛋白质使用时，术语“基本类似”意思是一种对应于参照蛋白质的蛋白质，其中该蛋白质具有与参照蛋白质基本相同的结构和功能，例如，只发生不影响多肽功能的氨基酸序列的变化。当用于蛋白质或氨基酸序列时，基本类似的与参照蛋白质或氨基酸序列之间的同一性百分数希望地至少为65％，更希望地至少75％，优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，再更优选地至少99％。

底物：底物是可被酶天然识别并能在该酶天然行使其功能的生物化学途径中将其转化为一种产物的分子，或是该分子的一种修饰形式，其也可被酶识别，并在类似于天然发生的反应的酶促反应中被该酶转化为一种产物。

耐受性：当接触足以抑制天然、未改变的植物之正常生长或行使功能的量的抑制剂或除草剂时，持续正常生长或行使功能的能力。

转化：一种向细胞、组织或植物中导入异源DNA的方法。转化的细胞、组织或植物被认为不仅包括转化方法的终产物而且包括其转基因后代。

转基因的：用优选地包含与目的DNA序列有效连接的适当启动子的重组DNA分子稳定转化的。序列表中的序列简述

SEQ ID NO:1拟南芥4788基因的基因组DNA序列

SEQ ID NO:2拟南芥4788基因的cDNA序列

SEQ ID NO:3拟南芥4788蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:4寡核苷酸SLP346for

本发明的一个目的在于提供一种有效且有益的鉴定新型除草剂的方法。本发明的一个特征在于拟南芥属中推断的通透酶基因的鉴定。本发明的另一个特征在于发现了推断的通透酶基因是幼苗生长和发育所必需的。本发明的一个优点是新发现的具有新型除草作用模式的必需基因使本领域技术人员能容易且快速地鉴定新型除草剂。

本发明的一个目的在于为测定具有除草剂活性的抑制化合物提供一种必需的植物基因。遗传学结果显示，当拟南芥属中推断的通透酶基因突变时，产生的表型在纯合状态中是幼苗致死的。这表明了突变基因所编码的基因产物的重要作用。

利用T-DNA插入诱变，本发明的发明者证明了该活性在拟南芥幼苗中是必需的。这意味着可抑制植物中蛋白质功能的化学品可能对植物具有有害作用，并且可能是良好的除草剂候选物。因此本发明提供利用以下所述基因序列编码的纯化的蛋白质鉴定其抑制剂的方法，然后可用该抑制剂作为除草剂例如在作物生长的田地中抑制不希望的植被的生长，特别是农业上重要的作物，如玉米及其他谷类作物，如小麦、燕麦、黑麦、高粱、稻、大麦、谷子、草皮草和牧草等，以及棉花、甘蔗、甜菜、油籽油菜和大豆。

本发明公开了一种来源于拟南芥属的新型核苷酸序列，称为4788基因。该基因组克隆的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1中，相应cDNA克隆的核苷酸序列示于SEQ ID NO:2中，拟南芥4788蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中。本发明也包括与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本类似的核苷酸序列。

本发明也包括与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本类似的核苷酸序列，其中该核苷酸序列是一种植物核苷酸序列。优选的是一种与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本类似的核苷酸序列，其中该核苷酸序列是一种拟南芥(Arabidopsis thaliana)核苷酸序列。

还包括一种与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本类似的核苷酸序列，其中所编码的蛋白质具有通透酶活性。更优选的是一种与SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示基本类似的核苷酸序列，其中所编码的蛋白质具有嘌呤或嘧啶通透酶活性。特别优选的是一种与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本类似的核苷酸序列，其中所编码的蛋白质具有尿嘧啶通透酶活性。还包括一种氨基酸序列，其包含由基本类似于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。还包括一种氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所编码的氨基酸序列。

本发明也包括氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列基本类似的蛋白质。

也包括一种包含基本类似于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的氨基酸序列。优选的是一种包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的氨基酸序列。

包括一种氨基酸序列，其包含由基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中该蛋白质具有通透酶活性。更优选的是一种氨基酸序列，其包含由基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中该蛋白质具有嘌呤或嘧啶通透酶活性。特别优选的是一种氨基酸序列，其包含由基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中该蛋白质具有尿嘧啶通透酶活性。

还包括一种氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所编码的氨基酸序列的至少20个连续氨基酸残基。

还包括一种氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的至少20个连续氨基酸残基。

另一个实施方案是一种嵌合基因，其包含一种与基本类似于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列有效连接的启动子。

还包括一种重组载体，其包含一种含有与基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列有效连接的启动子的嵌合基因，其中该载体能稳定地转化至宿主细胞中。

还包括一种宿主细胞，其含有包含一种嵌合基因的载体，该嵌合基因包含与基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列有效连接的启动子，其中该载体能稳定地转化至宿主细胞中，而该核苷酸序列可在该细胞中表达。

根据本发明的一种优选的宿主细胞是真核细胞，更优选的是一种选自昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞的宿主细胞。另一种优选的宿主细胞是原核细胞，更优选的是一种细菌细胞。

也包括一种植物，其含有包含一种嵌合基因的载体，该嵌合基因包含与基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列有效连接的启动子，其中该载体能稳定地转化至植物细胞中；也包括这种植物的后代和种子，该种子任选地被处理(例如涂层或覆盖)和/或包装，例如，与使用说明书一起置于袋子或其他容器中。更优选的是根据本发明的一种植物，其中该植物耐受通透酶活性抑制剂；也包括这种植物的后代和种子，该种子任选地被处理(例如涂层或覆盖)和/或包装，例如，与使用说明书一起置于袋子或其他容器中。

本发明的另一个实施方案是一种方法，用于制备编码具有改变的通透酶活性的基因产物的核苷酸序列，包括：

a)改组一种基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列，

b)表达得到的改组核苷酸序列，和

c)筛选与未改变的核苷酸序列的基因产物的通透酶活性相比，改变的通透酶活性。

优选的是根据本发明的一种方法，其中该核苷酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。更优选的是根据本发明的一种方法，其中所述通透酶活性是嘌呤或嘧啶通透酶活性。特别优选的是根据本发明的一种方法，其中所述通透酶活性是尿嘧啶通透酶活性。

本发明还包括一种改组的DNA分子，其可通过制备编码具有改变的通透酶活性的基因产物的核苷酸序列的方法获得，该方法包括：

a)改组一种基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列，

b)表达得到的改组核苷酸序列，和

本发明的另一个实施方案是通过根据本发明的方法产生的一种改组DNA分子。

本发明也包括一种通过根据本发明的方法获得的改组DNA分子，其中该改组DNA分子编码一种对通透酶活性抑制剂的耐受性增强的基因产物。

本发明的另一个实施方案是一种嵌合基因，其包含与通过根据本发明的方法产生的改组DNA分子有效连接的启动子。

本发明的另一个实施方案是一种含有一种嵌合基因的重组载体，该嵌合基因包含与通过根据本发明的方法产生的改组DNA分子有效连接的启动子，其中该载体能稳定地转化至宿主细胞中。

还包括一种宿主细胞，其含有包含一种嵌合基因的根据权利要求的载体，该嵌合基因包含与通过所述方法产生的改组DNA分子有效连接的启动子，其中该载体能稳定地转化至宿主细胞中，而该核苷酸序列可在该细胞中表达。优选的是根据本发明的一种宿主细胞，它是一种真核细胞，更优选的是该宿主细胞选自昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。也优选根据本发明的一种宿主细胞，它是一种原核细胞，更优选的是一种根据本发明的宿主细胞，是一种细菌细胞。

另一个实施方案是一种植物，其包含含有根据本发明的载体的植物细胞，该载体包含的嵌合基因包含与通过根据本发明的方法产生的改组DNA分子有效连接的启动子，其中该载体能稳定地转化至植物细胞中，而该核苷酸序列可在该细胞中表达；也包括这种植物的后代和种子，该种子任选地被处理(例如涂层或覆盖)和/或包装，例如，与使用说明书一起置于袋子或其他容器中。

另一个实施方案是一种耐受通透酶活性抑制剂的根据本发明的植物；也包括这种植物的后代和种子，该种子任选地被处理(例如涂层或覆盖)和/或包装，例如，与使用说明书一起置于袋子或其他容器中。

另一个实施方案是一种鉴定具有除草活性的化合物的方法，包括：

a)在有利于结合的条件下，将一种包含由基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的蛋白质，与一种待测定其结合该蛋白质的能力的化合物相结合，

b)选择步骤(a)中鉴定的一种能结合该蛋白质的化合物，

c)将步骤(b)中鉴定的化合物施用于一种植物，检测其除草活性，和

d)选择具有除草活性的化合物。

还包括一种可按照根据本发明的方法鉴定的具有除草活性的化合物。

还包括一种鉴定具有除草活性的通透酶活性抑制剂的方法，其包括：

a)将一种通透酶与一种待测定其抑制该通透酶活性的能力的化合物，在有利于这种抑制的条件下相结合，

b)选择步骤(a)中鉴定的一种能抑制该通透酶活性的化合物，

d)选择具有除草活性的化合物。

本发明包括一种根据本发明的方法，其中该通透酶是一种嘌呤或嘧啶通透酶，更优选地，该通透酶是一种尿嘧啶通透酶。

本发明的另一个实施方案是一种可按照根据本发明的方法鉴定的具有除草活性的化合物。

另一个实施方案是一种鉴定通透酶活性抑制剂的方法，其包括：

a)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或与之基本类似的核苷酸序列导入一种通透酶缺陷的宿主细胞如大肠杆菌uraA中，使得该序列可功能性表达；

b)将含有该核苷酸序列的宿主细胞与最低抑制浓度的5-氟尿嘧啶，和一种待测定其抑制该通透酶活性的能力的化合物，在有利于这种抑制的条件下结合；

c)在步骤(b)的条件下测定宿主细胞的生长；和

d)选择在步骤(c)中可抑制宿主细胞生长的化合物。

还包括一种抑制植物生长的方法，其包括，以足够抑制该植物生长的量向该植物施用一种化合物，该化合物可抑制包含由基本类似于SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的氨基酸序列的活性。

还包括一种鉴定具有除草活性的化合物的方法，其包括：

a)在有利于结合的条件下，将权利要求10的蛋白质与一种待测定其结合该蛋白质的能力的化合物相结合，

b)选择步骤(a)中鉴定的一种能结合该蛋白质的化合物，

d)选择具有除草活性的化合物。

以及可按照根据本发明的方法鉴定的具有除草活性的化合物。

还包括一种改进作物的方法，其包括，以可抑制不希望的植被生长，但不明显抑制除草剂耐性植物或种子生长的量，向耐受通透酶抑制剂的选自根据本发明的植物或种子的除草剂耐性植物或种子，施用一种具有除草活性的根据本发明的化合物。

本发明也包括利用4788基因产物作为除草剂靶标的方法，这基于该基因对于正常生长和发育的重要性。此外，本发明也能在筛选试验中用来鉴定是可能的除草剂的抑制剂。

在另一个优选的实施方案中，本发明描述了一种用于鉴定能抑制植物中4788活性的化学品的方法，其优选地包括下列步骤：a)获得优选地稳定转化的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，其含有一种编码具有4788活性的酶，并能过量表达酶活性4788基因产物的非天然核苷酸序列；b)对转基因植物、植物细胞、组织或部分，并对等基因的未转化植物、植物细胞、组织或部分施用一种化学品；c)在应用化学品后测定转基因的和未转化的植物、植物细胞、组织的生长或生存力；d)对比施用化学品后转基因的与未转化的植物、植物细胞、组织的生长或生存力；和e)选择可抑制非转基因植物、植物细胞、组织或部分的生存力或生长，而不明显抑制等基因转基因植物、植物细胞、组织或部分的生存力或生长的化学品。在一个优选的实施方案中，具有4788活性的酶由一种来源于植物，优选地来源于拟南芥的核苷酸序列编码，该序列希望地与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列相同或基本类似。在另一个实施方案中，具有4788活性的酶由一种能编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核苷酸序列编码。在又另一个实施方案中，具有4788活性的酶具有与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相同或基本类似的氨基酸序列。

本发明还包括具有改变的4788活性因此耐受在通常抑制天然存在的4788活性的水平上的除草剂的抑制植物、植物组织和植物细胞；也包括这种植物的后代和种子，该种子任选地被处理(例如涂层或覆盖)和/或包装，例如，与使用说明书一起置于袋子或其他容器中。本发明包括的除草剂耐性植物包括可能是正常抑制除草剂的靶标的那些植物，特别是上述农业上重要的作物。根据该实施方案，植物、植物组织、植物种子或植物细胞用一种重组DNA分子转化，优选地稳定转化，该重组DNA分子包含一种在植物中起作用的适当启动子，其与编码改变的4788基因的核苷酸编码序列有效连接，其耐受通常抑制野生型未改变4788基因产物活性的浓度的除草剂的抑制。通过对植物提供多拷贝的野生型4788基因，或通过在强于野生型的启动子的控制下过量表达野生型4788基因，提高野生型除草剂敏感的4788蛋白的表达，也可赋予植物改变的4788活性。然后用常规筛选技术筛选这样产生的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，由此分离、表征并培育除草剂耐性系。另外，也可用随机或位点特异性诱变产生除草剂耐性系。

因此，本发明提供用一种DNA分子转化的植物、植物细胞或植物组织，该DNA分子包含自一种植物分离的编码具有4788活性的酶的核苷酸序列，也包括这种植物的后代和种子，该种子任选地被处理(例如涂层或覆盖)和/成包装，例如，与使用说明书一起置于袋子或其他容器中，其中该酶具有4788活性，并且该DNA分子赋予该植物、植物细胞、植物种子或植物组织对其量通常抑制天然存在的4788活性的除草剂的耐受性。根据本实施方案的一个实施例，具有4788活性的酶由一种与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列相同或基本类似的核苷酸序列所编码，或者具有与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相同或基本类似的氨基酸序列。

本发明也提供一种抑制植物生长的方法，包括对植物施用一种可抑制植物中天然存在的4788活性的化学品的步骤。在有关方面，本发明涉及一种在种植作物种子或植物的田地中选择性抑制不希望的植被生长的方法，包括下列步骤：(a)任选地种植除草剂耐受性作物或作物种子，它们是耐受可抑制天然存在的4788活性的除草剂的植物或植物种子；和(b)以可抑制天然存在的4788活性的量，对田地中的作物或作物种子和不希望的植被施用一种除草剂，其中该除草剂可抑制杂草的生长，而不明显抑制作物的生长。

根据以下的发明描述和非限制性实施例，本领域技术人员将明白本发明的其他目的和优点。Ⅰ．由T-DNA插入诱变所证明的拟南芥属中4788基因的重要性

如以下实施例所示，用T-DNA插入诱变第一次在拟南芥属中证明了新型基因结构的确定，以及4788基因对于正常植物生长和发育的重要性。由于已确定了4788功能在植物中的重要性，并鉴定了编码这种重要活性的基因，因此发明人提供了一种研发新除草剂的重要的探索工具。

鉴定幼苗致死突变分离的拟南芥插入突变系作为必需蛋白质鉴定的第一步。由自基因组中含有T-DNA插入的单个T1植物收集的T2种子开始，鉴定那些纯合幼苗和致死幼苗分离的品系。通过将种子置于含有杀真菌剂苯菌灵和maxim的基本植物生长培养基上，并在室温和光照下7天及14天后筛选不能存活的幼苗，从而发现这些品系。不能存活的表型包括改变的色素形成或改变的形态学。可在平板上直接观察或在幼苗移植后在土壤中观察这些表型。

当一种品系被确定为分离幼苗致死时，确定T-DNA中的抗性标记是否与致死性共分离(Errampalli等人(1991)植物细胞(The Plant Cell)3:149-157)。通过将种子置于含有选择剂的培养基上并检测幼苗对选择剂的抗性或敏感性来进行共分离分析。所用选择剂的实例是潮霉素或膦丝菌素。将大约35株抗性幼苗移植到土壤中，并检测其后代幼苗致死性的分离。在T-DNA插入破坏了必需基因的情况下，每种植物中均存在抗性表型和幼苗致死表型的共分离。因此，在这种情况中，所有抗性植物在下一代中分离幼苗致死性；该结果表明，就引起这两种表型的DNA而言每一抗性植物均是杂合的。

对于显示T-DNA抗性标记与幼苗致死表型共分离的品系，进行Southern分析作为表征每种插入的分子性质的第一步。用自杂合子分离的基因组DNA和能与T-DNA载体DNA杂交的探针进行Southern分析。通常，特定植物中的T-DNA插入显示含有插入单遗传基因座的多拷贝T-DNA载体。根据Southern的结果，选择适当的限制酶进行质粒拯救，以分子克隆侧翼为T-DNA插入一端或两端的拟南芥基因组DNA。通过限制酶消化分析这样获得的质粒，以根据其消化模式将这些质粒归类。对每一种类的质粒克隆均测定DNA序列。分析所得序列中非T-DNA载体序列的存在。当发现这些序列时，使用BLAST和BLAST2程序(Altschul等人，分子生物学杂志215:403-410；Altschul等人(1997)核酸研究25:3389-3402)用其搜索DNA和蛋白质数据库。每种基因的其他基因组序列和cDNA序列用标准分子生物学方法鉴定。Ⅱ．拟南芥4788基因的序列

从标记的幼苗致死系#4788中分离侧翼为T-DNA边界的DNA，测序拟南芥4788基因。侧翼为T-DNA边界的拟南芥DNA与测序的拟南芥BAC(BAC T9J22，染色体2)的内部区域相同。该BAC克隆含有115851bp的序列，其中极小一部分对应于含有4788基因的基因组区。尽管已知BAC的信息，但发明人第一个最终确定了完整基因序列，并第一次证明4788基因产物是正常生长和发育所必需的，并阐明了4788基因产物的功能。本发明公开了拟南芥4788基因的核苷酸序列，以及拟南芥4788蛋白的氨基酸序列。对应于该基因组克隆的核苷酸序列示于SEQ IDNO:1中，相应的cDNA克隆示于SEQ ID NO:2中，编码成熟蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中。本发明也包括一种来源于植物的分离的氨基酸序列，其中该氨基酸序列与由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列相同或基本类似，其中该氨基酸序列具有4788活性。利用缺省设置的BLAST和BLAST2程序，4788基因的序列显示与尿嘧啶通透酶有相似性。

4788基因也是拟南芥基因家族的一员。该基因家族至少由6个成员组成(Genbank Acc.#s:AC002505(2739376),BAC T9J22；AC004481(3337350),BAC F13P17；AC001229(2190545),BAC F5I14；AB009053(n/a)，克隆MQB2(第13个开放阅读框)；U83501(1791307)；和AA712474(EST克隆194H6T7)，以及AA605567(EST克隆205J16XP))。Ⅲ．4788的重组产生及其应用

为在宿主生物中重组产生4788，将编码4788蛋白的核苷酸序列插入为所选宿主设计的表达盒中，并导入宿主中，在此重组产生。特定调节序列如启动子、信号序列、5’和3’非翻译序列和适用于所选宿主的增强子的选择属于本领域技术人员的水平之内。可将得到的含有与适当阅读框有效连接的各个元件的分子插入一种能转化宿主细胞的载体中。用于蛋白质重组产生的适当表达载体和方法众所周知，宿主生物如大肠杆菌、酵母和昆虫细胞(见，例如，Luckow和Summers，生物技术6:47(1988))，杆状病毒表达载体，如来源于苜蓿银纹夜蛾(Autographicacalifornica)核型多角体病毒(AcMNPV)的基因组的杆状病毒表达载体。一种优选的杆状病毒/昆虫系统是pAcHLT(Pharmingen,San Diego,CA)，其用来在线性苜蓿银纹夜蛾杆状病毒DNA(Pharmingen,San Diego,CA)的存在下转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞(ATCC)。用得到的病毒感染HighFive Tricoplusia ni细胞(Invitrogen,La Jolla,CA)。

在一个优选的实施方案中，编码具有4788活性的蛋白质的核苷酸序列来源于真核生物，如哺乳动物、苍蝇或酵母，但优选地来源于植物。在另一个优选的实施方案中，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列相同或基本类似，或者编码一种具有4788活性的蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同或基本类似。SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码拟南芥4788蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在另一个优选的实施方案中，该核苷酸序列来源于原核生物，优选地细菌，如大肠杆菌中的uraA基因(Andersen等人(1995)细菌学杂志(J.Bacteriol.)177:2008-2013)。用多种标准技术分离并纯化重组产生的4788。目前可使用的技术将依所用的宿主生物，蛋白质是否分泌，及技术人员熟知的其他这类因素而不同(见，例如，Ausubel,F.等人，《现代分子生物学技术》第16章，John Wiley&Sons,Inc.出版(1994))。表征4788蛋白的试验

重组产生的4788蛋白可用于多种用途。例如，它们能在体外试验中用来筛选尚未鉴定其靶标的已知除草化学品，来确定它们是否抑制4788。这种体外试验也可作为更普通的筛选方法用来鉴定可抑制这种酶活性，因此是新型除草剂候选物的化学品。另外，重组产生的4788蛋白也可用于阐明这些分子的复杂结构，并进一步表征其与已知抑制剂的结合，以合理地设计新的抑制性除草剂及除草剂耐受形式的酶。在此处例举的试验中能使用包括微生物来源在内的任何来源的基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列和基本类似于SEQ ID NO:3的蛋白质。希望地，这些核苷酸序列和蛋白质来源于植物。更希望地，其来源于双子叶植物。另外，这些核苷酸序列和蛋白质也可来自非玉米来源，另外可来自非单子叶植物来源。通透酶活性的测定

4788基因产物据认为起通透酶的作用，更具体而言起类似于玉米Lpe1蛋白的尿嘧啶通透酶的作用(Schultes等人(1996)植物细胞8:463-475)。玉米的叶通透酶1基因产物类似于细菌和真菌的嘌呤和嘧啶通透酶，并已知lpe1中的突变不利地影响叶绿体发育。因此，lpe1编码的蛋白质是一种可能的除草剂靶标，在此拟南芥4788基因产物的重要性进一步证明了这一点。根据植物蛋白质在缺乏相应活性的细菌宿主中的表达能发展一种新型试验(Andersen等人(1995)细菌学杂志177:2008-2013)。

能发展一种简单的试验来筛选可影响植物编码活性正常作用的化合物。这些化合物有希望在体外检测体内除草活性。一种试验包括在最低抑制浓度的5-氟尿嘧啶存在下在基本培养基中培养携带并功能表达4788基因的大肠杆菌uraA。这以96孔板的形式实现，以进行自动高通量筛选。在阻断4788蛋白功能方面有效的化合物能抑制细胞摄取5-FU的能力，和细菌生长结果。这种生长用简单的浊度测定法测定。

已经描述了基于植物基因在相应细菌突变体中表达的其他试验。但是，除了是一种新型除草剂靶标之外，该试验的一个特别的优点是，由于尿嘧啶通透酶在细胞表面表达，所以在抑制其功能方面有效的化合物不需要进入细胞来显示其活性。这可能是利用细菌系统作为模型发现在植物中有效的化合物中存在的一个主要问题，因为已知由于细菌对化合物的不良摄取，多种有效除草剂缺乏对细菌的活性。体外抑制物试验：可与未知功能的蛋白质相互作用的小分子配体的发现

在已确定一种蛋白质为可能的除草剂靶标后，下一步是进行一种可筛选大量化学品的试验，来确定哪一种可与该蛋白质相互作用。尽管开发对已知功能的蛋白质的试验是直接的，但用未知功能的蛋白质开发试验更加困难。测该蛋白质与配体间相互作用的新技术。列出了三种方法的简述，包括荧光相关光谱学、表面增强激光解吸/电离和biacore技术。现在发现了更多这样的方法，根据本公开内容其中某些可用于自动化大规模筛选。

荧光相关光谱学(FCS)理论形成于1972年，但只是最近几年FCS技术才成为可用的(Madge等人(1972)物理综述信件(Phys.Rev.Lett.)29:705-708；Maiti等人(1997)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94:11753-11757)。FCS测定小样品体积中荧光分子的平均扩散率。样本容量能低至10³个荧光分子，样品体积可低至单个细菌的细胞质。扩散率是分子量的函数，随分子量的增加而降低。因此FCS能通过测定分子量的改变，从而测定结合后分子扩散率的改变，用于蛋白质-配体相互作用分析。

表面增强激光解吸/电离(SELDI)由Hutchens和Yip在二十世纪八十年代后期发明(Hutchens和Yip(1993)质谱快讯(Rapid Commun.Mass Spectrom.)7:576-580)。当与飞行时间质谱仪(TOF)连接时，SELDI提供一种快速分析芯片上保留的分子的方法。它能通过共价结合芯片上的靶蛋白，并通过MS分析该蛋白质截留的小分子用于配体-蛋白质相互作用分析(Worrall等人(1998)分析生物化学(Anal.Biochem.)70:750-756)。

Biacore基于在配体与表面层上固定的蛋白质结合后该层表面折射率的变化。在该系统中，向带有固定化蛋白质的2-5μl小室中连续注射许多小配体。用表面胞质基团共振(SPR)通过记录从表面折射的激光检测其结合。通常，随表面层物质浓度特定改变的折射率改变实际上对于所有蛋白质和肽来说均相同，这使得一种方法适用于任何蛋白质(Liedberg等人(1983)传感器与调节器(Sensors Actuators)4:299-304；Malmquist(1993)自然，361:186-187)。Ⅳ．体内抑制试验

在一个实施方案中，以不同浓度对植物施用例如经体外筛选鉴定的可疑除草剂。优选地向植物喷洒这种可疑除草剂。施用可疑除草剂之后，记录其对植物的影响，例如死亡或生长的抑制。

在另一个实施方案中，对于4788活性抑制剂的一种体内筛选试验使用能过量表达具有4788活性的核苷酸序列的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，其中4788基因产物在该转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞中有酶活性。该核苷酸序列优选地来源于真核生物，如酵母，但优选地来源于植物。在一个更优选的实施方案中，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列相同或基本类似，或编码一种具有4788活性的蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同或基本类似。在另一个优选的实施方案中，该核苷酸序列来源于原核生物，优选地细菌，如大肠杆菌的uraA基因。

然后对转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，并对等基因的非转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞施用一种化学品，在施用化学品并对比后测定转基因的和非转化的植物、植物组织、植物种子或植物细胞的生长或生存力。选择能抑制非转基因植物生长，但不影响转基因植物生长的化合物作为4788活性的特异抑制剂。Ⅴ．除草剂耐受性植物

本发明还涉及耐受可抑制这些植物中天然存在的4788活性的除草剂的植物、植物组织、植物种子和植物细胞，其中此耐受性由改变的4788活性赋予。通过对植物提供另外的野生型4788基因以提高野生型除草剂敏感4788的表达，通过在植物中表达修饰的除草剂耐受性4788基因，或通过这些技术的组合，可赋予根据本发明的植物改变的4788活性。代表性植物包括为了正常预期目的对其施用这些除草剂的任何植物。优选农业上重要的作物，如棉花、大豆、油籽油菜、甜菜、玉米、稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、谷子、草皮、草料、草坪草等。A．增强的野生型4788表达

通过增强表达实现改变的4788活性，在植物细胞中产生足以克服除草剂引起的生长抑制的水平的4788。所表达的酶的水平通常至少2倍于，优选地至少5倍于，更优选地至少10倍于天然表达的量。增强的表达可能是由于植物细胞中的多拷贝的野生型4788基因、基因中编码序列的成倍发生(即基因扩增)或内源基因的非编码调节序列中的突变。具有这种改变的基因活性的植物能用本领域周知的方法通过直接植物筛选而获得(见，例如美国专利号5,162,602和美国专利号4,761,373和此处引用的参考文献)。这些植物也可通过本领域周知的遗传工程技术获得。除草剂敏感4788基因的增强表达也能通过用重组或嵌合DNA分子转化植物细胞实现，该DNA分子包含一种能引导有关结构基因在植物细胞中表达的启动子，该启动子与编码4788蛋白的同源或异源结构基因有效连接。优选地，这种转化是稳定的，从而提供可遗传的转基因性状。B．改变的除草剂耐性4788蛋白的表达

根据该实施方案，用一种重组DNA分子稳定转化植物、植物组织、植物种子或植物细胞，该DNA分子包含一种与编码除草剂耐受形式的4788的编码序列有效连接的在植物中有功能的适当启动子。除草剂耐受形式的酶至少具有一种氨基酸置换、添加或缺失，其提供对可抑制未改变的、天然存在形式的酶的除草剂的耐受性。然后用常规筛选技术筛选这样产生的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，由此分离、表征并培育除草剂耐性系。以下描述了获得编码除草剂耐受形式的4788的基因的方法：

一种普通的策略包括对微生物的直接或间接诱变方法。例如，可用诱变剂如紫外线或甲磺酸乙酯或甲酯体内随机诱变可遗传操作的微生物如大肠杆菌或酿酒酵母(S.cerevisiae)。例如，Miller，《分子遗传学实验》，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1972)；Davis等人，《高级细菌遗传学》，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1980)；Sherman等人，《酵母遗传学方法》，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1983)；和美国专利号4,975,374中描述了诱变方法。为诱变所选择的微生物含有一种正常的、抑制剂敏感的4788基因，并依赖于该基因所提供的活性。突变细胞在可抑制未改变基因的浓度的抑制剂存在下生长。选择在抑制剂存在下生长好于未诱变微生物(即显示对该抑制剂的抗性)的诱变微生物菌落进一步分析。通过克隆或PCR扩增分离来源于这些菌落的4788基因，并阐明其序列。然后将编码改变的基因产物的序列克隆回微生物中以证实其提供抑制剂耐受性的能力。

一种获得植物4788基因的突变除草剂耐性等位基因的方法包括直接植物筛选。例如，通过将用公认方法灭菌的种子接种于含有渐增浓度的抑制剂的简单基本盐培养基平板上，测定诱变4788基因对植物如拟南芥、大豆或玉米生长抑制的作用。抑制剂浓度为百万分之0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、110、300、1000和3000(ppm)。对随后的实验使用能重复检测到明显生长抑制的最低剂量。最低剂量的确定在本领域中为常规。

用植物材料的诱变提高抗性等位基因在所选群体中出现的频率。诱变的种子物质来自多种来源，包括种子的化学或物理诱变，或花粉的化学或物理诱变(Neuffer，《用于生物学研究的玉米》，Sheridan编，Univ.Press,Grand Forks,ND.,61-64页(1982))，然后用其使植物受精，并收集产生的M1突变种子。对于拟南芥，一般将M₂种子(Lehle Seeds,Tucson,AZ)-由用化学品如甲磺酸乙酯或用物理因素如γ射线或快中子诱变的种子长成的植物的子代种子-以可达10000个种子/平板(10cm直径)的密度接种于含有适当浓度抑制剂的基本盐培养基上，以根据耐受性选择。将在接种7-21天后仍持续生长并保持绿色的幼苗移植到土壤中，生长成熟，并结种。检测这些种子的后代对除草剂的耐受性。如果耐受性状是显性的，则种子抗性∶敏感性以3∶1分离的植物被认为在M₂代时对于抗性而言是杂合的。而认为全部产生抗性种子的植物在M₂代时对于抗性而言是纯合的。对完整种子的这种诱变和对其M₂代种子的筛选也能对其他物种如大豆进行(见，例如美国专利号5,084,082)。另外，通过用化学或物理方法诱变的花粉授精，获得对除草剂耐受性筛选的突变种子。

如以下举例说明的确定了除草剂耐受性的遗传学基础是4788基因。首先，使用基于SEQ ID NO:2所示拟南芥cDNA编码序列的引物，或更优选地，使用基于用于产生耐受等位基因的植物的未改变4788基因序列的引物，经PCR从显示对抑制剂的抗性的植物中分离4788基因的等位基因。对该等位基因测序确定编码序列中存在突变后，检测等位基因对已转化推断的提供耐受性等位基因的植物赋予抑制剂耐受性的能力。这些植物可以是拟南芥属植物或其生长对4788抑制剂敏感的其他任何植物。其次，插入的4788基因对已知限制片段长度多态性(RFLP)(见，例如，Chang等人，美国国家科学院院刊85:6856-6860(1988)；Nam等人，植物细胞1:699-705(1989))、酶切扩增多态序列(CAPS)(Konieczny和Ausubel(1993)植物杂志，4(2):403-410)或SSLP(Bell和Ecker(1994)基因组学(Genomics)19:137-144)作图。用相同的标记对4788抑制剂耐受性状独立作图。当耐受性是由于4788基因的突变时，将耐受性状对不能与4788基因位点区分的位点作图。

另一种获得4788基因的除草剂耐性等位基因的方法是通过植物细胞培养物的筛选。目的植物的植物组织的外植体，例如胚、叶盘等，或活跃生长的愈伤组织或悬浮培养物在渐增浓度的抑制性除草剂(或适用于实验室环境的类似抑制剂)存在下在培养基上生长。记录不同培养物中不同程度的生长。在某些培养物中，出现快速生长的变体菌落，其甚至在正常抑制浓度的抑制剂存在下仍持续生长。在组织或细胞接触抑制剂之前，用化学或物理诱变剂处理能提高发生这种较快生长变体的频率。如前段所述分离并检测4788基因的推断的耐受性提供等位基因。然后可为了最佳表达改造这些确定可提供除草剂耐受性的等位基因，并转化植物。另外，能由含有这些等位基因的组织或细胞培养物再生为植物。

再另一种方法包括野生型、除草剂敏感的植物4788基因在细菌或酵母中的诱变，随后在含有抑制浓度的抑制剂的培养基上培养该微生物，然后选择那些在该抑制剂存在下生长的菌落。更具体而言，将植物cDNA(如编码4788的拟南芥cDNA)克隆到一种本来缺乏所选基因活性的微生物中。然后用本领域周知的几种化学或酶学方法中的任一种，例如亚硫酸氢钠(Shortle等人，酶学方法(Methods Enzymol.)100:457-468(1983))、甲氧胺(Kadonaga等人，核酸研究13:1733-1745(1985))、寡核苷酸指导的饱和诱变(Hutchinson等人，美国国家科学院院刊83:710-714(1986))或多种聚合酶错掺策略(见，例如，Shortle等人，美国国家科学院院刊，79:1588-1592(1982)；Shiraishi等人，基因64:313-319(1988)；和Leung等人，技术(Technique)1:11-15(1989))，体内诱变或体外诱变转化的微生物。挑取在正常抑制浓度的抑制剂存在下生长的菌落，并通过重复划线纯化。纯化其质粒，并通过再转化缺乏4788基因活性的微生物检测其提供对该抑制剂耐受性的能力。然后测定通过该测试的质粒的cDNA插入片段的DNA序列。

用包括体外重组的方法，也称为DNA改组，也可获得除草剂抗性4788蛋白。通过DNA改组向4788基因中引入突变，优选地随机突变。DNA改组也导致4788基因内序列的重组和重排，或两种或多种不同4788基因之间序列的重组和交换。这些方法可产生上百万个突变的4788基因。根据希望的性质，例如提高的除草剂耐受性并根据提供对不同种类化学抑制剂的广谱耐受性的突变，筛选突变基因或改组基因。这种筛选为本领域技术人员所熟知。

在一个优选的实施方案中，由至少一种模板4788基因形成突变的4788基因，其中该模板4788基因被切割为希望大小的双链随机片段，该方法包括下列步骤：向产生的双链随机片段群中加入一种或多种单链或双链寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含与双链随机片段的一个同源区和一个异源区；变性得到的双链随机片段的混合物与单链片段中寡核苷酸；将得到的单链片段群与聚合酶在可导致该单链片段在同源区退火形成退火片段对的条件下温育，对片段对的一员来说该同源区足以引发另一个的复制，从而形成突变的双链多核苷酸；再重复第二步和第三步至少两个循环，其中再一循环第二步产生的混合物包含前一循环第三步的突变双链多核苷酸，而再一循环形成另一种突变的双链多核苷酸，其中该诱变核苷酸是一种对可抑制天然存在的4788活性的除草剂有提高的耐受性的突变4788基因。在一个优选的实施方案中，双链随机片段群中一种双链随机片段的浓度低于总DNA重量的1％。在一个更优选的实施方案中，模板双链多核苷酸至少包含约100种多核苷酸。在一个更优选的实施方案中，双链随机片段的大小约为5bp～5kb。在另一个优选实施方案中，该方法的第四步包括重复第二步与第三步至少10个循环。例如，Stemmer等人(1994)自然370:389-391、美国专利5,605,793和Crameri等人(1998)自然391:288-291、Cherry等人(1999)自然生物技术17:379-384及WO 97/200078描述了该方法，这些参考文献在此引用作为参考。

在另一个优选实施方案中，如Zhao等人(1998)自然生物技术16:258-261所述，通过交错延伸法(StEP)体外诱变两种或多种不同4788基因的任意组合。这两种或多种4788基因用作PCR扩增的模板，PCR反应的延伸循环优选地在比聚合酶最适聚合温度更低的温度下进行。例如，当使用最适温度约为72℃的热稳定聚合酶时，延伸反应的温度希望地低于72℃，更希望地低于65℃，优选地低于60℃，更优选地延伸反应的温度为55℃。另外，PCR循环延伸反应的持续时间希望地短于本领域通常进行的持续时间，更希望地少于30秒，优选地少于15秒，更优选地延伸反应的持续时间为5秒。在每一延伸反应中只有短DNA片段聚合，这使得在每一循环的变性和退火后起始DNA分子之间延伸产物模板转变，从而产生延伸产物的多样性。PCR反应的最佳循环数取决于待诱变的4788编码区的长度，但希望地超过40个循环，更希望地超过60个循环，优选地超过80个循环。4788基因每一组合的最佳延伸条件和最佳PCR循环数如述用本领域众所周知的方法确定。PCR反应的其他参数与本领域常用的基本相同。扩增反应的引物优选地设计为与位于4788基因编码序列外侧的DNA序列退火，如与包含4788基因的载体的DNA序列退火，因此PCR反应中使用的不同4788基因优选地包含于分开的载体中。引物希望地与距4788编码序列不到500bp处，优选地距4788编码序列不到200bp处，更优选地距4788编码序列不到120bp处的序列退火。优选地，4788编码序列由限制酶切位点包围，这些位点包含于在PCR反应中扩增的DNA序列中，从而便于扩增产物向适当载体中的克隆。

在另一个优选实施方案中，如WO 98/05765所述产生具有粘端的4788基因片段。粘端的产生方法是，将对应于4788基因一部分的第一种寡核苷酸与第二种寡核苷酸连接，此第二种寡核苷酸在基因中不存在，或对应于不与对应于第一种寡核苷酸的基因部分邻接的基因部分，其至少含有一种核糖核苷酸。用第一种寡核苷酸作为模板并用第二种寡核苷酸作为引物产生双链DNA。酶切并去除核糖核苷酸。也去除位于该核糖核苷酸5’的核苷酸，产生具有粘端的双链片段。经连接随机重装配这些片段，获得基因序列的新组合。

用包括靶基因原位修饰的方法也可获得除草剂抗性蛋白质。能使用一种体内导向并突变基因的技术，其基于自体互补的嵌合寡核苷酸。该方法是为了以位点特异方式和可遗传方式修饰内源基因而发展的(Beetham等人(1999)美国国家科学院院刊96:8774-8778；美国专利号5,756,325；美国专利号5,871,984；美国专利号5,731,181)，这些参考文献在此引用作为参考。另外也描述了产生表现农业希望的性状，在植物细胞中含有原位突变或修饰基因的植物的方法(WO 98/54330)，该参考文献在此引用作为参考。这种修饰能通过定向诱变技术如同源重组进行，并根据产生的除草剂抗性表型筛选(见，例如，Pazkowski等人，EMBO J.7:4021-4026(1988)和美国专利号5,487,992，特别是18-19栏和实施例8)，这些参考文献在此引用作为参考。

在本发明中使用任何4788基因或4788基因的任意组合进行体外重组，例如，来源于植物如拟南芥的4788基因，例如，SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示的4788基因，来源于细菌如热溶芽孢杆菌(Bacilluscaldolyticus)(Ghim和Neuhard(1994)细菌学杂志176:3698-3707)或大肠杆菌(Andersen等人(1995)细菌学杂志177:2008-2013)的4788基因，来源于玉蜀黍(Zea mays)的4788基因(Schultes等人(1996)植物细胞8:463-475)，所有文献均在此引用作为参考。在本发明中使用完整的4788基因或其部分。将用上述方法获得的突变4788基因的文库克隆到适当表达载体中，用得到的载体转化适当的宿主，例如藻类如衣藻(Chlamydomonas)、酵母或细菌。适当的宿主优选地是一种本来缺乏4788活性的宿主，例如大肠杆菌uraA突变体(Andersen等人(1995)细菌学杂志177:2008-2013)。在含有抑制浓度的抑制剂的培养基上培养用含突变4788基因文库的载体转化的宿主细胞，选择在该抑制剂存在下生长的菌落。挑取在正常抑制浓度的抑制剂存在下生长的菌落，经重复划线纯化。纯化其质粒，然后测定通过该检测的质粒的cDNA插入片段的DNA序列。

一种鉴定耐受抑制剂的修饰4788基因的试验能以与鉴定4788活性抑制剂的试验(抑制试验，见上)相同的方式进行，其中有如下改变：第一，在反应混合物之一中用突变4788替换抑制试验的野生型4788。第二，在两种反应混合物中均存在野生型酶的抑制剂。第三，比较突变活性(在抑制剂和突变酶存在下的活性)与未突变活性(在抑制剂和野生型酶存在下的活性)，以确定与未突变活性相比在突变活性中是否观察到酶活性的明显提高。在适当底物和抑制剂的存在下，突变活性是突变酶活性的量度。在适当底物和抑制剂的存在下，未突变活性是野生型酶活性的量度。明显提高可解释为在测定技术中高于固有误差限度的酶活性的提高，优选地是在抑制剂存在下比野生型酶活性高至少2倍或更多倍的提高，更优选地是至少5倍或更多倍的提高，最优选地是至少10倍或更多倍的提高。

除了用来产生除草剂耐受性植物外，编码除草剂耐受性4788的基因也能在植物细胞转化方法中用作选择性标记。例如，用一种转基因转化的植物、植物组织、植物种子或植物细胞也能用编码一种能由植物表达的改变的4788的基因转化。将转化细胞转移到含有一种酶抑制剂的培养基中，该抑制剂的量足以抑制不表达该修饰基因的植物细胞的存活，其中只有转化细胞能够存活。该方法适用于能用修饰4788编码基因转化的任何植物细胞，并能与任何目的转基因一同使用。转基因和修饰基因的表达能由在植物细胞中有功能的同一启动子引导，或由不同的启动子引导。Ⅵ．植物转化技术

利用常规重组DNA技术能将野生型或除草剂耐受形式的4788基因掺入植物或细菌细胞中。通常包括，利用本领域周知的标准克隆方法将编码4788的DNA分子插入一种该DNA分子与之异源(即，正常不存在)的表达系统中。该载体含有插入的蛋白质编码序列在含有该载体的宿主细胞中转录和翻译所必需的元件。能使用本领域所知的多种载体系统，如质粒、噬菌体、病毒及其他修饰病毒。也可修饰表达系统的成分以增强表达。例如，可使用截短序列、核苷酸置换或其他修饰。本领域所知的表达系统可用来在适当条件下实际转化任何作物植物细胞。包含野生型或除草剂耐受形式的4788基因的转基因优选地稳定转化并整合于宿主细胞基因组中。在另一个优选实施方案中，包含野生型或除草剂耐受形式的4788基因的转基因位于一种自主复制载体中。自主复制载体的实例是病毒，特别是双生病毒。转化细胞能再生为整个植物，使得所选形式的4788基因在转基因植物中提供除草剂耐受性。A．构建植物表达盒的要求

首先将准备在转基因植物中表达的基因序列装配于表达盒中可在植物内表达的适当启动子之后。这些表达盒也可包含转基因表达所需或为其选择的其他任何序列。这些序列包括但不限于，转录终止子、增强表达的外部序列如内含子、关键序列，和用于将基因产物导向特定细胞器和细胞区室的序列。然后可将这些表达盒容易地转移至以下所述的植物转化载体中。下面是典型表达盒的不同成分的描述。1．启动子

在表达盒中使用的启动子的选择将决定转基因在转基因植物中的空间和时间表达模式。选择的启动子将在特定细胞型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达转基因，此选择将反映希望的基因产物积累的位置。另外，所选的启动子可在不同诱导条件下引导基因表达。启动子在其强度即促进转录的能力方面不同。根据所用的宿主细胞系统，能使用本领域所知的大量适当启动子中的任一种。例如，组成型表达可使用CaMV 35S启动子、稻肌动蛋白启动子或遍在蛋白启动子。调节型表达可使用来源于烟草或拟南芥的化学诱导型PR-1启动子(见，例如，美国专利号5,689,044)。2．转录终止子

多种转录终止子适于在表达盒中使用。它们负责转基因之外的转录终止及其正确的聚腺苷酸化。适当的转录终止子是那些已知在植物中起作用的转录终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶及双子叶植物。3．增强或调节表达的序列

已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与本发明的基因结合使用而增强其在转基因植物中的表达。例如，多种内含子序列如玉米Adh1基因的内含子，显示能增强表达，尤其是在单子叶植物细胞中。另外，已知来源于病毒的多种非翻译前导序列也能增强表达，且其在双子叶植物细胞中特别有效。4．编码序列优化

为了在目的作物种中最佳表达，可通过改变编码序列来遗传改造所选基因的编码序列。修饰编码序列以实现在特定作物种中最佳表达的方法众所周知(见，例如，Perlak等人，美国国家科学院院报88:3324(1991)；和Koziel等人，生物技术(Bio/technol.)11:194(1993))。5．细胞内基因产物的导向

已知植物中存在多种导向基因产物的机制，并且较详细地表征了控制这些机制作用的序列。例如，基因产物向叶绿体的导向受在多种蛋白质氨基端发现的信号序列控制，该信号序列在叶绿体输出过程中被切下，产生成熟蛋白质(例如，Comai等人，生物化学杂志263:15104-15109(1988))。其他基因产物位于其他细胞器如线粒体和过氧化物酶体中(例如，Unger等人，植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)13:411-418(1989))。也可操作编码这些产物的cDNA，以实现异源基因产物向这些细胞器的导向。另外，已表征了使基因产物导向其他细胞区室的序列。氨基端序列负责向ER、质外体的导向，和由糊粉细胞的胞外分泌(Koehler和Ho，植物细胞2:769-783(1990))。另外，氨基端序列与羧基端序列一起负责基因产物的液泡导向(Shinshi等人，植物分子生物学14:357-368(1990))。通过将上述适当的导向序列与目的转基因序列融合，能将转基因产物引导至任何细胞器或细胞区室中。B．植物转化载体的构建

可用于植物转化的多种转化载体为植物转化领域的技术人员所公知，与本发明有关的基因可与任何这些载体结合使用。载体的选择取决于优选的转化技术和用于转化的靶物种。对于某些靶物种，可优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。转化中常规使用的选择性标记包括赋予卡那霉素及相关抗生素抗性的nptⅡ基因(Messing和Vierra，基因19:259-268(1982)；Benvan等人，自然304:184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究18:1062(1990)，Spencer等人，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)79:625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学4:2929-2931)、赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7):1099-1104(1983))和赋予草甘膦抗性的EPSPS基因(美国专利号4,940,935和5,188,642)。

1．适用于农杆菌(Agrobacterium)转化的载体

许多载体可用于应用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化。它们一般携带至少一种T-DNA边界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ的载体。适用于农杆菌转化的典型载体包括二元载体pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB10及其潮霉素选择衍生物。(见，例如，美国专利号5,639,949)。

2．适用于非农杆菌转化的载体

不使用根瘤农杆菌的转化避免了对所选转化载体中T-DNA序列的需要，所以除上述包含T-DNA序列的载体外，也可使用缺少这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择主要取决于待转化的物种的优选。适用于非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35(见，例如，美国专利号5,639,949)。C．转化技术

待目的编码序列被克隆到表达系统中后，即转化植物细胞。植物转化和再生的方法在本领域中众所周知。例如，Ti质粒载体已用于外源DNA的递送，以及直接DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射和微粒轰击。另外，也能用农杆菌属的细菌转化植物细胞。

双子叶植物的转化技术在本领域中众所周知，包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括原生质体或细胞对外源遗传物质的直接摄取。这可通过PEG或电穿孔介导的摄取、粒子轰击介导的送递或显微注射来实现。在所有情况中，都用本领域公知的标准技术使被转化的细胞再生为整个植物。大多数单子叶植物种的转化现也已成为常规。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术向原生质体中直接转移基因，对愈伤组织的粒子轰击，及农杆菌介导的转化。Ⅶ．培育

本发明的野生型或改变形式的4788基因能用于对包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物细胞在内的多种植物细胞提供除草剂耐受性。尽管该基因能插入属于这些种类的任何植物细胞中，但其在如下作物植物细胞中特别有用，如稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、洋白菜、花椰菜、硬花球花椰菜、萝卜、红萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜(squash)、南瓜(pumpkin)、夏季南瓜、黄瓜、苹果、梨、温柏、甜瓜、李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。野生型4788基因的高水平表达和/或在植物中提供除草剂耐受性的除草剂耐受形式的4788基因的表达，与对产量和质量至关重要的其他特征一起，能通过本领域周知的培育方法和技术引入植物系中。

通过在作物植物或能再生为作物植物的植物细胞培养物中直接选择获得除草剂耐受性4788等位基因，利用传统培育技术将其转移到商业品种中，产生除草剂耐性作物，而不需要遗传改造该等位基因和用其转化植物。

将参照下列详细实施例进一步描述本发明。这些实施例只是为了说明，除非另外指明而不意在限制。

实施例

此处使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中众所周知，由Sambrook等人，《分子克隆》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)和T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist，《基因融合实验》，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)和Ausubel,F.M.等人，《现代分子生物学方法》，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)，Reiter等人，《拟南芥研究方法》，World Scientific Press(1992)，和Schultz等人，《植物分子生物学指南》，Kluwer Academic Publishers(1998)描述。这些参考文献叙述了从T-DNA诱变的拟南芥群体中标记和克隆基因的所有步骤的标准技术：植物感染与转化、幼苗突变体的筛选和鉴定、共分离分析和质粒拯救。实施例1：标记幼苗-来源于T-DNA诱变的拟南芥界群体的致死系#4788-的序列分析

用质粒拯救技术分子克隆侧翼为由T-DNA诱变产生的T-DNA插入片段一端或两端的拟南芥基因组DNA。经限制酶消化分析这样获得的质粒，以根据其消化模型将这些质粒归类。对每一种类的质粒克隆均测定DNA序列。分析所得序列中非T-DNA载体序列的存在。用slp346引物测序按质粒拯救方法回收的质粒。引物slp346提供关于紧邻左T-DNA边界的侧翼序列的信息。经4788突变杂合子的基因组DNA的PCR证实质粒拯救。该PCR实验使用一条锚定于预测的侧翼序列中的引物和slp346引物(锚定于T-DNA插入片段中)。根据质粒拯救的克隆的序列发现预期大小的PCR产物证实了有效的拯救。

在对核苷酸序列数据库的NCBI WWW blastn搜索中使用从上述克隆中获得的序列(Altschul等人(1990)分子生物学杂志215:403-410；Altschul等人(1997)核酸研究25:3389-3402)。搜索结果表明，回收的序列与拟南芥染色体Ⅱ BAC T9J22(Genbank Acc.AC002505(2739376))的基因组DNA相同。发生插入事件的基因组DNA区域注释为编码一种推定的通透酶(保藏#2739376)。然后针对预测mRNA的5’和3’端设计引物，用来源于拟南芥cDNA文库的DNA作为模板进行PCR。TA连接并克隆(Original TA Cloning试剂盒，Invitrogen)产生的PCR产物，测序。该cDNA序列与Genbank注释中预测的序列相同，从而第一次证实了假定的开放阅读框注释。实施例2：重组4788蛋白在大肠杆菌中的表达

将对应于该cDNA克隆的推定成熟蛋白的编码区亚克隆到前述表达载体中，并使用厂商的条件转化大肠杆菌。具体实例包括质粒如pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA)、pFLAG(InternationalBiotechnologies,Inc.,New Haven,CT)和pTrcHis(Invitrogen,La Jolla,CA)。实施例3：通过DNA改组对4788基因的体外重组

PCR扩增编码4788蛋白的拟南芥4788基因。基本如述(Stemmer等人(1994)美国国家科学院院刊91:10747-10751)经DNaseI处理消化产生的DNA片段，并从反应混合物中去除PCR引物。不用引物进行PCR反应，随后用引物进行PCR反应，均如述进行(Stemmer等人(1994)美国国家科学院院刊91:10747-10751)。将产生的DNA片段克隆到pTRC99a(Pharmacia，目录号：27-5007-01)中，并用Biorad基因脉冲发生器和厂商条件经电穿孔转化大肠杆菌uraA株(Andersen等人(1995)细菌学杂志177(8):2008-2013)。被转化的细菌在含有抑制浓度的抑制剂的培养基上生长，选择那些在抑制剂存在下生长的菌落。挑取在正常抑制浓度的抑制剂存在下生长的菌落，经重复划线纯化。纯化其质粒，然后测定通过该检测的质粒的cDNA插入片段的DNA序列。在相似的反应中，体外重组包含编码该蛋白质的拟南芥4788基因的PCR扩增DNA片段和包含大肠杆菌uraA基因的PCR扩增DNA片段，如上所述回收得到的对抑制剂有提高的耐受性的变体。实施例4：通过交错延伸法对4788基因的体外重组

将编码4788蛋白的拟南芥4788基因和大肠杆菌uraA基因均克隆到pBluescript载体的多接头中。基本如述(Zhao等人(1998)自然生物技术16:258-261)用“反向引物”和“M13-20引物”(Stratagene目录)进行PCR反应。用适当的限制酶消化扩增的PCR片段，将其克隆到pTRC99a中，如实施例3所述筛选突变的4788基因。实施例5：体外结合试验

例如，根据实施例2获得重组4788蛋白。将该蛋白质固定于适于配体结合试验的芯片上。根据本领域众所周知的方法使该芯片上固定的蛋白质接触溶液中的样品化合物。在样品化合物接触固定的蛋白质时，进行能检测蛋白质-配体相互作用的测定。这些测定的实例是如上所述的SELDI、biacore和FCS。以这种方式易于发现可结合该蛋白质的化合物，并例如根据以下的实施例6进一步表征。实施例6：尿嘧啶通透酶活性的测定

发展了一种简单的试验来筛选可影响4788活性正常作用的化合物。这些化合物有希望在体外检测体内除草活性。该试验包括在最低抑制浓度的5-氟尿嘧啶存在下在基本培养基中培养携带并功能表达4788基因的大肠杆菌uraA。这以96孔板形式实现，以进行自动高通量筛选。在阻断4788蛋白功能方面有效的化合物能抑制细胞摄取5-FU的能力，和细菌生长结果。这种生长用简单的浊度测定法测定。更具体而言，本发明涉及一种鉴定通透酶活性抑制剂的方法，其包括：

b)将含有该核苷酸序列的宿主细胞与最低抑制浓度的5-氟尿嘧啶，和一种待测定其抑制该通透酶活性的能力的化合物，在有利于这种抑制的条件下相结合；

c)在步骤(b)的条件下测定宿主细胞的生长；和

d)选择在步骤(c)中抑制宿主细胞生长的化合物，和任选地

e)将步骤(d)中鉴定的化合物施用于一种植物，检测其除草活性，和

f)选择步骤(e)中具有除草活性的化合物。

以上公开的实施方案是说明性的。本发明的公开内容将使本领域技术人员理解本发明的许多变化。所有这些明显的和可预知的变化均包括于附加的权利要求书中。

序列表<110>Novartis AG<120>除草剂靶基因及方法<130>PB/5-30638/CGC 2031<140><141><150>Application No.09/153,278<151>1998-09-15<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>3710<212>DNA<213>拟南芥<400>1tcaaacaagt gactttttat atttatctta ttaattctgt agtctcgaga ttcgcttttt 60ctcctgctta cttcttttta tcatcttctc tttgtcggtt tgatttggaa aaactttctg 120caaaaaaaag agagattctt aaacttttta tctcaagatc ctttcaaaaa atctgaaaag 180agaagatttt taataaaaaa gaatggttga aactggtcac catcatcaac atccaccggc 240accggctgca gccggtcatc cgccggttcc atccatggcg atggcgcgta acatgggaac 300cacttggcct ccggcggagc aacttcatca tcttcaatat tgcatccact ctaacccttc 360ttggcgttag tctctctctt tctgcttata ctactttctt tatttttgtt tcagatgtaa 420aaaataaaaa ttataatctt ttcagtcaaa agttgtatta gttcagttct gtctctctct 480ctctttatct gctttatgtt gtgtcttaat ttgtttacca aaagattagt ttagatctca 540gtatctgatt cgattcttta tatttttcct ctgtgttgac tatattttag cttgtgttgg 600ggactaatta gctttaaatc taatgataaa tgttgtataa ttgttcttga gacacactaa 660ttgattaaga ttaaaataaa ctgtttcgtt attacttgtt tatgtagttg gtgaatccaa 720aatgctataa gaattgaatc cttagcagtt aaaagtgtgg ggttgggttt atgctaacac 780tggtcatgga aaatgaaatg caattagtgt tttaccatta caagaaatgc catttttaag 840ggattttgta acaaaaggat tgtattattg tttcctttta agaattgatt tgtctcattt 900ccattaacaa tgaatcattt tacagatgag acggttgtac tggctttcca gcattacatc 960gttatgctcg ggactactgt tttgattgcc aacacactag tgtcaccaat gggtggagat 1020cctgtatgtg atgtttttgg tttttggatc cggttgtcta atatttatgt tattatatga 1080ttctgaaatc gaccgtttgg tattttgaac gataataggg tgataaagcg cgggttatcc 1140agactatatt gtttatgtcg ggcataaaca cgttgctaca aacgcttatc gggacaaggc 1200ttcccacggt tatgggagta tcgttcgcgt atgttcttcc cgtattgtct ataatcagag 1260attacaacaa tggtcaattc gattccgaga aacaggttaa agctcgtttt atacttgcgc 1320ggtacggttg ctatatatat attttttttt ttacttgaca aatgccattt tccttgtaga 1380gattccgaca tactatgaga acggtacaag gatcattaat catttcttca ttcgtcaaca 1440tcataatcgg atatggtcag gcatggggga acttaataag gtaatataaa agatcaatat 1500ataacattac tagtttagaa gctgatggaa gttttaacat ttaatgatta tggtttcttt 1560aatgcagaat ctttagtccc atcattgttg tgcccgttgt ttctgttgtg agccttggcc 1620tattccttag aggcttccca ctggtaacaa tttcaactaa agtattcagc tttaacaaat 1680tttaactcct tcactaagtc attatgtgat ctcttcggat tttaacagct tgcaaactgt 1740gtggaaatcg gtctaccaat gctgattctg ttgatcatca cacagcaagt cgggcttttt 1800attattttcc gcgctatata tggtggtgat tgtttagata tgtaatatta aatcttgcta 1860ctgttcatct tgcagtatct taaacatgca ttctcaagga tttctatgat tcttgaaaga 1920tatgctttac ttgtttgcct ggctatcata tgggcttttg ctgctatcct tactgtttct 1980ggtgcttata ataatgtttc taccgcaaca aaacaaagtt gtcgaactga tcgtgccttt 2040cttatgtcat cagctccctg gtaggttgat tactatttga cttgattctt cttttcttct 2100aaggtctaaa tatctttata ctcagtcact caaactcatc tttcaggatt agaatcccat 2160atccattcca gtgggggact ccgatattca aagcgagtca tgtttttgga atgtttggtg 2220ctgcaattgt cgcatctgca gaggttgtta ttcatcatat tagtttctag cttatgttaa 2280atattcttca tgttacatgc tacaacttgt tcttatgtta tgtatatcct tattttcttt 2340agtctaccgg agtatttttc gctgcatcta gactagcagg agcaacagcg cctccagcac 2400atgtcgtctc tcgtagtatc ggtctacagg ttttatttcc agacactaag aaagtttttt 2460ttaatctttt cgttttctgt tctctctgct aatgttccga ataagtctat aagctgttat 2520attttccttt aagggtattg gtgtgctcct tgaaggaata tttggttcca ttactggcaa 2580taccgcgtcc gtgtaagttc taaatatctc ttgctatatg tgctactatc ctttcagaat 2640ttatacaaag aaactaggta tataattcat cttgatgata tatacaggga aaatgtcggt 2700ctccttggcc tcacacgaat agggagtaga cgagtggtgc aggtttcaac gtttttcatg 2760atatttttct ccatatttgg tttgtctttc aaccctctaa tcagtcatct tgactaagta 2820tagaaagtag ccgttcatgg gttttaaatc cgcgtgtttt caatgatctt caggaaaatt 2880tggcgcgttc tttgcgtcta ttccgcttcc aatctttgca ggcgtatact gtatactact 2940tggaatcgtt ggtgagtagc attttgtata tgaacctaca ctacctgatt tcttgtaaaa 3000gccggggctg cttatgatac ttttgttatg tgattggccc agttgctgtt ggaatatcgt 3060ttatacagtt taccgacact aattcgatga gaaacatgta cgtcattggt gtctctctct 3120tcttaagtct ttccatcgct cagtactttc ttgccaacac ttcaagagca ggatatggac 3180cagttaggac agcaggagga tgggtaagcc tttcaaagaa ccattgtttg aaacaccatt 3240ttacggtagt atagggagtg atataatatt tctactatat agtgtttctt tttcttaaat 3300gtgatgtcgc ggtgaattgt ggtgcagttc aacgatatac ttaatacgat atttgcttcg 3360gctccgttgg tggcgaccat tcttgcgacc atactagata acacgttgga agcaagacat 3420gcaagtgacg acgcaagagg aatcccgtgg tggaagccct tccagcacag gaacggagac 3480ggcaggaacg atgagttcta tagtatgccc cttagaatca acgagttaat gccgacacgg 3540ttcctttgaa gactgcccct gaacgtttct tctgtatttg gaaatgtaag atatgattat 3600gtgcatacct tgtagcttca ttggggaaaa attgagtcca gtggatacaa atgaacatag 3660gcctttgatg gaaaaagcta tttttttgca aactatataa cttgtgttac 3710<210>2<211>1674<212>DNA<213>拟南芥<220><221>CDS<222>(4)..(1659)<400>2aga atg gtt gaa act ggt cac cat cat caa cat cca ccg gca ccg gct 48

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115 120 125cct gta ttg tct ata atc aga gat tac aac aat ggt caa tcc gat tcc 432Pro Val Leu Ser Ile Ile Arg Asp Tyr Ash Asn Gly Gln Ser Asp Ser

130 135 140gag aaa cag aga ttc cga cat act atg aga acg gta caa gga tca tta 480Glu Lys Gln Arg Phe Arg His Thr Met Arg Thr Val Gln Gly Ser Leu

145 150 155atc att tct tca ttc gtc aac atc ata atc gga tat ggt cag gca tgg 528Ile Ile Ser Ser Phe Val Asn Ile Ile Ile Gly Tyr Gly Gln Ala Trp160 165 170 175ggg aac tta ata aga atc ttt agt ccc atc att gtt gtg ccc gtt gtt 576Gly Ash Leu Ile Arg Ile Phe Ser Pro Ile Ile Val Val Pro Val Val

180 185 190tct gtt gtg agc ctt ggc cta ttc ctt aga ggc ttc cca ctg ctt gca 624Ser Val Val Ser Leu Gly Leu Phe Leu Arg Gly Phe Pro Leu Leu Ala

195 200 205aac tgt gtg gaa atc ggt cta cca atg ctg att ctg ttg atc atc aca 672Asn Cys Val Glu Ile Gly Leu Pro Met Leu Ile Leu Leu Ile Ile Thr

210 215 220cag caa tat ctt aaa cat gca ttc tca agg att tct atg att ctt gaa 720Gln Gln Tyr Leu Lys His Ala Phe Ser Arg Ile Ser Met Ile Leu Glu

225 230 235aga tat gct tta ctt gtt tgc ccg gct atc ata tgg gct ttt gct gct 768Arg Tyr Ala Leu Leu Val Cys Pro Ala Ile Ile Trp Ala Phe Ala Ala240 245 250 255atc ctt act gtt tct ggt gct tat aat aat gtt tct acc gca aca aaa 816Ile Leu Thr Val Ser Gly Ala Tyr Asn Asn Val Ser Thr Ala Thr Lys

260 265 270caa agt tgt cga acg gat cgt gcc ttt ctt atg tca tca gct ccc tgg 864Gln Ser Cys Arg Thr Asp Arg Ala Phe Leu Met Ser Ser Ala Pro Trp

275 280 285att aga atc cca tat cca ttc cag tgg ggg act ccg ata ttc aaa gcg 912Ile Arg Ile Pro Tyr Pro Phe Gln Trp Gly Thr Pro Ile Phe Lys Ala

290 295 300agt cat gtt ttt gga atg ttt ggt gct gca att gtc gca tct gca gag 960Ser His Val Phe Gly Met Phe Gly Ala Ala Ile Val Ala Ser Ala Glu

305 310 315tct acc gga gta ttt ttc gct gca tct aga tta gca gga gca aca gcg 1008Ser Thr Gly Val Phe Phe Ala Ala Ser Arg Leu Ala Gly Ala Thr Ala320 325 330 335cct cca gca cat gtc gtc tct cgt agt atc ggt cta cag ggt att ggt 1056Pro Pro Ala His Val Val Ser Arg Ser Ile Gly Leu Gln Gly Ile Gly

340 345 350gtg ctc ctt gaa gga ata ttt ggt tcc att act ggc aat acc gcg tcc 1104Val Leu Leu Glu Gly Ile Phe Gly Ser Ile Thr Gly Asn Thr Ala Ser

355 360 365gtg gaa aat gtc ggt ctc ctt ggc ctc gca cga ata ggg agt aga cga 1152Val Glu Asn Val Gly Leu Leu Gly Leu Ala Arg Ile Gly Ser Arg Arg

370 375 380gtg gtg cag gtt tca acg ttt ttc atg ata ttt ttc tcc ata ttt gga 1200Val Val Gln Val Ser Thr Phe Phe Met Ile Phe Phe Ser Ile Phe Gly

385 390 395aaa ttt ggc gcg ttc ttt gcg tct att ccg ctt cca atc ttt gca ggc 1248Lys Phe Gly Ala Phe Phe Ala Ser Ile Pro Leu Pro Ile Phe Ala Gly400 405 410 415ata tac tgt ata cta ctt gga atc gtt gtt gct gtt gga ata tcg ttt 1296Ile Tyr Cys Ile Leu Leu Gly Ile Val Val Ala Val Gly Ile Ser Phe

420 425 430ata cag ttt acc gac act aat tcg atg aga aac atg tac gtc att ggt 1344Ile Gln Phe Thr Asp Thr Asn Ser Met Arg Asn Met Tyr Val Ile Gly

435 440 445gtc tct ctc ttc tta agt ctt tcc atc gct cag tac ttt ctt gcc aac 1392Val Ser Leu Phe Leu Ser Leu Ser Ile Ala Gln Tyr Phe Leu Ala Asn

450 455 460act tca aga gca gga tat gga cca gtt agg aca gca gga gga tgg ttc 1440Thr Ser Arg Ala Gly Tyr Gly Pro Val Arg Thr Ala Gly Gly Trp Phe

465 470 475aac gat ata ctt aat acg ata ttt gct tcg gct ccg ttg gtg gcg acc 1488Asn Asp Ile Leu Asn Thr Ile Phe Ala Ser Ala Pro Leu Val Ala Thr480 485 490 495att ctt gcg acc ata cta gat aac acg ttg gaa gca aga cat gca agt 1536Ile Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn Thr Leu Glu Ala Arg His Ala Ser

500 505 510gac gac gca aga gga atc ccg tgg tgg aag ccc ttc cag cac agg aac 1584Asp Asp Ala Arg Gly Ile Pro Trp Trp Lys Pro Phe Gln His Arg Asn

515 520 525gga gac ggc agg aac gat gag ttc tat agt atg ccc ctt aga atc aac 1632Gly Asp Gly Arg Asn Asp Glu Phe Tyr Ser Met Pro Leu Arg Ile Asn

530 535 540gag tta atg ccg aca cgg ttc ctt tga agactgcccc tgaac 1674Glu Leu Met Pro Thr Arg Phe Leu

545 550<210>3<211>551<212>PRT<213>拟南芥<400>3Met Val Glu Thr Gly His His His Gln His Pro Pro Ala Pro Ala Ala1 5 10 15Ala Gly His Pro Pro Val Pro Ser Met Ala Met Ala Arg Asn Met Gly

20 25 30Thr Thr Trp Pro Pro Ala Glu Gln Leu His His Leu Gln Tyr Cys Ile

35 40 45His Ser Asn Pro Ser Trp His Glu Thr Val Val Leu Ala Phe Gln His

50 55 60Tyr Ile Val Met Leu Gly Thr Thr Val Leu Ile Ala Asn Thr Leu Val65 70 75 80Ser Pro Met Gly Gly Asp Pro Gly Asp Lys Ala Arg Val Ile Gln Thr

85 90 95Ile Leu Phe Met Ser Gly Ile Asn Thr Leu Leu Gln Thr Leu Ile Gly

100 105 110Thr Arg Leu Pro Thr Val Met Gly Val Ser Phe Ala Tyr Val Leu Pro

115 120 125Val Leu Ser Ile Ile Arg Asp Tyr Asn Asn Gly Gln Ser Asp Ser Glu

130 135 140Lys Gln Arg Phe Arg His Thr Met Arg Thr Val Gln Gly Ser Leu Ile145 150 155 160Ile Ser Ser Phe Val Asn Ile Ile Ile Gly Tyr Gly Gln Ala Trp Gly

165 170 175Asn Leu Ile Arg Ile Phe Ser Pro Ile Ile Val Val Pro Val Val Ser

180 185 190Val Val Ser Leu Gly Leu Phe Leu Arg Gly Phe Pro Leu Leu Ala Asn

195 200 205Cys Val Glu Ile Gly Leu Pro Met Leu Ile Leu Leu Ile Ile Thr Gln

210 215 220Gln Tyr Leu Lys His Ala Phe Ser Arg Ile Ser Met Ile Leu Glu Arg225 230 235 240Tyr Ala Leu Leu Val Cys Pro Ala Ile Ile Trp Ala Phe Ala Ala Ile

245 250 255Leu Thr Val Ser Gly Ala Tyr Asn Asn Val Ser Thr Ala Thr Lys Gln

260 265 270Ser Cys Arg Thr Asp Arg Ala Phe Leu Met Ser Ser Ala Pro Trp Ile

275 280 285Arg Ile Pro Tyr Pro Phe Gln Trp Gly Thr Pro Ile Phe Lys Ala Ser

290 295 300His Val Phe Gly Met Phe Gly Ala Ala Ile Val Ala Ser Ala Glu Ser305 310 315 320Thr Gly Val Phe Phe Ala Ala Ser Arg Leu Ala Gly Ala Thr Ala Pro

325 330 335Pro Ala His Val Val Ser Arg Ser Ile Gly Leu Gln Gly Ile Gly Val

340 345 350Leu Leu Glu Gly Ile Phe Gly Ser Ile Thr Gly Asn Thr Ala Ser Val

355 360 365Glu Asn Val Gly Leu Leu Gly Leu Ala Arg Ile Gly Ser Arg Arg Val

370 375 380Val Gln Val Ser Thr Phe Phe Met Ile Phe Phe Ser Ile Phe Gly Lys385 390 395 400Phe Gly Ala Phe Phe Ala Ser Ile Pro Leu Pro Ile Phe Ala Gly Ile

405 410 415Tyr Cys Ile Leu Leu Gly Ile Val Val Ala Val Gly Ile Ser Phe Ile

420 425 430Gln Phe Thr Asp Thr Asn Ser Met Arg Asn Met Tyr Val Ile Gly Val

435 440 445Ser Leu Phe Leu Ser Leu Ser Ile Ala Gln Tyr Phe Leu Ala Asn Thr

450 455 460Ser Arg Ala Gly Tyr Gly Pro Val Arg Thr Ala Gly Gly Trp Phe Asn465 470 475 480Asp Ile Leu Asn Thr Ile Phe Ala Ser Ala Pro Leu Val Ala Thr Ile

485 490 495Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn Thr Leu Glu Ala Arg His Ala Ser Asp

500 505 510Asp Ala Arg Gly Ile Pro Trp Trp Lys Pro Phe Gln His Arg Asn Gly

515 520 525Asp Gly Arg Asn Asp Glu Phe Tyr Ser Met Pro Leu Arg Ile Asn Glu

530 535 540Leu Met Pro Thr Arg Phe Leu545 550<210>4<211>20<212>DNA<213>拟南芥<400>4gcggacatct acatttttga 20

Claims

1．一种基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

2．权利要求1的核苷酸序列，其中该序列编码一种基本类似于SEQID NO:3的氨基酸序列。

3．根据权利要求1的核苷酸序列，其中该核苷酸序列是一种植物核苷酸序列。

4．权利要求1的核苷酸序列，其中所述蛋白质具有通透酶活性。

5．权利要求4的核苷酸序列，其中所述蛋白质具有嘌呤或嘧啶通透酶活性。

6．一种氨基酸序列，其包含由基本类似于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

7．一种氨基酸序列，其包含基本类似于SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

8．权利要求6的氨基酸序列，其中所述蛋白质具有通透酶活性。

9．权利要求8的氨基酸序列，其中所述蛋白质具有嘌呤或嘧啶通透酶活性。

10．一种氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2编码的氨基酸序列的至少20个连续氨基酸残基。

11．一种氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的至少20个连续氨基酸残基。

12．一种嵌合基因，其包含与根据权利要求1-5任一项的核苷酸序列有效连接的启动子。

13．一种包含根据权利要求12的嵌合基因的重组载体，其中该载体能被稳定地转化到宿主细胞中。

14．一种含有根据权利要求13的载体的宿主细胞，其中所述核苷酸序列可在该细胞中表达。

15．根据权利要求14的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种真核细胞。

16．根据权利要求15的宿主细胞，其中该宿主细胞选自昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。

17．根据权利要求15的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种原核细胞。

18．一种包含权利要求16的植物细胞的植物或种子。

19．权利要求18的植物，其中该植物耐受通透酶活性抑制剂。

20．一种方法，用于制备编码具有改变的通透酶活性的基因产物的核苷酸序列，包括，

a)改组一种权利要求1的核苷酸序列，

b)表达得到的改组核苷酸序列，和

c)筛选与未改变的核苷酸序列的基因产物的通透酶活性相比改变的通透酶活性。

21．权利要求20的方法，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

22．权利要求20的方法，其中所述通透酶活性是嘌呤或嘧啶通透酶活性。

23．一种可通过权利要求20的方法获得的改组DNA分子。

24．一种通过权利要求20的方法获得的改组DNA分子，其中该改组DNA分子编码一种对通透酶活性抑制剂有增强的耐受性的基因产物。

25．一种嵌合基因，其包含与根据权利要求23-24任一项的核苷酸序列有效连接的启动子。

26．一种包含根据权利要求25的嵌合基因的重组载体，其中该载体能被稳定地转化到一种宿主细胞中。

27．一种含有根据权利要求26的载体的宿主细胞，其中所述核苷酸序列可在该细胞中表达。

28．根据权利要求27的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种真核细胞。

29．根据权利要求27的宿主细胞，其中该宿主细胞选自昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。

30．根据权利要求27的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种原核细胞。

31．一种包含权利要求29的植物细胞的植物或种子。

32．权利要求31的植物，其中该植物耐受通透酶活性抑制剂。

33．一种鉴定具有除草活性的化合物的方法，其包括：

a)在有利于结合的条件下，将一种权利要求6的蛋白质与一种待测定其结合该蛋白质的能力的化合物结合，

b)选择步骤(a)中鉴定的一种能结合该蛋白质的化合物，

d)选择具有除草活性的化合物。

34．一种可按照权利要求33的方法鉴定的具有除草活性的化合物。

35．一种鉴定具有除草活性的通透酶活性抑制剂的方法，其包括：

a)将一种通透酶与一种待测定其抑制该通透酶活性的能力的化合物，在有利于这种抑制的条件下结合，

b)选择步骤(a)中鉴定的一种能抑制该通透酶活性的化合物，

d)选择具有除草活性的化合物。

36．权利要求35的方法，其中该通透酶是一种嘌呤或嘧啶通透酶。

37．一种可按照权利要求35的方法鉴定的具有除草活性的化合物。

38．一种鉴定通透酶活性抑制剂的方法，其包括：

a)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或与之基本类似的核苷酸序列导入一种通透酶缺陷的宿主细胞如大肠杆菌uraA中，使得该序列可功能性地表达；

c)在步骤(b)的条件下测定宿主细胞的生长；和

d)选择在步骤(c)中抑制宿主细胞生长的化合物。

39．一种可按照权利要求38的方法鉴定的具有除草活性的化合物。

40．一种抑制植物生长的方法，包括以足以抑制该植物生长的量向该植物施用一种抑制权利要求6的氨基酸序列的活性的化合物。

41．权利要求40的方法，其中该化合物选自权利要求37的化合物和权利要求39的化合物。

42．一种改进作物的方法，包括，以可抑制不希望的植被生长但不明显抑制除草剂耐受性植物或种子生长的量，向选自权利要求19的植物或种子和权利要求32的植物或种子的除草剂耐受性植物或种子，施用一种具有除草活性的化合物，所述化合物选自权利要求34的化合物、权利要求37的化合物和权利要求39的化合物。