CN1289369A - 植物核黄素生物合成基因及其用途 - Google Patents

植物核黄素生物合成基因及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1289369A
CN1289369A CN99802488A CN99802488A CN1289369A CN 1289369 A CN1289369 A CN 1289369A CN 99802488 A CN99802488 A CN 99802488A CN 99802488 A CN99802488 A CN 99802488A CN 1289369 A CN1289369 A CN 1289369A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
enzyme
seq
dna molecular
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99802488A
Other languages
English (en)
Inventor
C·D·谷耶
M·A·约翰逊
S·L·沃拉茨
S·A·布鲁恩
E·R·沃德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Participations AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of CN1289369A publication Critical patent/CN1289369A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供植物核黄素生物合成基因,包括核黄素合成酶复合物β亚基(2,4-二氧四氢蝶啶合成酶)编码基因和双功能酶GTP环化水解酶Ⅱ/DHBP合成酶编码基因。本发明还公开了在异源宿主中重组生产这些核黄素生物合成基因的方法,用这些重组生产的酶筛选有除草剂活性的化学品的方法,和使用由此鉴定的除草剂化学品抑制不需要植物的生长的方法。更进一步,本发明提供了使用本发明的核黄素生物合成基因开发除草剂耐受性的植物、植物组织、植物种子、和植物细胞的方法。

Description

植物核黄素生物合成基因及其用途
一般地，本发明涉及参与植物核黄素生物合成的酶活性。具体地，本发明涉及编码双功能酶GTP环化水解酶II／DHBP合成酶和核黄素合成酶复合物β亚基(2，4-二氧四氢蝶啶合成酶)的植物基因。本发明有多种应用，包括这些核黄素生物合成酶在异源宿主中的重组生产，具有除草剂活性的化学品的筛选，和由此鉴定的除草剂化学品在控制不需要的植物的生长中的应用。本发明也可用于开发植物、植物组织、植物种子和植物细胞的除草剂耐受性。I．核黄素生物合成
所有的植物和许多微生物均合成核黄素(维生素B2-6，7-二甲基-9-(1-D-核糖醇)-异咯嗪)。因为核黄素是碳水化合物酶促氧化必需的辅酶如FAD和FMN的前体，所以它为基本代谢所必需。核黄素的生物合成始于鸟苷-5'-三磷酸(GTP)并经过若干酶促反应步骤，正如Mironov等在Mol．Gen．Genet．242：201-208(1994)的图1中所概述，该文以参考文献并入本文。
GTP环化水解酶II是核黄素生物合成的第一个酶，催化从GTP合成2，5-二氨基-4-氧-6-核糖氨基-嘧啶-5'-磷酸。DHBP合成酶催化5-磷酸核酮糖转化为3，4-二羟-2-丁酮磷酸(DHBP)。在芽胞杆菌(Bacillus)中，这两个酶活性是由一个双功能酶来完成；而在大肠杆菌中则是由两个单独的酶来完成。
核黄素生物合成酶蛋白是大约1，000，000道尔顿的酶复合物，含有约60个β亚基和3个α亚基。β亚基形成一个衣壳，催化2，4-二氧-5-氨基-6-核醇氨基(ribitylamino)-嘧啶(DARP)和3，4-二羟基-2-丁酮磷酸(DHBP)转化为6，7-二甲基-8-核醇基-2，4-二氧-四氢蝶啶(2，4-二氧四氢蝶啶)；因此，β亚基也称为“2，4-二氧四氢蝶啶合成酶”。然后，包含在β亚基衣壳内的α亚基催化两单位的2，4-二氧四氢蝶啶转化为一个DARP分子和一个核黄素分子，其中DARP分子重循环进入核黄素合成酶的第一个反应。II．除草剂的开发
在田间使用除草剂以控制不需要的植物如杂草的生长已几乎成为一个普遍的做法。除草剂市场每年超过150亿美元。尽管广泛使用除草剂，对于农民而言杂草的控制仍是一个重要而花费很大的问题。
除草剂的有效使用需要合理的操作。例如，应用的时间和方法以及杂草植物的生长阶段对于除草剂获得良好的杂草控制是关键的。由于许多种杂草抗除草剂，所以生产有效的新除草剂变得愈加重要。现在可运用重组DNA技术进行高通量筛选开发新的除草剂。植物生长发育必需的代谢酶可通过标准分子生物学技术重组生产，并可用作除草剂靶标筛选新的酶活性抑制剂。然后可将经此筛选发现的新抑制剂用作除草剂以控制不需要的植物，III．除草剂耐受性植物
不幸的是，具有较强效力、较宽杂草谱系和较快土壤降解能力的除草剂对作物也具有较大的毒性。解决该问题的一个方法是开发能抵抗或耐受除草剂的作物。耐受除草剂的作物杂交品种或变种可允许使用除草剂杀灭杂草，而没有同时伤害作物的危险。由于作物对除草剂敏感，以前除草剂的使用是被排除的或受限制的(例如限于植物出土前使用)，而耐受性的开发可允许除草剂应用于该作物。例如，Anderson等的美国专利4，761，373涉及具有各种咪唑烷酮或磺胺类除草剂抗性的植物。该抗性通过乙酰羟酸合成酶(AHAS)的改变来获得。Goodman的美国专利4，975，374涉及含有突变谷酰胺合成酶(GS)编码基因的植物细胞和植物，它们能抵抗已知抑制GS的除草剂如膦丝菌素和甲硫氨酸磺亚胺(sulfoximine)的抑制作用。Bedbrook等的美国专利5，013，659涉及表达突变乙酰乳酸合成酶的植物，突变的乙酰乳酸合成酶使该植物具有抗磺酰脲除草剂抑制的能力。Somers等的美国专利5，162，602公开了耐受环己二酮和芳氧基苯氧基丙酸除草剂的植物。该耐受性通过改变乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)来获得。定义
为清楚起见，对说明书中采用的某些术语进行了定义并陈述如下：
可激活DNA序列：调控基因组最好是植物基因组中基因的表达的DNA序列。可激活DNA序列与基因组中的内源靶基因互补。当可激活DNA序列导入细胞并表达时，将抑制靶基因的表达。与本发明相关的有用的可激活DNA序列包括那些编码或充当显性抑制因子的序列，例如在稳定转化植物中可破坏基因功能以正向鉴定一或多个植物正常生长发育必需基因的翻译或非翻译有义序列。优选的可激活DNA序列是反义DNA序列。靶基因优选编码植物生长或生存所必需的蛋白质，例如生物合成酶、受体、信号转导蛋白、结构基因产物或转运蛋白。在一个尤其优选的实施方案中，靶基因编码2，4-二氧四氢蝶啶合成酶或双功能酶GTP环化水解酶II／DHBP合成酶。反义序列与靶基因的相互作用将导致靶基因表达的充分抑制，从而杀死植物，或至少抑制了植物的正常生长或发育。
可激活DNA构建物：包含与可激活DNA序列操作性连接的合成启动子的重组DNA构建物，当其被导入细胞，最好是植物细胞时，并不表达，即是沉默的，除非存在能结合并激活合成启动子的完整杂合转录因子。将可激活DNA构建物导入细胞、组织或植物中以形成能表达可激活DNA序列的稳定转基因系。
嵌合：“嵌合”用于指DNA序列，如载体或基因，包含通过重组DNA技术融合在一起的一种以上不同来源的DNA序列，其天然并不存在，尤其在被转化植物中不存在。
DNA改组：DNA改组是指在DNA分子中导入，优选随机导入，突变或重排，或在两个或更多DNA分子间产生，优选随机产生，DNA序列交换的方法。DNA改组所获得的DNA分子是至少来源于一个模板DNA分子的非天然存在的改组DNA分子。相对模板DNA编码的酶而言，改组DNA分子编码修饰的酶，而且优选具有改变的生物学活性。
酶活性：本文是指酶催化底物转化为产物的能力。酶的底物包括酶的天然底物，也包括可被酶转化为产物或产物类似物的天然底物类似物。酶活性可通过例如测定一定时间后反应产物的量或测定一定时间后反应混合物中剩余的底物的量来测量。酶活性也可通过测定一定时间后反应混合物中剩余的未使用的反应辅因子的量或通过测定一定时间后反应混合物中已用的辅因子的量来测量。酶活性还可通过测定一定时间后反应混合物中剩余的自由能供体或能量富含分子(如ATP、磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸或磷酸肌酸)的量或通过测定已使用的自由能供体或能量富含分子(如ADP，丙酮酸，乙酸或肌酸)的量来测量。
表达是指植物中内源基因或转基因的转录和／或翻译。例如，对反义结构而言，表达可仅指反义DNA的转录。
基因是指编码序列和相关调控序列，其中编码序列转录为RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA。调控序列的例子有启动子序列以及5’和3’非翻译序列。
除草剂：用于杀死植物、植物细胞、植物种子或植物组织或抑制其生长的化学物质。
异源DNA序列：与导入的宿主细胞无天然联系的DNA序列，包括天然存在DNA序列的非天然存在的多拷贝。
同源DNA序列：与导入的宿主细胞天然相关的DNA序列。
抑制剂：灭活植物生长或生存所必需的蛋白质的酶活性，例如生物合成酶、受体、信号转导蛋白、结构基因产物或转运蛋白，的化学物质。在本发明中，抑制剂是灭活植物的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶或双功能酶GTP环化水解酶II／DHBP合成酶的酶活性的化学物质。术语“除草剂”在此定义为作用于植物、植物细胞、植物种子或植物组织的抑制剂。
分离的：在本发明中，分离的DNA分子或分离的酶是指经过人工操作而存在于其天然环境之外的DNA分子或酶，因此不是天然环境中的产物。分离的DNA分子或酶可以纯化形式存在或存在于非天然环境如转基因宿主细胞中。
最小启动子：在缺少上游激活时没有活性或仅有大大降低的启动子活性的启动子元件，尤其是TATA元件。当存在合适的转录因子时，最小启动子发挥作用以允许转录发生。
经修饰的酶活性：与植物中天然存在的酶活性(即在对该酶活性无人为的直接或间接操作的情况下天然存在的酶活性)不同的酶活性，其对抑制天然存在的酶活性的抑制剂有耐受性。
 植物是指任何植物，尤其是种子植物。
植物细胞：植物的结构和生理单位，由原生质体和细胞壁构成。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞，或作为更高级组织单位例如植物组织或植物器官的一部分。
重组DNA：通过重组DNA技术连接在一起的DNA序列组合分子。
重组DNA技术：用于连接DNA序列的方法，参见例如Sambrook等，1989，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社。
显著增加：大于测量方法固有的误差界限的酶活性增加，优选在抑制剂存在时比野生型酶活性增加约2倍或更多，更优选增加约5倍或更多，最优选增加约10倍或更多。
显著减少：是指酶反应产物的量大于测量方法固有的误差界限，优选在无抑制剂存在时比野生型酶活性减少约2倍或更多，更优选减少约5倍或更多，最优选减少约10倍或更多。
基本相似：在本发明中是指一个DNA分子与SEQ ID NO：1编码2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的部分，即SEQ ID NO：1编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的部分，有至少60％序列一致；或指一个DNA分子与SEQ IDNO：13编码植物双功能酶GTP环化水解II／DHBP合成酶的部分，即SEQ IDNO：13编码SEQ ID NO：14氨基酸序列的部分，有至少60％序列一致。在如下条件下一个基本相似的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶核苷酸序列能特异地与SEQ ID NO：1或其片段杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0．5MNaPO4pH7．0、1mM EDTA的溶液中于50℃杂交；用1％SDS、2X SSC于50℃洗涤。在上述条件下，一个基本相似的植物GTP环化水解酶II／DHBP合成酶核苷酸序列将特异地与SEQ ID NO：13或其片段杂交。对于蛋白而言，本文所用的“基本相似”是指一个蛋白序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：14所示氨基酸序列有至少90％的相同。
底物：底物是酶在天然执行其功能的生化途径中所天然识别并转化为产物的分子，或是该分子的修饰物，其在与天然反应类似的酶反应中同样可被该酶识别并转化为产物。
合成的是指含有天然序列中并不存在的结构特征的核苷酸序列。例如，一段与单子叶和／或双子叶植物基因的G+C含量及正常密码子分布更为接近的人工序列就被称作合成的。
耐受性：当暴露于抑制剂或除草剂时可继续正常生长或发挥功能的能力。
转化：将异源DNA导入细胞、组织或植物中的方法。转化细胞、组织或植物被理解为既包括转化操作的终产物，也包括其转基因后代。
转基因的：即稳定转化了重组DNA分子，该重组DNA分子优选包含合适启动子和操作性地与启动子连接的目标DNA序列。
鉴于以上描述，本发明的一个目标是提供用于鉴定新的或改良的除草剂的方法。本发明的另一个目标是提供使用这些新的或改良的除草剂抑制植物如杂草的生长的方法。本发明的再另一个目标是提供耐受这些新的或改良的除草剂的改良作物。
为实现这些或其他目标，本发明提供了含有分离自植物的编码核黄素生物合成所涉及酶的核苷酸序列的DNA分子，其中所述酶是2，4-二氧四氢蝶啶合成酶或是双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶。
根据一个实施方案，本发明提供含有分离自植物且编码核黄素合成酶β亚基(2，4-二氧四氢蝶啶合成酶)的核苷酸序列的DNA分子。
例如，本发明的该DNA分子可包含编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶的核苷酸序列，其中该酶含有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。在另一实例中，本发明的该DNA分子包含编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶的核苷酸序列，其中该酶含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。在另一实例中，本发明的该DNA分子包含分离自植物并编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶的核苷酸序列，其中所述DNA分子能在如下条件下与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA分子杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0．5MNaPO4pH7．0、1mM EDTA的溶液中于50℃杂交；用1％SDS、2X SSC于50℃洗涤。本发明进一步提供含有分离自植物并编码核黄素生物合成所涉及的酶的核苷酸序列的DNA分子，其中该酶具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性，并且其中所述DNA分子能在如下条件下与SEQ ID NO：1所示编码序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0．5MNaPO4pH7．0、1mM EDTA的溶液中于50℃杂交；用1％SDS、2X SSC于50℃洗涤。在又一实例中，本发明的DNA分子包含与SEQ ID NO：1所示编码序列基本相似的核苷酸序列，而且该序列编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶。在另一实例中，本发明的该DNA分子包含分离自植物并编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶的核苷酸序列，其中所述DNA分子有20个碱基对的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示编码序列中的一连续20个碱基对的核苷酸序列相同。再一实例中，本发明的该DNA分子包含SEQ ID NO：1所示编码序列并且编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶。尽管SEQ ID NO：1所提供的编码2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的核苷酸序列是根据本发明所提供之信息从Arabidopsisthaliana中分离的，但编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶的核苷酸序列也可采用本领域已知的标准方法从任何植物获得。
根据另一实施方案，本发明提供含有分离自植物并编码双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶的核苷酸序列的DNA分子。例如，本发明的该DNA分子可包含编码具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的酶的核苷酸序列，其中该酶含有与SEQ ID NO：14所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。在另一实例中，本发明的该DNA分子包含编码具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的酶的核苷酸序列，其中该酶含有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列。在本发明另一实例中，该DNA分子包含分离自植物并编码具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的酶的核苷酸序列，其中所述DNA分子可在如下条件下与编码SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的DNA分子杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0．5MNaPO4pH7．0、1mM EDTA的溶液中于50℃杂交；用1％SDS、2X SSC于50℃洗涤。本发明进一步提供含有分离自植物并编码核黄素生物合成所涉及的酶的核苷酸序列的DNA分子，其中该酶具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性，并且其中所述DNA分子能在如下条件下与SEQ ID NO：13所示编码序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0．5MNaPO4pH7．0、1mM EDTA的溶液中于50℃杂交；用1％SDS、2X SSC于50℃洗涤。
在又一实例中，本发明的DNA分子包含与SEQ ID NO：13所示编码序列基本相似的核苷酸序列，而且该序列编码具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的酶。在另一实例中，本发明的该DNA分子包含分离自植物并编码具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的酶的核苷酸序列，其中所述DNA分子有一20个碱基对的核苷酸序列与SEQ ID NO：13所示编码序列中的一连续20个碱基对的核苷酸序列相同。再一实例中，本发明的该DNA分子包含SEQ ID NO：13所示编码序列并且编码具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的酶。尽管SEQ ID NO：13所提供的编码双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶的核苷酸序列是根据本发明所提供的信息从Arabidopsisthaliana中分离的，但具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的酶的核苷酸编码序列也可采用本领域已知的标准方法从任何植物获得。
本发明还提供含有与本发明的DNA分子操作性连接的启动子的嵌合基因。进一步，本发明提供含有此嵌合基因的重组载体，其中该载体能被稳定转化入宿主细胞。更进一步，本发明提供含有此载体的宿主细胞，其中该宿主细胞能表达编码核黄素生物合成所涉及的酶的DNA分子。根据本发明，宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞或植物细胞。根据本发明该宿主细胞尤其可是细菌细胞。
本发明进一步提供制备编码具有改变的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的基因产物的核苷酸序列的方法，其包括：(a)改组来自植物的编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶的DNA分子，(b)表达所获得的改组核苷酸序列，并(c)筛选与未改组DNA分子编码的酶的活性相比改变的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性。根据该方法被改组的核苷酸序列优选SEQ ID NO：1。本发明还涉及通过该方法可获得的改组DNA分子。优选地，改组DNA分子编码的酶具有增强的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性抑制剂耐受性。本发明还提供含有与改组DNA分子操作性连接的启动子的嵌合基因；提供含有所述嵌合基因的重组载体，其中所述载体能被稳定转化至宿主细胞中；提供含有所述载体的宿主细胞。所述宿主细胞优选细菌细胞、酵母细胞或植物细胞，尤其是植物细胞。本发明还涉及含有这种植物细胞的植物或种子。所述植物优选耐受2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的抑制剂。
本发明进一步提供制备编码具有改变的双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的基因产物的核苷酸序列的方法，其包括：(a)改组来自植物的编码具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的酶的DNA分子，(b)表达所获得的改组核苷酸序列，并(c)筛选与未改组DNA分子编码的双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶的活性相比改变的酶活性。根据该方法改组的核苷酸序列优选SEQ ID NO：13。本发明还涉及可通过该方法获得的改组DNA分子。优选地，改组DNA分子编码的酶具有增强的双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性抑制剂耐受性。本发明还提供含有与改组DNA分子操作性连接的启动子的嵌合基因；提供含有所述嵌合基因的重组载体，其中所述载体能被稳定转化至宿主细胞中；提供含有所述载体的宿主细胞。所述宿主细胞优选细菌细胞、酵母细胞或植物细胞，尤其是植物细胞。本发明还涉及含有这种植物细胞的植物或种子。所述植物优选耐受双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的抑制剂。
根据另一实施方案，本发明还涉及上述核黄素生物合成酶的重组生产及其使用方法。具体地，本发明提供了分离的参与核黄素生物合成的植物酶，其中该酶具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性。优选该酶含有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。更优选该酶含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。本发明还提供了分离的参与核黄素生物合成的植物酶，其中该酶具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性。优选该酶含有与SEQ ID NO：14所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。更优选该酶含有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列。
本发明进一步提供了使用纯化的植物核黄素生物合成酶如2，4-二氧四氢蝶啶合成酶和GTP环化水解酶II／DNBP合成酶，筛选它们的新型抑制剂的方法，然后这些抑制剂可用作除草剂以抑制种植了作物尤其是农艺学上重要的作物的田间不需要的植物的生长，所述重要作物例如玉米和其它谷类作物如小麦、燕麦、黑麦、高粱、稻、大麦、粟、草皮和饲料草等，以及棉花、甘蔗、甜菜、油菜(oilseed rape)和大豆。
对于2，4-二氧四氢蝶啶合成酶，筛选能抑制该酶活性的化学品的方法优选包括步骤：(a)在具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶能催化2，4-二氧四氢蝶啶合成的条件下，在第一反应混合液中将该酶和2，4-二氧-5-氨基-6-核醇氨基-嘧啶以及3，4-二羟基-2-丁酮磷酸混合；(b)在与第一反应混合液相同的条件下，在第二混合液中将化学品和该酶与2，4-二氧-5-氨基-6-核醇氨基-嘧啶以及3，4-二羟基-2-丁酮磷酸混合；(c)测定第一和第二反应混合液中产生的2，4-二氧四氢蝶啶的量；和(d)比较第一和第二反应混合液中产生的2，4-二氧四氢蝶啶的量；其中如果第二反应混合液中产生的2，4-二氧四氢蝶啶的量比第一反应混合液中产生的2，4-二氧四氢蝶啶的量显著减少，则该化合物能抑制该酶的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性。根据本发明优选的筛选方法，其中第一反应混合液含有50μM的2，4-二氧-5-氨基-6-核醇氨基-嘧啶和0．5mM的3，4-二羟基-2-丁酮磷酸。根据本发明更优选的筛选方法，其中反应混合液中生产的2，4-二氧四氢蝶啶的量使用荧光计在407nm激发波长测量。
对于双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶，筛选能抑制该酶活性的化学品的方法优选包括步骤：(a)在具有双功能GTP环化水解酶II／DNBP合成酶活性的酶能分别催化2，5-二氨基-4-氧-6-核糖氨基-嘧啶-5’-磷酸或3，4-二羟基-2-丁酮磷酸合成的条件下，在第一反应混合液中将该酶和GTP或5-磷酸核酮糖混合；(b)在与第一反应混合液相同的条件下，在第二混合液中将化学品和该酶与GTP或5-磷酸核酮糖混合；(c)测定第一和第二反应混合液中产生的2，5-二氨基-4-氧-6-核糖氨基-嘧啶-5’-磷酸或3，4-二羟基-2-丁酮磷酸的量；和(d)比较第一和第二反应混合液中产生的2，5-二氨基-4-氧-6-核糖氨基-嘧啶-5’-磷酸或3，4-二羟基-2-丁酮磷酸的量；其中如果第二反应混合液中产生的2，5-二氨基-4-氧-6-核糖氨基-嘧啶-5’-磷酸或3，4-二羟基-2-丁酮磷酸的量比第一反应混合液中产生的量显著减少，则该化合物能抑制该酶的双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性。
本发明也包括上述筛选方法鉴定的除草剂化学品，以及通过给植物施用这种除草剂化学品来抑制植物生长的方法，其中该化学品抑制植物的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性或双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性。
本发明还包括植物、植物组织、植物种子和植物细胞，其具有改变的核黄素生物合成酶活性因而耐受正常抑制天然存在的核黄素生物合成酶活性水平的除草剂抑制作用。本发明包括的除草剂耐性植物包括那些本是正常抑制性除草剂潜在靶标的植物，尤其是以上提到的农艺学上重要的作物。根据该实施方案，植物、植物组织、植物种子或植物细胞稳定转化了一重组DNA分子，其包含在植物中有功能的与一核苷酸编码序列操作性连接的合适启动子，其中所述核苷酸编码序列编码修饰的核黄素生物合成酶，该酶对正常抑制未修饰野生型核黄素生物合成酶活性浓度的除草剂的抑制作用耐受。通过提供多拷贝野生型核黄素生物合成基因增加除草剂敏感性野生型核黄素生物合成酶的表达，或在比野生型更强的启动子的控制下超量表达野生型核黄素生物合成基因，植物也可获得改变的核黄素生物合成酶活性。然后通过常规筛选技术筛选由此产生的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，由此分离、鉴定和开发除草剂耐受品系。
因此，本发明提供含有包含分离自植物的编码核黄素生物合成所涉及酶的核苷酸序列的DNA分子的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中所述酶具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性，并且其中所述DNA分子赋予所述植物、植物细胞、植物种子或植物组织对正常抑制天然存在2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性量的除草剂的耐受性。根据该实施方案的一个实例，该酶含有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。根据该实施方案的另一个实例，该DNA分子与SEQID NO：1所示编码序列基本相似。在一个相关方面，本发明涉及在种植作物种子或植株的作物田间选择性抑制杂草生长的方法，其包括步骤：(a)种植除草剂耐性作物或作物种子，其是抑制天然存在的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的除草剂的耐受性植物或植物种子；(b)在田间向作物或作物种子及杂草施用抑制天然存在的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性量的除草剂，其中该除草剂抑制杂草的生长同时又不会显著抑制作物的生长。
本发明还提供含有包含分离自植物的编码核黄素生物合成所涉及酶的核苷酸序列的DNA分子的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中所述酶具有双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性，并且其中所述DNA分子赋予所述植物、植物细胞、植物种子或植物组织对正常抑制天然存在之双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性量的除草剂的耐受性。根据该实施方案的一个实例，该酶含有与SEQ ID NO：14所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。根据该实施方案的另一个实例，该DNA分子与SEQ ID NO：13所示编码序列基本相似。在一个相关方面，本发明涉及在种植作物种子或植株的作物田间选择性抑制杂草生长的方法，其包括步骤：(a)种植除草剂耐性作物或作物种子，其是抑制天然存在的双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性的除草剂的耐受性植物或植物种子；(b)在田间向作物或作物种子及杂草施用抑制天然存在的双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性量的除草剂，其中该除草剂抑制杂草的生长同时又不会显著抑制作物的生长。
本发明的其它目标和优点将为研究过本发明以下描述和非限制的实施例的本领域专业人员所明了。I．植物的核黄素生物合成基因
一方面，本发明涉及含有分离自植物的编码核黄素合成酶β亚基(2，4-二氧四氢蝶啶合成酶)的核苷酸序列的DNA分子。具体地，本发明提供了来自Arabidopsis thaliana并编码2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的DNA分子和与其基本相似的编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的酶的DNA分子。Arabidopsis thaliana的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的DNA编码序列见SEQ ID NO：1。
另一方面，本发明涉及含有分离自植物来源并编码双功能GTP环化水解酶II／3，4-二羟-2-丁酮磷酸(DHBP)合成酶的核苷酸序列的DNA分子。具体地，本发明提供了分离自Arabidopsis thaliana并编码该双功能酶的DNA分子和与其基本相似的编码具有GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性的酶的DNA分子。Arabidopsis thaliana的GTP环化水解酶II／DHBP合成酶的DNA编码序列见SEQ ID NO：13。本发明最先认识到植物中GTP环化水解酶II和DHBP合成酶构成了一个单一的双功能酶。
根据本发明申请人的公开，编码核黄素生物合成酶的DNA序列最初可从任何目标植物种的基因组中分离。从植物中分离核黄素生物合成基因的示例性方法见实施例1和11。采用该方法检索Arabidopsisthaliana的表达序列标签(EST)数据库(俄亥俄州阿布属植物生物资源中心，俄亥俄州立大学，哥伦布，俄亥俄州)，发现了与大肠杆菌(E．coli)核黄素合成酶β亚基和枯草芽胞杆菌(B．subtilis)GTP环化水解酶同源的EST。以这些EST特异的引物进行PCR扩增，产生的DNA片段用于探测阿布属植物的入ZAP文库，从而分离出cDNA。测定的一个cDNA编码的蛋白序列显示与大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的核黄素合成酶β亚基有大约68％的相似性。测定的另一cDNA编码的蛋白序列显示与枯草芽胞杆菌GTP环化水解酶有70％的相似。
此外，根据熟知技术核黄素生物合成基因序列可基于其与本发明所示Arabidopsis thaliana编码序列(SEQ ID NO：1和13)的序列相似性从任何植物中分离出来。在这些技术中，将已知植物核黄素生物合成基因编码序列的全部或部分用作探针，选择性地与存在于所选植物的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群体(即基因组或cDNA文库)中的其它核黄素生物合成基因序列杂交。这些技术包括平板DNA文库杂交筛选(噬菌斑筛选或菌落筛选；见例如Sambrook等编，“分子克隆”，冷泉港实验室出版，(1989))和使用与已知核黄素生物合成酶氨基酸序列中的保守区相应的寡核苷酸引物进行PCR扩增(参见例如，Innis等，“PCR技术手册，方法和应用指南”(“PCR Protocols，a Guideto Methods and Applications”)，Academic Press(1990))。这些方法尤其适用于从与探针序列来源的生物亲源关系密切的生物中分离核黄素生物合成基因序列。因此，可以预测采用阿布属植物编码序列作探针的这些方法将尤其适用于从其它植物种，包括单子叶植物和双子叶植物，分离核黄素生物合成基因序列。
本发明所示分离的核黄素生物合成基因序列可根据标准遗传工程技术进行操作以适合任何需要的目的。例如，完整的植物核黄素生物合成基因序列或其部分可用作能特异杂交编码序列或信使RNA的探针。为了在多种条件下获得特异杂交，此探针包括植物核黄素生物合成基因序列的特有序列，并且该序列有至少10个核苷酸长，优选至少20个核苷酸长，最优选至少50个核苷酸长。通过PCR此探针可用于扩增和分析所选生物的核黄素生物合成基因序列。该技术可用于从目标生物中分离另外的核黄素生物合成基因序列或是作为诊断分析法以确定某生物中是否存在核黄素生物合成基因序列。该技术也可用于检测是否存在与某个感兴趣的具体情况如除草剂耐受、健康状态不良等相关的改变的核黄素生物合成基因序列。
根据探针与基因组序列的选择性杂交，采用标准技术2，4-二氧四氢蝶啶合成酶特异的杂交探针和GTP环化水解酶II／DHBP合成酶特异的杂交探针也可用于在所选植物基因组中作图定位这些天然基因。该技术包括，但不限于，鉴定探针序列识别或包含的DNA多态性，以及运用此多态性来跟踪该基因相对已知图位的其它标记在来源于两个多态性亲本系杂交种自交后代的作图群体中的分离情况(参见例如Helentjaris等，植物分子生物学(Plant Mol．Biol．)5：109(1985)；Sommer等，生物技术(Biotechniques)12：82(1992)；D’Ovidio等，植物分子生物学15：169(1990))。尽管可考虑使用任何植物核黄素生物合成基因序列作为探针来作图定位核黄素生物合成基因，但优选的探针是那些来自与所选植物种亲源关系更近的植物种的基因序列，最优选的探针是那些来自所选植物种的基因序列。以该方法进行的核黄素生物合成基因的作图被认为对育种目的尤其有用。例如，通过了解赋予除草剂抗性的突变核黄素生物合成基因的遗传图位，可从参考遗传图谱识别出侧翼DNA标记(参见例如Helentjaris，遗传学动向(Trends Genet．)3：217(1987))。在除草剂抗性性状渐渗入新的育种系的过程中，这些标记可用于监测每一轮回交之后回归亲本中仍存在的连锁侧翼染色体DNA区域。
通过标准技术例如Northern杂交分析，2，4-二氧四氢蝶啶合成酶特异的杂交探针和GTP环化水解酶II／DHBP合成酶特异的杂交探针还可用于定量植物中核黄素生物合成基因mRNA的水平。该技术作为诊断方法可用于检测与具体情况如针对核黄素生物合成基因的除草剂耐受性的增强相关的核黄素生物合成基因表达水平的变化。II．反义抑制说明核黄素生物合成基因为植物所必需
正如以下实例所示，采用本申请人拥有的共同未决申请系列号08／978，830号[标题为“用于激活沉默转基因的方法和组合物”，1997年11月26日申请]所描述的反义激活系统反义抑制植物的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶，证明了核黄素生物合成基因为植物正常生长发育所必需，上述申请以参考文献并入本文。在该系统中，构建一个包含DNA结合域和激活域的杂合转录因子基因。再构建一个包含与可激活DNA序列操作性连接的合成启动子的可激活DNA构建物。选择或设计杂合转录因子基因和合成启动子使杂合转录因子的DNA结合域能特异地结合合成启动子，从而激活可激活DNA序列的表达。给第一种植物转化杂合转录因子基因，第二种植物转化可激活DNA构建物。将第一种和第二种植物杂交产生含有杂合转录因子和合成启动子编码序列的子代植物，其中可激活DNA序列在子代植物中表达。在优选实施方案中，可激活DNA序列是能灭活内源基因如2，4-二氧四氢蝶啶合成酶基因或双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶基因的表达的反义序列。因此，子代植物将不能正常表达该内源基因。
这种反义激活系统对允许表达作为组成型启动的转基因本可能不可挽救的性状是特别有用的。例如，有潜在致死效果的外源基因或设计成消除必需基因功能的反义基因或显性负向突变，尽管在植物生物学的基础研究中很有意义，但存在固有的实验问题。低转化频率经常被引用作为组成型启动的特定转基因相关致死性的证据，但这类阴性结果充满了各种无意义的解释。本发明是农业领域的一个重要进步，因为它允许被测转基因的稳定存在和增殖与其表达相分离。这种将转基因插入与表达相分离的能力对于得到关于基因功能重要性的可靠结论是特别有用的。因此，本发明的实质性益处是植物正常生长或发育必需的基因可用这种方式鉴定。这些基因的鉴定提供了从化合物文库中筛选有效除草剂的有用靶标。下面将更为详细地描述反义激活系统：
A．杂合转录因子基因
用于本文所述反义激活系统的杂合转录因子基因包含编码(1)DNA结合域和(2)与启动子处组装的转录机构成分相互作用的激活域的DNA序列。连接基因片段，典型地是使DNA结合域在5’末端而激活域在3’末端，以形成表达杂合转录因子的杂合基因。本领域技术人员可按常规方法将各种编码DNA结合域的DNA序列与各种编码激活域的DNA序列连接起来，形成多种组合的杂合转录因子基因。编码DNA结合域的DNA序列的例子包括但不限于编码GAL4、噬菌体434、lexA、lacI和λ噬菌体阻遏蛋白DNA结合域的序列。编码激活域的DNA序列的例子包括但不限于单纯疱疹VP16、玉米C1和P1的酸性激活域编码序列。另外，可通过将来自所选生物体的DNA片段与合适的DNA结合域融合然后直接进行功能选择的方法来分离合适的激活域(Estruch等，(1994)核酸研究(Nucleic Acids Res．)22：3983-3989)。不同来源的转录激活蛋白之间可相互交换结构域(Brent and Ptashne(1985)细胞(Cell)，43：729-736)。一种优选的杂合转录因子基因含有编码与玉米C1激活域融合的GAL4 DNA结合域的DNA序列。
B．可激活DNA构建物
用于本文所述反义激活系统的可激活DNA构建物包含(1)一个合成启动子并可操作地连接(2)一个可激活DNA序列。合成启动子包含至少一个能被杂合转录因子DNA结合域识别的DNA结合位点，和一个最小启动子，优选来自植物细胞识别的启动子的TATA元件。更具体地，TATA元件来自合成启动子将要转入的植物细胞类型所识别的启动子。最好是DNA结合位点在合成启动子中多次重复以便最小启动子可被更有效地激活，这样与合成启动子相连的可激活DNA序列就可获得更有效的表达。本领域技术人员可采用常规分子生物学和重组DNA技术来产生期望的合成启动子。可用于产生本发明有用的合成启动子的DNA结合位点的例子包括但不限于GAL4 DNA结合蛋白识别的上游激活序列(UASG)、lac操纵子和lexA结合位点。植物细胞识别的启动子TATA元件的例子包括那些来自CaMV 35S、玉米Bzl启动子和UBQ3启动子的TATA元件。一个特别优选的合成启动子包含具有TATA元件(相对转录起始位置-59到+48位核苷酸)的截短的CaMV 35S序列，其5’末端融合了GAL4 DNA结合域所识别的上游激活序列(UASG)的约10个串联同向重复。
可激活DNA序列包括任何希望在植物细胞中稳定导入和表达的DNA序列。特别希望的可激活DNA序列是有义或反义序列，其表达导致其对应内源基因表达的降低，从而抑制植物正常的生长或发育。可激活DNA序列操作性地与合成启动子连接，形成可激活DNA构建物。在转基因系中，可激活DNA构建物中的可激活DNA序列不表达，即它是沉默的，除非同时还存在可结合并激活合成启动子的杂合转录因子。随后将可激活DNA构建物导入细胞、组织或植物，形成表达可激活DNA序列的稳定转基因系，下文将作更全面的描述。在本发明中，可激活DNA序列优选包含2，4-二氧四氢蝶啶合成酶反义序列或双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶反义序列。
C．含有杂交转录因子基因或可激活DNA构建物的转基因植物
本文所述反义激活系统采用含有杂合转录因子基因的第一种植物和含有可激活DNA构建物的第二种植物。采用本领域熟知的常规方法将上述杂合转录因子基因和可激活DNA构建物导入植物，所述方法包括但不限于杂交、农杆菌介导的转化、Ti质粒载体、直接DNA摄取如微粒轰击、脂质体介导的摄取、显微注射等。按照本领域技术人员已知的标准方法筛选存在有功能转基因的转化体。
D．兼有杂合转录因子和可激活DNA构建物的转基因植物
兼有杂合转录因子和可激活DNA构建物的F1植物通过异花受粉产生并利用合适标记的存在来筛选。与仅含有可激活DNA构建物的植株相比，F1植株产生了高水平的可激活DNA序列表达产物，其可与使用强组成型启动子如CaMV 35S获得的表达相比。
反义激活实验：
本文所述系统的一个有用实验方法包括如下步骤：
a)提供稳定转化了杂合转录因子基因的第一种植株，其中所述杂
合转录因子基因编码的杂合转录因子在合成启动子存在于该植
株中时可激活该合成启动子，而且对于该杂合转录因子而言该
植株是纯合的；
b)提供稳定转化了可激活DNA构建物的第二种植株，其中可激活
DNA构建物包含可被步骤a)的杂合转录因子激活的合成启动
子，后者操作性连接了可激活DNA序列如2，4-二氧四氢蝶啶合
成酶反义序列或GTP环化水解酶II／DHBP合成酶反义序列；
c)将第一种转基因植物和第二种转基因植物杂交，产生在杂合转
录因子存在时表达可激活DNA序列的F1植物；和
d)测定F1植株中可激活DNA序列的表达效果。III．植物核黄素生物合成酶的重组生产及其用途
为了在宿主生物中重组生产植物核黄素生物合成酶，可将本发明的植物核黄素生物合成酶编码序列插入为所选宿主设计的表达盒中，并导入欲在其中重组生产该酶的宿主。适合于所选宿主的具体调节序列如启动子、信号序列、5’和3’非翻译序列和增强子的选择是本领域专业人员已知的。产生的分子含有按正确阅读框连接的各个元件，可插入能转化至宿主细胞的载体中。对于宿主生物如大肠杆菌、酵母和昆虫细胞，用于重组生产蛋白质的适宜表达载体和方法是熟知的(见如Luckow和Summers，Bio／Technol．6：47(1988))。具体例子包括质粒如pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)、pFLAG(InternationalBiotechnologies，Inc．，New Haven，CT)、pTrcHis(InVitrogen，LaJolla，CA)和杆状病毒表达载体如Autographica califomica核型多角体病毒(AcMNPV)基因组来源的载体。杆状病毒／昆虫系统优选pVIl1392／Sf21细胞(Invitrogen，La Jolla，CA)。
重组生产的植物核黄素生物合成酶可用多种标准技术分离和纯化。可采用的实际技术将根据使用的宿主生物、所述酶是否设计成分泌型以及本领域熟练技术人员熟悉的其它因素而不同(见如Ausubel，F．等，″Current Protocols in Molecular Biology″第16章，John Wiley＆Sons公司出版(1994))。
重组生产的植物核黄素生物合成酶可用于多种目的。例如，它们可用于在体外实验中筛选靶标尚未鉴定的已知除草化学品以确定其是否抑制核黄素生物合成酶。这种体外实验也可用作更普通的筛选方法以鉴别抑制这种酶活性因而是候选除草剂的化学品。此外，重组生产的核黄素生物合成酶可用于进一步分析其与已知抑制剂的相关性，以便合理设计新的抑制性除草剂以及该酶的除草剂耐性形式。抑制剂实验：
因此，用于鉴定植物必需基因如植物核黄素生物合成基因的抑制剂的方法包括如下步骤：
a)在可疑的酶功能抑制剂存在下将植物核黄素生物合成酶和它的底物反应；
b)将可疑抑制剂存在时酶活性速率与可疑抑制剂不存在时同样条件下的酶活性速率比较；和
c)确定该可疑抑制剂是否抑制核黄素生物合成酶。
例如，对植物2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的抑制效果可由在实验中2，4-二氧四氢蝶啶合成的降低或完全抑制来测定。这种测定可通过使用下文实施例所描述的荧光或吸光度检测比较候选抑制剂存在或不存在时体外实验中合成的2，4-二氧四氢蝶啶的量来实现。可采用类似实验筛选双功能植物GTP环化水解酶II／DHBP合成酶的抑制剂。
此外，重组生产的植物核黄素生物合成酶可用于阐明这些分子的复杂结构，如已阐明了枯草芽胞杆菌来源的核黄素合成酶(Ladenstein，等(1988)分子生物学杂志(J． Mol．Biol．)203，1045-1070)。关于植物核黄素生物合成酶的结构的这些信息可用于例如合理设计新的抑制性除草剂。IV．除草剂耐性植物
本发明还涉及耐除草剂的植物、植物组织、植物种子和植物细胞，所述除草剂抑制这些植物中天然存在的核黄素生物合成，其中对除草剂的耐受性是通过改变核黄素生物合成酶活性来赋予的。根据本发明，可通过给植物提供额外的野生型核黄素生物合成基因以增加除草剂敏感性野生型核黄素生物合成酶的表达、在植物中表达修饰的除草剂耐性核黄素生物合成酶、或这些技术的组合，来赋予植物改变的核黄素生物合成酶活性。代表性植物包括为了通常的目的应用这些除草剂的任何植物。优选农艺学上重要的作物，如棉花、大豆、油菜、甜菜、玉米、稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、粟、草皮(turf)、料草(forage)、草皮草等。
A．增加野生型核黄素生物合成酶的表达
通过增加表达来实现改变的核黄素生物合成酶活性，导致在植物细胞中核黄素生物合成酶的水平足以克服除草剂引起的生长抑制。表达的酶水平通常是天然表达量的至少两倍，优选至少五倍，更优选至少十倍。增加表达可由野生型核黄素生物合成酶的多拷贝；在该基因内编码序列多次出现(即基因扩增)或植物细胞中该内源基因的非编码调节序列突变而引起的。具有这种改变的基因活性的植物可通过采用本领域已知的方法直接筛选植物来获得(见例如美国专利5，162，602和美国专利4，761，373以及它们引用的参考文献)。这些植物也可通过本领域已知的基因工程技术获得。增加除草剂敏感性核黄素生物合成酶基因的表达也可通过用重组或嵌合DNA分子稳定转化植物细胞来实现，其中重组或嵌合DNA分子包含能启动植物细胞中相关结构基因表达的启动子，该启动子与编码核黄素生物合成酶的同源或异源结构基因操作性地连接。
B．修饰的除草剂耐性核黄素生物合成酶的表达
根据本实施方案，用重组DNA分子稳定转化植物、植物组织、植物种子或植物细胞，其中重组DNA分子包含在植物中起作用的适合启动子，该启动子可操作地与编码核黄素生物合成酶除草剂耐性形式的编码序列相连。该酶的除草剂耐受形式含有至少一个氨基酸替代、插入或缺失，以赋予对抑制该酶未修饰的天然存在形式的除草剂的耐受性。然后用传统筛选技术筛选由此产生的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，由此分离、分析和开发除草剂耐性株系。下面描述获取编码核黄素生物合成酶的除草剂耐性形式的编码基因的方法：
一个通用策略涉及对微生物的直接或间接诱变程序。例如可用诱变剂如紫外光或甲磺酸乙酯或甲酯对可遗传操作的微生物如大肠杆菌或酿酒酵母体内随机诱变。诱变程序参见例如Miller，分子遗传学实验(Experiments in Molecular Genetics)，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1972)；Davis等，高级细菌遗传学(Advanced Bacterial Genetics)，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1980)；Sherman等，酵母遗传学方法(Methods in Yeast Genetics)，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1983)；和美国专利4，975，374。选作诱变的微生物含有正常的抑制剂敏感性核黄素生物合成酶基因，并依赖于该基因产生的活性。诱变细胞在抑制未修饰基因的浓度的抑制剂存在下生长。选择在抑制剂存在时比未诱变微生物生长更好的诱变微生物菌落作进一步分析。通过克隆或PCR扩增，分离这些菌落的核黄素生物合成酶基因，并测定其序列。然后将编码改变的基因产物的序列重新克隆至该微生物中，以确认其提供抑制剂耐性的能力。
一种获取植物核黄素生物合成酶基因的除草剂耐受突变等位基因的方法涉及直接筛选植物。例如，诱变的核黄素生物合成酶基因对植物如阿布属(Arabidopsis)、大豆或玉米的生长抑制作用可通过将经本领域认可的方法消毒的种子铺在含有递增浓度抑制剂的简单基本盐培养基平板上来测定。这种浓度范围包括0．001、0．003、0．01、0．03、0．1、0．3、1、3、10、30、110、300、1000和3000份／百万份(ppm)。采用可重复检测显著生长抑制的最低剂量用于后续实验。
采用植物材料的诱变来增加筛选群体中抗性等位基因出现的频率。诱变的种子材料有许多来源，包括化学或物理诱变的种子，或化学或物理诱变的花粉(Neuffer，玉米生物学研究(Maize forBiological Research)Sheridan编，Univ．Press，Grand Forks，ND．，第61-64页(1982))，然后将该花粉给植物授粉，收集获得的M1突变种子。典型地，对于阿布属，将M2种子(Lehle Seeds，Tucson，AZ)，即用化学品如甲磺酸乙酯或物理因素如γ射线或快中子诱变的种子生长的植物的子代种子，以高达10，000种子／平板(10cm直径)的密度铺在含有适当浓度抑制剂的基本盐培养基上，以筛选耐性。将铺平板后持续生长并保持绿色7-21天的幼苗移植至土中，生长至成熟并结子。检测这些种子的子代对除草剂的耐性。如果耐受性状是显性的，则假定种子按抗性：敏感3∶1分离的植物在M2代是抗性杂合的。只产生抗性种子的植物则假定在M2代是抗性纯合的。这种对完整种子进行诱变并筛选其M2代种子的方法也可在其它物种上进行，如大豆(参见例如美国专利5，084，082)。此外，用于筛选除草剂耐性的突变种子可从用化学或物理方法诱变的花粉授粉来获得。
下面举例说明如何确证除草剂耐性的遗传基础是改变的核黄素生物合成基因。首先，使用PCR从显示抑制剂抗性的植物中分离核黄素生物合成基因的等位基因，其中PCR引物基于SEQ ID No：1或SEQ ID No：13所示阿布属cDNA编码序列中的保守区，或者更优选基于来源于用来产生耐性等位基因的植物的未改变的核黄素生物合成基因序列。对这些等位基因进行序列测定来确定在编码序列中存在突变之后，将这些假定的耐性基因转化植物，检测这些等位基因赋予这些植物抑制剂耐受性的能力。这些植物可是阿布属植物，也可是任何其它生长对抑制剂敏感的植物。然后，相对已知的限制性酶切片段多态性(RFLP)作图定位核黄素生物合成基因(见，如Chang等，美国科学院院刊85：6856-6860(1988)；Nam等，植物细胞(Plant Cell)1：699-705(1989))。使用相同标记对耐受性性状独立作图。如果耐受性是由该核黄素生物合成基因的突变引起，那么该耐受性性状的图位与核黄素生物合成基因图位相同。
另一种获得核黄素生物合成基因的除草剂耐受性等位基因的方法是筛选植物细胞培养物。在递增浓度的抑制性除草剂或实验室环境适用的类似抑制剂存在时，将目标植物的植物组织外植体，例如胚胎、叶盘等，或活跃生长的愈伤组织或悬浮培养物在培养基上生长。记录不同培养物的不同生长程度。在某些培养物中，出现即使存在正常抑制浓度的抑制剂也持续生长的快速生长变异克隆。这种快速生长变异体出现的频率可通过在暴露于抑制剂之前用化学或物理诱变剂处理组织或细胞来增加。按前面段落所述分离和检测假定的核黄素生物合成基因的耐受性等位基因。然后可将那些鉴定的除草剂耐受性等位基因进行改造以获得最佳表达并转化入植物中。此外，可从含有这些等位基因的组织或细胞培养物再生植物。
再另一种方法涉及在细菌或酵母中诱变除草剂敏感性野生型植物核黄素生物合成基因，之后将这些微生物培养于含抑制性浓度抑制剂的培养基中，然后筛选抑制剂存在时生长的菌落。更具体地，将植物cDNA，例如编码2，4-二氧四氢蝶啶合成酶(SEQ ID NO：1)或双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶(SEQ ID NO：13)的阿布属cDNA，克隆至本身缺乏所选基因活性的微生物中。然后，以本领域已知的任何化学法或酶法对转化微生物进行体内或离体诱变，例如亚硫酸钠(Shortle等，酶学方法(Methods Enzymol．)100：457-468(1983))；甲氧胺(Kadonaga等，核酸研究73：1733-1745)；寡核苷酸介导的饱和诱变(Hutchinson等，美国科学院院刊83：710-714(1986))；或各种聚合酶错误掺入法(见例如Shortle等，美国科学院院刊79：1588-1592(1982)；Shiraishi等，基因(Gene)64：313-319(1988)；和Leung等，技术(Technique)1：11-15(1989))。挑选正常抑制性浓度抑制剂存在时生长的菌落，并通过重复划线分离纯化。纯化它们的质粒，并通过将其重新转化至无核黄素生物合成酶基因活性的微生物中，检测其赋予抑制剂耐受性的能力。
除草剂抗性核黄素生物合成基因还可通过体外重组也称作DNA改组的方法来获得。通过DNA改组，在核黄素生物合成酶基因中引入突变，优选随机突变。DNA改组还会导致核黄素生物合成基因中序列的重组和重排，或在两个或多个不同核黄素生物合成蛋白编码序列之间重组和交换。这些方法能够产生成千上万的突变核黄素生物合成基因。在突变基因或改组基因中筛选期望特性如改善的除草剂耐受性，或对不同种类抑制剂化学物质提供广谱耐受性的突变。这些筛选方法是本领域技术人员所已知的。
在一个优选实施方案中，诱变核黄素生物合成基因是从至少一个模板核黄素生物合成基因形成的，其中模板核黄素生物合成基因被切割成期望大小的双链随机片段，并包括如下步骤：向得到的双链随机片段群体中加入一种或多种单链或双链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含双链随机片段的一个相同区域和一个不同区域；将所得双链随机片段和寡核苷酸混合物变性成单链片段；在导致所述单链片段在所述相同区域退火形成退火片段对的条件下将所得单链片段群体和聚合酶孵育，所述相同区域足以使一对片段的一条单链引发另一条的复制，从而形成诱变的双链多核苷酸；再重复第二和第三步至少两个循环，其中再次循环的第二步中所得混合物含有前一循环第三步产生的诱变双链多核苷酸，再次循环进一步形成诱变双链多核苷酸，其中诱变的多核苷酸是对抑制天然存在的核黄素生物合成活性的除草剂具有增强耐受性的突变核黄素生物合成基因。在一个优选实施方案中，双链随机片段群体中单个种类的单链随机片段的浓度按重量不到总DNA的1％。在一个进一步优选实施方案中，模板双链多核苷酸包含至少约100种多核苷酸。在另一个优选实施方案中，双链随机片段的大小从约5bp到5kb。在一个进一步优选实施方案中，该方法第四步包括重复第二和第三步至少10个循环。该方法参见例如Stemmer等(1994)自然(Nature)370：389-391、美国专利5，605，793和Crameri等(1998)自然391：288-291，以及WO97／20078，以上文献均以参考文献并入本文。
在另一优选实施方案中，用交错延伸法(StEP)体外诱变任意组合的两种或多种不同核黄素生物合成基因，如Zhao等(1998)NatureBiotechnology 16：258-261所述。简单地说，取两个或多个核黄素生物合成基因作为模板进行PCR扩增，PCR反应的延伸循环优选在低于聚合酶最佳聚合温度的温度下进行。例如，当采用最佳温度为72℃的耐热聚合酶时，延伸反应的温度期望低于72℃，更期望低于65℃，优选低于60℃，更优选延伸反应的温度为55℃。
此外，PCR循环延伸反应的时间期望比本领域通常采用的时间短，更期望少于30秒，优选少于15秒，更优选延伸反应的时间是5秒。在每一轮延伸反应中仅聚合短的DNA片段，使得每一轮变性和退火循环之后能够在起始DNA分子之间进行延伸产物的模板转换，从而在延伸产物中产生多样性。PCR反应中最佳循环数取决于将要诱变的核黄素生物合成酶编码区的长度，但期望采用40个以上循环，更期望60个以上循环，优选80个以上循环。每个核黄素生物合成基因组合的最佳延伸条件和最佳PCR循环数按照本领域熟知方法所述确定。PCR反应的其它参数基本上和本领域一般采用的相同。扩增反应的引物优选设计成与位于核黄素生物合成基因编码序列外侧的DNA序列退火，如和包含核黄素生物合成酶基因的载体的DNA序列退火，所以在PCR反应中使用的不同核黄素生物合成基因优选包含在分开的载体中。所述引物期望与位于距离核黄素生物合成基因编码序列少于500bp的序列退火，该序列优选距离核黄素生物合成基因编码序列少于200bp，更优选距离核黄素生物合成基因编码序列少于120bp。优选地，核黄素生物合成基因编码序列在限制性酶切位点之间，所述限制性酶切位点包含在PCR反应扩增的DNA序列中，因而便于将扩增片段克隆至适合载体中。
在另一个优选实施方案中，按WO98／05765所述产生具有粘性末端的核黄素生物合成基因片段。通过将相应于核黄素生物合成基因一部分的第一寡核苷酸和该基因中不存在的或相应于不与第一寡核苷酸相应基因部分相邻的该基因另一部分的第二寡核苷酸相连，产生粘性末端，其中第二寡核苷酸含有至少一个核糖核苷酸。采用第一寡核苷酸为模板，第二寡核苷酸为引物，产生双链DNA。切割并除去所述核糖核苷酸。再除去位于该核糖核苷酸5’端的核苷酸，就产生了带有粘性末端的双链片段。通过连接将这些片段随机地重新装配，获得基因序列的新的组合。
根据本发明，采用任何核黄素生物合成基因或核黄素生物合成基因的任何组合进行体外重组，例如，来自植物如Arabidopsis thaliana的核黄素生物合成基因，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13所示核黄素生物合成基因，或来自芽胞杆菌或大肠杆菌的核黄素生物合成基因。根据本发明，采用整个核黄素生物合成基因或其部分。将用上述方法获得的突变核黄素生物合成基因文库克隆至适合表达载体中，产生的载体转化入适当的宿主，例如藻类如衣藻(Chlamydomonas)、酵母或细菌。优选宿主是本身缺乏核黄素生物合成基因活性的宿主。转化了含突变核黄素生物合成基因文库的载体的宿主细胞在含有抑制性浓度抑制剂的培养基上培养并筛选在抑制剂存在时生长的那些菌落。挑取在正常抑制性浓度抑制剂存在下生长的菌落并通过重复划线纯化。纯化其质粒，然后测定通过了该测试的质粒的cDNA插入片段的DNA序列。
抑制剂耐受性修饰核黄素生物合成基因的鉴别实验可以采用和鉴别核黄素生物合成基因的抑制剂(上述抑制剂实验)相同的方式进行，并作如下修改：首先，在一个反应混合液中突变的核黄素生物合成酶替代了抑制剂实验中的野生型核黄素生物合成酶。其二，两个反应混合液中均存在野生型酶的抑制剂。其三，比较突变活性(抑制剂和突变酶存在时的活性)和未突变活性(抑制剂和野生型酶存在时的活性)，确定突变活性是否较未突变活性有酶活性的显著增加。突变活性是合适底物和抑制剂存在时以任何方式测量的突变酶活性。未突变活性是合适底物和抑制剂存在时以任何方式测量的野生型酶活性。显著增加定义为大于测量技术固有的误差界限的酶活性增加，优选抑制剂存在时比野生型酶活性增加约2倍或更多，更优选增加约5倍或更多，最优选增加约10倍或更多。
除草剂耐受性核黄素生物合成基因除用于产生除草剂耐受性植物，还可用作植物细胞转化方法中的筛选标记。例如，转化了转基因的植物、植物组织、植物种子或植物细胞还可转化可被该植物表达的改变的核黄素生物合成酶编码基因。将该转化细胞转移至含有该酶抑制剂的培养基中，其中所含抑制剂的量足于抑制不表达该修饰基因的植物细胞的生存，仅有转化细胞生长。该方法可运用于任何能转化修饰的核黄素生物合成酶编码基因的植物细胞，并可以和任何感兴趣的转基因一起使用。转基因和该修饰基因的表达可由在植物细胞中有功能的相同或不同的启动子启动。V．植物转化技术
采用传统的重组DNA技术可将野生型或除草剂耐受性核黄素生物合成基因转入植物或细菌细胞。一般地，这涉及到采用本领域已知的标准克隆方法将核黄素生物合成酶编码基因插入与该DNA分子异源的(即非正常存在的)表达系统中。该载体含有在包含该载体的宿主细胞中转录和翻译该插入蛋白编码序列所必需的元件。可采用本领域已知的大量载体系统，例如质粒、噬菌体病毒和其它修饰的病毒。还可修饰表达系统的成分来增强表达。例如，可采用截短序列、核苷酸替代或其它修饰。本领域已知的表达系统可用于在适合的务件下转化基本上任何作物植物细胞。转化细胞可再生为整个植株，以使所选形式的核黄素生物合成基因赋予该转基因植物除草剂耐受性。
A．构建植物表达盒的必要条件
首先将需要在转基因植物中表达的基因序列组装于表达盒中，位于可在植物中表达的合适启动子之后。表达盒还可包含表达该转基因所必需的或选用的任何其它序列。这些序列包括但不限于转录终止子、增强表达的外部序列如内含子、必需序列以及用于将基因产物定位至特定细胞器和细胞区室的序列。然后这些表达盒可很容易地转移至下文描述的植物转化载体中。以下描述了典型表达盒的各种成分。
1．启动子
用于表达盒的启动子的选择将决定转基因在转基因植物中的空间和时间表达模式。所选启动子将使转基因表达在特定细胞类型(例如叶表皮细胞，叶肉细胞，根外皮细胞)或特定组织或器官(例如根、叶或花)中，这种选择将反映基因产物积累的期望定位。此外，所选启动子可在各种诱导条件下启动基因表达。不同启动子的强度，即启动转录的能力不同。依赖于所用的宿主细胞系统，可采用本领域已知的许多适合启动子的任意一种。例如，对于组成型表达，可采用(CaMV 35S启动子、水稻肌动蛋白启动子或遍在蛋白启动子。对于调节型表达，可采用烟草或阿布属来源的化学诱导PR-1启动子(见例如美国专利5，689，044)。
2．转录终止子
多种转录终止子可用于表达盒。它们负责将转录终止于转基因及其正确的聚腺苷酸化之后。合适的转录终止子是那些已知在植物中发挥功能的转录终止子，包括CaMV 35S终止子，tml终止子，胭脂碱合成酶终止子以及豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶植物和双子叶植物。
3．增强或调节表达的序列
已发现转录单位中的许多序列可增强基因表达，因此这些序列可与本发明的所述基因联合使用以增强其在转基因植物中的表达。例如，已显示多种内含子序列如玉米Adhl基因的内含子可增强表达，尤其在单子叶植物细胞中如此。此外，已知病毒来源的许多非翻译引导序列也增强表达，其在双子叶植物细胞中尤其有效。
4．编码序列的优化
可通过遗传操作改变所选基因的编码序列以在目标作物种中获得最佳表达。修饰编码序列以在特定作物种中获得最佳表达的方法是人们所熟知的(见，例如Perlak等，美国科学院院刊88：3324(1991)；和Koziel等Bio／technol．11：194(1993))。
5．基因产物的细胞内定位
已知植物中存在多种定位基因产物的机制，对控制这些机制发挥作用的序列的性质已有较详细的描述。例如，基因产物定位到叶绿体是由在多种蛋白的氨基末端发现的信号序列所控制，这些蛋白在转入叶绿体的过程中被切割产生成熟蛋白(如Comai等，J．Biol．Chem．263：15104-15109(1988))。其它基因产物定位于其它细胞器如线粒体和过氧化物酶体(例如，Unger等。植物分子生物学(Plant Molec．Biol．)13：411-418(1989))。还可操作编码这些产物的cDNA以实现异源基因产物定位到这些细胞器中。此外，引起基因产物定位到其它细胞区室的序列的性质已有描述。氨基末端序列负责定位至内质网、质外体和从糊粉层细胞向细胞外分泌(Koehier和Ho，植物细胞(Plant Cell)2：769-783(1990))。此外，氨基末端序列联合羧基末端序列负责基因产物的液泡定位(Shinshi等．植物分子生物学14：357-368(1990))。通过将上述合适的定位序列与目标转基因序列融合，有可能将转基因产物定向至任何细胞器或细胞区室。
B．植物转化载体的构建
植物转化领域的普通技术人员已知多种植物转化用转化载体，本发明相关基因可联合任何这类载体使用。载体的选择取决于优选的转化技术和转化目标物种。对于特定目标物种，可优选不同抗生素或除草剂筛选标记。转化中常规使用的筛选标记包括赋予卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因(Gene)19：259-268(1982)；Bevan等，自然304：184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等，核酸研究18：1062(1990)；Spencer等，Theor．Appl．Genet 79：625-631(1990))、赋予潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学4：2929-2931)、赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBO J．2(7)：1099-1104(1983))以及赋予草甘膦抗性的EPSPS基因(美国专利4，940，935和5，188，642)。
1．适于农杆菌(Agrobacterium)转化的载体
许多载体可用于根癌农杆菌转化。典型地这些载体携带至少一个T-DNA边界序列，包括载体例如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ。适于农杆菌转化的典型载体包括二元载体pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB10及其潮霉素筛选的衍生载体(见，例如美国专利5，639，949)。
2．适于非农杆菌转化的载体
不使用根癌农杆菌的转化避免了在所选转化载体中需要T-DNA序列，因此除上述含有T-DNA序列的载体之外还可采用缺乏这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括微粒轰击、原生质体摄取(例如PEG和电穿孔)和显微注射转化。载体的选择很大程度上依赖于待转化物种的优选筛选方法。适于非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35(见例如美国专利5，639，949)。
C．转化技术
目标转化序列克隆至表达系统中后，将其转化入植物细胞。植物转化和再生的方法是本领域所熟知的。例如，外源DNA的运送已采用Ti质粒载体，以及直接DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射和微粒轰击。此外，农杆菌属来源的细菌可用于转化植物细胞。
用于双子叶植物的转化技术是本领域所熟知的，包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这可通过PEG或电穿孔介导的摄取、微粒轰击介导的传送或显微注射来实现。在每种情况下，可用本领域已知的标准方法将转化细胞再生成全株植物。
现在大部分单子叶植物种的转化也已成为常规。优选技术包括直接将基因转入原生质体的PEG或电穿孔技术、转入愈伤组织的微粒轰击，以及农杆菌介导的转化。VI．育种
可采用本发明的野生型或改变的核黄素生物合成基因赋予很多种植物细胞除草剂耐受性，所述植物包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。尽管该基因可插入这些广泛种类的植物细胞中，但在作物植物细胞中尤其有用，例如稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、倭瓜、南瓜、西葫芦、黄瓜、苹果、梨、柑橘、甜瓜、李子、樱桃、桃子、密桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、木瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
通过本领域已知的育种方法和技术，可在植物品系中引入赋予植物除草剂耐受性的野生型核黄素生物合成基因的高水平表达和／或除草剂耐受型核黄素生物合成基因的表达以及其它对产量和质量重要的性状。
在可通过在作物植物或可再生作物植株的植物细胞培养物中直接筛选获得除草剂耐性核黄素生物合成等位基因时，则可采用传统的育种技术将其转入商业品种中以开发除草剂耐性作物，而无需遗传操作该等位基因和将该基因转入植物。
本发明将通过以下详细实施例作进一步描述。这些实施例仅用于说明之目的，除非特别指明，它们不是限制性的。序列列表中序列的简要说明
SEQ ID NO：1是编码Arabidopsis thaliana核黄素合成酶β亚基(2，4-二氧四氢蝶啶合成酶)的cDNA序列。
SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1编码的Arabidopsis thaliana2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是寡核苷酸DG-63。
SEQ ID NO：4是寡核苷酸DG-65。
SEQ ID NO：5是寡核苷酸JG-L。
SEQ ID NO：6是寡核苷酸RS-1。
SEQ ID NO：7是寡核苷酸RS-2。
SEQ ID NO：8是实施例7中使用的合成肽。
SEQ ID NO：9是实施例7中使用的另一合成肽。
SEQ ID NO：10是寡核苷酸DG-252。
SEQ ID NO：11是寡核苷酸DG-253。
SEQ ID NO：12是寡核苷酸DG-254。
SEQ ID NO：13是编码Arabidopsis thaliana双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶的部分cDNA序列。
SEQ ID NO：14是SEQ ID NO：13编码的成熟Arabidopsis thaliana双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是寡核苷酸DG-67。
SEQ ID NO：16是寡核苷酸DG-69。
SEQ ID NO：17是寡核苷酸DG-392a。
SEQ ID NO：18是寡核苷酸DG-393a。
SEQ ID NO：19是寡核苷酸DG-390a。
SEQ ID NO：20是寡核苷酸DG-391a。实施例
这里所用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并参见Sambrook等编，分子克隆(Molecular Cloning)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)和T．J．Silhavy，M．L．Berman，和L．W．Enquist，基因融合实验(Experiments with Gene Fusions)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1984)和Ausubel，F．M．等，现代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene PublishingAssoc．和Wiley-interscience出版(1987)。实施例1：从阿布属植物中分离编码2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的cDNA
搜索Arabidopsis thaliana表达序列标签(EST)数据库(俄亥俄州阿布属生物资源中心，俄亥俄州立大学，Columbus，OH)，发现一个EST(EST#P25540，gb acc．#Z34233)与大肠杆菌的核黄素合成酶β亚基同源。以阿布属cDNA文库(Minet等，(1992)植物杂志(Plant J．)2：417-422)的质粒DNA为模板，利用根据该EST序列设计的合成寡核苷酸DG-63(SEQ ID NO：3)和DG-65(SEQ ID NO：4)，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增获得一个204bp的DNA片段。将该204bp片段连入TA克隆载体pCRII(Invitrogen Corp．，San Diego，CA)。通过荧光染料标记双脱氧链终止法(Applied Biosystems，Inc．，Foster City，CA)测序，以确证该204bp序列与EST#P25540序列一致。
大约50，000 pfu的λZAP阿布属cDNA文库以每10厘米培养皿8，000噬菌斑的密度铺平板，37℃生长7小时后制备噬菌斑影印滤膜。以采用PrimeTime试剂盒(International Biotechnologies，Inc．，New Haven，CT)随机引物法标记了32P-dCTP的该204bp片段杂交噬菌斑影印滤膜。杂交条件是7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mM EDTA，1％牛血清白蛋白，65℃。杂交过夜后，滤膜用1％SDS、50mMNaPO4、1mMEDTA于65℃洗涤。放射自显影检测到6个阳性杂交噬菌斑。纯化至单噬菌斑后，分离插入的cDNA，采用荧光染料标记双脱氧链终止法(AppliedBiosystems，Inc．，Foster City，CA)测定其序列。采用GAP程序(Deveraux等，(1984)核酸研究12：387-95)对命名为RSβ-1的最长克隆进行数据库搜索，发现该序列与大肠杆菌的核黄素合成酶β亚基相似。蛋白质之间有68％相似，44％相同。而且该阿布属成熟蛋白与大肠杆菌核黄素合成酶β亚基的比较，提示存在一个叶绿体转运肽。
根据布达佩斯条约的条款，含有RSβ-1的pBluescript SK载体pDG-4a．t．于1995年2月7日保藏在农业研究培养物保藏中心(NRRL)，1815 N．University St．，Peoria，IL 61604，美国，NRRL保藏号为B-21400。
编码RSβ-1的阿布属cDNA序列见SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：2。实施例2：根据与阿布属2，4-二氧四氢蝶啶合成酶编码序列的序列相似性，分离其它2，4-二氧四氢蝶啶合成酶基因
以每个10cm培养皿约8，000pfu的密度将噬菌体或质粒文库铺板，37℃生长7小时后制备噬菌斑影印滤膜。以采用PrimeTime试剂盒(International Biotechnologies，Inc．，New Haven，CT)随机引物法标记了32P-dCTP的SEQ ID NO：1所示cDNA杂交噬菌斑影印滤膜。杂交条件是7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mM EDTA，50℃。杂交过夜后，滤膜用2XSSC，1％SDS于50℃洗涤。放射自显影检测阳性杂交噬菌斑。纯化至单噬菌斑后，分离插入的cDNA，采用荧光染料标记双脱氧链终止法(Applied Biosystems，Inc．，Foster City，CA)测定其序列。本领域普通技术人员可采用该实验程序从任何其它植物种中获得与阿布属编码序列(SEQ ID NO：1)基本类似的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶基因。实施例3：构建含有GAL4结合位点／最小35S CaMV启动子并融合了反义2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的载体
pAT71：
从pGALLuc2(Goff等，(1991)基因和发育(Genes＆Development)5：298-309)中切下含10个GAL4结合位点和最小35S启动子(-59到+1)的EcoRI-PstI片段，并插入pBluescript的相应位点，产生pAT52。将pAT52的HindIII-PstI片段，pCIB1716的PstI-EcoRI片段(含有35S非翻译引导区，GUS基因，35S终止子)和pUC18的HindIII-EcoRI酶切片段进行三方连接，构建pAT66。用PstI-NcoI切下pAT66的35S引导区并替换为PCR产生的+1至+48的35S引导区，产生pAT71。
pJG304：
以SacI线性化质粒pBS SK+(Stratagene，LaJolla，CA)，用绿豆核酸酶处理除去SacI位点，以T4连接酶重新连接产生pJG201。用KpnI从pAT71中切下10XGAL4共有结合位点／CaMV 35S最小启动子／GUS基因／CaMV终止子盒，并克隆至pJG201的KpnI位点，产生pJG304。
用限制性内切酶Asp718部分消化pJG304以分离全长的线性片段。该片段与过量摩尔的22碱基寡核苷酸JG-L(SEQ ID NO：5)连接。限制性酶切分析鉴定在GAL4 DNA结合位点5’端插入了该接头的克隆，将此质粒命名为pJG304？XhoI。
pDG1：
用寡核苷酸RS-1(SEQ ID NO：6)和RS-2(SEQ ID NO：7)从cDNA克隆RSβ-1中PCR扩增2，4-二氧四氢蝶啶合成酶cDNA克隆的片段。该PCR产物包括2，4-二氧四氢蝶啶合成酶cDNA(SEQ ID NO：1)终止于792碱基对的5’部分。
用SacI和NcoI消化载体pJG304？XhoI，切下GUS基因编码序列。用SacI和NcoI消化上述2，4-二氧四氢蝶啶合成酶PCR片段，并连入pJG304？XhoI，产生pDG1。实施例4：从GAL4结合位点／CaMV最小35S启动子反义表达2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的植物转化载体。
pJG261：
用EcoRI和HindIII消化载体pGPTV(Becker等，(1992)植物分子生物学20：1195-1197)以除去胭脂碱合成酶启动子／GUS盒。同时用EcoRI和HindIII从pSE380(Invitrogen，San Diego，CA)切下超级接头并克隆至EcoRI／HindIII线性化的pGPTV中，产生pJG261。
pDG2：
以XhoI消化pDG1以切下含有GAL4 DNA结合位点／35S最小启动子／反义2，4-二氧四氢蝶啶合成酶／CaMV终止子融合物的盒子。将该盒子连入XhoI消化的pJG261，以便该转录与bar筛选标记的转录相背，产生pDG2。实施例5：含有GAL4结合位点／最小CaMV 35S和反义2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的转基因植物的产生
将pDG2电转化(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)至根癌农杆菌株C58C1(pMP90)中，然后渗透转化(Bechtold等，(1993)C．R．Acad．Sci．Paris，316：1188-93)阿布属植物(Columbia生态型)。在含15mg／lBasta的发芽培养基(4．3g／l Murashige-Skoog盐，0．5g／l的Mes，1％蔗糖，10ug／l硫胺，5ug／l维生素B6，5ug／l烟酸，1mg／l肌醇，pH5．8)上，筛选所渗透转化植物的种子。实施例6：含GAL4／C1反式激活蛋白的转基因植物的产生
将pGALCl(Goff等，(1991)基因和发育，5：298-309)来源的GAL4-C1EcoRI酶切片段连入pIC20H的EcoRI位点，构建pSGZL1。以BamHI-BgIII切下pSGZL1的GAL4-C1片段并插入pCIB770(Rothstein，等，(1987)基因53：153-161)的BamHI位点，产生pAT53。
按Valvekens等(1985)美国科学院院刊85：5536-5540所述将pAT53转化阿布属根外植体。具有单位点插入和GAL4／C1表达阳性的转基因植物用于纯合化。实施例7：采用GAL4／C1反式激活蛋白和GAL4结合位点／最小CaMV 35S启动子反义抑制2，4-二氧四氢蝶啶合成酶
将含有GAL4结合位点／最小CaMV 35S启动子／反义2，4-二氧四氢蝶啶合成酶结构的15株转基因植物移植至土中，在温室中生长成熟。将初级转化株的花与纯合GAL4／C1反式激活蛋白系pAT53-103来源的花粉杂交。F1代种子铺于发芽培养基和含15mg／l Basta的发芽培养基上。一个株系在平板上出现50％致死性表型。将剩余F1株系的幼苗移植至土中，在温室中生长至成熟。来自2个F1株系的幼苗在植入土壤后死亡了一半。
通过注射与纯化蛋白衍生物结合的合成多肽CIGAVIRGDTT(SEQ IDNO：8)和KAGNKGAETALTALEM(SEQ ID NO：9)，在山羊中产生2，4-二氧四氢蝶啶合成酶抗体。F1植物的Western分析显示，2，4-二氧四氢蝶啶合成酶水平的显著降低(Towbin等，美国科学院院刊76：4350-4354)。实施例8：重组植物2，4-二氧四氢蝶啶合成酶在大肠杆菌中的表达和纯化
为在大肠杆菌中生产重组植物2，4-二氧四氢蝶啶合成酶，使用PCR在pET-32a(Novagen，Inc．，Madison，WI)中产生阿布属2，4-二氧四氢蝶啶合成酶cDNA(SEQ ID NO：1)与硫氧还蛋白5’末端(LaVallie等，(1992)生物工艺学(Biotechnology)11：187-193)的翻译融合物。使用合成寡核苷酸引物DG-252(SEQ ID NO：10)，DG-253(SEQ ID NO：11)，和DG-254(SEQ ID NO：12)，聚合酶链式反应扩增长度为693-bp和483-bp的DNA片段。用NcoI和EcoRI消化该PCR产物。在低熔点琼脂糖胶上分离消化产物，并切下这些片段。同时，用NcoI和EcoRI消化pET32a质粒。在胶上分离消化产物，并从胶中切下pET32a载体。将该载体片段与两个PCR片段连接，连接产物转化至感受态大肠杆菌XL1 Blue细胞(Stratagene，La Jolla，CA)中。
筛选并培养氨苄青霉素抗性菌落，并提取其质粒DNA。该质粒的结构用荧光染料标记双脱氧链终止法(Applied Biosystems，Inc．，Foster City，CA)测序确证。具有期望结构的重组质粒命名为pET32aRSβFL-1和pET32aRSβNo CTP-1。
将质粒pET32aRSβFL-1和pET32aRSβNo CTP-1转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，根据厂家说明书(pET System Manual，Novagen，Inc．，Madison，WI)表达并纯化重组蛋白。由该菌株产生的融合蛋白含有大肠杆菌硫氧还蛋白的约132个氨基酸，His标签，和凝血酶切割位点，随后是阿布属2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的推测成熟编码序列，其开始于质粒pET32aRSβFL-1预测蛋白编码序列的第1号密码子，和质粒pET32aRSβNo CTP-1预测蛋白编码序列的第71号密码子。实施例9：2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性分析
联合使用HPLC和荧光计检测2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性。在下列条件下，2，4-二氧四氢蝶啶和2，4-二氧-5-氨基-6-核醇氨基-嘧啶(DARP)均是发荧光的：激发波长407nm；发射波长487nm。然而，2，4-二氧四氢蝶啶的荧光强度比等摩尔浓度的DARP约高6倍。2，4-二氧四氢蝶啶和DARP的405nm吸光值间也存在6倍的差别。3，4-二羟-2-丁酮磷酸不发荧光。用33％90mM甲酸、60％水和7％甲醇可在C18柱上分离2，4-二氧四氢蝶啶和DARP。前4分钟先洗脱出2，4-二氧四氢蝶啶，接着2分钟后洗脱出DARP。
峰面积可直接与产生的2，4-二氧四氢蝶啶的摩尔量相关。优化研究显示，反应缓冲液优选100mMKPO4pH7，5mMβ-巯基乙醇，2mM DTT。该酶活性的pH范围是6．5-7．5，但最优选pH7。动力学研究显示丁酮磷酸的Km值是190μM，DARP的Km值是5．5μM。Kis等，生物化学(Biochem．)34：2883-2892(1995)报告了细菌酶的Km值分别是130和5。反应在37℃孵育10分钟，然后加入5％TCA终止。离心去除沉淀蛋白，注射10ul上清液至HPLC上。因为反应可非酶促进行，所以所有样品均应设置对照以扣除背景活性。
实施例10：高通量筛选
高通量筛选2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的新型抑制剂优选利用如下事实：在对2，4-二氧四氢蝶啶最佳的条件下2，4-二氧四氢蝶啶与DARP发射的荧光强度不同，或这两个化合物的吸光度之间存在6倍差异。采用荧光检测进行高通量筛选的程序举例如下：在96孔微量滴定板孔中将2，4-二氧四氢蝶啶合成酶、缓冲液、测试底物和DARP共190μl体积混合，测定初始荧光值(例如采用Waters荧光微量滴定板读数仪)。加入10μl3，4-二羟-2-丁酮磷酸开始反应。适当孵育时间之后，再次测定荧光。然后将初始读数和最终读数的差按比例换算成对照反应的百分数。在全部反应混合物中底物的初始浓度优选50μM DARP和0．5mM丁酮磷酸。调节2，4-二氧四氢蝶啶合成酶量和孵育时间使产生的2，4-二氧四氢蝶啶浓度达到大约25μM。这样将产生比背景强约3-4倍的荧光信号。实施例11：从阿布属中分离编码双功能GTP环化水解酶II／3，4-二羟-2-丁酮磷酸合成酶的cDNA
搜索Arabidopsis thaliana表达序列标签(EST)数据库(俄亥俄州阿布属生物资源中心，俄亥俄州立大学，哥伦布，俄亥俄州)揭示，一个EST(EST#SCH1T7P；gb acc．#T12970)与枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的GTP环化水解酶同源。以阿布属cDNA文库(Minet等，(1992)植物杂志2：417-422)质粒DNA为模板，按该EST序列设计合成寡核苷酸DG-67(SEQ ID NO：15)和DG-69(SEQ ID NO：16)，进行聚合酶链式反应(PCR)产生一个322bp的DNA片段。将该322bp片段连接至TA克隆载体pCR II(Invitrogen Corp．，San Diego，CA)中。用荧光染料标记双脱氧链终止法(Applied Biosystems，Inc．，Foster City，CA)测序，证实322bp片段的序列和EST#SCH1T7P片段的序列相同。
将大约150，000pfu的入ZAP阿布属cDNA文库以每个10厘米培养皿8，000噬菌斑的密度铺平板，37℃生长7小时后制备噬菌斑影印滤膜。以采用PrimeTime试剂盒(International Biotechnologies，Inc．，NewHaven，CT)随机引物法标记了32P-dCTP的该322bp片段杂交噬菌斑影印滤膜。杂交条件是7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mMEDTA，1％牛血清白蛋白，65℃。杂交过夜后，滤膜用1％SDS，50mMNaPO4，1mM EDTA于65℃洗涤。放射自显影检测到10个阳性杂交噬菌斑。纯化至单噬菌斑后，分离插入的cDNA，采用荧光染料标记双脱氧链终止法(Applied Biosystems，Inc．，Foster City，CA)测定其序列。采用GAP程序(Deveraux等，(1984)核酸研究12：387-95)对命名为GTP-1的最长克隆进行数据库搜索，发现该序列与枯草芽胞杆菌的双功能GTP环化水解酶II／3，4-二羟-2-丁酮-4-磷酸合成酶相似。蛋白质之间有70％相似，54％相同。此外，该阿布属成熟蛋白与枯草芽胞杆菌的GTP环化水解酶II／3，4-二羟-2-丁酮-4-磷酸合成酶比较，提示存在一个叶绿体转运肽。
根据布达佩斯条约的条款，含有GTP-1的pBluescript SK载体pDG-3a．t．已于1995年2月7日保藏在农业研究培养物保藏中心(NRRL)1815N．University St．，Peoria，IL 61604，美国，NRRL保藏号为B-21399。
编码GTP-1的阿布属cDNA序列见SEQ ID NO：13，其编码的没有推测转运肽的成熟蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：14。实施例12：根据与阿布属GTP环化水解酶II／3，4-二羟-2-丁酮-4-磷酸合成酶编码序列的同源性，分离其它GTP环化水解酶II／3，4-二羟-2-丁酮-4-磷酸合成酶基因
以每个10cm培养皿约8，000pfu的密度将噬菌体或质粒文库铺板，37℃生长7小时后制备噬菌斑影印滤膜。以采用PrimeTime试剂盒(International Biotechnologies，Inc．，New Haven，CT)随机引物法标记了32P-dCTP的SEQ ID NO：13所示cDNA杂交噬菌斑影印滤膜。杂交条件是7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mM EDTA，50℃。杂交过夜后，滤膜用2XSSC，1％SDS于50℃洗涤。放射自显影检测阳性杂交噬菌斑。纯化至单噬菌斑后，分离插入的cDNA，采用荧光染料标记双脱氧链终止法(Applied Biosystems，Inc．，Foster City，CA)测定其序列。本领域普通技术人员可采用该实验程序从任何其它植物种中获得基本与阿布属编码序列(SEQ ID NO：13)相似的双功能GTP环化水解酶II／3，4-二羟-2-丁酮-4-磷酸合成酶基因。实施例13：重组植物GTP环化水解酶II／DHBP合成酶在大肠杆菌中的表达和纯化
为在大肠杆菌中生产重组高等植物2，4-二氧四氢蝶啶合成酶，使用两步PCR法在pET-32a(Novagen，Inc．，Madison，WI)中产生阿布属GTP环化水解酶II／3，4-二羟-2-丁酮-4-磷酸合成酶cDNA(SEQ ID NO：13)与硫氧还蛋白5’末端(LaVallie等，(1992)生物工艺学(Biotechnology)11：187-193(1992))的翻译融合物。采用合成寡核苷酸引物DG-392a(SEQ ID NO：17)和DG-393a(SEQ ID NO：18)进行聚合酶链式反应，扩增一长度为939-bp的DNA片段。用NcoI和EcoRI消化该PCR产物。在低熔点琼脂糖胶上分离消化产物，并切下这些片段。同时，用NcoI和EcoRI消化pET32a质粒。在胶上分离消化产物，并从胶中切下pET32a载体。将该载体片段与该PCR产物相连，连接产物转化至感受态大肠杆菌XL1 Blue细胞(Stratagene，La Jolla，CA)中。
筛选并培养氨苄青霉素抗性菌落，并提取其质粒DNA。该质粒的结构用荧光染料标记双脱氧链终止法(Applied Biosystems，Inc．，Foster City，CA)测序确证。具有期望结构的重组质粒命名为pET32aGTP-1。
然后使用合成寡核苷酸引物DG-390a(SEQ ID NO：19)和DG-391a(SEQ ID NO：20)进行聚合酶链式反应，扩增长度为662-bp的DNA片段。用NcoI消化该PCR产物。在低熔点琼脂糖胶上分离消化产物，并切下该片段。同时，用NcoI消化pET32aGTP-1质粒。在胶上分离消化产物，并从胶中切下pET32aGTP-1载体。将该载体片段与该PCR产物相连，连接产物转化至感受态大肠杆菌XL1 Blue细胞(Stratagene，La Jolla，CA)中。
筛选并培养氨苄青霉素抗性菌落，并提取其质粒DNA。该质粒的结构用荧光染料标记双脱氧链终止法(Applied Biosystems，Inc．，Foster City，CA)测序确证。具有期望结构的重组质粒命名为pET32aGTP-2。
将质粒pET32aGTP-2转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，根据厂家说明书(pET System Manual，Novagen，Inc．，Madison W1)表达并纯化重组蛋白。从该菌株获得的融合蛋白含有大肠杆菌硫氧还蛋白的约132个氨基酸，His标签和凝血酶切割位点，随后是阿布属GTP环化水解酶II／3，4-二羟-2-丁酮-4-磷酸合成酶的推测成熟编码序列。实施例14：通过DNA改组体外重组核黄素生物合成基因
PCR扩增编码核黄素生物合成蛋白(例如SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：14)的植物核黄素生物合成基因(例如，SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：13)。基本按已述方法(Stemmer等(1994)美国科学院院刊91：10747-10751)，将所获DNA片段以DNaseI消化处理，然后从反应混合物中除去PCR引物。进行无引物的PCR反应，之后进行有引物的PCR反应，两者均参见Stemmer等(1994)美国科学院院刊91：10747-10751。将所获DNA片段克隆至pTRC99a(Pharmacia，Cat no：27-5007-01)，并通过例如采用Biorad Gene Pulser和生产厂商的条件进行的电穿孔，将其转化至过氧化酶突变宿主中。转化宿主生长于含有抑制性浓度抑制剂的培养基上，所述抑制剂是根据上述一方法选定的，然后筛选抑制剂存在时生长的菌落。挑取存在正常抑制浓度的抑制剂时生长的菌落，并重复划线纯化。纯化其质粒，然后测定从通过该测试的质粒来源的插入cDNA的DNA序列。
在类似反应中，将含有编码核黄素生物合成蛋白的本发明植物核黄素生物合成基因的PCR扩增DNA片段，与含有不同宿主来源的核黄素生物合成基因的PCR扩增DNA片段，进行体外重组。然后根据上述方法回收具有改良抑制剂耐受性的所得变体。实施例15：通过交叉延伸法体外重组核黄素生物合成基因
将编码核黄素生物合成蛋白(例如，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：14)的植物核黄素生物合成基因(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13)和其它宿主来源的相应核黄素生物合成基因均克隆至pBluescript载体的多克隆接头处。PCR反应采用“反向引物”和“M1320引物”(StratageneCatalog)基本参照Zhao等所述方法(Zhao等．(1998)NatureBiotechnology 16∶258-261)进行。扩增的PCR片段以合适的限制性酶消化并克隆至pTRC99a中，然后根据实施例14所述方法筛选突变的核黄素生物合成基因。
对在此描述的本发明的各种改变将为本领域技术人员所明了。这些改变将包括在所附权利要求的范围之内。
序列表(1)一般信息：
(i)申请者：
(A)姓名：Novartis AG
(B)街道：Schwarzwaldallee 215
(C)城市：巴塞尔(Basel)
(D)国家：瑞士
(E)邮政编码(ZIP)：4058
(F)电话：+41613241111
(G)传真：+41613227532
(ii)发明名称：植物核黄素生物合成基因及其应用
(iii)序列数：20
(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM兼容PC
(C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1．0，Version#1．30(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：991碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(ix)特征
(A)名称／关键词：CDS
(B)位置：35．．718
(D)其它信息：／产物=″2，4-二氧四氢蝶啶合成酶″(xi)序列描述：SEQ ID NO：1AGAGAACCGT CTCTAAAACT CCGACGAACG AAAA ATG AAG TCA TTA GCT TCG52Met Lys Ser Leu Ala Ser1                     5CCG CCG TGT CTC CGC CTG ATA CCG ACG GCA CAC CGT CAG CTC AAT TCG100Pro Pro Cys Leu Arg Leu Ile Pro Thr Ala His Arg Gln Leu Asn Ser10                   15                      20CGT CAA TCT TCC TCC GCC TGT TAT ATA CAC GGT GGC TCT TCT GTG AAC148Arg Gln Ser Ser Ser Ala Cys Tyr Ile His Gly Gly Ser Ser Val Asn25                   30                      35AAA TCC AAT AAT CTC TCA TTC TCC TCA TCC ACA TCC GGA TTT GCG TCA196Lys Ser Asn Asn Leu Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser Gly Phe Ala Ser4                    45                      50CCA CTA GCT GTA GAG AAG GAA TTA CGC TCT TCA TTC GTA CAG ACG GCT244Pro Leu Ala Val Glu Lys Glu Leu Arg Ser Ser Phe Val Gln Thr Ala55                   60                     65             70GCT GTT CGC CAT GTT ACG GGG TCT CTT ATC AGA GGC GAA GGT CTT AGA292Ala Val Arg His Val Thr Gly Ser Leu Ile Arg Gly Glu Gly Leu Arg75                    80                      85TTC GCC ATC GTG GTA GCT CGT TTC AAT GAG GTT GTG ACT AAG TTG CTT340Phe Ala Ile Val Val Ala Arg Phe Asn Glu Val Val Thr Lys Leu Leu90                    95                      100TTG GAA GGA GCG ATT GAG ACT TTC AAG AAG TAT TCA GTC AGA GAA GAA388Leu Glu Gly Ala Ile Glu Thr Phe Lys Lys Tyr Ser Val Arg Glu Glu105                  110                  115GAC ATT GAA GTT ATT TGG GTT CCT GGC AGC TTT GAA ATT GGT GTT GTT436Asp Ile Glu Val Ile Trp Val Pro Gly Ser Phe Glu Ile Gly Val Val120                  125                   130GCA CAA AAT CTT GGG AAA TCG GGA AAA TTT CAT GCT GTT TTA TGT ATC484Ala Gln Asn Leu Gly Lys Ser Gly Lys Phe His Ala Val Leu Cys Ile135                  140                   145            150GGC GCT GTG ATA AGA GGA GAT ACC ACA CAT TAT GAT GCT GTT GCC AAC532Gly Ala Val Ile Arg Gly Asp Thr Thr His Tyr Asp Ala Val Ala Asn155                  160                   165TCT GCT GCG TCT GGA GTA CTT TCT GCT AGC ATA AAT TCA GGC GTT CCA580Ser Ala Ala Ser Gly Val Leu Ser Ala Ser Ile Asn Ser Gly Val Pro170                  175                   180TGC ATA TTT GGT GTA CTG ACT TGC GAG GAC ATG GAT CAG GCT CTG AAT628Cys Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys Glu Asp Met Asp Gln Ala Leu Asn185                  190                   195CGA TCT GGT GGC AAA GCC GGC AAT AAG GGA GCT GAA ACT GCT TTG ACG676Arg Ser Gly Gly Lys Ala Gly Asn Lys Gly Ala Glu Thr Ala Leu Thr200                  205                   210GCG CTC GAA ATG GCG TCG TTG TTT GAG CAC CAC CTG AAA TAG718Ala Leu Glu Met Ala Ser Leu Phe Glu His His Leu Lys  *  215                        220                       225CTCGGCTCGT TCGATGGATG AACATGATCA CGTATGAGAA CCTCTTGATG TTGTCCCATT778TGGTTACAAT CCAGTCTCTG AAATTGTTTG TACCTCAAAG ATTGTCCAAA TGTTTTACCC838TTGGTTACCA AATCAATTAA ACGCTTTTGT AAGCTTCTGG CCTTGTTTTT TTTTTTTGAA898TCGTATGATA ATAATAATTC CTCCGAATTT TGGGGTCTTT CTGTACTAAT CAAAAATGTG958ATCTTCTTTG TTGTAAAAAA AAAAAAAAAA AAA991(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：228个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Lys Ser Leu Ala Ser Pro Pro Cys Leu Arg Leu Ile Pro Thr Ala1                   5                            10        15His Arg Gln Leu Asn Ser Arg Gln Ser Ser Ser Ala Cys Tyr Ile His20                  25                           30Gly Gly Ser Ser Val Asn Lys Ser Asn Asn Leu Ser Phe Ser Ser Ser35                  40                           45Thr Ser Gly Phe Ala Ser Pro Leu Ala Val Glu Lys Glu Leu Arg Ser  50                    55                    60Ser Phe Val Gln Thr Ala Ala Val Arg His Val Thr Gly Ser Leu Ile65                    70                    75             80Arg Gly Glu Gly Leu Arg Phe Ala Ile Val Val Ala Arg Phe Asn Glu85                    90                    95Val Val Thr Lys Leu Leu Leu Glu Gly Ala Ile Glu Thr Phe Lys Lys100                   105                   110Tyr Ser Val Arg Glu Glu Asp Ile Glu Val Ile Trp Val Pro Gly Ser115                   120                   125Phe Glu Ile Gly Val Val Ala Gln Asn Leu Gly Lys Ser Gly Lys Phe130                   135                   140His Ala Val Leu Cys Ile Gly Ala Val Ile Arg Gly Asp Thr Thr His145                   150                   155           160Tyr Asp Ala Val Ala Asn Ser Ala Ala Ser Gly Val Leu Ser Ala Ser165                   170                   175Ile Asn Ser Gly Val Pro Cys Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys Glu Asp180                   185                   190Met Asp Gln Ala Leu Asn Arg Ser Gly Gly Lys Ala Gly Asn Lys Gly195                   200                   205Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ala Leu Glu Met Ala Ser Leu Phe Glu His210                   215                   220His Leu Lys  *225(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：16碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3ATTTTGTAAC CAAGGG16(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：16碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=“DG-65”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4GGCAATAAGG GAGCTG16(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：22碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″JG-L″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5GTACCTCGAG TCTAGACTCG AG22(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：27碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″RS-1″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6AGCTACCATG GGAGGTTCTC ATACGTG27(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：27碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″RS-2″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7AGCTAGAGCT CACGAGAGAA CCGTCTC27(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：无
(D)拓扑结构：无
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8
Cys Ile Gly Ala Val Ile Arg Gly Asp Thr Thr
  1                 5                    10(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：16氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：无
(D)拓扑结构：无
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9
Lys Ala Gly Asn Lys Gly Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ala Leu GluMet
  1                 5               10                   15(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：30碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″DG-252″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10GATCCCATGG CTAAGTCATT AGCTTCGCCG30(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″DG-253″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11ATCGCCATGG CTGTTCGCCA TGTTACG27(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″DG-254″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12CAGTGAATTC CTAGAGCTAT TTCAGGTGGT G31(2)SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：1665个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(ix)特征
(A)名称／关键词：CDS
(B)位置：2．．1432
(D)其它信息：／产物=″双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13C TCA TTC ACC AAC GGA AAC ACT CCT CTC TCA AAT GGG TCT CTC ATT46Ser Phe Thr Asn Gly Asn Thr Pro Leu Ser Asn Gly Ser Leu Ile1               5                  10                  15GAT GAT CGG ACC GAA GAG CCA TTA GAG GCT GAT TCG GTT TCA CTT GGA94Asp Asp Arg Thr Glu Glu Pro Leu Glu Ala Asp Ser Val Ser Leu Gly20              25                 30ACA CTT GCT GCT GAT TCT GCT CCT GCA CCA GCC AAT GGT TTT GTT GCT142Thr Leu Ala Ala Asp Ser Ala Pro Ala Pro Ala Asn Gly Phe Val Ala35              40                 45GAA GAT GAT GAC TTT GAG TTG GAT TTA CCA ACT CCT GGT TTC TCT TCT190Glu Asp Asp Asp Phe Glu Leu Asp Leu Pro Thr Pro Gly Phe Ser Ser50              55                 60ATC CCT GAG GCC ATT GAA GAT ATA CGC CAA GGA AAG CTT GTG GTG GTT238Ile Pro Glu Ala Ile Glu Asp Ile Arg Gln Gly Lys Leu Val Val Val65              70                 75GTG GAT GAT GAA GAT AGG GAA AAT GAA GGG GAT TTG GTG ATG GCT GCT286Val Asp Asp Glu Asp Arg Glu Asn Glu Gly Asp Leu Val Met Ala Ala  80                  85                  90                 95CAG TTA GCA ACA CCT GAA GCT ATG GCT TTT ATT GTG AGA CAT GGA ACT334Gln Leu Ala Thr Pro Glu Ala Met Ala Phe Ile Val Arg His Gly Thr100                 105                  110GGG ATA GTT TGT GTG AGC ATG AAA GAA GAT GAT CTC GAG AGG TTG CAC382Gly Ile Val Cys Val Ser Met Lys Glu Asp Asp Leu Glu Arg Leu His115                 120                  125CTT CCT CTA ATG GTG AAT CAG AAG GAA AAC GAA GAA AAG CTC TCT ACT430Leu Pro Leu Met Val Asn Gln Lys Glu Asn Glu Glu Lys Leu Ser Thr130                 135                  140GCA TTT ACA GTG ACT GTG GAT GCA AAA CAT GGC ACA ACA ACG GGA GTA478Ala Phe Thr Val Thr Val Asp Ala Lys His Gly Thr Thr Thr Gly Val145                 150                  155TCA GCT CGT GAC AGG GCA ACA ACC ATA TTG TCT CTT GCA TCA AGA GAT526Ser Ala Arg Asp Arg Ala Thr Thr Ile Leu Ser Leu Ala Ser Arg Asp160                 165                  170              175TCA AAG CCT GAG GAT TTC AAT CGT CCA GGT CAT ATC TTC CCA CTG AAG574Ser Lys Pro Glu Asp Phe Asn Arg Pro Gly His Ile Phe Pro Leu Lys180                 185                  190TAT CGG GAA GGT GGG GTT CTG AAA AGG GCT GGA CAC ACT GAA GCA TCT622Tyr Arg Glu Gly Gly Val Leu Lys Arg Ala Gly His Thr Glu Ala Ser195                 200                   205GTT GAT CTC ACT GTT TTA GCT GGA CTG GAT CCT GTT GGA GTA CTT TGT670Val Asp Leu Thr Val Leu Ala Gly Leu Asp Pro Val Gly Val Leu Cys210                   215                   220GAA ATT GTT GAT GAT GAT GGT TCC ATG GCT AGA TTA CCA AAA CTT CGT718Glu Ile Val Asp Asp Asp Gly Ser Met Ala Arg Leu Pro Lys Leu Arg225                   230                   235GAA TTT GCC GCC GAG AAC AAC CTG AAA GTT GTT TCC ATC GCA GAT TTG766Glu Phe Ala Ala Glu Asn Asn Leu Lys Val Val Ser Ile Ala Asp Leu240                   245                   250           255ATC AGG TAT AGA AGA AAG AGA GAT AAA TTA GTG GAA CGT GCT TCT GCG814Ile Arg Tyr Arg Arg Lys Arg Asp Lys Leu Val Glu Arg Ala Ser Ala260                   265                  270GCT CGG ATC CCA ACA ATG TGG GGA CCT TTC ACT GCT TAC TGC TAT AGG862Ala Arg Ile Pro Thr Met Trp Gly Pro Phe Thr Ala Tyr Cys Tyr Arg275                   280                  285TCC ATA TTA GAC GGA ATA GAG CAC ATA GCA ATG GTT AAG GGT GAG ATT910Ser Ile Leu Asp Gly Ile Glu His Ile Ala Met Val Lys Gly Glu Ile290                   295                  300GGT GAC GGT CAA GAC ATT CTC GTG AGG GTT CAT TCT GAA TGT CTA ACA958Gly Asp Gly Gln Asp Ile Leu Val Arg Val His Ser Glu Cys Leu Thr305                   310                  315GGG GAC ATA TTT GGG TCT GCA AGG TGT GAT TGC GGG AAC CAG CTA GCA1006Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ala Arg Cys Asp Cys Gly Asn Gln Leu Ala320                   325                  330            335CTC TCG ATG CAG CAG ATC GAG GCT ACT GGT CGC GGT GTG CTG GTT TAC1054Leu Ser Met Gln Gln Ile Glu Ala Thr Gly Arg Gly Val Leu Val Tyr340                         345           350CTA CGT GGA CAT GAA GGA AGA GGG ATC GGT TTA GGA CAC AAG CTT CGA1102Leu Arg Gly His Glu Gly Arg Gly Ile Gly Leu Gly His Lys Leu Arg355                         360           365GCT TAC AAT CTG CAA GAT GCT GGT CGA GAC ACG GTT GAA GCT AAT GAG1150Ala Tyr Asn Leu Gln Asp Ala Gly Arg Asp Thr Val Glu Ala Asn Glu370                         375           380GAA TTA GGA CTT CCT GTT GAT TCT AGA GAG TAT GGA ATT GGT GCA CAG1198Glu Leu Gly Leu Pro Val Asp Ser Arg Glu Tyr Gly Ile Gly Ala Gln385                         390           395ATA ATA AGG GAT TTA GGT GTT AGG ACA ATG AAG CTG ATG ACA AAT AAT1246Ile Ile Arg Asp Leu Gly Val Arg Thr Met Lys Leu Met Thr Asn Asn400                         405           410             415CCC CCA AAG TAT GTT GGT TTG AAG GGA TAT GGA TTA GCC ATT GTT GGG1294Pro Pro Lys Tyr Val Gly Leu Lys Gly Tyr Gly Leu Ala Ile Val Gly420                         425           430AGA GTC CCT CTA TTG AGT CTT ATC ACG AAG GAG AAT AAG AGA TAT CTG1342Arg Val Pro Leu Leu Ser Leu Ile Thr Lys Glu Asn Lys Arg Tyr Leu435                         440           445GAG ACA AAG CGG ACC AAG ATG GGT CAC ATG TAT GGC TTG AAG TTC AAA1390Glu Thr Lys Arg Thr Lys Met Gly His Met Tyr Gly Leu Lys Phe Lys450                         455           460GGG GAT GTT GTG GAG AAG ATT GAG TCT GAA TCT GAG TCC TAA1432Gly Asp Val Val Glu Lys Ile Glu Ser Glu Ser Glu Ser *465                   470                 475GCTTAAAAAC CAGGACGAAC CGAATGGAAT CAAGAACTAT AGATATAATA CTTCCCAAAA1492AACAAGGAAA GAAATTGACA CAGAAGAAGA GGAAAAAGAC ATTTGATCTG TCTGAGAAAC1552TTGATTAGAT TGGTTTATGT TCTAATCTAA TCTGATTTGA TTTTTTTTTA TTTTGTCTAC1612GATTCTTGAG TTACGAAATG TTCATCATTT GTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA1665(2)SEQ ID NO：14的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：477个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14Ser Phe Thr Asn Gly Asn Thr Pro Leu Ser Asn Gly Ser Leu Ile Asp1                 5                    10                  15Asp Arg Thr Glu Glu Pro Leu Glu Ala Asp Ser Val Ser Leu Gly Thr20                25                   30Leu Ala Ala Asp Ser Ala Pro Ala Pro Ala Asn Gly Phe Val Ala Glu35                40                   45Asp Asp Asp Phe Glu Leu Asp Leu Pro Thr Pro Gly Phe Ser Ser Ile50                55                   60Pro Glu Ala Ile Glu Asp Ile Arg Gln Gly Lys Leu Val Val Val Val65                    70                  75               80Asp Asp Glu Asp Arg Glu Asn Glu Gly Asp Leu Val Met Ala Ala Gln85                    90                  95Leu Ala Thr Pro Glu Ala Met Ala Phe Ile Val Arg His Gly Thr Gly100                   105                 110Ile Val Cys Val Ser Met Lys Glu Asp Asp Leu Glu Arg Leu His Leu115                   120                 125Pro Leu Met Val Asn Gln Lys Glu Asn Glu Glu Lys Leu Ser Thr Ala130                   135                 140Phe Thr Val Thr Val Asp Ala Lys His Gly Thr Thr Thr Gly Val Ser145                   150                 155             160Ala Arg Asp Arg Ala Thr Thr Ile Leu Ser Leu Ala Ser Arg Asp Ser165                   170                 175Lys Pro Glu Asp Phe Asn Arg Pro Gly His Ile Phe Pro Leu Lys Tyr180                   185                 190Arg Glu Gly Gly Val Leu Lys Arg Ala Gly His Thr Glu Ala Ser Val195                   200                 205Asp Leu Thr Val Leu Ala Gly Leu Asp Pro Val Gly Val Leu Cys Glu210                   215                 220Ile Val Asp Asp Asp Gly Ser Met Ala Arg Leu Pro Lys Leu Arg Glu225                   230                 235             240Phe Ala Ala Glu Asn Asn Leu Lys Val Val Ser Ile Ala Asp Leu Ile245                   250                 255Arg Tyr Arg Arg Lys Arg Asp Lys Leu Val Glu Arg Ala Ser Ala Ala260                   265                 270Arg Ile Pro Thr Met Trp Gly Pro Phe Thr Ala Tyr Cys Tyr Arg Ser275                   280                 285Ile Leu Asp Gly Ile Glu His Ile Ala Met Val Lys Gly Glu Ile Gly290                   295                 300Asp Gly Gln Asp Ile Leu Val Arg Val His Ser Glu Cys Leu Thr Gly305                   310                 315             320Asp Ile Phe Gly Ser Ala Arg Cys Asp Cys Gly Asn Gln Leu Ala Leu325                   330                 335Ser Met Gln Gln Ile Glu Ala Thr Gly Arg Gly Val Leu Val Tyr Leu340                   345                 350Arg Gly His Glu Gly Arg Gly Ile Gly Leu Gly His Lys Leu Arg Ala355                   360                 365Tyr Asn Leu Gln Asp Ala Gly Arg Asp Thr Val Glu Ala Asn Glu Glu370                   375                 380Leu Gly Leu Pro Val Asp Ser Arg Glu Tyr Gly Ile Gly Ala Gln Ile385                   390                 395             400Ile Arg Asp Leu Gly Val Arg Thr Met Lys Leu Met Thr Asn Asn Pro405                   410                 415Pro Lys Tyr Val Gly Leu Lys Gly Tyr Gly Leu Ala Ile Val Gly Arg420                   425                 430Val Pro Leu Leu Ser Leu Ile Thr Lys Glu Asn Lys Arg Tyr Leu Glu435                   440                 445Thr Lys Arg Thr Lys Met Gly His Met Tyr Gly Leu Lys Phe Lys Gly450                   455                 460Asp Val Val Glu Lys Ile Glu Ser Glu Ser Glu Ser *465                   470                 475(2)SEQ ID NO：15的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：16碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″DG-67″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15GCTAATGAGG AATTAG16(2)SEQ ID NO：16的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：16碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″DG-69″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16TGATTCCATT CGGTTC16(2)SEQ ID NO：17的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″DG-392a″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17TGTCTCTTGC ATCAAGAG18(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″DG-393a″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18CAGTGAATTC TTAAGCTTAG GACTCAGATT CAG33(2)SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：25碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″DG-390a″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19GATCCCATGG GTTTCTCTTC TATCG25(2)SEQ ID NO：20的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：／desc=″DG-391a″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20CCGAGCCGCA GAAGCACG18

Claims (66)

1．包含分离自植物并编码核黄素生物合成所涉及酶的核苷酸序列的DNA分子，其中所述酶具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性或GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性。
2．根据权利要求1的DNA分子，其中的酶具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性。
3．根据权利要求2的DNA分子，其中所述酶具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。
4．根据权利要求2的DNA分子，其中所述酶含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。
5．含有分离自植物并编码具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性之酶的核苷酸序列的DNA分子，其中所述DNA分子可在如下条件下与根据权利要求4的DNA分子杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mM EDTA，50℃杂交；用2X SSC，1％SDS于50℃洗涤。
6．根据权利要求2的DNA分子，其中所述DNA分子可在如下条件下与SEQ ID NO：1所示编码序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mM EDTA，50℃杂交；用2X SSC，1％SDS于50℃洗涤。
7．根据权利要求2的分子，其中所述DNA分子包含与SEQ ID NO：1所示编码序列的一个连续20个碱基对序列相同的一个20个碱基对核苷酸序列。
8．根据权利要求2的DNA分子，其包含SEQ ID NO：1所示的编码序列。
9．根据权利要求1的DNA分子，其中所述酶具有双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性。
10．根据权利要求9的DNA分子，其中所述酶包含与SEQ ID NO：14所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。
11．根据权利要求9的DNA分子，其中所述酶包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列。
12．含有分离自植物并编码具有双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性之酶的核苷酸序列的DNA分子，其中所述DNA分子可在如下条件下与根据权利要求11的DNA分子杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mM EDTA，50℃杂交；用2X SSC，1％SDS于50℃洗涤。
13．根据权利要求9的DNA分子，其中所述DNA分子可在如下条件下与SEQ ID NO：13所示的编码序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mM EDTA，50℃杂交；用2X SSC，1％SDS于50℃洗涤。
14．根据权利要求9的DNA分子，其中所述DNA分子包含与SEQ IDNO：13所示编码序列的一个连续20个碱基对序列相同的一个20个碱基对核苷酸序列。
15．根据权利要求9的DNA分子，其包含SEQ ID NO：13所示编码序列。
16．包含与根据权利要求1的DNA分子操作性连接的启动子的嵌合基因。
17．包含根据权利要求16的嵌合基因的重组载体，其中所述载体能被稳定转化至宿主细胞中。
18．包含根据权利要求17的载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞能表达编码核黄素合成中涉及的酶的DNA分子。
19．根据权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、酵母细胞和植物细胞。
20．根据权利要求19的宿主细胞，其是细菌细胞。
21．制备编码具有改变的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的基因产物的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)改组根据权利要求2的DNA分子；
(b)表达所获改组核苷酸序列；和
(c)筛选与根据权利要求2的DNA分子所编码酶的活性相比改变的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性。
22．权利要求21的方法，其中核苷酸序列是SEQ ID NO：1。
23．可通过权利要求22的方法获得的改组DNA分子。
24．根据权利要求23的改组DNA分子，其中所述改组的DNA分子编码具有对2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性抑制剂增强耐受性的酶。
25．包含与根据权利要求23的改组DNA分子操作性连接的启动子的嵌合基因。
26．包含根据权利要求25的嵌合基因的重组载体，其中所述载体能被稳定转化至宿主细胞中。
27．包含根据权利要求26的载体的宿主细胞。
28．根据权利要求27的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、酵母细胞和植物细胞。
29．根据权利要求28的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
30．包含根据权利要求29的植物细胞的植物或种子。
31．根据权利要求30的植物，其中所述植物具有对2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的抑制剂的耐受性。
32．制备编码具有改变的双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性的基因产物的核苷酸序列的方法，其包含：
(a)改组根据权利要求9的DNA分子；
(b)表达所获改组核苷酸序列；和
(c)筛选与根据权利要求9的DNA分子所编码酶的活性相比改变的双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性。
33．权利要求32的方法，其中核苷酸序列是SEQ ID NO：13。
34．可通过权利要求33的方法获得的改组DNA分子。
35．根据权利要求34的改组DNA分子，其中所述改组的DNA分子编码具有对双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性抑制剂增强耐受性的酶。
36．包含与根据权利要求34的改组DNA分子操作性连接的启动子的嵌合基因。
37．包含根据权利要求36的嵌合基因的重组载体，其中所述载体能被稳定转化至宿主细胞中。
38．包含根据权利要求37的载体的宿主细胞。
39．根据权利要求38的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、酵母细胞和植物细胞。
40．根据权利要求39的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
41．包含根据权利要求40的植物细胞的植物或种子。
42．根据权利要求41的植物，其中所述植物具有对双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性的抑制剂的耐受性。
43．核黄素生物合成所涉及的分离的植物酶，其中所述酶具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性或双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性。
44．根据权利要求43的酶，其中所述酶具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性。
45．根据权利要求44的酶，其中所述酶包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。
46．根据权利要求44的酶，其中所述酶包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。
47．根据权利要求43的酶，其中所述酶具有双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性。
48．根据权利要求47的酶，其中所述酶包含与SEQ ID NO：14所示氨基酸序列基本相似的氨基酸序列。
49．根据权利要求47的酶，其中所述酶包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列。
50．筛选能够抑制2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性的化学品的方法，其包含步骤：
(a)在根据权利要求44的酶能催化2，4-二氧四氢蝶啶合成的条件下，在第一反应混合液中将该酶和2，4-二氧-5-氨基-6-核醇氨基-嘧啶以及3，4-二羟-2-丁酮磷酸混合；
(b)在与第一反应混合液相同的条件下，在第二混合液中将该
化学品和该酶与2，4-二氧-5-氨基-6-核醇氨基-嘧啶以及
3，4-二羟-2-丁酮磷酸混合；
(c)测定第一和第二反应混合液中产生的2，4-二氧四氢蝶啶
的量；和
(d)比较第一和第二反应混合液中产生的2，4-二氧四氢蝶啶
的量；其中如果第二反应混合液中产生的2，4-二氧四氢蝶啶的量比第一反应混合液中产生的2，4-二氧四氢蝶啶的量显著减少，则该化学品能抑制该酶的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性。
51．根据权利要求50的方法，其中第一反应混合物包含50μM的2，4-二氧-5-氨基-6-核醇氨基-嘧啶和0．5mM的3，4-二羟-2-丁酮磷酸。
52．根据权利要求50的方法，其中反应混合液中产生的2，4-二氧四氢蝶啶的量采用荧光计于407nm激发波长测定。
53．通过权利要求50的筛选方法鉴定的化学品。
54．抑制植物生长的方法，其包括将权利要求53的化学品应用于植物，从而该化学品抑制植物的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性。
55．筛选能够抑制双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性的化学品的方法，其包含步骤：
(a)在根据权利要求47的酶能分别催化2，5-二氨基-4-氧-6-
核糖氨基-嘧啶-5’-磷酸和3，4-二羟-2-丁酮磷酸合成的条件
下，在第一反应混合液中将该酶和GTP或5-磷酸核酮糖混合；
(b)在与第一反应混合液相同的条件下，在第二反应混合液中
将该化学品和该酶与GTP或5-磷酸核酮糖混合；
(c)测定第一和第二反应混合液中产生的2，5-二氨基-4-氧-6-
核糖氨基-嘧啶-5’-磷酸或3，4-二羟-2-丁酮磷酸的量；和
(d)比较第一和第二反应混合液中产生的2，5-二氨基-4-氧-6-
核糖氨基-嘧啶-5’-磷酸或3，4-二羟-2-丁酮磷酸的量；其中如果第二反应混合液中产生的2，5-二氨基-4-氧-6-核糖氨基-嘧啶-5’-磷酸或3，4-二羟-2-丁酮磷酸的量比第一反应混合液中产生的量显著减少，则该化学品能抑制该酶的双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶的活性。
56．通过权利要求55的筛选方法鉴定的化学品。
57．抑制植物生长的方法，其包括将权利要求56的化学品应用于植物，从而该化学品抑制植物的GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性。
58．包含含分离自植物并编码核黄素生物合成所涉及酶的核苷酸序列的DNA分子的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中所述酶具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性或GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性，并且其中所述DNA分子赋予所述植物、植物细胞、植物种子或植物组织对正常抑制核黄素生物合成量的除草剂的耐受性。
59．根据权利要求58的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中所述酶具有2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性，并且其中所述DNA分子赋予所述植物、植物细胞、植物种子或植物组织对抑制天然存在的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性量的除草剂的耐受性。
60．根据权利要求58的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中所述酶包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸基本相似的氨基酸序列。
61．根据权利要求59的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中所述DNA分子在如下条件下能与SEQ ID NO：1所示编码序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mM EDTA，50℃杂交；用2X SSC，1％SDS于50℃洗涤。
62．根据权利要求58的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中所述酶具有双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性，并且其中所述DNA分子赋予所述植物、植物细胞、植物种子或植物组织对抑制天然存在的双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成酶活性量的除草剂的耐受性。
63．根据权利要求62的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中所述酶包含与SEQ ID NO：14所示氨基酸基本相似的氨基酸序列。
64．根据权利要求62的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中所述DNA分子在如下条件下能与SEQ ID NO：13所示编码序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0．5MNaPO4pH7．0，1mM EDTA，50℃杂交；用2X SSC，1％SDS于50℃洗涤。
65．在种植作物种子或植物的作物田间选择性抑制杂草生长的方法，其包括步骤：
(a)种植除草剂耐受性作物或作物种子，其是根据权利要求59
的植物或植物种子；和
(b)将能抑制天然存在的2，4-二氧四氢蝶啶合成酶活性量的
除草剂应用于田间作物或作物种子和杂草，其中该除草剂抑
制了杂草的生长而不显著抑制作物的生长。
66．在种植作物种子或植物的作物田间选择性抑制杂草生长的方法，其包括步骤：
(a)种植除草剂耐受性作物或作物种子，其是根据权利要求39
的植物或植物种子；和
(b)将能抑制天然存在的双功能GTP环化水解酶II／DHBP合成
酶活性量的除草剂应用于田间作物或作物种子和杂草，其中
该除草剂抑制了杂草的生长而不显著抑制作物的生长。
CN99802488A 1998-01-30 1999-01-28 植物核黄素生物合成基因及其用途 Pending CN1289369A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10981098P 1998-01-30 1998-01-30
US60/109,810 1998-01-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1289369A true CN1289369A (zh) 2001-03-28

Family

ID=22329685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99802488A Pending CN1289369A (zh) 1998-01-30 1999-01-28 植物核黄素生物合成基因及其用途

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP1051504A2 (zh)
JP (1) JP2002501753A (zh)
KR (1) KR20010082509A (zh)
CN (1) CN1289369A (zh)
AU (1) AU744487B2 (zh)
BR (1) BR9908213A (zh)
CA (1) CA2318522A1 (zh)
CZ (1) CZ20002750A3 (zh)
HU (1) HUP0101278A3 (zh)
ID (1) ID25910A (zh)
IL (1) IL137303A0 (zh)
IN (1) IN2000CH00209A (zh)
MX (1) MXPA00007432A (zh)
PL (1) PL342805A1 (zh)
TR (1) TR200002193T2 (zh)
WO (1) WO1999038986A2 (zh)
ZA (1) ZA99716B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002522089A (ja) * 1998-08-12 2002-07-23 マキシジェン， インコーポレイテッド 除草剤選択性作物を生成するためのｄｎａシャッフリング
AU1979500A (en) * 1998-12-15 2000-07-24 Adelbert Bacher Method for screening for inhibitors of riboflavin biosynthesis
DE19910102B4 (de) * 1999-03-08 2006-06-01 Fischer, Markus, Dr.rer.nat. Proteinkonjugate, Verfahren, Vektoren, Proteine und DNA zu deren Herstellung, deren Verwendung, sowie Arzneimittel und Impfstoffe mit einem Gehalt derselben
DE19942175A1 (de) * 1999-09-03 2001-03-08 Adelbert Bacher Methode zum Auffinden von Inhibitoren der Riboflavinbiosynthese
AU2001248371A1 (en) * 2000-04-18 2001-10-30 Syngenta Participations Ag Amino acid:glyoxylate aminotransferase genes from plants and uses thereof
CN110964769B (zh) * 2019-11-29 2022-11-11 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU744487B2 (en) 2002-02-28
CZ20002750A3 (cs) 2000-11-15
AU2720299A (en) 1999-08-16
MXPA00007432A (en) 2001-02-01
IN2000CH00209A (zh) 2005-05-20
CA2318522A1 (en) 1999-08-05
EP1051504A2 (en) 2000-11-15
HUP0101278A2 (hu) 2001-08-28
PL342805A1 (en) 2001-07-02
WO1999038986A3 (en) 1999-09-23
KR20010082509A (ko) 2001-08-30
HUP0101278A3 (en) 2003-04-28
TR200002193T2 (tr) 2001-05-21
JP2002501753A (ja) 2002-01-22
BR9908213A (pt) 2000-11-28
IL137303A0 (en) 2001-07-24
WO1999038986A2 (en) 1999-08-05
ID25910A (id) 2000-11-09
ZA99716B (en) 1999-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1245516C (zh) 编码乙酰乳酸合酶基因的基因
CN1285875A (zh) 突变的羟基苯丙酮酸双氧化酶、基dna序列和含该基因且耐除草剂的植物的分离
CN1252273C (zh) 编码植物脱氧海普赖氨酸合成酶的dna,植物真核起始因子5a，转基因植物和控制植物衰老和程序性细胞死亡的方法
CN1263856C (zh) 真核生物中原卟啉原氧化酶酶活力的操作
CN1024021C (zh) 含谷胱甘肽s-转移酶基因的除莠剂耐性植物
CN1236394A (zh) 除草剂抗性植物
CN1201012C (zh) 改变植物开花时间的方法
CN1933723A (zh) 玉米植株mon88017和组合物以及检测它们的方法
CN1251136A (zh) 生长得到改造的植物
CN1742085A (zh) 用于增加谷物产量的基因及其用途
CN1341151A (zh) 除草剂的靶基因和方法
CN1852975A (zh) 转基因的高色氨酸植物
CN101048507A (zh) 一种增大种子大小的方法
CN1406282A (zh) 种子产量、生物量、和收获指数增加的转基因植物
CN1420932A (zh) 由表达serk相互作用蛋白质实现无融合生殖
CN1842601A (zh) 通过靶向抑制内源贮藏蛋白增强植物种子中异源多肽的累积
CN1131315C (zh) 植物中海藻糖的产生
CN1719971A (zh) 转基因高色氨酸植物
CN101037695A (zh) 一种控制水稻花粉育性基因及应用
CN1246464C (zh) 可增强植物对渗透压的抵抗力的新转录因子
CN1280622A (zh) 转基因植物中生育酚含量的操纵
CN101037696A (zh) 一种水稻冷害基因及应用
CN1294267C (zh) 携带新黄素裂解酶基因的转基因植物
CN1289369A (zh) 植物核黄素生物合成基因及其用途
CN1219966A (zh) 植物糖传感蛋白及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SINGENTA PARTICIPATION AG

Free format text: FORMER OWNER: NOVANNIS COMPANY

Effective date: 20011204

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20011204

Address after: Basel

Applicant after: Xingenta Shara Co., Ltd.

Address before: Basel

Applicant before: Novartis AG

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication