CN1280622A

CN1280622A - 转基因植物中生育酚含量的操纵

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Publication number: CN1280622A
Application number: CN98810737A
Authority: CN
Inventors: 伯恩哈德·格里姆; 田中亮一
Original assignee: INSTITUT fur PFLANZENGENTIC und KULTURPFLANFORSCHUNG
Current assignee: INSTITUT fur PFLANZENGENTIC und KULTURPFLANFORSCHUNG
Priority date: 1997-10-29
Filing date: 1998-10-29
Publication date: 2001-01-17
Also published as: CA2306458A1; BR9813165A; AU747854B2; EP1025250A2; WO1999023231A3; PL340335A1; AU1961699A; AR010953A1; DE19849960A1; SK5992000A3; HUP0003963A2; KR20010031660A; JP2001521745A; IL135391A0; WO1999023231A2; DE19752647C1; US6624342B1

Abstract

本发明涉及提供了编码牻牛儿牻牛儿还原酶的新的核酸序列、一种用于产生新植物的方法,其中所述植物含有新的核酸序列并且相对于野生型植物来说所述植物的生育酚和/或叶绿素的含量有所改变,本发明涉及这些植物及其部分、其产物和植物细胞以及所述的核酸序列用于影响转基因植物及其部分、产物和植物细胞的生育酚、叶绿素和/或维生素K₁的含量的用途。

Description

转基因植物中生育酚含量的操纵

本发明涉及编码牻牛儿牻牛儿还原酶的新的核酸序列、一种用于产生新植物的方法，所述植物含有新的核酸序列并且与野生型植物相比所述植物的生育酚和／或叶绿素的含量被改变，本发明涉及这些新的植物、其部分和产物与植物细胞以及所述的核酸序列用于操纵转基因植物、其部分和产物以及植物细胞中的生育酚、叶绿素和／或维生素K₁的含量的用途。

在植物的类异戊二烯代谢中，以C₂₀-中间体的形式生成双萜化合物牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)。它是由向法尼焦磷酸这种C₁₅-倍半萜中加入一个单位的异戊烯焦磷酸(IPP)而产生的。GGPP进入植物次级代谢的几条合成途径。例如，可以使两分子的GGPP“尾对尾”地连接起来以得到C₄₀-体这种四萜，通常称之为类胡萝卜素并且例如β-胡萝卜素属于这类物质。通过加入更多的IPP分子，GGPP进一步进入诸如橡胶(rubber)和杜仲胶之类的多萜类的生物合成中。

此外，可以将GGPP转化成其它的双萜、比如叶绿焦磷酸(PPP)。C₂₀-体叶绿醇在生育酚的生物合成(Soll与Schulz(1981)《生物化学与生物物理学研究通讯》99，907-912)和叶绿素的合成(Beale与Weinstein(1990)在：《血红素和叶绿素的生物合成》(Daily H．A．编辑)McGraw Hill，NY，287-391)中是一种必须的中间体。当所有叶绿素(叶绿素a，b，c等)的基本结构是由四个吡咯环组成的卟啉系时，其中通过类似于酯键的键穿过吡咯环Ⅳ将叶绿醇结合到所述的卟啉系上，生育酚的特征在于由尿黑酸和叶绿醇尾组成的结构。

通常称作维生素E的生育酚一族的物质包括若干种结构密切相关的亲脂的维生素，即α-、β-、γ-、δ-和ε-生育酚，其中在生物学领域中α-生育酚是最重要的。在许多植物油中可以发现生育酚，其中特别富含生育酚的是大豆、小麦、玉米、水稻、棉花、苜蓿和坚果的种子油。同样，水果和蔬菜、例如木莓、菜豆、豌豆、茴香、胡椒等也含有生育酚。就目前所知，生育酚仅仅在植物和具有光合作用活性的生物体中合成。

由于其氧化还原电位，生育酚有助于避免由空气中的氧气氧化不饱和脂肪酸；α-生育酚是人体内最重要的亲脂的抗氧化剂。据假定由于其起到了抗氧化剂的作用，因此生育酚有助于生物膜的稳定，这是因为所述膜的流动性是通过保护膜脂的不饱和脂肪酸来维持的。而且，根据近来的观察，定期地摄取相对高剂量的生育酚可以阻碍动脉硬化的形成。此外，已经描述了生育酚的积极的生理特性和影响，诸如推迟与糖尿病相关的晚期损伤、降低白内障形成的危险性、减少吸烟者中的氧化应激反应(stress)、抗致癌作用、防止诸如红斑(erythremes)和皮肤老化等的皮肤损伤的保护作用。

由于其氧化抑制特性，因此生育酚不仅用于食品技术应用领域，而且用于以天然油为基料的涂料、除臭剂以及其它诸如防晒剂、皮肤护理剂、口红等的化妆品中。在这些应用中，对于在促进循环和脂质还原剂中用作维生素E以及在兽医应用中用作食品添加剂而言，类似于醋酸生育酚和琥珀酸生育酚这样的生育酚化合物是常用的应用形式。

在生育酚的生物合成中、尤其是在α-生育酚的生物合成中，人们相信叶绿焦磷酸是限制因子。先前的研究表明PPP是通过类异戊二烯基团的顺序氢化由GGPP生成的，在该反应过程中，二氢-GGPP和四氢-GGPP作为中间体而生成(GGPP-＞二氢-GGPP-＞四氢-GGPP-＞PPP；例如参阅Bollivar等人(1994)《生物化学》33，12763-12768)。

正如目前假定的那样，GGPP至PPP的逐步的氢化是由牻牛儿牻牛儿还原酶(GGPP还原酶，又称作牻牛儿牻牛儿焦磷酸氢化酶和GGPP氢化酶)催化的，其中所述酶是由植物中的Chl P基因编码的。牻牛儿牻牛儿还原酶属于类异戊二烯代谢过程并且在两条代谢途径、即生育酚的生物合成和叶绿素的生物合成中发挥作用。

首次针对叶绿素的生物合成已经表明该酶的重要作用(Benz等人(1980)《植物科学通讯》19，225-230；Soll与Schultz(1981)《生物化学与生物物理学研究通讯》99，907-912；Schoch等人(1977)《Z．Pflanzenphysiol．》83，427-436)。叶绿素生物合成中的最后一步是叶绿素酯的酯化，其中所述反应可以与叶绿素焦磷酸以及牻牛儿牻牛儿焦磷酸一起发生。在荚膜红细菌突变体的系统化研究中，可以证明在第一步中以GGPP酯化菌绿素酯并且接下来氢化酯化的叶绿素-GG(Katz等人(1972)《美国化学协会杂志》94，7938-7939)。在高等植物中，可以在大多数部分中发现叶绿基叶绿素(叶绿素-P)(Rudiger与Schoch(1991)在：《叶绿素》(Scheer，H．编辑)第451-464页，CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达州，美国)。迄今为止仍未阐明的是何种底物参与了植物中所述还原酶的反应。目前，据假定植物的牻牛儿牻牛儿还原酶能够将叶绿素-GG转化为叶绿素-P(Schoch等人(1978)《Z．Pflanzenphysiol．》83，427-436)并且能够将GGPP氢化为PPP，然后将PPP连接到叶绿素酯上(Soll等人(1983)《植物生理学》71，849-854)。

GGPP作为叶绿体外膜中生育酚和叶绿醌的合成途径以及类囊体膜中叶绿素合成的底物。在1983年，由Soll等人(《植物生理学》(1983)71，849-854)首次描述了GGPP至PPP的还原反应。但是直至今日，编码所述植物酶并且可以用于操纵转基因植物中生育酚含量的核酸序列的分离和鉴定仍是不成功的。

牻牛儿牻牛儿还原酶在生育酚和叶绿素代谢中的重要作用使得该酶在分子生物技术中成为了一种特别有价值的工具。通过诸如转化编码牻牛儿牻牛儿还原酶的DNA序列之类的分子生物学技术，在植物中实现生育酚和／或叶绿素生物合成性能的改变应当是可能的。通过这种方式，例如生产出具有生育酚含量增加或减少的转基因植物将成为可能。这样的转基因植物及其部分、细胞和／或产物随后可以用作食品和饲料，并且一般说来作为用于化工、药物和化妆品工业应用领域中的生育酚的生产中心。

此外，有理由期望与野生型植物相比显示出抗氧化的生育酚含量提高的植物同样表现出抗应激条件、尤其是抗氧化应激的耐受性的提高。

因此，本发明的一个目的是提供新的核酸序列，其中借助所述的核酸序列，在植物、植物细胞、植物部分和／或植物产物中可以操纵生育酚的含量。

此外，本发明的一个重要的目的是提供与野生型植物相比具有改变了生育酚含量的转基因植物、植物细胞、植物产物和植物部分。

本发明进一步的目的是显示如何将本发明的DNA序列、其基因产物以及本发明的转基因植物用于植物育种实践中的可能方式。

从下面的描述中将会看出本发明进一步的目的。通过导致生育酚含量改变的独立权利要求的主题解决了这些问题，其中特别是基于所提供的本发明的DNA序列、直接参与生育酚生物合成的基因产物以及这些DNA序列向植物中的转移。

因此，本发明涉及编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶(又称作牻牛儿牻牛儿焦磷酸氢化酶)的生物活性的蛋白或其生物活性片段的DNA序列。就本发明而言，生物活性片段是指所介导的生物活性足以影响生育酚的含量。更具体地讲，本发明涉及从植物中分离出来的并且编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶的酶活性的蛋白或其生物活性片段的DNA序列。特别优选的是SEQ：ID NO．1中所示的DNA序列(也可参见图1)。

此外，本发明涉及编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶生物活性的蛋白的本发明DNA序列的等位基因和衍生物，所述的等位基因和衍生物尤其是核酸分子，由于遗传密码的简并性，它们的序列不同于本发明的DNA序列，并且所述的等位基因和衍生物编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶生物活性的蛋白或其片段。

再者，本发明涉及包括本发明的DNA序列的核酸分子、或者通过天然存在的或者通过基因技术或化学方法和合成方法由本发明的序列产生的核酸分子或者从中推导出的核酸分子。所述核酸分子可以是任何形式的核酸，诸如DNA或RNA分子、cDNA、基因组DNA、mRNA等。

本发明还涉及核酸分子，其中使本发明的DNA序列与在植物细胞中提供转录、并且如果希望的话还提供翻译的调节元件结合。

因此，例如在组成型调节元件的控制下、但同样在诱导型或组织特异性或发育特异性调节元件的控制下，在植物细胞中表达本发明的DNA序列是可能的，所述的调节元件具体是指启动子。例如当诱导型启动子的使用使得在植物细胞中实现特异地引发的本发明DNA序列的表达成为可能时，组织特异性(例如种子特异性)启动子的使用提供了在特异性组织中(例如在种子组织中)改变生育酚含量的可能性。因此，在本发明一个优选的实施方案中，本发明的DNA序列与组织特异性启动子结合、具体地与种子特异性启动子结合。

本发明进一步涉及由本发明的DNA序列或本发明的核酸分子编码的具有牻牛儿牻牛儿还原酶生物活性的蛋白或其活性片段。优选地，所述蛋白是植物的牻牛儿牻牛儿还原酶，优选所述的蛋白来自烟草，特别优选的是具有SEQ：ID No．2中所示的氨基酸序列的蛋白(也可参见图2)或其活性片段。

本发明进一步的目的是提供载体和微生物，它们的使用使得产生其中实现了生育酚含量改变的新的植物成为可能。通过提供本发明的载体和微生物来解决这一问题，所述的载体和微生物包括编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶活性的酶的核酸序列。

因此，本发明还涉及载体(具体地讲为质粒、粘粒、病毒、噬菌体)以及在遗传工程中常用的其它载体，如上所述该载体包括本发明的核酸分子，并且如果希望的话，该载体可以用于把本发明的核酸分子转移到植物和植物细胞中。

本发明还涉及含有本发明的核酸序列的转化的微生物，诸如细菌、病毒、真菌、酵母等。

在一个优选的实施方案中，使包含在载体中的核酸分子与在原核细胞和真核细胞中提供转录并且如果希望的话还提供翻译的调节元件结合。

如果希望的话，可以用增强子序列或者其它调节序列补充本发明的核酸序列。这些调节序列例如还包括提供了将基因产物运送到某一细胞小室中的信号序列。

同样地，本发明的目的为提供与野生型植物相比显示出改变了生育酚含量的新的植物、植物细胞、植物部分或植物产物，这可能与叶绿素生物合成性能的变化有关联。

通过转移本发明的核酸分子并且在植物中进行表达来解决这些问题。通过提供本发明的核酸分子，目前通过基因技术的方法以这样的一种方式来操纵植物细胞是可能的，所述的方式即与野生型细胞相比，所述植物细胞表现出新的或者改变了的牻牛儿牻牛儿还原酶的活性，结果显示出改变了的生育酚的生物合成性能以及变化了的生育酚的含量。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及与野生型植物相比其中的生育酚含量有所提高的植物和植物细胞及其部分，这是由于本发明的核酸分子的存在与表达所致。

本发明还涉及一些植物，其中本发明的核酸分子的转移导致生育酚和／或叶绿素的含量降低。生育酚和／或叶绿素生物合成的产率的降低例如可以通过反义构建体的转移或者诸如共抑制之类的其它抑制机制来达到。

此外，本发明涉及转基因植物细胞和包括所述植物细胞的植物及其部分和产物，其中将所述新的核酸分子整合到植物的基因组中。本发明还涉及一些植物，其中在所述植物的细胞中，本发明的核酸序列以自我复制的形式存在、即所述植物细胞在自主的核酸分子上含有外源DNA。

用本发明的核酸分子转化的并且其中由于所述分子的转移合成出改变了数量的生育酚和／或叶绿素的植物原则上可以是任意的植物。优选地，该植物是单子叶的或者双子叶的有用的植物。单子叶植物的例子是属于燕麦属(燕麦)、小麦属(小麦)、黑麦属(黑麦)、大麦属(大麦)、稻属(水稻)、稷属、狼尾草属、狗尾草属、蜀黍属(小米)、玉米属(玉米)。有用的双子叶植物特别是豆科的植物、诸如豆类，并且尤其是苜蓿、大豆、油菜、番茄、甜菜、马铃薯、观赏植物、树木。其它有用的植物例如可以是结果实的植物(特别是苹果树、梨树、樱桃树、葡萄树、柑橘属果树、菠萝树和香蕉树)、油棕榈树、茶树、可可与咖啡树、烟草、剑麻、棉花、亚麻、向日葵以及药用植物和牧草、饲料用谷类植物和饲用植物。特别优选的是谷类作物、谷类植物、小麦、黑麦、燕麦、大麦、水稻、玉米和小米、饲料用谷类植物、甜菜、油菜、大豆、番茄、马铃薯、香草、饲料用草、饲用牧草以及三叶草。不言而喻的是本发明特别涉及普通的食用和饲用植物。在本文中，除了已经提及的植物以外，还将提及的有花生、小扁豆、饲用豆类(Ackerbohne)、饲用甜菜(mangel)、荞麦、胡萝卜、菊芋、芸苔属植物(rapa、oleifera、napus、rapifera)、白芥和swede。

而且，本发明涉及本发明的植物的繁殖材料，诸如种子、果实、插条、块茎、根状茎等，由此该繁殖材料可以含有上述的转基因植物细胞以及所述植物的部分，诸如原生质体、植物细胞和愈伤组织。

本发明进一步涉及植物细胞，其中由于本发明核酸分子的存在并且如果希望的话所述的核酸分子还进行表达，因此所述植物细胞与不含该核酸分子的植物细胞相比具有改变了含量的维生素K₁。特别是在植物中存在的亲脂的维生素K₁在凝血因子的形成中起到了重要的作用；维生素K₁的缺乏导致血液凝固能力的降低，这也正是维生素K₁为何又被称作抗出血维生素或凝血维生素的原因。由于本发明核酸分子的表达造成了牻牛儿牻牛儿还原酶活性的改变并从而造成了PPP-合成状况的改变，并且考虑到称作维生素K₁的叶绿醌与生育酚相类似包括一个单位的叶绿醇的事实，因此本发明还涉及这样的植物细胞和植物，它们单独地表现出维生素K₁含量的改变或者同时还表现出生育酚含量的改变。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及转基因植物细胞和植物及其部分和产物，由于编码植物的牻牛儿牻牛儿还原酶的DNA序列的存在并且如果希望的话所述DNA序列还进行表达，因此与未转化的细胞相比，上述物质具有改变了的生育酚的含量。包含在植物细胞中的DNA序列优选为从烟草中分离出来的编码牻牛儿牻牛儿还原酶的序列。特别优选的是如SEQ：IDNo．1中所示的DNA序列(也可参见图1)。在一个特别优选的实施方案中，本发明的DNA序列编码牻牛儿牻牛儿还原酶的前酶(pre-enzyme)，它包括用于转运到质体中的转运序列。

本发明进一步涉及植物，在该植物中除了chl P基因以外，还表达用于羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPD)的基因。HPD酶催化4-羟苯基丙酮酸反应为尿黑酸，如上所述，尿黑酸代表着除叶绿醇之外的生育酚的第二前体。其中，在Norris等人(1995)的《植物细胞》7，2139-2149中描述了HPD酶及其在植物的类异戊二烯代谢中的作用。

通过分别编码牻牛儿牻牛儿还原酶和HPD的序列的共表达、且优选超量表达，与仅含有编码chl P的本发明的序列的植物相比，可以进一步提高转基因植物中生育酚的含量。

在进一步的实施方案中，本发明涉及已用如上所述的核酸分子或载体转化或感染的宿主细胞(尤其是原核细胞或真核细胞)，以及由所述宿主细胞产生的并且含有所述的核酸分子或载体的细胞。该宿主细胞例如可以是细菌、藻类、酵母和真菌的细胞以及植物或动物的细胞。本发明还涉及这样的一种宿主细胞，所述细胞不仅含有本发明的核酸分子，而且进一步含有通过基因技术或者自然地转移的一个或多个核酸分子，它们携带有参与了生育酚、叶绿素和／或维生素K₁的生物合成的酶的遗传信息。

本发明进一步的目的为提供用于产生显示出改变了生育酚含量的植物细胞和植物的方法。

通过一些方法来解决这一问题，其中由于编码牻牛儿牻牛儿还原酶的核酸分子的转移，通过所述的方法可能产生显示出改变了生育酚含量的新的植物和植物细胞。

此外，通过另一些方法来解决这一问题，其中通过所述的方法可能产生新的植物细胞和植物，由于编码牻牛儿牻牛儿还原酶的核酸分子和编码HPD的核酸分子的共转移或者由于编码牻牛儿牻牛儿还原酶和编码HPD的核酸分子的转移，所述的植物细胞和植物与野生型植物相比显示出改变了的生育酚的含量。

为了产生这样的新的植物细胞和植物，可以采用几种不同的方法。一方面，可以通过常规基因技术的转化方法以把新的核酸分子整合到植物基因组中的这样的一种方式来改造植物和植物细胞，这就意味着产生了稳定的转化体。另一方面，也可以将本发明的核酸分子以自我复制系统的形式引入植物细胞或植物中，其中所述核酸分子的存在并且如果希望的话所述核酸分子的表达造成了生育酚生物合成状况的改变。例如，本发明的核酸分子可以包含在与植物或植物细胞接触的病毒中。

根据本发明，由于本发明核酸序列的表达而显示出改变了生育酚含量的植物细胞是由包括下列步骤的方法产生的：

a)制备包括下列DNA序列的表达盒：

-在植物细胞中提供转录的启动子；

-至少一种编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶的酶活性的蛋白或片段的核酸序列，由此将所述的核酸序列以有义的取向连接到所述启动子的3’端；以及

-如果希望的话，用于转录终止并向各自的转录物中添加一个聚腺苷酸尾的终止信号，其中将终止信号连接到编码区的3’端；

b)用步骤a)中产生的表达盒转化植物细胞；

c)再生出转基因植物，并且如果希望的话繁殖所述的植物。

作为一种可供选择的方法，可以将本发明的一种或多种核酸序列以自我复制系统的形式引入植物细胞或植物中。

在另一种可供选择的方法中，上述方法的步骤a)可以以这样的一种方式加以改进，即将编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶的酶活性的蛋白或片段的至少一种本发明的核酸序列以反义的取向连接到所述启动子的3’端。

本发明进一步的目的为表明本发明的核酸序列以及含有这些核酸序列的核酸分子的有利的应用情况。

通过所述新的DNA分子用于产生植物细胞和植物的本发明的用途来解决这一问题，其中所述的植物细胞和植物与野生型细胞和野生型植物相比表现出生育酚含量有所改变、优选有所增加。

此外，本发明涉及本发明的核酸序列用于产生显示出改变了叶绿素含量的植物的用途。

再者，本发明涉及本发明的核酸序列用于产生显示出改变了维生素K₁含量、优选有所增加的植物的用途。

本发明进一步的目的为显示出本发明的植物及其细胞、部分和产物的可能的用途。

本发明特别涉及本发明的植物作为饲用和／或食用植物的用途。取决于在有用的转基因植物及其产物和部分当中所实现的维生素E和／或维生素K₁的含量的增加，可以降低各种维生素、尤其是维生素E的数量，通常以别的方式将它们混合到饲料／食品中并且经常也需要它们。在某些情况下，常规地补充维生素就变得多余了。除此以外，本发明通常涉及通过增加生育酚和／或叶绿醌的含量来增强有用植物的营养价值。

此外，本发明涉及本发明的植物细胞、植物、其部分和产物作为维生素E和／或维生素K₁的生产场所的用途。除了由于其维生素的特性而导致的应用以外、例如在饮食和药物、化妆品、皮肤护理品中通常补充维生素E等，生育酚在诸如类脂和油这样的化学产品中还用作抗氧化剂。因此，本发明的植物为在很广泛的商业目的中生产生育酚和／或维生素K₁提供了一个重要的来源。

本发明进一步涉及与种子特异性启动子结合的本发明的核酸序列用于产生植物的用途，其中具体地讲来种子组织表现出生育酚含量有所改变、优选有所增加。在本发明的一个优选的实施方案中，将本发明的核酸序列与USP(Baumlein等人(1991)《分子基因遗传学》225，459-467)或大麦醇溶蛋白启动子(Brandt等人(1985)《Carlsberg Res．Commun．》50，333-345)结合使用。

通过以反义的方式使用本发明的DNA序列，所提到的启动子、特别是种子特异性启动子对特异性地降低转基因种子中生育酚和叶绿素的含量尤其有用。

此外，本发明涉及牻牛儿牻牛儿还原酶基因用于在植物中产生改变了生育酚含量的用途。

而且，为了实现在植物中生育酚含量的改变，本发明涉及具有牻牛儿牻牛儿还原酶的酶活性的蛋白的用途。

此外，本发明涉及本发明的核酸分子、具有牻牛儿牻牛儿还原酶活性的本发明的蛋白和／或具有新的或改变了的牻牛儿牻牛儿还原酶活性的本发明的转基因植物和宿主细胞用来鉴定用于植物保护的新的除草物质的用途。由于牻牛儿牻牛儿还原酶在叶绿素和生育酚生物合成中的关键性的作用，因此本发明的DNA序列以及由其编码的蛋白是除草剂研究中的一个极有价值的目标。例如，在通过下列技术得到的数据和知识的基础上，为了鉴定或合成出牻牛儿牻牛儿还原酶的抑制剂或效应物并从而得到潜在的除草剂，可以使用本发明具有牻牛儿牻牛儿还原酶活性的蛋白来进行X-射线结构分析、NMR光谱分析、分子模拟和药物设计。

本发明进一步涉及本发明的核酸序列用于产生耐除草剂的植物的用途。编码牻牛儿牻牛儿还原酶的序列可以通过标准的技术进行修饰，或者可以补充上新的序列元件、并且随后转移到植物细胞中。由本发明的序列推导出的序列的转移例如可以以这样的一种方式用于改变植物的性质，所述的方式即在转基因植物中合成出或多或少地在功能上具有活性的牻牛儿牻牛儿还原酶或具有改变了特性的牻牛儿牻牛儿还原酶的变体，或者使存在于转基因植物中的chl P基因的表达水平降低。结果，通过提高CHLP的活性，可以实现对阻断叶绿素生物合成的除草剂的耐受性的增加。类似地，例如在转基因植物细胞中修饰的牻牛儿牻牛儿还原酶基因的表达可以与对除草剂的耐受性的增加联系在一起。

此外，本发明涉及本发明的核酸序列或由其编码的蛋白用于生产抗体的用途。

因此，本发明包括本发明的核酸分子的任何可能的用途以及本发明的蛋白或其片段的任何可能的用途，其中所述核酸分子的存在并且如果希望的话所述核酸分子的表达在植物中造成了生育酚含量和／或叶绿素含量的改变，而所述蛋白或其片段的酶活性导致了所述的改变。

原则上，可以使用在所选植物中起作用的任何启动子，其中所述启动子满足的先决条件是由所说启动子控制的表达导致生育酚合成能力的改变。鉴于转基因植物用作食用和／或饲用植物，就此而论提供种子特异性表达的启动子是特别有用的。针对这类启动子的例子有USP启动子、大麦醇溶蛋白启动子和napine启动子。

假如这类启动子仍是不为人知的或者仍是无法得到的话，那么用于分离这类启动子的方案和方法则是本领域普通技术人员公知的。一般说来在第一步中，从种子组织中分离出聚腺苷酸化RNA并建立cDNA文库。在第二步中，通过基于来源于非种子组织的聚腺苷酸化RNA分子的cDNA克隆，通过从第一文库的杂交鉴定那些克隆，其所对应的聚腺苷酸化RNA分子仅在种子组织中表达。随后，通过以这种方式鉴定的cDNAs分离出启动子，然后可以使用该启动子来控制本文所述的编码核酸序列的表达。根据本发明，同样可以分离并使用其它组织特异性或发育特异性启动子或者通过非生物刺激诱导出的启动子。

另一方面，由于本发明核酸分子的表达，可以期望所述植物在若干区域或器官中表现出生育酚含量的改变、优选有所增加。在这种情况下，使用组成型启动子(例如使用来自花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子)可能是令人满意的。

本发明还包括编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶生物活性的蛋白或其生物活性片段的核酸分子以及与上述核酸分子杂交的核酸分子。在本发明的上下文中，“生物活性片段”通常是指该片段足以造成生育酚含量的改变。在本发明的上下文中，术语“杂交”是指在常规杂交条件下的杂交，其中优选在严格条件下的杂交，例如在Sambrook等人(1989)的《分子克隆：实验指南》第2版(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)中所述的条件。

与本发明的分子杂交的核酸分子例如可以从基因组或cDNA文库中分离出来。

使用所述的核酸分子或这些分子的部分或这些分子的反向互补分子，例如通过根据标准技术的杂交(例如参见Sambrook等人，出处同上)，可以进行这类核酸分子的鉴定和分离。对这类核酸分子的鉴定和分离而言，还可以使用由本发明的DNA序列推导出来的序列，例如通过简并的寡核苷酸引物。

因此，本发明还包括本发明的DNA序列或其片段用于鉴定和分离来自植物或其它生物体的同源序列的用途。

例如，可以将完全地或基本上表现为上述核酸序列或这些序列的片段的核酸分子用作杂交探针。用作杂交探针的片段也可以是合成的片段，所述片段是通过常规合成技术生产的，并且其序列与本发明核酸分子的序列基本对应。一旦已经鉴定并分离出与本发明的核酸序列杂交的基因，那么必须测定其序列并且分析由这些序列编码的蛋白的性质。为了做到这一点，本领域的普通技术人员可以采用许多分子生物学、生物化学和生物技术的标准方法。

与本发明的核酸分子杂交的分子还包括上述DNA分子的片段、衍生物和等位变体，其中所述DNA分子编码牻牛儿牻牛儿还原酶或其生物(即酶)活性片段。就此而论，片段是指所述核酸分子的片段或区域，其具有足够的长度足以编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶的酶活性或者具有可比的酶活性的多肽或蛋白，而所述的多肽或蛋白能够造成生育酚含量的改变。在上下文中，术语“衍生物”是指这些分子的序列在一个或几个位置上不同于上述核酸分子的序列并且与这些序列之间显示出很大程度的同源性。在上下文中，同源性是指序列同一性至少为40％、尤其是同一性至少为60％、优选大于80％、且特别优选大于90％。与上述核酸分子之间的偏差可能是由于缺失、添加、取代、插入或重组。

同源性进一步是指在所述的核酸分子之间或在由其编码的蛋白之间存在着功能上和／或结构上的等同物。就与上述分子同源的并且表现为这些分子的衍生物的核酸分子而言，它通常涉及这些分子的代表执行相同生物功能的修饰的变体。这可能涉及自然发生的变异(例如来自其它生物体的序列)或者突变，由此这些修饰可以是自然发生的或者是通过具体的诱变而引入的。而且，变异可能涉及用合成的方法产生的序列。就等位变体而言，这些变体可以是天然存在的和用合成的方法产生的变体，或者是通过重组DNA技术产生的变体。

通常，由本发明核酸分子的不同的变体和衍生物编码的蛋白都具有共同的特性。所述的特性例如有酶活性、分子量、免疫反应性、构象等。其它共同的特性可以有物理性质，例如在凝胶电泳中的迁移模式、层析特性、沉降系数、溶解度光谱性质、稳定性、最佳pH、最佳温度等。此外，由所述蛋白催化的反应当然可以具有共同的或类似的特征。

为了实现将外源基因引入高等植物中，可以采用多种克隆载体，其含有在大肠杆菌中具有活性的复制起点和用于选择转化的细菌细胞的标记基因。这类载体的例子有pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。可以将所需的序列在合适的限制位点处插入载体中。将得到的质粒用于转化大肠杆菌的细胞。在合适的培养基中培养转化的大肠杆菌细胞，随后收获并溶解细胞。回收所述质粒。通常，把限制酶切作图、凝胶电泳以及其它生物化学、分子生物学的方法用作分析方法以鉴定回收的质粒DNA。在每次操作之后，可以消化质粒DNA，并且可以将得到的DNA片段与其它DNA序列连接起来。可以在相同的或者其它的质粒中克隆每个质粒DNA序列。

为了将DNA引入植物宿主细胞中，可以采用许多众所周知的方法，并且本领域普通技术人员可以容易地确定和选择各个合适的步骤。这些技术包括通过使用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌作为转化工具用T-DNA转化植物细胞、原生质体融合、将分离的DNA直接进行基因转移至原生质体中、DNA的微量注射和电穿孔、通过biolistic方法和其它可能的方法引入DNA。

当把DNA注射和电穿孔到植物细胞中时，对所用的质粒本身并没有具体的要求。这同样也适用于直接的基因转移。在这里，经常可以使用简单的质粒、诸如pUC-衍生物。但是，如果打算从以这种方式转化的细胞再生出完整的植株的话，那么通常需要选择标记基因的存在。本领域的普通技术人员熟悉常规的选择标记，并且他可以容易地选择合适的标记。

取决于针对引入感兴趣基因而选择的方法，可能需要其它的DNA序列。例如，如果将Ti或Ri质粒用来转化植物细胞的话，至少包含在Ti和Ri质粒中的T-DNA的右边缘、但经常是右边缘和左边缘都必须与待引入作为侧翼区的基因结合。

如果将土壤杆菌用于转化的话，那么必须将待引入的DNA克隆到特殊的质粒中，即克隆到中间或二元载体中。由于与T-DNA中的序列同源的序列，可以通过同源重组将中间载体整合到土壤杆菌的Ti或Ri质粒中。此外，后者含有用于转移T-DNA所需的vir区。中间载体在土壤杆菌中无法复制。通过辅助质粒，可以将中间载体转移到根癌土壤杆菌中(偶联)。二元载体可以在大肠杆菌和土壤杆菌中复制。它们含有选择标记基因和由T-DNA的右边和左边边缘区形成的接头或多接头。可以将这些载体直接转化到土壤杆菌中(Holsters等人(1978)《分子与普通遗传学》163，181-187)。充当宿主细胞的土壤杆菌应当含有携带vir区的质粒。对于将T-DNA转移到植物细胞中而言，需要vir区。也可以存在其它的T-DNA。将以所述方式转化的土壤杆菌用于转化植物细胞。

对使用T-DNA转化植物细胞已经进行了详细的研究并且在下列文献中进行了充分的描述：EP 120 515；Hoekema的《二元植物载体系统》Offsetdrokkerij Kanters B．V．，Alblasserdam(1985)第V章；Fraley等人(1993)《Crit．Rev．Plant．Sci．》4，1-46与An等人(1985)《EMBO J．》4，277-287。

为了把DNA转移到植物细胞中，可以适当地与根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌一起培养植物的外植体。在可以含有用于选择转化细胞的抗生素或杀生物剂的合适的培养基中，可以从受感染的植物材料(例如叶、叶片、茎的区段、根、但也可以是原生质体或在悬浮培养中培养物的植物细胞)中再生出完整的植株。根据常规的再生方法、通过使用常规的营养培养基进行植物的再生。然后针对所引入的DNA的存在，可以检查以上述方式得到的植物。通过采用biolistic方法或通过原生质体转化引入外源DNA的其它可能的方法是公知的(例如参见Wilmitzer L(1993)在《生物技术：多卷综合论文集》中的“转基因植物”(H．J．Rehm，G．Reed，A．Puhler，P．Stadler编辑)第2卷，627-659，V．C．H．Weinheim-纽约，Basel-剑桥)。

在很好地建立了通过根癌土壤杆菌由Ti质粒载体系统转化双子叶植物的同时，近来的研究表明单子叶植物也可以由基于土壤杆菌的载体转化(Chan等人(1993)《植物分子生物学》22，491-506；Hiei等人(1994)《植物杂志》6，271-282；Deng等人(1990)《中国科学》33，28-34；Wilmink等人(1992)《植物细胞报道》11，67-80；May等人(1995)《生物／技术》13，486-492；Conner与Domiss(1992)《国际植物科学杂志》153，550-555；Ritchie等人(1993)《转基因研究》2，252-265)。

用于转化单子叶植物的可供选择的系统为通过biolistic方法的转化(Wan与Lemaux(1994)《植物生理学》104，37-48；Vasil等人(1993)《生物／技术》11，1553-1558；Ritala等人(1990)《应用遗传学理论》79，625-631；Altpeter等人(1996)《植物细胞报道》16，12-17)、原生质体的转化、经部分透化处理的细胞的电穿孔以及通过玻璃纤维引入DNA。

在文献中(例如参见WO 95／06128，EP 0 513 849；EP 0 465 875；Fromm等人(1990)《生物技术》8，833-844；Gordon-Kamm等人(1990)《植物细胞》2，603-618；Koziel等人(1993)《生物技术》11，194-200)曾多次具体地描述了玉米的转化。EP 292 435描述了一种方法，通过该方法从无粘液易碎的颗粒状的玉米愈伤组织开始可以得到能育的植物。Shillito等人((1989)《生物／技术》7，581)在其文章中已经观察到为了产生能育的植物，还必须从愈伤组织培养物开始，由该愈伤组织可以得到具有再生为植物的能力的正在分裂的原生质体培养物。在体外培养7至8个月后，Shillito等人得到了能产生活的后代的植物。

Prioli与Sondahl((1989)《生物／技术》7，589)描述了由玉米的原生质体再生和产生能育的植物、即cateto玉米近交系Cat 100-1。作者设想从原生质体再生出能育的植物取决于许多不同的因素，诸如基因型、供体细胞的生理条件和培养条件。

同样已经描述了谷类物种的成功转化，例如大麦(Wan与Lexaux，出处同上；Ritala等人，出处同上)和小麦(Nehra等人(1994)《植物杂志》5，285-297；Altpeter等人，出处同上)。

一旦将所引入的DNA整合到植物细胞的基因组中，它就保持稳定并且同样稳定地遗传给最初转化的细胞的后代。通常，它含有赋予了抗杀生物剂或抗生素(诸如卡那霉素G418、博来霉素、潮霉素、氨甲蝶呤、草甘膦、链霉素、磺酰脲、庆大霉素或膦丝菌素等)的抗性的选择标记。因此，可以逐个选取的选择标记应当可以使在缺少所引入的DNA的细胞中选择转化的细胞。

转化的细胞在植物体内以通常的方式生长(也可参见McCormick等人(1986)《植物细胞报道》5，81-84)。得到的植物可以以通常的方式培养并且可以通过自体受精进行繁殖或者与具有相同的转化的或其它遗传性状的植物杂交。得到的杂种个体植物具有各自的表型特征。通常可以从该植物得到种子。

为了确保稳定地维持并继承了所述的表型性状，应当培育两代至多代后代。为了确保维持着各自的表型或其它特征，还应当收获种子。

通过采用常用的方法，还可以测定转基因系，其中该系对新的核酸分子而言是纯合的，并且就改变了的生育酚含量而言可以检查其表型行为并与半合子系的行为进行比较。

通过常规的分子生物学和生物化学的方法可以实现本发明具有牻牛儿牻牛儿还原酶活性的蛋白的表达。本领域普通技术人员熟悉这些技术，并且他能毫无困难地选出合适的检测方法，例如用于检测牻牛儿牻牛儿还原酶特异性RNA的以及用于测定牻牛儿牻牛儿还原酶特异性RNA的积累量的RNA印迹分析，用于鉴定编码牻牛儿牻牛儿还原酶的DNA序列的DNA印迹分析，或用于检测由本发明的DNA序列编码的蛋白(优选CHL P)的蛋白质印迹分析。牻牛儿牻牛儿还原酶的酶活性例如可以通过由Soll与Schultz(1981)在《生物化学与生物物理学研究通讯》99，907-912中所述的酶分析法来检测和测量，其中所述方法基于叶绿基叶绿素的形成。

本发明基于从来自烟草cv．Petit Havana SR1的cDNA文库中成功地分离出编码牻牛儿牻牛儿还原酶的cDNA克隆。包括完整的开放读框的该cDNA克隆的序列示于SEQ：ID NO．1中。使用SEQ：ID NO．1的序列，可能产生与野生型植物相比表现出改变了生育酚含量的转基因植物。

将含有SEQ：ID NO．1的DNA序列的cDNA克隆转化到大肠杆菌中，并且遵照布达佩斯条约于1997年10月16日将得到的大肠杆菌菌株以保藏号DSM 11816保藏在德国D-38124 Braunschweig的Mascheroder Weg 1b的德意志微生物与细胞培养有限公司保藏中心(DSMZ)中。

下面的实施例起到了解释本发明的目的。

实施例

实施例1：

克隆编码牻牛儿牻牛儿还原酶(CHLP)的烟草cDNA

为了鉴定来自烟草的牻牛儿牻牛儿还原酶的cDNA，根据制造商的说明通过使用编码基因座4D9T7P的来自鼠耳芥的EST筛选λZAP Ⅱ cDNA文库(烟草SR1，Stratagene，美国)。所用的EST序列与已知的来自荚膜红细菌的(Young等人(1989)《分子基因遗传学》218，1-12；Bollivar等人(1994)《分子生物学杂志》237，622-640；Bollivar等人(1994)《生物化学》33，12763-12768)和集胞蓝细菌PCC6803的(Addlesee等人(1996)《FEBS通讯》389，126-130)bch P／chl P序列之间具有相似性。

所用的杂交探针包括4D9T7P(登记入册号为T04791)中从第1个碱基到第364个碱基的EST序列的区域。从来自鼠耳芥的PRL2文库(载体：λZipLox)(Newman等人(1994)《植物生理学》106：1241-1255)中以NotⅠ／SalⅠ限制片段的形式分离出探针，并通过切口平移用[α-³²p]dCTP(生命技术公司，Eggenstein，德国)对探针进行放射性标记。

根据下列方案进行杂交：

-在55℃下用具有下列组成的杂交溶液进行2小时的预杂交：5×SSC，0．1％ SDS，5×Denhardt试剂，100μm／ml变性鲑精DNA；

-在55℃下用具有以上组成并外加放射性标记的探针的新鲜的杂交溶液进行12小时的主要的杂交；

-洗涤：在55℃下用2×SSC和0．1％SDS洗涤2次、10分钟，以及

在55℃下用1×SSC和0．1％SDS洗涤1次、5分钟。

通过常规的方法对由cDNA文库的筛选分离出的质粒DNA进行测序。在SEQ：ID NO．1中所示的经鉴定的chl P cDNA序列包括1510个核苷酸(没有聚腺苷酸尾)；第1至第1392个核苷酸编码由464个氨基酸残基组成的52kDa的蛋白(包括起始密码子甲硫氨酸，并且没有终止密码子(第1393至第1395个核苷酸))。CHL P蛋白的推测的氨基酸序列示于SEQ：ID NO．2中。示于SEQ：ID NO．1中的核苷酸序列包括由第1396至第1510个核苷酸的3’非翻译区。

对DNA和RNA的分离、序列分析、限制酶切分析、克隆、凝胶电泳、放射性标记、DNA、RNA和蛋白质印迹分析、杂交和类似的步骤而言，采用如在标准的实验指南中所述的常规的方法，诸如Sambrook等人(1989)《分子克隆：实验指南》第2版(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)。

实施例2：

转化烟草植物并再生出完整的植物

为了生产超量表达CHLP的并从而与未转化的植物相比表现出生育酚含量有所增加的转基因植物，用限制酶BamHⅠ和SalⅠ从载体中切下SEQ：IDNO．1的DNA序列，将所述DNA序列置于pBluescript载体的多克隆位点中，并在CaMV 35S启动子之后以有义的取向连接到用相同的限制性内切核酸酶消化的为pBIB衍生物(Becker(1990)《核酸研究》18，203)的二元载体BinAR-TX(Hofgen与Willmitzer(1990)《植物科学》66，221-230)中。为了加以说明，如图3包括了载体BinAR-TX的限制图。

代替所提到的二元载体BinAR-TX，任何其它适合于植物转化的载体可以用于构建嵌合基因，其中包括CaMV 35S启动子或任何在植物细胞中提供了转录和翻译的其它启动子与编码CHL P的DNA序列的融合。

然后把重组载体pCHLPbin引入根癌土壤杆菌中(GV2260菌株；(Horsch等人(1985)《科学》227，1229-1231))，并且通过叶盘转化技术(Horsch等人，出处同上)用该重组载体转化烟草植物(SNN)。

针对这一目的，将得到的根癌土壤杆菌克隆的过夜培养物在5000rpm下离心10分钟，并将细菌重新悬浮在2YT-培养基中。将无菌培养物(烟草cv．Samsun NN)的年幼的烟草叶切成直径约为1厘米的小薄片，并将其在细菌悬浮物中培养很短的一段时间。随后，将叶子的切片放在MS培养基(Murashige与Skoog(1962)《植物生理学》15，473；0．7％的琼脂)上，并在黑暗中保持2天。然后，将叶子的切片放在含有1．6％的葡萄糖、1mg／l的苄氨基嘌呤、0．2mg／l的萘乙酸、500mg／l的claforan(头孢噻肟，Hoechst，法兰克福，德国)和50mg／l的卡那霉素的MS培养基(0．7％的琼脂)上来诱导枝条。每7至10天更换一次培养基。在发育成为枝条后，将叶子的切片转移到含有相同培养基的玻璃容器中。切下正在发育的枝条并将其放在含有2％的蔗糖和250mg／l的claforan的MS培养基上，并且再生出完整的植物。

实施例3：

分析含有重组载体pCHLPbin的转基因烟草植物

如上所述，转化、选择并再生出转基因的烟草植物。在无菌培养物中长出根后，将大约100个独立的初级转化体转移到温室中的土壤中。在温室中，在60％的湿度下，将烟草植物在20-25℃下在光照中培养16小时并在18-20℃下在黑暗中培养8小时。

与对照植物相比，具有正常的或者增加了生育酚和／或叶绿素含量的转化体既没有显示出异常的外观或习性，也没有显示出生长速率的改变。

几种初级转化体显示出比野生型植物的生育酚含量增加了高达4倍至6倍。生育酚含量的这种增加还可以在T1和T2代的后代以及在纯合的后代植物中进一步提高，所述植物是通过普通的自体受精以及随后在含有卡那霉素的培养基上测定种子的分离模式来得到的。

此外，可以观察到在应激条件下可以进一步提高转基因植物中的生育酚的含量，诸如与对照植物相比，在培养过程中在低的或升高的温度下或在高能量的光照下以及在衰老的叶子中所发现的。

根据下列方法测量生育酚：

将叶盘在液氮中进行组织匀浆并在甲醇中提取三次。收集提取物并在LiCrospher 100 HPLC RP-18-柱(Merck，Darmstadt，德国)上以1ml／分钟的流速按照下列梯度进行洗脱：94％的溶剂B(100％的甲醇)／6％的溶剂A(30％的甲醇，10％ 0．1M的醋酸铵，pH 5．1)洗脱7分钟，对接下来的17分钟而言采用99％的溶剂B／1％的溶剂A，再接下来的26分钟采用94％的溶剂B／6％的溶剂A。

在可供选择的步骤中，收集到的提取物是通过HPLC以等度的方式(梯度如下：2％的溶剂A[10％的甲醇和10％的酸]与98％的甲醇(溶剂B)；流速为1ml／分钟)进行分析的。为了进行检测，使用了带有Shimadzu RF 551荧光检测器(295 nm_ex，325 nm_em)的Waters LC-组件-设备。

在图4的直方图中显示出生育酚测定的结果。转化体28和30的第6、9、12片叶子(从所述植物的顶部开始编号)与对照植物(SNN)的对应叶子的比较表明转基因系具有比野生型植物高出多达6倍的生育酚含量。

不考虑其在含有卡那霉素的培养基上生长的能力，转基因的烟草植物也可以通过DNA印迹杂交进行分析。在与编码CHL P的标记的cDNA片段杂交后，采用转化体的基因组DNA可以检测出额外的放射性标记的条带，将其用限制酶消化并与对照植物的基因组DNA进行比较。

RNA印迹分析揭示出与对照植物中的CHL P-RNA的含量相比，转化体中特异的RNA的数量有所增加。

此外，在转基因植物中，可以通过蛋白质印迹分析来测定牻牛儿牻牛儿还原酶表达的增加。与对照植物相比，转化体显示出CHL P蛋白的数量的增加。

再者，通过质体输入实验(根据Grimm等人(1989)《植物分子生物学》13，583-593进行实验)可以证实在体外转录和翻译后，由SEQ：ID NO．1的序列编码的CHL P蛋白前体被输入到质体中。

实施例4：

构建CHL P反义构建体并转移到烟草中

在根据实施例2和3所产生的并进行了分析的转基因植物由于超量表达本发明的DNA序列而显示出生育酚含量有所增加的同时，为了产生具有降低了CHL P活性的转基因烟草植物，于是构建下列反义构建体并将其转移到烟草中。

使用限制酶KpnⅠ和XbaⅠ从载体中切下SEQ：ID NO．1的cDNA序列，将该序列置于pBluescript载体的多克隆位点中，并以反义的取向与用相同的限制酶消化的二元载体BinAR-TX(参见实施例2)中的花椰菜花叶病毒的35S启动子融合。如实施例2中所述的那样，通过根癌土壤杆菌介导的叶盘转化将得到的重组载体pCHLPASbin转移到烟草中。然后再生出转基因植物。再生出大约100个独立的转基因系，并通过标准的方法(如DNA印迹)来证明转基因的拷贝的插入。

所述转化体显示出比对照植物更低的生长速率、更少量的色素形成、CHL P-特异性RNA的减少和CHL P蛋白含量的下降、高含量的牻牛儿牻牛儿叶绿素(与野生型植物中100％的叶绿基叶绿素相比，具有高达50％的总叶绿素含量)以及叶绿素和生育酚含量的降低。

实施例5：

在大肠杆菌中超量表达具有活性的牻牛儿牻牛儿还原酶

为了生产出在大肠杆菌中超量表达重组CHL P的表达克隆，使用下列寡核苷酸引物通过PCR(94℃下1分钟；60℃下2分钟；72℃下3分钟；25次循环)由SEQ：ID NO．1的DNA序列扩增针对推定的成熟(已加工的)蛋白的开放读框：

-CSYNl 5’-cgc cat ggg ccg caa tct tcg tgt tgc ggt-3’

和

-CSYN2 5’-gca gat ctg tcc att tcc ctt ctt agt gca-3’。

将扩增的PCR片段进行纯化并用限制酶NcoⅠ和BglⅡ消化，并且将其连接到用相同的酶切割的表达载体pQE60(Qiagen，Hilden，德国)中。起始密码子ATG(形成针对限制酶NcoⅠ的识别序列的一部分)的后面是chl P序列，它起始于CHL P cDNA序列的开放读框的第148个核苷酸。结果，甲硫氨酸的后面是甘氨酸，这对应于由cDNA序列推导的肽序列的第50个氨基酸残基。

为了表达植物的CHL P，用重组载体转化大肠杆菌菌株XL 1Blue(Stratagene，LaJolla，CA，美国)或SG 13009(Gottesmann等人(1981)《细菌学杂志》148，256-273)。在通过加入IPTG诱导重组基因进行转录之后，在大肠杆菌菌株中表达出分子量约为47 kDa的蛋白。在细菌提取物的沉淀部分中可以检测到所述蛋白，并且根据制造商的指导(Qiagen，Hilden，德国)使用Ni-亲和柱在变性条件下从总提取物中进行纯化。

将纯化的蛋白注射到兔子体内进行免疫接种。

在一种与细菌的菌绿素合酶综合的酶测定中，通过使用叶绿素酯和GGPP证实了从总提取物中纯化的蛋白具有牻牛儿牻牛儿还原酶的活性。所述的酶测定是根据Oster等人(1997)《生物化学杂志》272，9671-9676中的方案进行的。

色素叶绿素GG和叶绿素-叶绿醇是通过HPLC在装填有RP 18Gromsel 120 ODS5的柱(4×250nm)中以1．2ml／分钟的流速采用由60％的丙酮(溶剂A)和100％的丙酮(溶剂B)组成的下列梯度进行分离的：t₀时为75％的溶剂A和25％的溶剂B，2分钟；在t_2-4内达到45％的溶剂A和55％的溶剂B；在t_4-13内达到30％的溶剂A和70％的溶剂B；在t_13-17内达到100％的溶剂B；t_17-21时为等度的100％的溶剂B；接下来在5分钟内达到75％的溶剂A和25％的溶剂B；然后在接下来的5分钟内为等度的75％的溶剂A和25％的溶剂B。通过使用荧光检测器(λ_ex425nm，λ_em665nm)来检测四吡咯。

实施例6：

在烟草中共表达CHL P基因和HPD基因

通过使用寡核苷酸引物

-hpdoli 1 5’-tta ggt acc atg ggc cac caa acc gcc gcc gtt tca g-3’

和

-hpdoli 2 5’-tga gtc gac cac aat cct tta gtt ggt tct tct tct tg-3’，

由鼠耳芥的cDNA文库扩增HPD cDNA(登记入册号为AF 000228)的介于第37和第1404个核苷酸之间的序列，将该序列克隆并测序。用限制性内切核酸酶KpnⅠ和SalⅠ消化扩增的片段，并将其连接到同样用KpnⅠ和SalⅠ消化的二元载体Bin-Hyg-TX中。载体Bin-Hyg-TX是pBIB的衍生物(Becker，出处同上)，与实施例2中所用的载体BinAR-TX一样，该载体可以在花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子的控制下使连接到多克隆位点上的编码区进行表达。与用于表达CHL P基因的使得在植物细胞中可以根据抗卡那霉素进行选择的载体BinAR-TX相反，二元载体Bin-Hyg-TX携带潮霉素抗性基因作为植物细胞的选择标记。为了进行说明，在图5中提供了载体Bin-Hyg-TX的限制图。

代替所提到的二元载体Bin-Hyg-TX，任何适合于植物转化的载体可以用于构建嵌合基因，其中包括CaMV 35S启动子或任何在植物细胞中提供了转录和翻译的其它启动子与编码HPD的DNA序列的融合。

然后，如以上实施例2中所述的那样，通过根癌土壤杆菌将得到的重组载体pBinHygHPD转移到烟草SNN上，由此在含有潮霉素的培养基上选择转基因的烟草的枝条。使用再生后得到的植物作为对照植物。

此外，用重组载体pBinHygHPD通过叶盘转化转化实施例2中所述的转化体28和30以及在35S RNA启动子的控制下超量表达CHL P基因的进一步的转化体，并在既含卡那霉素又含潮霉素的培养基上进行选择的情况下再生出完整的植物。

在所有的转基因植物中，通过合适的DNA和RNA印迹杂交实验，使用上述提到的编码HPD的PCR片段作探针来验证嵌合HPD基因的成功的转移和表达。

在仅表达CHL P基因的转基因植物(参见实施例3，转化体28和30)与共表达HPD基因和CHL P基因的植物(转化体28+HPD和30+HPD)叶子中的生育酚含量(如实施例3所述进行分析)的比较揭示出通过同时表达羟苯基丙酮酸双加氧酶的基因，生育酚的含量可以进一步得到提高。

另一方面，表达CHL P基因和HPD基因的转基因植物还可以通过杂交合适的转基因系来得到，特别是使纯合的“CHL P系”与纯合的“HPD系”杂交。

在应激条件下(例如升高温度、光照应激等)，在双转化体(和双杂交)中可以预期生育酚含量有额外的增加。

除了表达HPD和CHL P的上述双转化体之外，还就生育酚的含量以及应激条件对其生育酚含量的影响，分析了转基因的HPD系。可以证明的是与非转基因的对照植物相比，在烟草叶中HPD的超量表达导致生育酚的含量增加了2至3倍，并且在应激条件下生育酚的含量尤其得到了提高。

图6表明与对照植物(SNN)相比，表达鼠耳芥属的羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPD)的12周龄转基因烟草系(#2，6和33)的第4、7和第10片叶子中生育酚的含量。或在38℃或在10℃下并且在约为200μmol光子／m2／s的光强下培养植物。随着叶片年龄的增加，植物中生育酚也逐渐地积累。特别在更老的叶子中，在38℃下培养的植物中生育酚的含量增加得更多，并且比对照植物的量高出2倍。相比之下，在低温下培育的转化体中生育酚的含量仅比野生型植物有少许的提高。

这些结果表明在需要增加生育酚的情况下，例如特别是在应激的条件下，HPD特异性地有助于这些抗氧化剂在转基因植物中的产生。

实施例7：

转基因植物抗氧化应激的抗性的提高

就抑制性和氧化物质的影响而言，在叶盘培养实验中分析实施例2和3所产生的转基因植物。在光照下，在20mM磷酸钾缓冲液(pH 7．1)中培养15支幼苗10小时。在对照样品(水)中、在含有3．3μM(低浓度=LC)或33μM(高浓度=HC)的氟锁草醚(可以从德国Ludwigshafen的BASF公司得到，一种原卟啉原氧化酶的抑制剂)的样品中以及在含有1．7μM(低浓度=LC)或17μM(高浓度=HC)的玫瑰红(酸性红，4，5，6，7四氯-2’，4’，5’，7’-四碘荧光素，可以从德国Deisenhofen的Sigma-Aldrich公司得到，该物质产生具有反应性的氧)的样品中培养植物。与野生型植物(SNN)相比，在所分析的处于缓冲液对照样品中的以及在氧化应激条件下的转基因系(28，30)中生育酚的含量高出大约2至3倍。图7中给出了结果。

结果表明由于与野生型植物相比其生育酚的含量有所增加，因此本发明的植物表现出对抗氧化应激的耐受性的增加。因而，在本发明的植物中可以预期细胞膜抵抗具有反应性的氧的抗氧化保护性的提高。

实施例8：

转基因植物种子中的生育酚的含量

根据上述步骤从转基因植物的种子中提取生育酚，其中由于在CaMV35S启动子的控制下表达CHL P，因此所述转基因植物与野生型植物相比在叶子中表现出生育酚含量的增加(参见实施例2)。图8显示出通过HPLC定量测定的生育酚的结果，并与烟草的对照植物比较。

除α-生育酚以外，还定量分析了γ-生育酚。后者通常以更高的数量存在于烟草的种子当中；在烟草种子中，γ-生育酚与α-生育酚之比约为10∶1。在牻牛儿牻牛儿还原酶的表达有所提高的转基因植物中这两种形式的生育酚、尤其是α-生育酚的含量比对照植物要高2至3倍。

反映出在35S启动子的控制下组成型CHL P表达对种子中生育酚含量的影响的这些结果清楚地表明通过使用种子特异性启动子(或在种子组织中可以特异性地诱导的启动子)，种子组织中牻牛儿牻牛儿还原酶的表达以及所造成的转基因植物种子中的生育酚含量可以进一步得到提高。

假如尚未充分地描述任何方式的分子生物学步骤的话，则应当按照标准的方法进行所述的步骤，例如由Sambrook等人(1989)《分子克隆：实验指南》第2版(冷泉港出版社，冷泉港，纽约州)所述的方法。就植物的转化而言，参阅众所周知的综述性文章以及本文所提到的报道和出版物。

附图的描述图1：SEQ：ID No．1显示出来自烟草的牻牛儿牻牛儿还原酶(CHL P)

的chl P cDNA的核苷酸序列。图2：SEQ：ID No．2显示出由图1中所示的SEQ：ID No．1推导的来

自烟草的酶CHL P的氨基酸序列。图3：如在植物转化实验中所用的二元载体BinAR的限制图。

BinAR(Hofgen与Willmitzer(1990)《植物科学》66，221)是

Bin19的衍生物(Bevan(1984)《核酸研究》12，8711)，它含有

用于在植物中组成型表达嵌合基因的表达盒，其中通过Bin19

的EcoRⅠ和HindⅢ限制位点克隆该表达盒。该盒包括含有

CaMV 35S启动子的一段770个碱基对的EcoRⅠ／HindⅢ片

段、pUC18多接头的部分以及章鱼氨酸合酶基因(OCS)的终

止信号。为了插入编码序列，pUC18多接头特有的限制位

点、即KpnⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ和SalⅠ是特别有用的。

作为植物的选择标记，二元载体BinAR携带有卡那霉素抗性

基因。图4：表明转基因烟草植物(系28和30)的第6、9和第12片叶子(从

所述植物的顶部开始编号)相比于对照植物(SNN)的对应叶子

中生育酚的含量的条形图。图5：如用于植物转化的二元载体Bin-Hyg-TX的限制图，它也是

pBIB的衍生物(Becker，出处同上；Bevan，出处同上)，该载

体含有用于在植物中组成型表达嵌合基因的表达盒。为了插入

编码序列，pUC18多接头特有的限制位点、即HpaⅠ、KpnⅠ、

SmaⅠ、XbaⅠ和SalⅠ是特别有用的。作为植物的选择标记，二

元载体Bin-Hyg-TX携带有潮霉素抗性基因。图6：在表达鼠耳芥属的酶HPD的12周龄转基因系(#2，6，33)和对

照植物(SNN)中第4、7和第10片叶子中生育酚的含量的条

形图。图7：12天龄的幼苗中的生育酚含量，其中将所述幼苗分别在下列

溶液中在光照下培养10小时：20mM磷酸钾缓冲液(pH 7．1；

对照=水)；含有3．3μM(LC)或33μM(HC)的氟锁草醚的所

述缓冲液；以及含有1．7μM(LC)或17μM(HC)的玫瑰红的

所述缓冲液(SNN=野生型对照植物，28和39=转基因系)。图8：在转基因烟草植物(#7，39，67，96)和野生型烟草植物(SNN)的

种子中α-生育酚和γ-生育酚的相对值。100％的α-生育

酚对应于6ng／mg种子；100％的γ生育酚对应于62．8ng／mg

种子。

序列表

(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：

(A)姓名：Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung

(B)街道：Corrensstrasse 3

(C)城市：Gatersleben

(E)国家：德国

(F)邮政编码：06466

(ⅱ)发明名称：转基因植物中生育酚含量的操纵

(ⅲ)序列数：3

(ⅳ)计算机可读形式：

(A)存储媒体类型：软磁盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1．0，#1．30版(欧洲专利局)

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1510个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假定：无

(ⅳ)反义：无

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：ATGGCTTCCA TTGCTCTCAA AACTTTCACC GGCCTCCGTC AATCCTCGCC GGAAAACAAT 60TCCATTACTC TTTCTAAATC CCTCCCCTTC ACCCAAACCC ACCGTAGGCT CCGAATCAAT 120GCTTCCTAAT CCAGCCCAAG AGTCAACGGC CGCAATCTTC GTGTTGCGGT GGTGGGCGGT 180GGTCCTGCTG GTGGCGCCGC CGCTGAAACA CTCGCCAAGG GAGGAATTGA AACCTTCTTA 240ATCGAACGCA AAATGGACAA CTGCAAACCC TGCGGTGGGG CCATCCCACT TTGCATGGTG 300GGAGAATTTG ACCTCCCTTT GGATATCATT GACCGGAAAG TTACAAAGAT GAAGATGATT 360TCCCCATCCA ACGTTGCTGT TGATATTGGT CAGACTTTAA AGCCTCACGA GTACATCGGT 420ATGGTGCGCC GCGAAGTACT CGATGCTTAC CTCCGTGACC GCGCTGCTGA AGCCGGAGCC 480TCTGTTCTCA ACGGCTTGTT CCTCAAAATG GACATGCCCA AAGCTCCCAA CGCACCTTAC 540GTCCTTCACT ACACAGCTTA CGACTCCAAA ACTAATGGCG CGGGGGAGAA GCGTACCCTG 600GAAGTTGACG CCGTTATCGG CGCTGACGGT GCAAATTCCC GTGTCGCAAA ATCCATAAAC 660GCCGGTGACT ACGAGTACGC TATTGCATTC CAAGAAAGGA TTAAAATTTC CGATGATAAA 720ATGAAGTATT ACGAGAATTT AGCTGAAATG TACGTGGGTG ATGACGTGTC CCCTGATTTT 780TACGGGTGGG TTTTCCCCAA ATGTGACCAC GTTGCCGTTG GCACTGGCAC AGTCACCCAC 840AAAGCTGACA TCAAAAAATT CCAGCTAGCT ACAAGATTGA GAGCTGATTC CAAAATCACC 900GGCGGAAAAA TTATCCGGGT CGAGGCCCAC CCGATTCCAG AACACCCAAG ACCCAGAAGA 960TTACAAGACA GAGTTGCATT GGTTGGTGAT GCGGCAGGGT ACGTGACCAA ATGTTCGGGC 1020GAAGGGATTT ACTTCGCGGC AAAGAGTGGA CGTATGTGTG CTGAAGCAAT TGTTGAAGGG 1080TCAGAAATGG GAAAAAGAAT GGTGGACGAG AGTGATTTGA GGAAGTATTT GGAGAAATGG 1140GACAAGACTT ATTGGCCAAC GTACAAGGTG CTTGATATAT TGCAGAAGGT ATTTTACAGG 1200TCGAATCCGG CGAGGGAAGC ATTTGTTGAA ATGTGCGCAG ATGAGTATGT GCAGAAGATG 1260ACATTTGACA GCTATTTGTA CAAGAAAGTA GCACCAGGAA ACCCAATTGA AGACTTGAAG 1320CTTGCTGTGA ATACCATTGG AAGTTTGGTG AGAGCTAATG CACTAAGAAG GGAAATGGAC 1380AAGCTCAGTG TATAAGAAGA TTAACAGCAT TAATATTTTC TTGTAATTGA AGGATTTATT 1440TCTCAAATTA CTCTGTAAAC ACCTTTCATC CTGCCTTTAA TCGGATTTAT GTAACTTCAT 1500AATTTGAGCT 1510

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1510个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：未知

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅸ)特征：

(A)名称／关键词：CDS

(B)位置：1．．1392

(ⅹ)序列描述：SEQ ID NO：2：ATG GCT TCC ATT GCT CTC AAA ACT TTC ACC GGC CTC CGT CAA TCC TCG 48Met Ala Ser Ile Ala Leu Lys Thr Phe Thr Gly Leu Arg Gln Ser Ser1 5 10 15CCG GAA AAC AAT TCC ATT ACT CTT TCT AAA TCC CTC CCC TTC ACC CAA 96Pro Glu Asn Asn Ser Ile Thr Leu Ser Lys Ser Leu Pro Phe Thr Gln20 25 30ACC CAC CGT AGG CTC CGA ATC AAT GCT TCC AAA TCC AGC CCA AGA GTC 144Thr His Arg Arg Leu Arg Ile Asn Ala Ser Lys Ser Ser Pro Arg Val35 40 45AAC GGC CGC AAT CTT CGT GTT GCG GTG GTG GGC GGT GGT CCT GCT GGT 192Asn Gly Arg Asn Leu Arg Val Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly50 55 60GGC GCC GCC GCT GAA ACA CTC GCC AAG GGA GGA ATT GAA ACC TTC TTA 240Gly Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ala Lys Gly Gly Ile Glu Thr Phe Leu65 70 75 80ATC GAA CGC AAA ATG GAC AAC TGC AAA CCC TGC GGT GGG GCC ATC CCA 288Ile Glu Arg Lys Met Asp Asn Cys Lys Pro Cys Gly Gly Ala Ile Pro85 90 95CTT TGC ATG GTG GGA GAA TTT GAC CTC CCT TTG GAT ATC ATT GAC CGG 336Leu Cys Met Val Gly Glu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Ile Ile Asp Arg100 105 110AAA GTT ACA AAG ATG AAG ATG ATT TCC CCA TCC AAC GTT GCT GTT GAT 384Lys Val Thr Lys Met Lys Met Ile Ser Pro Ser Asn Val Ala Val Asp115 120 125ATT GGT CAG ACT TTA AAG CCT CAC GAG TAC ATC GGT ATG GTG CGC CGC 432Ile Gly Gln Thr Leu Lys Pro His Glu Tyr Ile Gly Met Val Arg Arg130 135 140GAA GTA CTC GAT GCT TAC CTC CGT GAC CGC GCT GCT GAA GCC GGA GCC 480Glu Val Leu Asp Ala Tyr Leu Arg Asp Arg Ala Ala Glu Ala Gly Ala145 150 155 160TCT GTT CTC AAC GGC TTG TTC CTC AAA ATG GAC ATG CCC AAA GCT CCC 528Ser Val Leu Asn Gly Leu Phe Leu Lys Met Asp Met Pro Lys Ala Pro165 170 175AAC GCA CCT TAC GTC CTT CAC TAC ACA GCT TAC GAC TCC AAA ACT AAT 576Asn Ala Pro Tyr Val Leu His Tyr Thr Ala Tyr Asp Ser Lys Thr Asn180 185 190GGC GCG GGG GAG AAG CGT ACC CTG GAA GTT GAC GCC GTT ATC GGC GCT 624Gly Ala Gly Glu Lys Arg Thr Leu Glu Val Asp Ala Val Ile Gly Ala

195 200 205GAC GGT GCA AAT TCC CGT GTC GCA AAA TCC ATA AAC GCC GGT GAC TAC 672Asp Gly Ala Asn Ser Arg Val Ala Lys Ser Ile Asn Ala Gly Asp Tyr

210 215 220GAG TAC GCT ATT GCA TTC CAA GAA AGG ATT AAA ATT TCC GAT GAT AAA 720Glu Tyr Ala Ile Ala Phe Gln Glu Arg Ile Lys Ile Ser Asp Asp Lys225 230 235 240ATG AAG TAT TAC GAG AAT TTA GCT GAA ATG TAC GTG GGT GAT GAC GTG 768Met Lys Tyr Tyr Glu Asn Leu Ala Glu Met Tyr Val Gly Asp Asp Val

245 250 255TCC CCT GAT TTT TAC GGG TGG GTT TTC CCC AAA TGT GAC CAC GTT GCC 816Sar Pro Asp Phe Tyr Gly Trp Val Phe Pro Lys Cys Asp His Val Ala

260 265 270GTT GGC ACT GGC ACA GTC ACC CAC AAA GCT GAC ATC AAA AAA TTC CAG 864Val Gly Thr Gly Thr Val Thr His Lys Ala Asp Ile Lys Lys Phe Gln

275 280 285CTA GCT ACA AGA TTG AGA GCT GAT TCC AAA ATC ACC GGC GGA AAA ATT 912Leu Ala Thr Arg Leu Arg Ala Asp Ser Lys Ile Thr Gly Gly Lys Ile

290 295 300ATC CGG GTC GAG GCC CAC CCG ATT CCA GAA CAC CCA AGA CCC AGA AGA 960Ile Arg Val Glu Ala His Pro Ile Pro Glu His Pro Arg Pro Arg Arg305 310 315 320TTA CAA GAC AGA GTT GCA TTG GTT GGT GAT GCG GCA GGG TAC GTG ACC 1008Leu Gln Asp Arg Val Ala Leu Val Gly Asp Ala Ala Gly Tyr Val Thr

325 330 335AAA TGT TCG GGC GAA GGG ATT TAC TTC GCG GCA AAG AGT GGA CGT ATG 1056Lys Cys Ser Gly Glu Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Lys Ser Gly Arg Met

340 345 350TGT GCT GAA GCA ATT GTT GAA GGG TCA GAA ATG GGA AAA AGA ATG GTG 1104Cys Ala Glu Ala Ile Val Glu Gly Ser Glu Met Gly Lys Arg Met Val

355 360 365GAC GAG AGT GAT TTG AGG AAG TAT TTG GAG AAA TGG GAC AAG ACT TAT 1152Asp Glu Ser Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Glu Lys Trp Asp Lys Thr Tyr

370 375 380Asp CCA ACG TAC AAG GTG CTT GAT ATA TTG CAG AAG GTA TTT TAC AGG 1200Trp Pro Thr Tyr Lys Val Leu Asp Ile Leu Gln Lys Val Phe Tyr Arg385 390 395 400TCG AAT CCG GCG AGG GAA GCA TTT GTT GAA ATG TGC GCA GAT GAG TAT 1248Ser Asn Pro Ala Arg Glu Ala Phe Val Glu Met Cys Ala Asp Glu Tyr

405 410 415GTG CAG AAG ATG ACA TTT GAC AGC TAT TTG TAC AAG AAA GTA GCA CCA 1296Val Gln Lys Met Thr Phe Asp Ser Tyr Leu Tyr Lys Lys Val Ala Pro

420 425 430GGA AAC CCA ATT GAA GAC TTG AAG CTT GCT GTG AAT ACC ATT GGA AGT 1344Gly Asn Pro Ile Glu Asp Leu Lys Leu Ala Val Asn Thr Ile Gly Ser

435 440 445TTG GTG AGA GCT AAT GCA CTA AGA AGG GAA ATG GAC AAG CTC AGT GTA 1392Leu Val Arg Ala Asn Ala Leu Arg Arg Glu Met Asp Lys Leu Ser Val

450 455 460TAAGAAGATT AACAGCATTA ATATTTTCTT GTAATTGAAG GATTTATTTC TCAAATTACT 1452CTGTAAACAC CTTTCATCCT GCCTTTAATC GGATTTATGT AACTTCATAA TTTGAGCT 1510

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：464个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Ala Ser Ile Ala Leu Lys Thr Phe Thr Gly Leu Arg Gln Ser Ser1 5 10 15Pro Glu Asn Asn Ser Ile Thr Leu Ser Lys Ser Leu Pro Phe Thr Gln

20 25 30Thr His Arg Arg Leu Arg Ile Asn Ala Ser Lys Ser Ser Pro Arg Val

35 40 45Asn Gly Arg Asn Leu Arg Val Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly

50 55 60Gly Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ala Lys Gly Gly Ile Glu Thr Phe Leu

65 70 75 80Ile Glu Arg Lys Met Asp Asn Cys Lys Pro Cys Gly Gly Ala Ile Pro

85 90 95Leu Cys Met Val Gly Glu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Ile Ile Asp Arg

100 105 110Lys Val Thr Lys Met Lys Met Ile Ser Pro Ser Asn Val Ala Val Asp

115 120 125Ile Gly Gln Thr Leu Lys Pro His Glu Tyr Ile Gly Met Val Arg Arg

130 135 140Glu Val Leu Asp Ala Tyr Leu Arg Asp Arg Ala Ala Glu Ala Gly Ala

145 150 155 160Ser Val Leu Asn Gly Leu Phe Leu Lys Met Asp Met Pro Lys Ala Pro

165 170 175Asn Ala Pro Tyr Val Leu His Tyr Thr Ala Tyr Asp Ser Lys Thr Asn

180 185 190Gly Ala Gly Glu Lys Arg Thr Leu Glu Val Asp Ala Val Ile Gly Ala

195 200 205Asp Gly Ala Asn Ser Arg Val Ala Lys Ser Ile Asn Ala Gly Asp Tyr

210 215 220Glu Tyr Ala Ile Ala Phe Gln Glu Arg Ile Lys Ile Ser Asp Asp Lys

225 230 235 240Met Lys Tyr Tyr Glu Asn Leu Ala Glu Met Tyr Val Gly Asp Asp Val

245 250 255Ser Pro Asp Phe Tyr Gly Trp Val Phe Pro Lys Cys Asp His Val Ala

260 265 270Val Gly Thr Gly Thr Val Thr His Lys Ala Asp Ile Lys Lys Phe Gln

275 280 285Leu Ala Thr Arg Leu Arg Ala Asp Ser Lys Ile Thr Gly Gly Lys Ile

290 295 300Ile Arg Val Glu Ala His Pro Ile Pro Glu His Pro Arg Pro Arg Arg

305 310 315 320Leu Gln Asp Arg Val Ala Leu Val Gly Asp Ala Ala Gly Tyr Val Thr

325 330 335Lys Cys Ser Gly Glu Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Lys Ser Gly Arg Met

340 345 350Cys Ala Glu Ala Ile Val Glu Gly Ser Glu Met Gly Lys Arg Met Val

355 360 365Asp Glu Ser Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Glu Lys Trp Asp Lys Thr Tyr

370 375 380Trp Pro Thr Tyr Lys Val Leu Asp Ile Leu Gln Lys Val Phe Tyr Arg

385 390 395 400Ser Asn Pro Ala Arg Glu Ala Phe Val Glu Met Cys Ala Asp Glu Tyr

405 410 415Val Gln Lys Met Thr Phe Asp Ser Tyr Leu Tyr Lys Lys Val Ala Pro

420 425 430Gly Asn Pro Ile Glu Asp Leu Lys Leu Ala Val Asn Thr Ile Gly Ser

435 440 445Leu Val Arg Ala Asn Ala Leu Arg Arg Glu Met Asp Lys Leu Ser Val

450 455 460

Claims

1．核酸序列，其特征在于所述序列编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶活性的蛋白或其活性片段。

2．根据权利要求1的核酸序列，其特征在于所述序列编码植物蛋白。

3．根据权利要求1或2的核酸序列，其特征在于所述序列编码来自烟草的蛋白。

4．SEQ：ID No．1的核酸序列。

5．根据权利要求1的核酸序列，其特征在于所述序列包含在克隆DSM11816中。

6．根据前述权利要求之任一的核酸序列的等位基因和衍生物，其特征在于所述等位基因和衍生物编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶活性的蛋白或其活性片段。

7．核酸分子，其特征在于所述分子包括根据前述权利要求之任一的核酸序列。

8．根据权利要求7的核酸分子，其特征在于所述分子包括与在原核细胞或真核细胞中提供转录和翻译的调节元件结合的权利要求1至6之任一的核酸序列。

9．根据权利要求7或8的核酸分子，其特征在于所述分子包括与在植物细胞中提供转录和翻译的启动子结合的权利要求1至6之任一的核酸序列。

10．根据权利要求9的核酸分子，其特征在于所述启动子为组成型、诱导型、组织特异性或发育特异性启动子。

11．根据权利要求10的核酸分子，其特征在于所述启动子为种子特异性启动子。

12．根据权利要求7-11之任一的核酸分子，其特征在于所述分子进一步包括增强子序列、编码信号肽的序列或其它的调节序列。

13．根据权利要求7-12之任一的核酸分子，其中所述的编码核酸序列以有义取向。

14．根据权利要求7-12之任一的核酸分子，其中所述的编码核酸序列以反义取向。

15．具有牻牛儿牻牛儿还原酶的生物活性的蛋白或其活性片段，其特征在于所述蛋白或其片段是由根据前述权利要求之任一的DNA序列或核酸分子编码的。

16．具有牻牛儿牻牛儿还原酶的生物活性的蛋白或其活性片段，其特征在于所述蛋白或其片段具有SEQ：ID No．2中所示的氨基酸序列或其区域。

17．微生物，其特征在于所述微生物含有根据权利要求1-14之任一的核酸序列或核酸分子。

18．转基因植物、所说植物的部分和所说植物的繁殖材料以及这些植物的后代，其中所述的转基因植物包括根据权利要求1-14之任一的核酸序列、由该核酸序列推导出的核酸序列或根据权利要求1-14之任一的核酸分子，而所说植物的部分及繁殖材料诸如原生质体、植物细胞、愈伤组织、种子、块茎、插条等。

19．根据权利要求18的植物，其中所述植物与野生型植物相比显示出改变了的生育酚含量。

20．根据权利要求19的植物，其中所述植物与野生型植物相比显示出增加了的生育酚含量。

21．根据权利要求18的植物，其中所述植物与野生型植物相比显示出改变了的维生素K₁的含量。

22．根据权利要求21的植物，其中所述植物与野生型植物相比显示出增加了的维生素K₁的含量。

23．根据权利要求18的植物，其中所述植物与野生型植物相比显示出改变了的叶绿素含量。

24．根据权利要求23的植物，其中所述植物与野生型植物相比显示出增加了的叶绿素含量。

25．根据权利要求18-24之任一的双子叶植物。

26．根据权利要求25的植物，其中所述植物是有用的植物、食用和／或饲用植物，尤其是油菜、大豆、番茄、马铃薯、甜菜、三叶草。

27．根据权利要求18-24之任一的单子叶植物。

28．根据权利要求27的植物，其中所述植物是有用的植物、食用和／或饲用植物，尤其是谷类植物、诸如小麦、大麦、玉米、燕麦、黑麦、水稻，香草、饲用牧草和牧草。

29．根据权利要求18-28之任一的植物、所说植物的部分和所说植物的繁殖材料以及这些植物的后代，其中将根据权利要求1-6之任一的核酸序列整合到所述植物的基因组中，而所说植物的部分及繁殖材料诸如原生质体、植物细胞、愈伤组织、种子、块茎或插条等。

30．包括原生质体的转基因植物细胞，其中所述植物细胞含有根据权利要求1-14之任一的核酸序列、由该核酸序列推导出的核酸序列或根据权利要求1-14之任一的核酸分子。

31．根据权利要求30的包括原生质体的植物细胞，其中所述植物细胞与未转化的植物细胞相比显示出生育酚、维生素K₁和／或叶绿素的含量有所改变、优选有所增加。

32．根据权利要求18-31之任一的植物和植物细胞，其中所述植物和植物细胞进一步含有编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸序列。

33．用于生产根据权利要求18-32之任一的植物或植物细胞的方法，所述方法包括下列步骤：

a)制备包括以5’-3’取向融合的下列成分的核酸序列：

-在植物中起作用的启动子、优选种子特异性启动子，

-至少一种编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶活性的蛋白或其活性片段的核酸序列，以及

-任选地，用于终止转录并在相应的转录物上添加聚腺苷酸尾的终止信号以及任选由该序列推导出的DNA序列；

b)将所述步骤a)的核酸序列转移到植物细胞中，并且任选地将所述的核酸序列整合到所述植物的基因组中，

c)如果希望的话，完全地再生出转化的植物，并任选地繁殖所述的植物。

34．根据权利要求18-29与32之任一的植物作为食用或饲用植物的用途。

35．根据权利要求18-29与32之任一的植物作为生育酚和／或维生素K1的生产场所的用途。

36．权利要求1-14之任一的核酸序列或核酸分子用于鉴定、分离或扩增编码具有牻牛儿牻牛儿还原酶活性的蛋白或其活性片段的核酸序列或分子的用途。

37．权利要求1-16之任一的核酸序列、核酸分子或蛋白用于免疫接种和生产抗体的用途。

38．权利要求1-14之任一的核酸序列或核酸分子用于生产转基因植物或植物细胞的用途。

39．根据权利要求38的用途，其中所述的植物或植物细胞显示出改变了的生育酚含量。

40．根据权利要求38的用途，其中所述的植物或植物细胞显示出改变了的叶绿素含量。

41．根据权利要求38的用途，其中所述的植物或植物细胞显示出改变了的维生素K₁的含量。

42．根据权利要求38的用途，其中所述的植物或植物细胞与野生型植物相比显示出对除草剂的耐受性有所提高。

43．根据权利要求38-42之任一的用途，其中所述的植物或植物细胞进一步含有编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸序列。

44．权利要求1-17之任一的核酸序列、核酸分子、蛋白或微生物用于鉴定植物的牻牛儿牻牛儿还原酶的抑制剂或效应物的用途。