JP2001521745A

JP2001521745A - 遺伝子導入植物のトコフェロール含有量操作

Info

Publication number: JP2001521745A
Application number: JP2000519087A
Authority: JP
Inventors: ベルンハルトグリム; 亮一田中
Original assignee: インスティテュートフュールプフランツェンゲネティクウントクルトゥルプフランツェンフォルシュング
Priority date: 1997-10-29
Filing date: 1998-10-29
Publication date: 2001-11-13
Also published as: PL340335A1; CN1280622A; AU747854B2; KR20010031660A; SK5992000A3; BR9813165A; WO1999023231A3; US6624342B1; DE19849960A1; DE19752647C1; AU1961699A; HUP0003963A2; EP1025250A2; WO1999023231A2; IL135391A0; CA2306458A1; AR010953A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ゲラニルゲラニルレダクターゼをコードする新規な核酸配列、前記新規なＤＮＡ配列を含み、野性型植物と比較してそのトコフェロールおよび／またはクロロフィル含有量が変化している新規な植物の生産方法、これら新規な植物、その部分およびその産生物、並びに植物細胞に加えて、遺伝子導入植物、その部分およびその産生物並びに植物細胞でトコフェロール、クロロフィルおよび／またはビタミンＫ₁含有量を操作するために前記ＤＮＡ配列を使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ゲラニルゲラニルレダクターゼをコードする新規な核酸配列；新規
な核酸配列を含み、さらに野性型植物と較べて異なる含有量のトコフェロールお
よび／またはクロロフィルを含む新規な植物を製造する方法；これら新規な植物
、その部分およびその産生物並びに植物細胞の他に；形質導入植物、その部分お
よびその産生物、並びに植物細胞のトコフェロール、クロロフィルおよび／また
はビタミンＫ₁含有量の操作のために当該核酸配列を使用することに関する。

【０００２】ジテルペンゲラニルゲラニルピロホスフェート（ＧＧＰＰ）は、植物のイソプ
レノイド代謝でＣ₂₀−中間体として生成される。それは、１単位のイソペンテニ
ルピロホスフェート（ＩＰＰ）をファルネシルピロホスフェート、Ｃ₁₅−セスキ
テルペンに添加することによって生成される。ＧＧＰＰは、植物二次代謝のいく
つかの合成経路に入る。例えば、ＧＧＰＰの２分子が" 尾部対尾部"結合し、Ｃ₄ ₀ 体、テトラテルペンを生成することができる。これは一般にカロテノイドと呼ばれ、例えばβ−カロチンはこれに属する。さらにＩＰＰ分子が添加されて、Ｇ
ＧＰＰはさらにポリテルペン（例えばゴムおよびグッタペルカ）生合成経路に入
る。

【０００３】さらに、ＧＧＰＰは他のジテルペン、例えばフィチルピロホスフェート（ＰＰ
Ｐ）に変換できる。Ｃ₂₀−体フィトールは、トコフェロール生合成（Soll & Sch
ulz, Biochem. Biophys. Res. Commun. 99:907-912(1981)）の他に、クロロフィ
ル生合成（Beale & Weisnstein, "Biosynthesis of Heme and Chlorophyll"（H.
A. Daily編）McGraw Hill刊、NY, 287-391(1990))）における必須の中間体である。全てのクロロフィル（クロロフィルａ、ｂ、ｃなど）の基本構造は４つのピ
ロール環から成るポルフィリン系で、この系にフィトールが第四ピロール環を介
してエステル様結合により結合しているが、トコフェロールはホモゲンチセート
およびフィトール尾部から成るという特徴を有する。

【０００４】トコフェロール群（一般にはビタミンＥと称される）には、いくつかの構造的
に近縁な親油性ビタミン、すなわちα−、β−、γ−およびε−トコフェロール
が含まれ、α−トコフェロールが生物学的な関係では最も重要である。トコフェ
ロールは植物油の多くで見出され、特にダイズ、コムギ、トウモロコシ、コメ、
綿、アルファルファおよび木の実の種子油はトコフェロールに富む。果実および
野菜（例えばラズベリー、インゲンマメ、エンドウマメ、ウイキョウ、コショウ
など）はトコフェロールを含有する。現在知られているところでは、トコフェロ
ールは、もっぱら植物および光合成の能力を有する生物で合成される。

【０００５】それらのレドックス能のゆえに、トコフェロールは、空気中の酸素による不飽
和脂肪酸の酸化防止に寄与し、α−トコフェロールはヒトで最も重要な親油性抗
酸化剤である。抗酸化剤としてのそれらの機能のためにトコフェロールは生物学
的な膜の安定化に寄与する。なぜならば、生物膜の流動性は、膜脂質の不飽和脂
肪酸の保護によって維持されているからである。さらにまた、最近の研究によれ
ば、比較的高い用量のトコフェロールの規則的摂取によって、粥状硬化症の進行
を防止することができる。トコフェロールのまた別の有望な特性および影響、例
えば糖尿病に付随する後期障害の遅延、白内障発生リスクの減少、喫煙者の酸化
性ストレスの減少、抗癌作用、皮膚の損傷（例えば紅斑および皮膚の加齢など）
に対する防御作用が報告された。

【０００６】その酸化抑制特性のゆえに、トコフェロールは食品工業だけでなく天然油系塗
装、デオドラントおよび他の化粧品（例えば日焼け防止剤、皮膚保護剤、リップ
スティックなど）にも用いられる。そのような用途では、酢酸トコフェリルおよ
びコハク酸トコフェリルのようなトコフェロール化合物は、ビタミンＥとして（
循環促進性および脂質還元性薬剤として）、さらに獣医領域の食品添加物として
使用する場合の通常の使用形態である。

【０００７】トコフェロールの生合成（特にα−トコフェロールの生合成）では、フィチル
ピロホスフェートは制限因子であると考えられる。先の研究では、ＰＰＰはイソ
プレノイド基の連続的水素付加によってＧＧＰＰから生成されることが示された
この反応中に、ジヒドロ−ＧＧＰＰおよびテトラヒドロ−ＧＧＰＰは中間体とし
て生成される（ＧＧＰＰ−＞ジヒドロ−ＧＧＰＰ−＞テトラヒドロ−ＧＧＰＰ−
＞ＰＰＰ、例えば次の文献を参照されたい：Bollivar et al. Biochemistry 33:
12763-12768(1994))。

【０００８】現時点で推定されているように、酵素ゲラニルゲラニルレダクターゼ（ＧＧＰ
Ｐレダクターゼ、またゲラニルゲラニルピロホスフェートヒドロゲナーゼおよび
ＧＧＰＰヒドロゲナーゼとも称される）によってＧＧＰＰからＰＰＰへと一工程
ずつ水素が付加される。この酵素はＣｈｌＰ遺伝子により植物でコードされる。
この酵素ゲラニルゲラニルレダクターゼはイソプレノイド代謝に属し、２つの代
謝経路のために機能する（すなわちトコペロール生合成およびクロロフィル生合
成）。

【０００９】この酵素の本質的な役割はクロロフィル生合成について初めて示された（Benz et al. Plant Sci. Lett. 19:225-230(1980); Soll & Schultz, Biochem. Biop
hys. Res. Commun. 99:907-912(1981); Schoch et al. Z. Pflanzenphysiol. 83
:427-436(1977)）。クロロフィル生合成の最終工程はクロロフィリドのエステル
化で、これはフィチルピロホスフェートの他にゲラニルゲラニルピロホスフェー
トで生じるであろう。ロドバクター・キャプシュラツス（Rhodobacter capsulat
us）変異種の系統的研究によって、バクテリオクロロフィリドは第一の工程でＧ
ＧＰＰでエステル化され、その後エステル化クロロフィル−ＧＧに水素が付加さ
れることが明らかにされた（Katz et al. J. Am. Chem. Soc. 94:7938-7939(197
2)）。高等植物では、フィチルクロロフィル（クロロフィル−Ｐ）はほとんどの
部分で見出すことができる（Rudiger & Schoch, "Chlorophylls"(1991) H. Sche
er編、pp.451-464, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA)。これまでのところ
、どの基質が植物のレダクターゼ反応に必要かは解明されていない。現在では、
植物酵素ゲラニルゲラニルレダクターゼはクロロフィル−ＧＧをクロロフィル−
Ｐに変換する他、ＧＧＰＰに水素を付加してＰＰＰとし、続いてこれをクロロフ
ィリドに結合させることができると推定されている（Soll et al. Plant Physio
logy 71:849-854(1983))。

【００１０】ＧＧＰＰは、葉緑体外側膜でのトコフェロールおよびフィロキノンの合成経路
で、およびチラコイド膜のクロロフィル合成で基質として働く。ＧＧＰＰからＰ
ＰＰへの還元は、１９８３年に先ずソルら（Soll et al., Plant Physiol. 71:8
49-854(1983)）によって報告された。しかしながら、今日まで、この植物酵素を
コードし、遺伝子導入植物でトコフェロール含有量を操作するために使用できる
核酸配列の単離および性状決定は成功していない。

【００１１】トコフェロールおよびクロロフィル代謝におけるゲラニルゲラニルレダクター
ゼの基本的役割のゆえに、この酵素は分子生物工学の非常に価値ある道具となっ
た。分子生物学的技術、例えばゲラニルゲラニルレダクターゼをコードするＤＮ
Ａ配列の移入によって、植物のトコフェロールおよび／またはクロロフィル生合
成の能力を改造することができるであろう。このようにして、例えばトコフェロ
ール含有量が増加または減少している遺伝子導入植物を製造することができるよ
うになるであろう。続いて、そのような遺伝子導入植物、その部分、細胞および
／またはその産生物を食品および飼料として、さらには一般的に化学工業、医薬
品工業および化粧品工業で利用するためにトコフェロールの製造センターとして
用いることができる。さらに、野性型植物と較べて抗酸化剤トコフェロール含有量の増加を示す植物
はまたストレス状態、特に酸化性ストレスに対して耐性強化を示すと期待される
理由が存在する。

【００１２】したがって、本発明の目的は、植物、植物細胞、植物の部分および／または植
物産生物中のトコフェロールの含有量を操作するための助けとなる新規な核酸配
列を提供することである。さらに、本発明の重要な目的は、野性型植物と較べてトコフェロール含有量の
変化を示す遺伝子導入植物、植物細胞、植物産生物および植物部分を提供するこ
とである。本発明のさらに別の目的は、本発明のＤＮＡ配列、それらの遺伝子産物の可能
な使用方法および植物交配の実施で本発明の遺伝子導入植物の可能な使用方法を
示すことである。本発明の更なる目的は以下の記載から理解されるであろう。これらの課題は、
それぞれ別個の請求項の内容によって、特に、本発明のＤＮＡ配列の供給（この
ＤＮＡ配列の遺伝子産物はトコフェロール生合成に直接必要である）およびこれ
らＤＮＡ配列の植物への導入（導入の結果トコフェロール含有量が変化する）を
基にして解決される。

【００１３】本発明はしたがって、ゲラニルゲラニルレダクターゼ（ゲラニルゲラニルピロ
ホスフェートヒドロゲナーゼとも称される）の生物学的活性を有する蛋白質、ま
たはその生物学的に活性なフラグメントコードするＤＮＡ配列に関する。本発明
に関して、生物学的に活性なフラグメントとは、それが仲介する生物学的活性が
トコフェロール含有量に影響を与えるために十分であることを意味する。特に、
本発明は、植物から単離され、ゲラニルゲラニルレダクターゼの酵素活性を有す
る蛋白質またはその生物学的に活性なフラグメントをコードするＤＮＡ配列に関
する。特に好ましいＤＮＡ配列は、配列番号：１に示された配列である（図１も
また参照されたい）。

【００１４】さらに、本発明は、本発明のＤＮＡ配列の対立遺伝子座および派生遺伝子に関
する。これらは、ゲラニルゲラニルレダクターゼの生物学的活性を有する蛋白質
をコードするが、特に遺伝暗号の縮退のために本発明のＤＮＡとは配列が異なっ
ている、ゲラニルゲラニルレダクターゼの活性を有する蛋白質またはそのフラグ
メントをコードする核酸分子である。さらに、本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含む核酸分子、または、天然に存在
することによって、または遺伝子工学的もしくいは化学的処理および合成手法に
よって本発明の配列から派生する核酸分子、またはそれらから推論される核酸分
子に関する。これらの核酸分子は任意の核酸形、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子
、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなどであろう。

【００１５】本発明はまた、本発明のＤＮＡ配列が植物細胞での転写、および所望の場合に
は翻訳を提供する調節成分と結合した核酸分子に関する。したがって、本発明のＤＮＡ配列は、例えば構造的調節成分の制御下だけでな
く、誘発性または組織特異的もしくは発生特異的調節成分、特にプロモータの制
御下で植物細胞で発現させることができる。しかしながら例えば、誘発性プロモ
ータの使用は、植物細胞で本発明のＤＮＡ配列の発現の特異的な開始を可能にす
るが、一方、組織特異的（例えば種子特異的）プロモータの使用は、特異的組織
（例えば種子組織）でのトコフェロール含有量を変化させることを可能にする。
したがって、本発明の好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡ配列は組織特異的
プロモータと、特に種子特異的プロモータと結合させる。

【００１６】本発明はさらに、本発明のＤＮＡまたは本発明の核酸によってコードされる、
ゲラニルゲラニルレダクターゼの生物学的活性を有する蛋白質またはその活性な
フラグメントに関する。好ましくは、この蛋白質は、好ましくはニコチアナ・タ
バクム（Nicotiana tabacum)に由来する植物のゲラニルゲラニルレダクターゼで
、特に好ましいものは、配列番号：２（図２もまた参照のこと）に示したアミノ
酸配列を有する蛋白質またはその活性フラグメントである。

【００１７】本発明のまた別の目的はベクターおよび微生物を提供することであって、それ
らを使用することによって、トコフェロールの含有量の変化を達成できる新規な
植物を産出することが可能になる。この課題は、ゲラニルゲラニルレダクターゼ
の活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む本発明のベクターおよび微生物
を提供することによって解決される。したがって、本発明はまた、ベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス
、バクテリオファージおよび遺伝子工学で常習的に用いられている他のベクター
に関し、これらは上記に述べた本発明の核酸分子を含み、所望の場合には植物お
よび植物細胞への本発明の核酸分子の移入に用いることができる。

【００１８】本発明はまた、形質転換微生物（例えば細菌、ウイルス、真菌、酵母など）に
関し、これらは本発明の核酸分子を含有する。好ましい実施態様では、ベクターに含まれる核酸分子は、転写および所望の場
合は原核細胞および真核細胞での翻訳を提供する調節成分と結合している。所望の場合は、本発明の核酸配列にはエンハンサー配列または他の調節配列を
補充することができる。これらの調節配列は、例えば遺伝子産物を一定の細胞区
画へ輸送させるシグナル配列もまた含む。

【００１９】さらに別の本発明の目的は、トコフェロールの含有量の変化を示す新規な植物
、植物細胞、植物の部分または植物の産生物を提供することで、これは野性型植
物と較べてクロロフィルの生合成能の改変を伴うであろう。これらの課題は、本発明の核酸分子を移入し、さらに植物でそれらを発現させ
ることによって解決される。本発明の核酸分子を提供することによって、新規な
ゲラニルゲラニルレダクターゼ活性または野性型細胞と比較して変化した活性を
示し、結果としてトコフェロール生合成能およびトコフェロール含有量の変化を
示すように植物細胞を遺伝子工学的方法で操作することが可能になった。好ましい実施態様では、本発明は、本発明の核酸分子の存在とその発現によっ
て野性型植物と比較してトコフェロール含有量が増加した植物および植物細胞並
びにその部分に関する。

【００２０】本発明はまた、本発明の核酸分子の移入がトコフェロールおよび／またはクロ
ロフィル含有量の減少をもたらす植物に関する。トコフェロールおよび／または
クロロフィル生合成の減少は、例えばアンチセンス構築物または他の抑圧機構（
例えば同時抑圧（co-suppression))の移入によってもたらされる。

【００２１】さらに本発明は、新規な核酸分子が植物ゲノムに組み込まれた遺伝子導入植物
細胞およびそのような植物細胞を含む植物並びにその植物の産生物に関する。本
発明はまた、本発明の核酸配列が自己複製型としてその細胞内に存在する、すな
わち当該植物細胞が自己の核酸分子上に外来ＤＮＡを含有する植物に関する。

【００２２】本発明の核酸分子で形質転換され、異なる量のトコフェロールおよび／または
クロロフィルが当該分子の移入によって合成される植物は、おおむねいずれの植
物でもよい。好ましくは、そのような植物は有用な単子葉または双子葉植物であ
る。単子葉植物の例は、アベナ属（エンバク）、トリチクム属（コムギ）、セカ
レ属（ライムギ）、ホルデウム属（オオムギ）、オリザ属（コメ）、パニクム属
、ペニセツム属、セタリア属、ソルグム属（アワ）、ゼア属（トウモロコシ）に
属する植物である。有用な双子葉植物は、とりわけ豆を生じる植物、例えばマメ
科の植物、特にアルファルファ、ダイズ、セイヨウアブラナ、トマト、テンサイ
、ジャガイモ、鑑賞植物、樹木である。他の有用な植物は、例えば果樹植物（特
にリンゴ、ナシ、サクランボ、ブドウ、柑橘類果実、パイナップルおよびバナナ
）、ギネアアブラヤシ、紅茶、ココアおよびコーヒーの木、タバコ、サイザルア
サ、綿の木、アマ、ヒマワリの他に薬用植物および牧草、飼料用穀類および飼料
用植物である。特に好ましいものは、穀粒、穀類、コムギ、ライムギ、エンバク
、オオムギ、コメ、トウモロコシおよびアワ、飼料用穀類、テンサイ、セイヨウ
アブラナ、ダイズ、トマト、ジャガイモ、スィートグラス、牧草、飼葉およびク
ローバーである。本発明は、特に一般的な食用植物および飼料用植物に関するも
のであることは自明である。したがって既に述べた植物の他にピーナツ、ヒラマ
メ、飼料用豆（エッケルボーン（Ackerbohne))、飼料用テンサイ、ソバ、ニンジ
ン、トピナンバー（topinambur）、ブラシカ(Brassica)（ラパ（rapa）、オレイ
フェラ(oleifera)、ナプス（napusu）、ラピフェラ(rapifera)）、ホワイトマス
タードおよびスィード（swede)も含まれるべきである。

【００２３】さらに、本発明は、本発明の植物の繁殖用材料（例えば種子、果実、挿し木用
切り枝、塊茎、根茎など）に関する。この繁殖用材料は前述の植物細胞の他にそ
のような植物の部分（例えばプロトプラスト、植物細胞およびカルス）を含むで
あろう。

【００２４】本発明はさらに、本発明の核酸分子の存在および所望の場合はその発現によっ
て、当該核酸分子を含まない植物細胞と比較した場合、ビタミンＫ₁の含有量が変化している植物細胞に関する。親油性ビタミンＫ₁（特に植物に存在する）は凝集因子の形成に基本的な役割を果たす。ビタミンＫ₁の欠乏は血液凝固の低下をもたらし、これがビタミンＫ₁が抗出血性ビタミンまたは凝固ビタミンとも呼ばれる所以である。本発明の核酸分子の発現はゲラニルゲラニルレダクターゼ活
性を変化させるので、したがってＰＰＰ−合成成果が変化し、さらにフィロキノ
ン（ビタミンＫ₁と呼ばれる）はトコフェロールのように１単位のフィトールを含むという観点から、本発明はまた、ビタミンＫ₁の含有量のみが変化した、またはトコフェロール含有量と併せて変化した植物細胞および植物に関する。

【００２５】好ましい実施態様では、本発明は、遺伝子導入植物細胞および植物、並びにそ
の部分およびその産生物に関する。これらは、植物ゲラニルゲラニルレダクター
ゼをコードするＤＮＡ配列の存在および所望の場合はその発現によって、非形質
転換細胞と比較してトコフェロール含有量が変化している。好ましくは、当該植
物細胞に含まれるＤＮＡ配列は、タバコから単離されたゲラニルゲラニルレダク
ターゼをコードする配列である。特に好ましいものは配列番号：１（図１参照）
に示したＤＮＡ配列である。特に好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡ配列は
ゲラニルゲラニルレダクターゼのプレ酵素で、プラスミドへの転座に必要なトラ
ンシット配列を含む。

【００２６】本発明はさらに、ｃｈｌＰ遺伝子に加えてヒドロキシフェニルピルベートジオ
キシゲナーゼ（ＨＰＤ）が発現されている植物に関する。この酵素ＨＰＤは４−
ヒドロキシフェニルピルベートからホモゲンチセートへの反応を触媒する。上記
で述べたように、ホモゲンチセートはフィトールに加えてトコフェロールの第二
の前駆体である。酵素ＰＨＤについては、特にノリスらの文献で植物のイソプレ
ノイド代謝内でのその役割とともに記載されている（Norris et al., The Plant
Cell 7:2139-2149(1995))。それぞれゲラニルゲラニルレダクターゼおよびＨＰＤをコードする配列の同時
発現、好ましくは過剰発現によって、遺伝子導入植物のトコフェロール含有量は
、ｃｈｌＰをコードする本発明の配列のみを含む植物と比較してさらに高められ
る。

【００２７】別の実施態様では、本発明は、上記で述べた核酸分子またはベクターで形質転
換または感染させたホスト細胞（特に原核細胞または真核細胞）、およびそのよ
うなホスト細胞に由来し当該核酸分子またはベクターを含む細胞に関する。これ
らのホスト細胞は、例えば細菌、藻類、酵母および真菌の他に植物または動物細
胞でもよい。本発明はまた、本発明の核酸分子を含むだけでなく、さらに、トコ
フェロール、クロロフィルおよび／またはビタミンＫ₁の生合成に必要な酵素の遺伝情報を有する１つまたは２つ以上の核酸分子（これらは遺伝子工学によるか
、または自然の状態で移入される）を含むホスト細胞に関する。

【００２８】本発明のまた別の目的は、トコフェロール含有量が変化している植物細胞およ
び植物を生産する方法を提供することである。この課題は、ゲラニルゲラニルレダクターゼをコードする核酸分子の移入によ
ってトコフェロール含有量の変化を示す新規な植物および植物細胞を生産するこ
とができる手段によって解決される。さらにまた、この課題は、ゲラニルゲラニルレダクターゼをコードする核酸分
子およびＰＨＤをコードする核酸分子の同時発現、またはゲラニルゲラニルレダ
クターゼをコードする核酸分子およびＰＨＤをコードする核酸分子の移入によっ
て、野性型植物と比較してトコフェロール含有量の変化を示す新規な植物細胞お
よび植物を産生することができる手段によって解決される。

【００２９】そのような新規な植物細胞および植物を生産するためにはいくつかの異なる方
法を用いることができる。一方では、植物および植物細胞は、新規な核酸分子が
植物ゲノムに組み込まれるような方法で、通常の遺伝子工学による形質転換によ
って改造することができる（これは安定な形質転換体が産生されることを意味す
る）。他方、本発明の核酸分子（その存在および所望の場合はその発現が、トコ
フェロール生合成の性能の変化をもたらす）は、自己複製系として植物細胞また
は植物に導入してもよい。例えば、本発明の核酸分子は、植物または植物細胞と
接触できるウイルスに包含させてもよい。

【００３０】本発明にしたがえば、本発明の核酸配列の発現によってトコフェロール含有量
の変化を示す植物細胞は、以下の工程を含む方法によって産生される：ａ）以下のＤＮＡ配列を含む発現カセットの作製： −植物細胞で転写を提供するプロモータ； −ゲラニルゲラニルレダクターゼの酵素活性を有する蛋白質またはフラグメン
トをコードする少なくとも１つの核酸（この場合、核酸配列はセンス方向でプロ
モータの３'末端に連結されている）；および −所望の場合には、転写を終了させ、さらに対応する転写物にポリＡテールを
付加するための終止シグナル（この場合、終止シグナルはコード領域の３'末端に連結される）；ｂ）工程ａ）で作製された発現カセットによる植物細胞の形質転換；ｃ）遺伝子導入植物の再生、および所望の場合は当該植物の繁殖。別の選択として、自己複製系として本発明の１つまたは２つ以上の核酸配列を
植物細胞または植物に導入してもよい。

【００３１】さらに別の選択として、本発明の少なくとも１つの核酸配列（これはゲラニル
ゲラニルレダクターゼの酵素活性を有する蛋白質またはフラグメントをコードす
る）が、アンチセンス方向でプロモーターの３'末端に連結されるように、上記の方法の工程ａ）を改変してもよい。

【００３２】本発明のまた別の目的は、本発明の核酸配列およびこれらの核酸配列を含む核
酸分子の有利な利用を示すことである。この課題は、野性型細胞および野性型植物と比較してトコフェロール含有量の
変化、好ましくは増加を示す植物細胞および植物を生産するために新規なＤＮＡ
分子を本発明にしたがって使用することによって解決される。

【００３３】さらに、本発明は、トコフェロール含有量の変化を示す植物の生産のために本
発明の核酸配列を使用することに関する。さらにまた、本発明は、ビタミンＫ₁含有量の変化、好ましくは増加を示す植物の生産のために本発明の核酸配列を使用することに関する。本発明のさらに別の目的は、本発明の植物、その細胞、部分および生産物の可
能な使用を示すことである。

【００３４】本発明は特に、飼料用および／または食用植物として本発明の植物を使用する
ことに関する。有用な遺伝子導入植物並びにその生産物および部分におけるビタ
ミンＥおよび／またはＫ₁の増加の達成度に応じて、対応するビタミンの量、特にビタミンＥ（これは通常飼料／食品に混合され、さらにまた、しばしばそうす
ることを要求される）を減少させることができる。ある種の環境下では、通常の
ビタミン補充は不必要となるであろう。これとは別に、本発明は、トコフェロー
ルおよび／またはフィロキノン含有量を増加させることによって一般に有用な植
物の栄養価の強化に関する。

【００３５】さらに、本発明は、ビタミンＥおよび／またはＫ₁の生産部位として本発明の植物細胞、植物、その部分および生産物を使用することに関する。それらビタミ
ンの特性による利用とは別に、例えば特別食および医薬品、化粧品、スキンケア
製品（一般にビタミンＥが補充される）では、トコフェロールがまた、例えば脂
質および油のような化学品において抗酸化剤として用いられる。したがって、本
発明の植物は、産業的に広範囲の目的を有するトコフェロールおよび／またはビ
タミンＫ₁の製造のために重要な供給源を提供する。

【００３６】本発明はさらに、特に種子組織がトコフェロール含有量の変化、好ましくは増
加を示す植物の生産のために、種子特異的プロモータと併せて本発明の核酸配列
を使用することに関する。本発明の好ましい実施態様では、本発明の核酸配列は
、ＵＳＰ（Baumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225:459-467(1991))またはホル
デインプロモータ（Brandt et al., Carlsberg Res. Commun. 50:333-345(1985)
）と併せて用いられる。前述のプロモータ、特に種子特異的プロモータは、本発明のＤＮＡ配列をアン
チセンス手法とともに用いることによって、遺伝子導入種子のトコフェロールお
よびクロロフィル含有量を特異的に減少させるために特に有用である。さらに、本発明は、植物でトコフェロール含有量の変化をもたらすためにゲラ
ニルゲラニルレダクターゼ遺伝子を使用することに関する。さらにまた、本発明は、植物のトコフェロール含有量を変化させるためにゲラ
ニルゲラニルレダクターゼの酵素活性を有する蛋白質を使用することに関する。

【００３７】さらに、本発明は、植物防疫に必要な新規な除草剤の同定のために、本発明の
核酸分子、ゲラニルゲラニルレダクターゼ活性を有する本発明の蛋白質、および
／または新規なもしくは変化したゲラニルゲラニルレダクターゼ活性を有する本
発明の遺伝子導入植物およびホスト細胞を使用することに関する。クロロフィル
およびトコフェロール生合成でのゲラニルゲラニルレダクターゼの重要な役割の
ゆえに、本発明のＤＮＡ配列およびそれによってコードされる蛋白質は、除草剤
研究の極めて重要な標的である。例えば、ゲラニルゲラニルレダクターゼ酵素活性を有する本発明の蛋白質は、
Ｘ線構造解析、ＮＭＲ分光計、分子モデルおよびドラッグデザインに用いられ、
これらの技術によって得られたデータおよび情報を基にゲラニルゲラニルレダク
ターゼの抑制物質またはエフェクターを特定または合成することができる。

【００３８】本発明はさらに、除草剤耐性植物を生産するために本発明の核酸配列を使用す
ることに関する。ゲラニルゲラニルレダクターゼをコードする配列は標準的技術
によって改造するか、または新規な成分を補充し、さらにこれらの配列を植物細
胞に導入することができる。本発明の配列から推論した配列を移入して、例えば
、機能的に活性のより高いもしくは低いゲラニルゲラニルレダクターゼ、または
特性が変化したゲラニルゲラニルレダクターゼの変種が遺伝子導入植物で合成さ
れるように、または遺伝子導入植物に存在するｃｈｌＰ遺伝子の発現レベルが減
少するように植物の特性を改造することができる。結果として、ＣＨＬＰ活性を
増加させることによって、クロロフィル生合成を阻害する除草剤に対する耐性を
高めることができる。同様に、例えば遺伝子導入植物細胞での改造ゲラニルゲラ
ニルレダクターゼ遺伝子の発現は、除草剤に対する耐性の増加と関連する。

【００３９】さらに本発明は、抗体を産生するために本発明の核酸配列またはそれによって
コードされる蛋白質を使用することに関する。したがって、本発明は、植物における本発明の核酸分子の存在および所望の場
合はその発現が、トコフェロール含有量および／またはクロロフィル含有量の変
化を引き起こす本発明の核酸の一切の使用とともに、そのような変化をもたらす
酵素活性を有する本発明の蛋白質およびそのフラグメントの一切の使用を含む。

【００４０】原則として、植物で機能する選択可能ないずれのプロモータも使用できる。こ
れらのプロモータは、当該プロモータによって制御される発現がトコフェロール
合成性能を変化させるという前提条件を満たす必要がある。食用および／または
飼料用植物として遺伝子導入植物を使用するという観点から、種子特異的発現を
提供するプロモータはこの点で特に有用である。そのようなプロモータの例はＵ
ＳＰプロモータ、ホルデインプロモータおよびナピンプロモータである。

【００４１】そのようなプロモータが未だ不明であるか、または未だ入手できない場合に当
該プロモータを単離する方法は当業者には知られている。一般に、先ず第一の工
程で、ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを種子組織から単離してｃＤＮＡライブラリーを作製する。第二の工程では、非種子組織に由来するポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ分子を基に得られたｃＤＮＡによって、その対応するポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ分子が種子組織でのみ発現されているｃＤＮＡクローンをその第一のライブラリーからハイブリダイ
ゼーションによって特定する。続いてこのようにして特定したｃＤＮＡを用いて
プロモータを単離し、本明細書で述べるコード核酸配列の発現を制御するために
用いることができる。同様に、他の組織特異的または発生特異的プロモータ、ま
たは非生物学的刺激により誘導できるプロモータも単離可能で、本発明にしたが
って用いることができる。

【００４２】また別には、本発明の核酸分子の発現によって、植物がトコフェロール含有量
の変化、好ましくは増加を示すことが所望されるであろう。このような場合には
、構造性プロモータ、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡプロ
モータを使用するのが望ましい。

【００４３】本発明はまた、ゲラニルゲラニルレダクターゼの生物活性を有する蛋白質また
は生物学的に活性なそのフラグメントをコードする核酸分子を含む。これらの核
酸分子は上記の核酸分子とハイブリダイズする。本発明では、" 生物学的に活性
なフラグメント"とは、一般に、そのフラグメントがトコフェロール含有量の変化を生じるために十分であることを意味する。本発明では、" ハイブリダイゼー
ション"という用語は、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは厳しい（ストリンジェントな）条件下（例えばサンブルックらの成書（Sambrook et
al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）に記載されたような
条件）でのハイブリダイゼーションを意味する。

【００４４】本発明の分子とハイブリダイズする核酸分子は、例えばゲノムライブラリーま
たはｃＤＮＡライブラリーから単離できる。そのような核酸分子の特定および単離は、当該核酸分子もしくはこれら分子の
部分またはこれら分子の逆相補物を用いて、例えば標準的技術によるハイブリダ
イゼーション（例えば上掲書（Sambrook et al.)を参照）によって実施できる。
そのような核酸分子の特定および単離のためにはまた、本発明のＤＮＡ配列、例
えば縮退オリゴヌクレオチドプライマーから推定される配列を用いることができ
る。

【００４５】したがって、本発明はまた、本発明のＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植
物または他の生物体から相同な配列を特定および単離するために使用することを
含む。例えば、正確にまたは本質的に上記の核酸配列またはこれら配列のフラグメン
トを表わしている核酸分子はハイブリダイゼーションプローブとして用いること
ができる。ハイブリダイゼーションプローブとして用いられるフラグメントは通
常の合成技術にしたがって製造された合成フラグメントでもよく、その配列は、
本発明の核酸分子の配列と基本的に一致する。本発明の核酸配列とハイブリダイ
ズする遺伝子を特定し単離したら、それらの配列を決定し、それら配列によって
コードされる蛋白質の特性を分析することが必要である。そのために、多くの分
子生物学的、生化学的および生物工学的手法が当業者には利用可能である。

【００４６】本発明の核酸分子とハイブリダイズする分子にはまた、ゲラニルゲラニルレダ
クターゼまたは生物学的に、すなわち酵素的に活性なそのフラグメントをコード
する上記ＤＮＡ分子のフラグメント、その誘導体および対立遺伝子変種が含まれ
る。これに関してフラグメントとは、ゲラニルゲラニルレダクターゼまたはそれ
に匹敵する酵素活性（トコフェロール含有量の変化をもたらすことができる活性
）を有するポリペプチドまたは蛋白質をコードするために十分に長い核酸分子の
フラグメントまたは部分を指す。本明細書では" 誘導体"とは、これらの分子の配列が、上記の核酸分子の配列と１つまたはいくつかの位置で区別でき、しかも
これらの配列と極めて高い相同性を示すことをことを意味する。本明細書の相同
性とは、少なくとも４０％の配列同一性、特に少なくとも６０％の配列同一性、
好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の配列同一性を意味する。上
記の核酸分子との相違は、欠失、付加、置換、挿入または組換えによるものであ
る。

【００４７】相同性とは、さらに問題の核酸分子間またはそれによってコードされる蛋白質
間に機能的および／または構造的同等性が存在することを意味する。上記の分子
と相同性を有し、さらにこれら分子の誘導体である核酸分子の場合は、通常これ
ら分子の改変された変種と関連を有し、同じ生物学的機能を示す。これらは、天
然に存在する変種（例えば他の生物または変異に由来する配列）と関連するであ
ろう。この場合、これらの改変は自然に発生したものであるか、または特定の変
異によって導入されたものであろう。さらに、これらの変種は合成で製造された
配列とも関連する。対立遺伝子変種の場合、これらは、天然に発生するか、合成
によって生じるか、または組換えＤＮＡ技術によって製造される変種であろう。

【００４８】本発明の核酸分子の種々の変種および誘導体によってコードされた蛋白質は、
通常は共通の特徴を有する。そのような特徴は、例えば酵素活性、分子量、免疫
学的反応性、構造などである。また別の共通の特徴は物理的特性、例えばゲル電
気泳動での泳動パターン、クロマトグラフィー特性、沈降係数、可溶性、分光特
性、安定性、至適ｐＨ、至適温度などである。さらに、この蛋白質によって触媒
される反応ももちろん共通または同様な特性を有する。

【００４９】外来遺伝子を高等植物に導入するために、多様なクローニングベクターが利用
可能で、これらベクターは、大腸菌（E. coli)で活性な複製開始点および形質転
換細菌細胞選別用のマーカー遺伝子を含む。そのようなベクターの例は、ｐＢＲ
３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４などである。
所望の配列は適切な制限部位でベクターに挿入できる。得られたプラスミドは大
腸菌細胞の形質転換に用いられる。形質転換させた大腸菌を適切な培地で培養し
、続いて採集して溶菌させる。プラスミドを回収する。通常は、分析手段として
制限地図作製、ゲル電気泳動および他の生物学的、分子生物学的手法が、回収プ
ラスミドＤＮＡの性状を調べるために利用される。各操作の後、プラスミドＤＮ
Ａを消化し、得られたＤＮＡフラグメントを他のＤＮＡ配列に連結できる。各プ
ラスミドＤＮＡ配列を同じプラスミドまたは他のプラスミドでクローニングでき
る。

【００５０】植物のホスト細胞にＤＮＡを導入するには多くの周知の方法を利用することが
できる。当業者は、それぞれに適した方法を容易に決定および選択することがで
きる。これらの技術には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens)またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhiz
ogenes）を形質転換手段として用いるＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プ
ロトプラストの融合、単離ＤＮＡのプロトプラストへの直接遺伝子移入、ＤＮＡ
のマイクロインジェクションおよび電気穿孔、生物学的手段によるＤＮＡの導入
および他の可能な手段が含まれる。

【００５１】ＤＮＡを植物細胞に注入および電気穿孔する場合、それ自体について特別なこ
とは使用されるプラスミドに要求されない。同じことが遺伝子の直接移入にも適
用される。ここでは簡単なプラスミド（例えばｐＵＣ誘導体）がしばしば用いら
れる。しかしながら、完全な植物をこのようにして形質転換した細胞から再生す
る場合は、選別マーカー遺伝子の存在が通常は必要である。通常の選別マーカー
は当業者には周知で、容易に適切なマーカーを選択できる。

【００５２】問題の遺伝子の導入のために選択した方法にしたがって、さらに付加的なＤＮ
Ａ配列が要求されるであろう。例えば、植物細胞の形質転換にＴｉプラスミドま
たはＲｉプラスミドを用いる場合は、ＴｉおよびＲｉプラスミドに含まれるＴ−
ＤＮＡの少なくとも右側の境界（しばしば左右の境界）は、導入されるべき遺伝
子と隣接領域として結合されねばならない。

【００５３】アグロバクターを形質転換に用いる場合、導入ＤＮＡは、特別なプラスミド、
すなわち中継ベクター（intermediary vector)または複式ベクター(binary vect
or）でクローニングしなければならない。Ｔ−ＤＮＡ中の配列と相同な配列のた
めに、中継ベクターは、アグロバクターのＴｉまたはＲｉプラスミドに相同組換
えによって組み込まれる。さらに、後者は、Ｔ−ＤＮＡの移入に必要なｖｉｒ領
域を含む。中継ベクターはアグロバクター内で複製できない。中継ベクターは、
アグロバクターに属するアグロバクテリウム・ツメファシエンスにヘルパープラ
スミド（共役）によって移入できる。複式ベクターは大腸菌内でもアグロバクタ
ーと同様に複製できる。それらは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界領域によって囲まれ
た選別マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。これらのベク
ターは直接アグロバクターに導入して形質転換できる（Holsters et al., Molec
ular and eneral Genetics 163:181-187(1978)）。ホスト細胞として機能するア
グロバクターはｖｉｒ領域を有するプラスミドを含んでいるであろう。ｖｉｒ領
域は植物細胞へＴ−ＤＮＡを移入させるために必要である。また別のＴ−ＤＮＡ
が存在するであろう。前述の態様で形質転換されたアグロバクターは植物細胞の
形質転換に用いられる。

【００５４】植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は完全に研究され、欧州特許第
１２０５１５号および以下の文献に適切に開示されている（Hoekema, "The Bina
ry Plant Vector System", Offsetdrokkerji Kanters B.V., Alblasserdam(1985
), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46; An et al., EM
BO J. 4:277-287(1985))。

【００５５】植物細胞にＤＮＡを移入するために、植物の外移植片をアグロバクテリウム・
ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスとともに適切に培養す
る。この感染植物片（例えば葉、葉の一部、茎の断片、根、さらにまた浮遊培養
として培養したプロトプラストまたは植物細胞）から、完全な植物が、形質転換
細胞の選別用の抗生物質を含む適切な培養液中で再生できる。植物の再生は、通
常の栄養培地を用いることによって一般的な再生方法にしたがって実施できる。
続いて、上記のようにして得られた植物を導入したＤＮＡの有無について調べる
ことができる。生物学的方法を利用するかまたはプロトプラストの形質転換によ
る外来ＤＮＡを導入する他の方法も知られている（例えば以下の文献を参照のこ
と：L. Wilmitzer, Transgenic Plants, "Biotechnology, A Murti Volume Comp
rehensive Treatise(H.J. Rehm, G. Reed, A. Pｕhler, P. Stadler, eds.) Vol
.2, 627-659(1993), V.C.H. Weinheim-New York, Basel-Cambridge)。

【００５６】アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いるＴｉプラスミドベクター系に
よる双子葉植物の形質転換は十分に確立されているが、一方、最近の研究によれ
ば、単子葉植物もまたアグロバクター系ベクターによって形質転換できることが
示された（Chan et al., Plant Mol. Biol. 22:491-506; Hiei et al., Plant J
. 6:271-282(1994); Deng et al., Science in China 33:28-34(1990); Wilmink
et al., Plant Cell Reports 11:67-80(1992); May et al., Bio/Technology 1
3:486-492(1995); Conner & Domiss, Int. J. Plant Sci. 153:550-555(1992);
Ritchie et al., Transgenic Res. 2:252-265(1993))。

【００５７】単子葉植物を形質転換するまた別の系は、生物学的手法による形質転換（Wan
& Lemaux, Plant Physiol. 104:37-48(1994); Vasil et al., Bio/Technlogy 11
:1553-1558; Ritala et al., Tehor Appl. Genet. 79:625-631(1990); Altpeter
et al., Plant Cell Reports 16:12-17(1996)）、プロトプラストの形質転換、
部分的に透過性にした細胞の電気穿孔、およびグラスファイバーによるＤＮＡの
導入である。

【００５８】トウモロコシの形質転換は特に文献で何度か記載された（例えば以下を参照さ
れたい：WO95/06128; EP0513849; EP0465875; Fromm et al., Biotechnology 8:
833-844(1990); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618(1990); Koziel et
al., Biotechnology 11:194-200(1993)）。欧州特許第２９２４３５号は、粘液
の少ない砕けやすい顆粒質のトウモロコシのカルスから出発して繁殖能力のある
植物を得ることができる方法を開示している。これに関して、Shillitoらは、繁
殖力のある植物の生成には、植物体を再生する能力を有する分裂プロトプラスト
培養を得ることができるカルス培養から出発することがさらに必要であることを
観察した（Bio/Technology 7:581(1989)）。７から８ヵ月のin vitro培養期間の
後でShillitoらは生存力をもつ子孫を生産することができる植物を得た。

【００５９】 Prioli & Sondahl（Bio/Technology 7:589(1989)）は、トウモロコシのプロト
プラスト、カテオトウモロコシの同系交配株Ｃａｔ１００−１から繁殖力のある
植物の再生および生産を記載した。この著者らは、プロトプラストから繁殖力を
有する植物の再生は多数の異なる因子、例えば遺伝子型、供与細胞の生理的状態
および培養条件によって左右されると推定している。穀物種の形質転換の成功例もまた、例えばオオムギ（Wan & Lexaux, 上掲書;R
itala et al., 上掲書）およびコムギ（Nehra et al., Plant J. 5:285-297(199
4);Alypeter et al., 上掲書）について報告された。

【００６０】導入されたＤＮＡが植物細胞のゲノムに組み込まれると、当該ＤＮＡは安定を
維持し、さらに最初に形質転換された細胞の子孫に安定に伝えられる。通常は、
当該ＤＮＡは、抗生物質（例えばカナマイシンＧ４１８、ブレオマイシン、ヒグ
ロマイシン、メトトレキセート、グリフォセート、ストレプトマイシン、スルホ
ニルウレア、ゲンタマイシン、またはホスフィノトリシンなど）に対する耐性を
付与する選別マーカーを含んでいる。個々に選択される選別マーカーは、したが
って導入ＤＮＡを欠く細胞から形質転換細胞の選別を可能にするはずである。

【００６１】形質転換細胞は通常の態様で植物内で増殖する（以下の文献もまた参照された
い：McCormick et al., Plant Cell Reports 5:81-84(1986)）。得られた植物は
通常の態様で栽培でき、自家受粉によって繁殖させるか、または同じ形質転換特
質または他の遺伝的特質を有する植物と交配できる。生じた個々のハイブリッド
植物はそれぞれの表現特性を有する。通常、これら植物から種子を得ることがで
きる。この表現型特質が安定に維持され伝達されることを担保するために２世代また
は３世代以上増殖させるべきである。それぞれの表現型または他の特質が維持さ
れていることを担保するために種子も採取されるべきである。

【００６２】通常の方法を適用することによって、遺伝子導入系統を調べることができる。
これらは当該新規な核酸分子についてホモ接合体で、それらの表現型の出現態様
をトコフェロール含有量の変化について調査し、ヘミ接合系統のそれと比較する
ことができる。

【００６３】ゲラニルゲラニルレダクターゼ活性を有する本発明の蛋白質の発現は、通常の
分子生物学的および生化学的手法によって達成できる。当業者はこれらの技術を
熟知しており、容易に適切な検出方法を選択できる。例えばゲラニルゲラニルレ
ダクターゼ特異的ＲＮＡの検出およびゲラニルゲラニルレダクターゼ特異的ＲＮ
Ａの蓄積量の決定にはノザンブロット分析を、ゲラニルゲラニルレダクターゼを
コードするＤＮＡ配列の特定にはサザンブロット分析を、または本発明のＤＮＡ
配列によってコードされた蛋白質、好ましくはＣＨＬＰの検出にはウェスタンブ
ロット分析を選択できる。ゲラニルゲラニルレダクターゼの酵素活性は、例えば
文献（Soll & Schultz, Biochem. Biophys. Res. Commun. 99:907-912(1981))に
記載されたように酵素アッセイによって検出できる。このアッセイは、クロロフ
ィルフィチルの生成を基にしている。

【００６４】本発明は、ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum)の亜種、Petit Havana SR1由来のｃＤＮＡライブラリーから得たゲラニルゲラニルレダクターゼをコー
ドするｃＤＮＡクローンの単離の成功による。このｃＤＮＡクローンの配列（完
全な開放読み枠を含む）は配列番号：１に示されている。配列番号：１の配列を
用いて、野性型植物と比較してトコフェロール含有量の変化を示す遺伝子導入植
物を生産することができた。このｃＤＮＡクローン（配列番号：１のＤＮＡ配列を含む）で大腸菌を形質転
換し、得られた大腸菌株はブダペスト条約にしたがい１９９７年１０月１６日に
寄託番号ＤＳＭ１１８１６の下に下記に寄託された。：Deutsch Sammlung fur M
ikuroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Mascherroder Weg 1b, D-3812
4 Braunschweig, Germany 。

【００６５】以下の実施例は本発明を詳述するために提供する。実施例実施例１：ゲラニルゲラニルレダクターゼ（ＣＨＬＰ）をコードするタバコｃ
ＤＮＡのクローニングタバコのゲラニルゲラニルレダクターゼｃＤＮＡを特定するために、ラムダＺ
ＡＰＩＩｃＤＮＡライブラリー（ニコチアナ・タバクムＳＲ１、Stratagene, US
A)を、４Ｄ９Ｔ７Ｐ遺伝子座をコードするアラビドプシス・タリアーナ（Arabid
opsis thaliana）由来のＥＳＴを用い製造元のプロトコルにしたがってスクリー
ニングした。使用したＥＳＴ配列は、ロドバクター・キャプスラツス（Rhodobac
ter capsulatus）由来の既知のｂｃｈＰ／ｃｈｌＰ配列（Young et al., Mol. G
en. Genet. 218:1-12(1989); Bollivar et al., J. Mol. Biol. 237:622-640(19
94); Bollivar et al., Biochemistry 33:12763-12768(1994))およびシネコシス
チス（Synechocystis)ＰＣＣ６８０３（Addlesee et al., FEBS lett. 389:126-
130(1996))と類似性を示していた。

【００６６】使用したハイブリダイゼーションプローブは、４Ｄ９Ｔ７Ｐ（受付番号Ｔ０４
７９１）の塩基１から塩基３６４までのＥＳＴ配列の領域を含む。このプローブ
はＡ．タリアーナ由来のＰＲＬ２ライブラリー（ベクター：λＺｉｐＬｏｘ）（
Newman et al., Plant Physiol. 106:1241-1255(1994))からＮｏｔＩ／ＳａｌＩ
制限フラグメントとして単離し、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰでニックトランスレーシ
ョン（Life Technologies, Eggenstein, Germany）により放射能標識した。

【００６７】ハイブリダイゼーションは以下のプロトコルにしたがって実施した： −以下の組成を有するハイブリダイゼーション溶液を用いて５５℃で２時間予
備ハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬
、１００μｍ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ； −上記の組成および放射能標識プローブを含む新しいハイブリダイゼーション
溶液を用いて５５℃で１２時間主ハイブリダイゼーション； −洗浄：２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで５５℃で１０分２回、および１×
ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで５５℃で５分１回。

【００６８】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって単離したプラスミドＤＮＡの
配列を通常の方法で決定した。配列番号：１に示す、特定したｃｈｌＰｃＤＮＡ
配列は１５１０ヌクレオチドを含み（ポリＡテールを含まない）、ヌクレオチド
１から１３９２は５２ｋＤａの蛋白質（４６４アミノ酸残基から成り、開始コド
ンメチオニンを含み、終止コドン（ヌクレオチド１３９３から１３９５）は含ま
ない）をコードする。ＣＨＬＰ蛋白質の推定アミノ酸配列は配列番号：２に示さ
れている。配列番号：１に示すヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１３９６から
１５１０の３'非翻訳領域を含む。

【００６９】ＤＮＡ、ＲＮＡ単離、配列分析、制限分析、クローニング、ゲル電気泳動、放
射能標識、サザン、ノザンおよびウェスタンブロット分析、ハイブリダイゼーシ
ョンおよび同様な方法については、例えばサンブルックらの成書（Sambrook et
al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)のような標準的な研
究室マニュアルに記載された通常の方法を利用した。

【００７０】実施例２：タバコの植物体の形質転換および完全な植物体の再生ＣＨＰＬを過剰発現し、したがって非形質転換植物と比較してトコフェロール
含有量の増加を示す遺伝子導入植物を生産するために、配列番号：１のＤＮＡ配
列(pBluescriptベクターの多数のクローニング部位に存在する）を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＳａｌＩを用いてベクターから切り出し、同じ制限エンドヌクレア
ーゼで消化した複式ベクターＢｉｎＡｒ−ＴＸ（Hofgen & Willmitzer, Plant S
cience 66:221-230(1990))、ｐＢＩＢ誘導体（Becker, Nucleic Acid Res. 18:2
03(1990)）のＣａＭＶ３５Ｓプロモータの後にセンス方向で連結した。説明のた
めにベクターＢｉｎＡＲ−ＴＸの制限地図を図３に示す。

【００７１】上記の複式ベクターＢｉｎＡＲ−ＴＸの代わりに、植物の形質転換に適した他
の任意のベクターを用いて、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータまたは植物細胞で転写お
よび翻訳を提供する他の任意のプロモータおよびＣＨＬＰをコードするＤＮＡ配
列の融合物を含むキメラ遺伝子を構築することができる。この組換え体（リコンビナント）ベクターｐＣＨＬＰｂｉｎを続いてアグロバ
クテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ２２６０株；(Horsch et al., Science 22
7:1229-1231(1985))に導入し、リーフディスク形質転換技術(Horsch et al., 上
掲書）によってタバコの植物体（ＳＮＮ）の形質転換に用いた。

【００７２】この目的のために、得られたアグロバクテリウム・ツメファシエンスクローン
の一晩培養を５０００ｒｐｍで１０分遠心し細菌を２ＹＴ培地に再懸濁させた。
若いタバコの葉の無菌培養（ニコチアナ・タバクムの亜種サムスン（Samsun）Ｎ
Ｎ）から直径約１ｃｍの小片を切り出し、短時間上記の細菌懸濁液で保温した。
続いて、この葉の薄片をＭＳ培地（Murashige & Skoog, Physiol. Plant 15:473
(1962)；０．７％寒天）に静置し、暗所で２日間保持した。続いて、成長部分誘
発のために、この葉の薄片を１．６％のグルコース、１ｍｇ／ｍｌのベンジルア
ミノプリン、０．２ｍｇ／ｍｌのナフチル酸性酸、５００ｍｇ／ｍｌクラフォラ
ン（セフォタキシム、ヘキスト（Hoechst)、Franfurt, Germany)および５０ｍｇ
／ｍｌのカナマイシンを含むＭＳ培地に静置した。培地を７日から１０日毎に交
換した。幼弱植物の発生後、葉の薄片を同じ培地を含むガラス容器に移した。こ
の幼弱植物を切り出し、２％の蔗糖および２５０ｍｇ／ｌのクラフォランを含む
ＭＳ培地に静置し、完全な植物体を再生させた。

【００７３】実施例３：リコンビナントベクターｐＣＨＬＰｂｉｎを含む遺伝子導入タバコ
植物体の分析遺伝子導入タバコ植物体を、上記のように形質転換し、選別し再生した。無菌
培養で根が成長した後、それぞれ別個に１００個の一次形質転換体を温室の土壌
に移した。タバコの植物体を６０％の湿度の温室で２０−２５℃で１６時間照明
および１８−２０℃で８時間無照明で保持した。トコフェロールおよび／またはクロロフィル含有量が正常または増加している
形質転換体は、コントロール植物と比較してその外観または性質に異常を示さず
、また成長速度にも変化はなかった。

【００７４】一次形質転換体のいくつかは、野性型植物と比較して４倍から６倍のトコフェ
ロール含有量の増加を示した。トコフェロール含有量のこの増加はＴ１およびＴ
２世代の子孫、並びに通常の自家受粉とそれに続くカナマイシン含有培地での種
子の分離パターン決定によって得られたホモ接合体の子孫植物体でさらに増加さ
せることができた。さらにまた、遺伝子導入植物のトコフェロール含有量は、コントロール植物と
比較して、ストレス状態（例えば低温もしくは高温での栽培時、または強力な照
明下での栽培時で見出される）下で、老化した葉の場合と同様にさらに増加する
ことが観察された。

【００７５】トコフェロールは以下の方法にしたがって測定した：リーフディスクを液体窒素中で均質化し、メタノールで３回抽出した。抽出物を
集め、リクロスファー（LiCrospher）１００ＨＰＬＣＲＰ−１８カラム（Merck,
Damstadt, Germany）で流速１ｍｌ／分で以下のグラディエントで溶出させた：
９４％溶媒Ｂ（１００％メタノール）／６％溶媒Ａ（３０％メタノール、１０％
０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．１）で７分、９９％溶媒Ｂ／１％溶媒Ａで
さらに１７分、続いて９４％溶媒Ｂ／６％溶媒Ａでさらに２６分。

【００７６】また別の方法では、採集した抽出物を均一型グラディエント（以下のようなグ
ラディエント：２％溶媒Ａ〔１０％メタノールおよび１０％酸性酸〕および９８
％メタノール（溶媒Ｂ）；流速１ｍｌ／分）でＨＰＬＣによって分析した。検出
には、シマズＲＦ５５１蛍光検出装置（２９５ｎｍ_ex、３２５ｎｍ_em）付きウォ
ータース（Waters) ＬＣ−モデュール装置を用いた。

【００７７】トコフェロールアッセイの結果は図４の棒線グラフで示す。形質転換体２８お
よび３０の葉６、９、１２（植物の上部から順に番号を付与）とコントロール植
物（ＳＮＮ）の対応する葉との比較によって、遺伝子導入系統は、野性型植物と
比較して６倍高いトコフェロール含有量を有することが示された。

【００７８】カナマイシン含有培地で増殖するその能力に関係なく、形質導入タバコ植物体
をサザンブロットハイブリダイゼーションによってもまた分析した。ＣＨＬＰの
標識ｃＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼーション後に、制限酵素で消化し
た形質転換体のゲノムを用いてさらに別の放射能標識バンドを検出することがで
きた。ノザンブロット分析では、コントロール植物のＣＨＬＰ−ＲＮＡ含有量と比較
して形質転換体で特異的ＲＮＡ量の増加が示された。

【００７９】さらに、ゲラニルゲラニルレダクターゼ発現の増加がウェスタンブロット分析
によって遺伝子導入植物で観察できた。形質転換体は、コントロール植物と比較
してＣＨＬＰ蛋白質量の増加を示した。さらにまた、プラスチド移入実験（文献（Grimm et al., Plant Mol. Biol. 1
3:583-593(1989))にしたがって実施）によって、配列番号：１の配列によってコ
ードされるＣＨＬＰ前蛋白質は、in vitro転写および翻訳後にプラスチドに移入
されることが確認できた。

【００８０】実施例４：ＣＨＬＰアンチセンス構築物の構築とタバコへの移入実施例２および３にしたがって生産し分析した遺伝子導入植物は、本発明のＤ
ＮＡ配列の過剰発現のためにトコフェロール含有量の増加を示すが、以下のアン
チセンス構築物は、ＣＨＬＰ活性が低下した遺伝子導入タバコ植物体を生産する
ために構築し、タバコに移入した。

【００８１】配列番号：１のｃＤＮＡ配列（pBluescript ベクターの多数のクローニング部
位に存在する）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａＩを用いてベクターから切り出
し、同じ制限酵素で消化した複式ベクターＢｉｎＡＲ−ＴＸ（実施例２参照）中
にアンチセンス方向でカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモータと融合
させた。得られたリコンビナントベクターｐＣＨＬＰＡＳｂｉｎを、実施例２で
述べたように、アグロバクテリウム・ツメファシエンス仲介リーフディスク形質
転換によってタバコに移入した。続いて、遺伝子導入植物を再生させた。約１０
０個のそれぞれ別個の遺伝子導入系統を再生させ、サザンブロット分析のような
標準的手法によって導入遺伝子コピーの挿入を証明した。

【００８２】形質転換体は、コントロール植物よりも増殖速度が遅く、ＣＨＬＰ特異的ＲＮ
Ａは減少し、ＣＨＬＰ蛋白質含有量は減少し、ゲラニルゲラニルクロロフィル量
は高く（野性型のフィチルクロロフィルの１００％と較べて全クロロフィル含有
量の５０％）、さらにクロロフィルおよびトコフェロール含有量は減少すること
を示した。

【００８３】実施例５：大腸菌での活性なゲラニルゲラニルレダクターゼの過剰発現大腸菌でリコンビナントＣＨＬＰを過剰発現させる発現クローンを作製するた
めに、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で１分、６
０℃で２分、７２℃で３分、２５サイクル）によって、配列番号：１のＤＮＡ配
列から仮定的成熟（加工）蛋白質のための開放読み枠を増幅させた：ＣＳＹＮ１ 5'-cgc cat ggg ccg caa tct tcg tgt tgc ggt-3' およびＣＳＹＮ２ 5'-gca gat ctg tcc att tcc ctt ctt agt gca-3'

【００８４】増幅ＰＣＲフラグメントを精製し、制限酵素ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化
し、同じ酵素で切断した発現ベクターｐＱＥ６０（Qiagen, Hilden, Germany)に
連結した。開始コドンＡＴＧ（制限酵素ＮｃｏＩのための認識部位の構成部分）
の後に、ＣＨＬＰｃＤＮＡ配列の開放読み枠のヌクレオチド１４８から始まるｃ
ｈｌＰ配列が続いた。結果として、ｃＤＮＡ配列から推定されるペプチド配列の
アミノ酸残基５０に対応するグリシンがメチオニンの後に続いた。

【００８５】植物ＣＨＬＰの発現のために、大腸菌株ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Stratagene, LaJoll
a, CA, USA）またはＳＧ１３００９（Gottesmann et al., J. Bacteriol. 148:2
56-273(1981)）をリコンビナントベクターで形質転換した。ＩＰＴＧの添加によ
りリコンビナント遺伝子の転写誘発後、約４７ｋＤａの分子量を有する蛋白質が
大腸菌株で発現した。この蛋白質は細菌抽出物の沈澱分画で検出でき、Ｎｉ−ア
フィニティーカラム（Qiagen, Hilden, Germany)を用いて製造元の指示にしたが
い変性条件下で全抽出物から精製した。この精製蛋白質を注射してウサギを免疫した。

【００８６】全抽出物から精製したこの蛋白質は、クロロフィリドおよびＧＧＰＰを用いて
細菌のバクテリオクロロフィルシンターゼによる結合酵素アッセイでゲラニルゲ
ラニルレダクターゼ活性を有することが確認された。酵素アッセイは、文献（Os
ter et al., J. Biol. Chem. 272:9671-9676(1997)）のプロトコルにしたがって
実施した。

【００８７】色素、クロロフィル−ＧＧおよびクロロフィル−フィトールを、ＲＰ１８グロ
ムセル（Gromsel)１２０ＯＤＳ５を充填したカラム（４×２５０ｎｍ）で以下か
ら成るグラディエントを用いて下記のように１．２ｍｌ／分の流速でＨＰＬＣに
よって分離した：６０％アセトン（溶媒Ａ）および１００％アセトン（溶媒Ｂ）
：ｔ₀７５％溶媒Ａおよび２５％溶媒Ｂ、２分；ｔ_2-4で４５％溶媒Ａおよび５５
％溶媒Ｂに；ｔ_4-13で３０％溶媒Ａおよび７０％溶媒Ｂに；ｔ_13-17で１００％溶媒Ｂに；ｔ_17-21で１００％溶媒Ｂ均一；続いて５分で７５％溶媒Ａおよび２５％溶媒Ｂに；続いてさらに５分、７５％溶媒Ａおよび２５％溶媒Ｂで均一。テ
トラピロールは、蛍光検出装置（λ_ex４２５ｎｍ、λ_em６６５ｎｍ）を用いて検
出した。

【００８８】実施例６：ＣＨＬＰ遺伝子およびＨＰＤ遺伝子のニコチアーナ・タバクムでの
同時発現以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ヌクレオチド３７と１４０４
との間のＨＰＤｃＤＮＡ（受付番号：ＡＦ０００２２８）の配列をアラビドプシ
ス・タリアーナ（Arabidopsis thaliana）ｃＤＮＡライブラリーから増幅し、ク
ローニングして配列決定した：ｈｐｄｏｌｉ１ 5'-tta ggt acc atg ggc cac caa acc gcc gcc gtt tca g-3' ｈｐｄｏｌｉ２ 5'-tga gtc gac cac aat cct tta gtt ggt tct tct tg-2' 増幅フラグメントを制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩおよびＳａｌＩで消化し、
ＫｐｎＩおよびＳａｌＩで消化した複式ベクターＢｉｎ−Ｈｙｇ−ＴＸに連結し
た。このベクターＢｉｎ−Ｈｙｇ−ＴＸはｐＢＩＢの誘導体（Becker, 上掲書）
で、実施例２で用いたベクターＢｉｎＡＲ−ＴＸのようにコード領域の発現を可
能にするものである。これを、カリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡプ
ロモータの制御下にある複数のクローニング部位に連結した。ＣＨＬＰ遺伝子の
発現に用いたベクターＢｉｎ−Ｈｙｇ−ＴＸ（これはカナマイシンに対して植物
細胞の選別を可能にする）とは異なり、複式ベクターＢｉｎ−Ｈｙｇ−ＴＸは、
植物細胞の選別マーカーとしてヒグロマイシン耐性遺伝子を含む。説明のために
、ベクターＢｉｎ−Ｈｙｇ−ＴＸの制限地図を図５に提供する。

【００８９】前述の複式ベクターＢｉｎ−Ｈｙｇ−ＴＸの代わりに、植物の形質転換に適し
たいずれのベクターも、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターまたは他のプロモータ（こ
れは植物細胞での転写と翻訳を提供する）およびＨＰＤをコードするＤＮＡ配列
の融合物を含むキメラ遺伝子の構築に用いることができる。上記の実施例２で述べたように、得られたリコンビナントベクターｐＢｉｎＨ
ｙｇＨＰＤのタバコＳＮＮへの移入をアグロバクテリウム・ツメファシエンスを
用いて続いて実施し、さらに遺伝子導入成長部分をヒグロマイシン含有培地で選
別した。再生後に得られた植物をコントロール植物として用いた。

【００９０】さらに、実施例２で述べた形質転換体２８および３０は、３５ＳＲＮＡプロモ
ータの制御下でＣＨＬＰ遺伝子を過剰発現する更なる形質転換体と同様に、この
リコンビナントベクターｐＢｉｎＨｙｇＨＰＤを用いてリーフディスクにより形
質転換し、カナマイシンおよびヒグロマイシンの両方を含む培地で選別して完全
な植物を再生した。キメラＨＰＤ遺伝子の移入と発現の成功は、プローブとしてＨＰＤをコードす
る上記のＰＣＲフラグメントを用いて適切なサザンおよびノザンブロットハイブ
リダイゼーション実験によって全ての遺伝子導入植物で確認された。

【００９１】ＣＨＬＰ遺伝子のみを発現している遺伝子導入植物（実施例３、形質転換体２
８および３０）およびＨＰＤ遺伝子とＣＨＬＰ遺伝子とを同時発現している植物
（形質転換体２８＋ＨＰＤおよび３０＋ＨＰＤ）の葉のトコフェロール含有量の
比較（実施例３で述べた分析）によって、トコフェロール含有量はヒドロキシフ
ェニルピルベートジオキシゲナーゼ遺伝子の同時発現によってさらに増加するこ
とが明らかになった。

【００９２】また別に、ＨＰＤ遺伝子と同様にＣＨＬＰ遺伝子を発現する遺伝子導入植物は
また、適切な遺伝子導入系統を交配、特にホモ接合体" ＣＨＬＰ系統"をホモ接合体" ＨＰＤ系統"と交配することによって得ることができる。トコフェロール含有量のさらなる増加が、ストレス条件下（例えば高温、光ス
トレスなど）で二重形質転換体（および二重交配体）で期待できる。

【００９３】上記の二重形質転換体（ＨＰＤとＣＨＬＰを発現する）とは別に、遺伝子導入
ＨＰＤ系統をトコフェロール含有量とそれら含有量に対するストレス状態の影響
について分析した。タバコの葉でのＨＰＤの過剰発現はトコフェロール含有量の
２から３倍の増加をもたらし、非遺伝子導入コントロール植物と較べてトコフェ
ロール含有量は特にストレス条件下で増加することが示された。

【００９４】図６は、１２週齢の遺伝子導入タバコ系統（＃２、６および３３）（アラビド
プシス酵素ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（ＨＰＤ）を発現）
の葉４、７および１０のトコフェロール含有量のコントロール植物（ＳＮＮ）と
の比較を示す。植物を３８℃または１０℃のいずれかの温度で、約２００μｍｏ
ｌフォトン／ｍ²／ｓの光度で栽培した。トコフェロールは、葉齢が進むにつれ植物中にだんだんと蓄積された。特に古い葉では、トコフェロール含有量は３８
℃で栽培された植物ではるかに増加し、コントロール植物と比較して２倍量に達
した。それに較べて、低温で保持された形質転換体のトコフェロール含有量は野
性型植物と比較してわずかに増加しただけであった。これらの結果は、トコフェロールを増加させたい場合、例えばストレス条件下
ではＨＰＤは特に遺伝子導入植物でこれら抗酸化剤の生成に有利に働くことを示
している。

【００９５】実施例７：酸化性ストレスに対する遺伝子導入植物の耐性増加実施例２および３にしたがって生産された遺伝子導入植物を、抑制性および酸
化性物質の影響についてリーフディスク保温実験で分析した。１５本の苗木を照
明下で１０時間２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．１）中で保温した。
植物を、コントロールサンプル（水）中、３．３μＭ（低濃度＝ＬＣ）または３
３μＭ（高濃度＝ＨＣ）のアシフルオルフェン(Acifluorfen, バズフ（BASF, Lu
dwigshafen, Germany)から入手できる、これはプロトポルフィリノゲンオキシダ
ーゼの抑制物質である）を含むサンプル中、および１．７μＭ（低濃度＝ＬＣ）
または１７μＭ（高濃度＝ＨＣ）のローズベンガル（アシッドレッド、４，５，
６，７−テトラクロロ−２'，４'，５'，７'−テトラヨードフルオレセイン、シ
グマ−アルドリッヒ（Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany)から入手できる、
これは反応性酸素を生成する）を含むサンプル中で保温した。トコフェロール含
有量は、野性型植物（ＳＮＮ）と比較して、コントロール緩衝液サンプル中では
酸化性ストレス条件下と同様に分析した遺伝子導入系統（２８、３０）で約２か
ら３倍高かった。結果は図７に示す。この結果は、野性型植物と比較してそのトコフェロール含有量の増加のために
、本発明の植物は酸化性ストレスに対する耐性が増加することを示している。し
たがって、反応性酸素に対する細胞膜の抗酸化的防御が増加することが本発明の
植物で期待できる。

【００９６】実施例８：遺伝子導入植物の種子のトコフェロール含有量ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御下にあるＣＨＬＰの発現により野性型植物と
比較して葉のトコフェロール含有量の増加を示す遺伝子導入植物の種子から、上
記の方法にしたがってトコフェロールを抽出した（実施例２参照）。コントロー
ルのタバコ植物体と比較したＨＰＬＣによるトコフェロール定量の結果は図８に
示す。 α−トコフェロールに加えγ−トコフェロールも定量した。後者は一般にタバ
コの種子に高濃度で存在する。γ−トコフェロール対α−トコフェロールの比は
タバコの種子で約１０：１である。両形態のトコフェロールの含有量、特にα−
トコフェロールは、コントロール植物と比較してゲラニルゲラニルレダクターゼ
発現が増加している遺伝子導入植物では２から３倍高い。

【００９７】種子中のトコフェロール含有量に対する３５Ｓプロモータ制御下の構造性ＣＨ
ＬＰ発現の影響を反映するこれらの結果は、種子特異的プロモータ（または種子
組織で特異的に誘発できるプロモータ）の使用によって、種子組織でのゲラニル
ゲラニルレダクターゼの発現および結果として遺伝子導入植物の種子中のトコフ
ェロール含有量をさらに増加させることができることを示している。

【００９８】いずれの場合にも分子生物学的手法の記載が不十分な場合は、例えばサンブル
ックらが記載したような標準的な方法を実施できるであろう：Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbo
r Press, Cold Spring Harbor, New York. 植物の形質転換に関しては、本明細
書に記載した報告および刊行物の他に一般に知られている概論を参照できる。

【００９９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】配列番号：１は、ニコチアナ・タバクム由来のゲラニルゲラニルレダクターゼ
（ＣＨＬＰ）のｃｈｌＰｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。

【図２】配列番号：２は、図１に示した配列番号：１から推定したＮ．タバクムの酵素
ＣＨＬＰのアミノ酸配列を示す。

【図３】植物形質転換実験に用いられた複式ベクターＢｉｎＡＲの制限地図である。Ｂ
ｉｎＡＰ（Hofgen & Willmitzer, Plant Science 66:221(1990))は、Ｂｉｎ１９
誘導体（Bevan, Nucl. Acids Res. 12:8711(1984))で、これは、キメラ遺伝子の
植物中での構造的発現のために発現カセットを含む。この発現カセットはＢｉｎ
１９のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によりクローニングされた。こ
のカセットは７７０塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含み、
このフラグメントは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、ｐＵＣ１８ポリリンカーの部
分およびオクトピンシンターゼ遺伝子（ＯＣＳ）の終止シグナルを含有する。コ
ード配列挿入のために、ｐＵＣ１８ポリリンカーの固有の制限部位（すなわちＫ
ｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＳａｌＩ）は特に有用である。
植物選別マーカーとして、この複式ベクターＢｉｎＡＲはカナマイシン耐性遺伝
子を含む。

【図４】棒線グラフは、コントロール植物（ＳＮＮ）の対応する葉に対して、遺伝子導
入タバコ植物体（系統２８および３０）の葉６、９、１２（数字は植物の先端か
ら順に付されている）のトコフェロール含有量を示す。

【図５】植物の形質転換に用いられた複式ベクターＢｉｎ−Ｈｙｇ−ＴＸの制限地図で
ある。これはまたｐＢＩＢ−誘導体（Becker, 上掲書;Bevan, 上掲書）で、植物
でのキメラ遺伝子の構造的発現のために発現カセットを含んでいる。コード配列
の挿入のために、ｐＵＣ１８ポリリンカーの固有の制限部位、すなわちＨｐａＩ
、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩおよびＳａｌＩは特に有用である。植物選別マ
ーカーとして、この複式ベクターＢｉｎＨｙｇ−ＴＸはヒグロマイシン耐性遺伝
子を含む。

【図６】１２週齢の遺伝子導入系統（＃２、６、３３、これらはアラビドプシスの酵素
ＨＰＤを発現する）の葉４、７および１０並びにコントロール植物（ＳＮＮ）の
トコフェロール含有量の棒線グラフである。

【図７】１２日齢の苗木のトコフェロール含有量である。これらは３．３μＭ（ＬＣ）
または３３μＭ（ＨＣ）のアシフルオルフェン、および１．７μＭ（ＬＣ）また
は１７μＭ（ＨＣ）のローズベンガルを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７．１；コントロール＝水）中で照明下で１０時間保温した（ＳＮＮ＝野性
型コントロール植物、２８および３９＝遺伝子導入系統）。

【図８】遺伝子導入タバコ植物体（＃７、３９、６７、９６）および野性型タバコ植物
体（ＳＮＮ）の種子のα−トコフェロールおよびγ−トコフェロールの相対値。
１００％α−トコフェロールは６ｎｇ／ｍｇ種子に一致し、１００％γ−トコフ
ェロールは６２．８ｎｇ／ｍｇ種子に一致する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/02 5/00 ＣＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD09 CD12 CD14 CD17 4B024 AA08 BA08 CA04 CA09 DA01 DA05 DA06 EA04 FA02 FA06 FA18 GA11 GA17 GA19 4B050 CC03 DD13 FF03E FF14E LL05 4B065 AA11X AA26X AA89X AA89Y AB01 BA02 CA28 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲラニルゲラニルレダクターゼの活性を有する蛋白質または
その活性なフラグメントをコードすることを特徴とする核酸配列。
【請求項２】植物蛋白質をコードすることを特徴とする、請求項１に記載
の核酸配列。
【請求項３】タバコ由来の蛋白質をコードすることを特徴とする、請求項
１または２に記載の核酸配列。
【請求項４】配列番号：１に記載の核酸配列。
【請求項５】クローンＤＳＭ１１８１６に含まれることを特徴とする、請
求項１に記載の核酸配列。
【請求項６】ゲラニルゲラニルレダクターゼの活性を有する蛋白質または
その活性なフラグメントをコードすることを特徴とする、先行する請求項のいず
れかに記載の核酸配列の対立遺伝子および誘導体。
【請求項７】先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列を含むことを特
徴とする核酸分子。
【請求項８】原核細胞または真核細胞での転写および翻訳を提供する調節
成分と一緒に請求項１から６のいずれかに記載の核酸配列を含むことを特徴とす
る、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】植物細胞での転写および翻訳を提供するプロモータと一緒に
請求項１から６のいずれかに記載の核酸配列を含むことを特徴とする、請求項７
または８に記載の核酸分子。
【請求項１０】前記プロモータが構造性、誘発性、組織特異的、または発
生特異的プロモータであることを特徴とする、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】前記プロモータが種子特異的プロモータであることを特徴
とする請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】さらにエンハンサー配列、シグナルペプチドをコードする
配列または他の調節配列を含むことを特徴とする、請求項７〜１１のいずれかに
記載の核酸分子。
【請求項１３】前記コード核酸配列がセンス方向で配置される、請求項７
〜１２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１４】前記コード核酸配列がアンチセンス方向で配置される、請
求項７〜１２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１５】先行する請求項のいずれかに記載のＤＮＡ配列または核酸
分子によってコードされることを特徴とする、ゲラニルゲラニルレダクターゼの
生物学的活性を有する蛋白質またはその活性なフラグメント。
【請求項１６】配列番号：２に示されたアミノ酸配列またはその領域を有
することを特徴とする、ゲラニルゲラニルレダクターゼの生物学的活性を有する
蛋白質またはその活性なフラグメント。
【請求項１７】請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸配列または核酸分
子を含むことを特徴とする微生物。
【請求項１８】請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸配列、それから推
定される核酸配列または核酸分子を含む遺伝子導入植物、さらに前記植物の部分
および前記植物の繁殖用材料（例えばプロトプラスト、植物細胞、カルス、種子
、塊茎、挿し木用切り枝など）、さらにこれら植物の子孫。
【請求項１９】野性型植物と比較してトコフェロール含有量の変化を示す
請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】野性型植物と比較してトコフェロール含有量の増加を示す
請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】野性型植物と比較してビタミンＫ₁含有量の変化を示す請求項１８に記載の植物。
【請求項２２】野性型植物と比較してビタミンＫ₁含有量の増加を示す請求項２１に記載の植物。
【請求項２３】野性型植物と比較してクロロフィル含有量の変化を示す請
求項１８に記載の植物。
【請求項２４】野性型植物と比較してクロロフィル含有量の増加を示す請
求項２３に記載の植物。
【請求項２５】請求項１８〜２４のいずれかに記載の双子葉植物。
【請求項２６】前記植物が有用な植物、食用および／または飼料用植物、
特にセイヨウアブラナ、ダイズ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、クローバーで
ある請求項２５に記載の植物。
【請求項２７】請求項１８〜２４のいずれかに記載の単子葉植物。
【請求項２８】前記植物が有用な植物、食用および／または飼料用植物、
特に穀類、例えばコムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、ライムギ、コメ
、スィートグラス、飼葉および牧草である請求項２７に記載の植物。
【請求項２９】請求項１〜６のいずれかに記載の核酸配列が前記植物ゲノ
ムに組み込まれている請求項１８〜２８のいずれかに記載の植物、さらに前記植
物の部分および前記植物の繁殖用材料（例えばプロトプラスト、植物細胞、カル
ス、種子、塊茎、または挿し木用切り枝など）、さらにこれら植物の子孫。
【請求項３０】請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸配列、それらから
推定される核酸配列または核酸分子を含む遺伝子導入植物細胞（プロトプラスト
を含む）。
【請求項３１】非形質転換植物細胞と比較してトコフェロール、ビタミン
Ｋ₁および／またはクロロフィル含有量の変化、好ましくは増加を示す請求項３０の植物細胞（プロトプラストを含む）。
【請求項３２】さらにヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼを
コードする核酸配列を含む、請求項１８〜３１のいずれかに記載の植物および植
物細胞。
【請求項３３】以下の工程ａ）〜ｃ）を含む、請求項１８〜３２のいずれ
かに記載の植物または植物細胞を製造する方法：ａ）以下の構成成分を含む核酸配列を作製し、５'−３'の方向性で融合させる
工程：植物内で機能するプロモータ、好ましくは種子特異的プロモータ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ活性を有する蛋白質またはその活性なフラグメ
ントをコードする少なくとも１つの核酸配列、および場合によって、転写の終了およびポリＡテールの対応する転写物への付加のた
めの終止シグナル、さらに場合によってそれらから推定されるＤＮＡ配列；ｂ）工程ａ）の核酸配列を植物細胞に移入し、場合によって前記植物ゲノムに
前記核酸配列を組込む工程；ｃ）所望の場合は、完全に形質転換した植物を再生し、さらに場合によって前
記植物を繁殖させる工程。
【請求項３４】食用植物または飼料用植物としての請求項１８〜２９およ
び３２のいずれかに記載の植物の使用。
【請求項３５】トコフェロールおよび／またはビタミンＫ₁の生産部位としての請求項１８〜２９および３２のいずれかに記載の植物の使用。
【請求項３６】ゲラニルゲラニルレダクターゼ活性を有する蛋白質または
その活性なフラグメントをコードする核酸配列または核酸分子の特定、単離また
は増幅のための請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸配列または核酸分子の使
用。
【請求項３７】免疫および抗体産生のための請求項１〜１６のいずれかに
記載の核酸分子または蛋白質の核酸配列の使用。
【請求項３８】遺伝子導入植物または植物細胞の生産のための請求項１〜
１４のいずれかに記載の核酸配列または核酸分子の使用。
【請求項３９】前記植物または植物細胞がトコフェロール含有量の変化を
示す請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】前記植物または植物細胞がクロロフィル含有量の変化を示
す請求項３８に記載の使用。
【請求項４１】前記植物または植物細胞がビタミンＫ₁含有量の変化を示す請求項３８に記載の使用。
【請求項４２】前記植物または植物細胞が、野性型植物と比較して除草剤
耐性の増加を示す請求項３８に記載の使用。
【請求項４３】前記植物または植物細胞がさらにヒドロキシフェニルピル
ベートジオキシゲナーゼをコードする核酸配列を含む、請求項３８〜４２のいず
れかに記載の使用。
【請求項４４】植物のゲラニルゲラニルレダクターゼの抑制物質またはエ
フェクターの特定のための、請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸配列、核酸
分子、蛋白質または微生物の使用。