DE19849960A1 - Beeinflussung des Tocopherolgehaltes in transgenen Pflanzen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nukleinsäuresequenzen, die für eine Geranylgeranyl-Reduktase kodieren, eine Methode zur Erzeugung neuer Pflanzen, die eine neue Nukleinsäuresequenz enthalten und deren Gehalt an Tocopherol und/oder Chlorophyll im Vergleich zu Wildtyppflanzen verändert ist, diese neuen Pflanzen, deren Teile und Produkte und Pflanzenzellen sowie die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen zur Beeinflussung des Tocopherol-, Chlorophyll- und/oder Vitamin K₁-Gehaltes in transgenen Pflanzen, deren Teilen und Produkten und Pflanzenzellen.

Das Diterpen Geranylgeranyl-pyrophosphat (GGPP) entsteht als 20-C-Zwischenprodukt im pflanzlichen Isoprenoidstoffwechsel. Es resultiert aus der Addition einer Einheit Isopentenyl-pyrophosphat (IPP) an Farnesyl-pyrophosphat, ein 15-C-Sesquiterpen. GGPP fließt in diverse Synthesewege des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels. So können beispielsweise zwei Moleküle GGPP "Schwanz an Schwanz" zu 40-C-Körpern zusammengefügt werden, die Tetraterpene, die allgemein als Carotinoide bezeichnet werden und zu denen beispielsweise das β-Carotin gehört. Durch die Addition weiterer Moleküle IPP fließt GGPP des weiteren in die Biosynthese von Polyterpenen, wie Kautschuk und Guttapercha, ein.

GGPP kann darüber hinaus in weitere Diterpene, wie z. B. Phytyl-pyrophosphat (PPP), überführt werden. Der 20-C-Körper Phytol ist ein obligatorisches Intermediat in der Biosynthese der Tocopherole (Soll and Schulz (1981) Biochem. Biophys. Res. Commun. 99, 907-912) sowie der Synthese der Chlorophylle (Beale and Weinstein (1990) In: Biosynthesis of Heme and Chlorophyll (Dailey H.A., ed.) McGraw Hill, NY, 287-391). Während die Grundstruktur aller Chlorophylle (Chlorophyll a, b, c, usw.) ein aus 4 Pyrrolringen aufgebautes Porphyrinsystem ist, an welches das Phytol esterartig über den Pyrrolring IV gebunden ist, zeichnen sich die Tocopherole durch eine aus Homogentisat und einem Phytol-Schwanz bestehende Struktur aus.

Die Gruppe der Tocopherole, die allgemein als Vitamin E bezeichnet werden, umfaßt eine Reihe strukturell nahe verwandter fettlöslicher Vitamine, namlich α-, β-, γ-, δ- und ε- Tocopherol, wovon α-Tocopherol biologisch am wichtigsten ist. Die Tocopherole kommen in vielen Pflanzenölen vor, besonders reich an Tocopherolen sind die Samenöle von Soja, Weizen, Mais, Reis, Baumwolle, Luzerne und Nüssen. Auch Früchte und Gemüse, z. B. Himbeeren, Bohnen, Erbsen, Fenchel, Paprika, etc. enthalten Tocopherole. Soweit bisher bekannt werden Tocopherole ausschließlich in Pflanzen bzw. photosynthetisch aktiven Organismen synthetisiert.

Tocopherole tragen aufgrund ihres Redoxpotentials dazu bei, die Oxidation ungesättigter Fettsäuren durch Luftsauerstoff zu vermeiden; im Menschen ist α-Tocopherol das wichtigste fettlösliche Antioxidans. Es wird angenommen, daß die Tocopherole durch diese Funktion als Antioxidantien zur Stabilisierung biologischer Membranen beitragen, da durch den Schutz der ungesättigten Fettsäuren der Membranlipide die Membran-Fluidität aufrechterhalten wird. Jüngeren Erkenntnissen zufolge kann darüber hinaus mit der regelmäßigen Zufuhr relativ hoher Tocopherol-Dosen der Ausbildung der Arteriosklerose entgegengewirkt werden. Als weitere günstige physiologische Eigenschaft der Tocopherole wurde die Verzögerung Diabetes bedingter Spätschäden, die Verminderung des Risikos der Kataraktbildung, Verhinderung des oxidativen Stresses bei Rauchern, anticarcinogene Effekte, protektive Wirkung gegen Hautschäden wie Erythreme und Hautalterung, etc. beschrieben.

Wegen ihrer oxidationshemmenden Eigenschaften werden die Tocopherole nicht nur lebensmitteltechnologisch genutzt, sondern auch in auf natürlichen Ölen basierenden Anstrichfarben, in Desodorantien und anderen Kosmetika, beispielsweise Sonnenschutzmittel, Hautpflegemitteln, Lippenstiften etc. eingesetzt. Dabei sind Tocopherolverbindungen wie Tocopherylacetat und -succinat die üblichen Applikationsformen für die Anwendung als Vitamin E, in durchblutungsfördernden und Lipid-senkenden Mitteln und veterinärmedizinisch als Futtermittelzusatz.

In der Biosythese der Tocopherole, insbesondere des α-Tocopherols, scheint Phytylpyrophosphat ein limitierender Faktor zu sein. Bisherige Untersuchungen deuten darauf hin, daß PPP durch sequentielle Hydrogenierung der Isoprenoidgruppe aus GGPP hervorgeht, wobei als Intermediate Dihydro-GGPP und Tetrahydro-GGPP entstehen (GGPP → Dihydro-GGPP → Tetrahydro-GGPP → PPP; vgl. bspw. Bollivar et al. (1994) Biochemistry 33, 12763-12768).

Die schrittweise Hydrogenierung von GGPP zu PPP wird, so wird gegenwärtig angenommen, durch das Enzym Geranylgeranyl-Reduktase (GGPP-Reduktase, auch als Geranylgeranyl-pyrophosphat-Hydrogenase bzw. GGPP-Hydrogenase bezeichnet) katalysiert, das in Pflanzen im Gen Chl P kodiert wird. Das Enzym Geranylgeranyl- Reduktase gehört zum Isoprenoidstoffwechsel und fungiert für zwei Stoffwechselwege: die Tocopherolsynthese und die Chlorophyllsynthese.

Die essentielle Bedeutung dieses Enzyms ist erstmals für die Chlorophyllbiosynthese gezeigt worden (Benz et al. (1980) Plant Sci. Lett. 19, 225-230; Soll and Schultz (1981) Biochem. Biophys. Res. Commun. 99, 907-912; Schoch et al. (1977) Z. Pflanzenphysiol. 83, 427-436). Der letzte Schritt der Chlorophyllbiosynthese ist die Veresterung von Chlorophyllid, die sowohl mit Phytyl-pyrophosphat als auch mit Geranylgeranyl­ pyrophosphat erfolgen kann. Systematische Untersuchungen von Rhodobacter capsulatus- Mutanten haben zeigen können, daß zuerst Bacteriochlorophyllid mit GGPP verestert und nachfolgend esterifiziertes Chlorophyll-GG hydrogeniert wird (Katz et al. (1972) J. Am. Chem. Soc. 94, 7938-7939). In höheren Pflanzen wird größtenteils Phytyl-Chlorophyll (Chlorophyll-P) nachgewiesen (Rüdiger and Schoch (1991) in Chlorophylls (Scheer, H., Ed.) pp. 451-464, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA). Es ist bisher nicht geklärt, mit welchen Substraten die Reduktase-Reaktion in Pflanzen erfolgt. Gegenwärtig wird angenommen, daß die pflanzliche Geranylgeranyl-Reduktase in der Lage ist, sowohl Chlorophyll-GG in Chlorophyll-P umzuwandeln (Schoch et al. (1978) Z. Pflanzenphysiol. 83, 427-436) als auch GGPP zu PPP zu hydrogenieren, das dann anschließend mit Chlorophyllid verbunden wird (Soll et al. (1983) Plant Physiol. 71, 849-854).

GGPP dient als Substrat für die Synthesewege des Tocopherols und des Phyllochinons in Chloroplastenhüllmembranen und für die Chlorophyllsynthese in den Thylakoidmembranen. Die Reduktion von GGPP zu PPP wurde erstmals 1983 von Soll et al. beschrieben (1983, Plant. Physiol. 71, 849-854). Bisher ist allerdings die Isolierung und Charakterisierung von Nukleinsäuresequenzen, die für das pflanzliche Enzym kodieren und für die Beeinflussung des Tocopherolgehaltes in transgenen Pflanzen eingesetzt werden können, nicht gelungen.

Die essentielle Rolle der Geranylgeranyl-Reduktase im Tocopherol- und Chlorophyllstoffwechsel macht dieses Enzym zu einem besonders wertvollen Instrument für die molekulare Biotechnologie. Mit Hilfe molekularbiologischer Techniken wie der Übertragung von DNA-Sequenzen, die für Geranylgeranyl-Reduktase kodieren, könnten in Pflanzen Änderungen in der Tocopherol- und/oder Chlorophyllbiosyntheseleistung erzielt werden. Auf diese Weise wäre z. B. die Erzeugung von transgenen Pflanzen mit erhöhtem oder verringertem Tocopherolgehalt möglich. Solche transgenen Pflanzen bzw. deren Teile, Zellen und/oder Produkte könnten anschließend als Nahrungs- und Futtermittel bzw. allgemein als Produktionsstätte für Tocopherol, das in der chemischen, pharmazeutischen und kosmetischen Industrie Anwendung findet, eingesetzt werden.

Darüber hinaus ist davon auszugehen, daß Pflanzen, die einen gegenüber Wildtyppflanzen erhöhten Gehalt an antioxidativ wirksamen Tocopherolen aufweisen, auch eine erhöhte Resistenz gegenüber Streßbedingungen, insbesondere gegenüber oxidativem Streß, aufweisen.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, neue Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, mit deren Hilfe in Pflanzen, Pflanzenzellen, -teilen und/oder -produkten der Gehalt an Tocopherol beeinflußt werden kann.

Des weiteren ist es eine wichtige Aufgabe der Erfindung, transgene Pflanzen, -zellen, -produkte und -teile mit gegenüber Wildtyppflanzen verändertem Tocopherolgehalt bereitzustellen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Möglichkeiten der Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, deren Genprodukte sowie der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen für die pflanzenzüchterische Praxis aufzuzeigen.

Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung. Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche, insbesondere basierend auf der Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, deren Genprodukte unmittelbar an der Tocopherolbiosynthese beteiligt sind, und der in einem veränderten Tocopherolgehalt resultierenden Übertragung dieser DNA-Sequenzen auf Pflanzen, gelöst.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der biologischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase (auch Geranylgeranyl-pyrophosphat- Hydrogenase genannt) oder ein biologisch aktives Fragment davon kodieren. Biologisch aktives Fragment bedeutet im Zusammenhang mit dieser Erfindung, daß die vermittelte biologische Aktivität zu einer Beeinflussung des Tocopherolgehalts ausreicht. Insbesondere betrifft die Erfindung pflanzliche DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der biologischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase oder ein biologisch aktives Fragment davon kodieren, besonders bevorzugt betrifft die Erfindung die in SEQ : ID NO. 1 angegebene DNA-Sequenz (s. auch Abb. 1).

Des weiteren betrifft die Erfindung Allele und Derivate der erfindungsgemaßen DNA- Sequenzen, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Geranylgeranyl- Reduktase kodieren, insbesondere Nukleinsäuremoleküle, deren Sequenzen sich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen unterscheiden und die für ein Protein oder ein Fragment davon kodieren, das die biologische Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase aufweist.

Des weiteren betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten oder durch natürlich vorkommende oder durch gentechnische oder chemische Prozesse und Syntheseverfahren aus diesen entstanden sind bzw. von diesen abgeleitet wurden. Hierbei kann es sich beispielsweise um DNA- oder RNA- Moleküle, cDNA, genomische DNA, mRNA etc. handeln.

Die Erfindung betrifft auch solche Nukleinsäuremoleküle, in denen die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen mit regulatorischen Elementen verknüpft sind, die die Transkription und, falls erwünscht, Translation in der Pflanzenzelle gewährleisten.

So können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispielsweise unter Kontrolle konstitutiver, aber auch induzierbarer oder gewebe- bzw. enwicklungsspezifischer Regulationselemente, insbesondere Promotoren, in Pflanzenzellen exprimiert werden. Während beispielsweise die Verwendung eines induzierbaren Promotors die gezielt ausgelöste Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen ermöglicht, bietet z. B. der Einsatz von gewebespezifischen, beispielsweise samenspezi­ fischen, Promotoren die Möglichkeit, den Tocopherolgehalt in bestimmten Gewebe, beispielsweise in Samengewebe zu verändern. So liegen die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen in einer bevorzugten Ausführungsform in Kombination mit gewebespezifischen Promotoren, insbesondere samenspezifischen Promotoren, vor.

Die Erfindung betrifft weiterhin Proteine mit der biologischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase oder aktive Fragmente davon, die durch eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kodiert werden. Vorzugs­ weise handelt es sich um eine pflanzliche Geranylgeranyl-Reduktase, bevorzugt aus Nicotiana tahacum, besonders bevorzugt um ein Protein mit der in SEQ : ID No. 2 (s. auch Abb. 2) gezeigten Aminosäuresequenz oder ein aktives Fragement davon.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Vektoren und Mikroorganismen zu liefern, deren Verwendung die Herstellung neuer Pflanzen, in denen ein veränderter Tocopherolgehalt erzielt werden kann, ermöglicht. Diese Aufgabe wird durch die Bereit­ stellung der erfindungsgemäßen Vektoren und Mikroorganismen gelöst, die für Enzyme mit der Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase kodierende Nukleinsäuresequenzen enthalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten und gegebenenfalls für den Transfer der erfindungsgemaßen Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzt werden können.

Ebenso betrifft die Erfindung transformierte Mikroorganismen, wie Bakterien, Viren, Pilze, Hefen etc., die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nukleinsäuremoleküle verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Transkription und ggf. Translation in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen gewährleisten.

Gegebenenfalls können die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung durch Enliancer- Sequenzen oder andere regulatorische Sequenzen ergänzt sein. Diese regulatorischen Sequenzen beinhalten z. B. auch Signalsequenzen, die für den Transport des Genprodukts zu einem bestimmten Kompartiment sorgen.

Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung neue Pflanzen, Pflanzenzellen, -teile oder -produkte bereitzustellen, die sich durch einen veränderten Tocopherolgehalt auszeichnen, der ggf. mit einer gegenüber Wildtyppflanzen veränderten Chlorophyllbiosyntheseleistung gekoppelt sein kann.

Diese Aufgaben werden durch die Übertragung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle und ihre Expression in Pflanzen gelöst. Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie im Vergleich zu Wildtypzellen eine neue oder veränderte Geranylgeranyl-Reduktase-Aktivität aufweisen und es als Folge dazu zu einer veränderten Tocopherolbiosyntheseleistung und zu einem veränderten Tocopherolgehalt kommt.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Pflanzen bzw. deren Zellen und Teile, in denen der Tocopherolgehalt aufgrund der Gegenwart und Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle gegenüber Wildtyppflanzen erhöht ist.

Die Erfindung betrifft aber auch solche Pflanzen, in denen die Übertragung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zu einer Verringerung des Tocopherol- und/oder Chlorophyllgehalts führt. Eine reduzierte Tocopherol- und/oder Chlorophyllbiosynthese­ leistung kann beispielsweise durch den Transfer von antisense-Konstrukten oder andere Suppressionsmechanismen, wie beispielsweise Cosuppression, erreicht werden.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin transgene Pflanzenzellen bzw. solche Pflanzenzellen umfassende Pflanzen und deren Teile und Produkte, in denen die neuen Nukleinsäuremoleküle integriert in das pflanzliche Genom vorliegen. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Pflanzen, in deren Zellen die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz in selbstreplizierender Form vorliegt, d. h. die Pflanzenzelle enthält die fremde DNA auf einem eigenständigen Nukleinsäuremolekül.

Bei den Pflanzen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen transformiert sind und in denen aufgrund der Einführung eines solchen Moleküls eine veränderte Menge an Tocopherol und/oder Chlorophyll synthetisiert wird, kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutzpflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Secale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) gehören. Bei den dicotylen Nutzpflanzen sind u. a. zu nennen Leguminosen, wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen, Bäume. Weitere Nutzpflanzen können beispielsweise Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal, Baumwolle, Lein, Sonnenblume sowie Heilpflanzen und Weidegräser und Futterpflanzen sein. Besonders bevorzugt sind die Getreide, Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Futtergetreide, Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel, Süßgräser, Futtergräser, und Klee. Es ergibt sich von selbst, daß die Erfindung insbesondere übliche Nahrungs- bzw. Futterpflanzen betrifft. Hier sind neben den bereits erwähnten Pflanzen zusätzlich Erdnuß, Linse, Ackerbohne, Runkelrübe, Buchweizen, Möhre, Sonnenblume, Topinambur, Rübsen, Weißer Senf, Kohlrübe und Stoppelrübe zu nennen.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke etc., wobei dieses Vermehrungsmaterial gegebenenfalls oben beschriebene transgene Pflanzenzellen enthält, sowie Teile dieser Pflanzen wie Protoplasten, Pflanzenzellen und Kalli.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzenzellen, die aufgrund der Gegenwart und ggf. Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle einen im Vergleich zu Pflanzenzellen, die die Nukleinsäuremoleküle nicht enthalten, veränderten Gehalt an Vitamin K₁ aufweisen. Das fettlösliche Vitamin K₁, das insbesondere in Pflanzen enthalten ist, hat eine wichtige Funktion bei der Bildung von Gerinnungsfaktoren, Mangel an Vitamin K₁ führt zu einer Verringerung der Blutgerinnung, weshalb es auch als antihämorhagisches oder Koagulationsvitamin bezeichnet wird. Da die Expression der erfindungsgemaßen Nukleinsäuremoleküle in einer veränderten Geranylgeranyl-Reduktase- Aktivität und demzufolge veränderten PPP-Sytheseleistung resultiert und das als Vitamin K₁ bezeichnete Phyllochinon, wie die Tocopherole, eine Einheit Phytol umfaßt, sind auch solche Pflanzenzellen bzw. Pflanzen Gegenstand der Erfindung, die einen veränderte Vitamin K₁-Gehalt alleine oder in Kombination mit einem veränderten Tocopherolgehalt aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um transgene Pflanzenzellen bzw. Pflanzen und deren Teile und Produkte, die aufgrund der Gegenwart und ggf. Expression einer für eine Geranylgeranyl-Reduktase aus Pflanzen kodierenden DNA-Sequenz einen gegenüber nicht-transformierten Zellen veränderten Tocopherolgehalt aufweisen. Bevorzugt handelt es sich bei der in den Pflanzenzellen enthaltenen DNA-Sequenz um eine für Geranylgeranyl-Reduktase kodierende Sequenz, die aus Tabak stammt. Besonders bevorzugt handelt es sich um die in SEQ : ID NO. 1 dargestellte DNA-Sequenz (siehe auch Abb. 1). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodieren die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen für ein Geranylgeranyl-Reduktase-Vorstufenenzym, das eine Transit­ sequenz für die Translokation in Plastiden umfaßt.

Die Erfindung betrifft des weiteren Pflanzen, in denen neben dem chl P-Gen zusätzlich ein Gen für Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPD) exprimiert wird. Das Enzym HPD katalysiert die Umsetzung von 4-Hydroxyphenylpyruvat in Homogentisat, das wie oben erwähnt neben dem Phytol den zweiten Baustein der Tocopherole darstellt. Das Enzym HPD sowie seine Stellung im pflanzlichen Isoprenoid-Stoffwechsel sind inter alia in Norris et al. (1995) The Plant Cell 7, 2139-2149, beschrieben.

Durch die gemeinsame Expression, vorzugsweise Überexpression, von Sequenzen, die für Geranylgeranyl-Reduktase und HPD kodieren, kann der Tocopherolgehalt in transgenen Pflanzen gegenüber solchen Pflanzen, die nur die erfindungsgemäßen, für CHL P kodierenden Sequenzen enthalten, zusätzlich gesteigert werden.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nukleinsäuremolekül oder einem Vektor transformiert bzw. infiziert wurden, und Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien, Algen, Hefe- und Pilzzellen sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein. Gegenstand der Erfindung sind auch solche Wirtszellen, die neben den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen ein oder mehrere auf gentechnologischem oder natürlichem Weg übertragene Nukleinsäuremoleküle enthalten, die die genetische Information für an der Tocopherol-, Chlorophyll- und/oder Vitamin K₁-Biosynthese beteiligte Enzyme tragen.

Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen und Pflanzen, die sich durch einen veränderten Tocopherolgehalt auszeichnen, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe die Erzeugung neuer Pflanzenzellen und Pflanzen, die aufgrund der Übertragung von für Geranylgeranyl- Reduktase kodierenden Nukleinsäuremolekülen einen veränderten Tocopherolgehalt aufweisen, möglich ist.

Des weiteren wird diese Aufgabe durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe die Erzeugung neuer Pflanzenzellen und Pflanzen möglich ist, die aufgrund der gemeinsamen Übertragung von für Geranylgeranyl-Reduktase kodierenden Nukleinsäurenmolekülen und für HPD kodierenden Nukleinsäuremolekülen oder der Übertragung von für Geranylgeranyl- Reduktase und für HPD kodierenden Nukleinsäuremolekülen einen gegenüber Wildtyppflanzen veränderten Tocopherolgehalt aufweisen.

Zur Erzeugung solcher neuer Pflanzenzellen und Pflanzen bieten sich verschiedene Methoden an. Zum einen können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer Transformationsmethoden derart verändert werden, daß die neuen Nukleinsäuremoleküle in das pflanzliche Genom integriert werden, d. h. daß stabile Trans­ formanten erzeugt werden. Zum anderen kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, dessen Anwesenheit und ggf. Expression in der Pflanzenzelle eine veränderte Tocopherolbiosyntheseleistung bewirkt, in der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbst­ replizierendes System enthalten sein. So können die erfindungsgemaßen Nukleinsäure­ moleküle z. B. in einem Virus enthalten sein, mit dem die Pflanze bzw. Pflanzenzelle in Kontakt kommt.

Erfindungsgemäß werden Pflanzenzellen, die aufgrund der Expression einer erfindungs­ gemäßen Nukleinsäuresequenz einen veränderten Tocopherolgehalt aufweisen, durch ein Verfahren hergestellt, das folgende Schritte umfaßt:

• a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
  • - einen Promotor, der die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleistet;
  • - mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein oder ein Fragment mit der enzymatischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz in Sense-Orientierung an das 3'-Ende des Promotors gekoppelt ist; und
  • - gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript, das an das 3'-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist.
• b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette.
• c) Regeneration transgener Pflanzen und gegebenenfalls die Vermehrung der Pflanzen.

Alternativ kann eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen als selbstreplizierendes System in die Pflanzenzelle bzw. Pflanze eingebracht werden.

Als weitere Alternative kann Schritt a) des obigen Verfahrens dahingehend abgewandelt werden, daß die mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein oder ein Fragment mit der enzymatischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase kodiert, in Antisense-Orientierung an das 3'-Ende des Promotors gekoppelt ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verwendungen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzer sowie der sie enthaltenen Nukleinsäuremoleküle aufzuzeigen.

Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäßen Verwendungen der neuen DNA- Moleküle zur Erzeugung von Pflanzenzellen und Pflanzen, die sich durch einen im Vergleich zu Wildtypzellen bzw. -pflanzen veränderten, vorzugsweise erhöhten, Tocopherolgehalt auszeichnen, gelöst.

Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zur Erzeugung von Pflanzen, die einen veränderten Chlorophyllgehalt aufweisen.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zur Erzeugung von Pflanzen, die sich durch einen veränderten, vorzugsweise erhöhten, Gehalt an Vitamin K₁ auszeichnen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Möglichkeiten der Verwendung der erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. deren Zellen, Teile und Produkte aufzuzeichnen.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen Pflanzen als Futter- und/oder Nahrungspflanze. In Abhängigkeit von der erzielten Erhöhung des Gehalts an Vitamin E und/oder Vitamin K₁ in der transgenen Nutzpflanze bzw. deren Produkte und Teile kann eine sonst allgemein übliche und oft auch erforderliche Zumischung der entsprechenden Vitamine, insbesondere von Vitamin E, mengenmäßig beschränkt bzw. vollkommen überflüssig werden. Unabhängig davon betrifft die Erfindung allgemein die Erhöhung des Nährwerts von Nutzpflanzen durch eine Steigerung des Gehalts an Tocopherolen und/oder Phyllochinon.

Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemaßen Pflanzenzellen, Pflanzen, deren Teile und Produkte, als Produktionsstätten für Vitamin E und/oder Vitamin K₁. Neben ihrer Anwendung aufgrund ihres Vitamin-Charakters, beispielsweise in diätetischen und pharmazeutischen Produkten, Kosmetika, Hautpflegeprodukten, allgemein zur Vitamin E-Supplementierung, etc., finden Tocopherole auch als Antioxidantien in chemischen Produkten wie beispielsweise Fetten und Ölen Anwendung. Die erfindungsgemäßen Pflanzen stellen somit eine wichtige Quelle für die Gewinnung von Tocopherolen und/oder Vitamin K₁ für ein breites Spektrum gewerblicher Zwecke dar.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Kombination mit samenspezifischen Promotoren zur Erzeugung von Pflanzen, bei denen sich vor allem das Samengewebe durch einen veränderten, vorzugsweise erhöhten, Tocopherolgehalt auszeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Kombination mit dem USP- (Bäumlein et al. (1991) Mol. Gen. Gene. 225, 459-467) oder Hordein-Promotor (Brandt et al. (1985) Carlsberg Res. Commun. 50, 333-345).

Diese genannten Promotoren, insbesondere die samenspezifischen Promotoren, eignen sich auch besonders für die gezielte Reduktion des Tocopherol- bzw. Chlorophyllgehalts in transgenen Samen unter Einsatz der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen im Zusammenhang mit der Antisense-Technik.

Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung eines Geranylgeranyl-Reduktase-Gens zur Erzeugung eines veränderten Tocopherolgehalts in Pflanzen.

Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase, um in Pflanzen einen veränderten Tocopherolgehalt zu erzielen.

Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, der erfindungsgemäßen Proteine mit Geranylgeranyl-Reduktase- Aktivität und/oder der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw. Wirtszellen mit neuer bzw. veränderter Geranylgeranyl-Reduktase-Aktivität zur Identifizierung neuer herbizider Wirkstoffe für den Pflanzenschutz. Dank der Schlüsselstellung der Geranylgeranyl- Reduktase innerhalb der Chlorophyll- und Tocopherolbiosynthese stellen die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und die durch sie kodierten Proteine ein äußerst wertvolles Target für die Herbizidforschung dar. So können beispielsweise die erfindungs­ gemäßen Proteine mit enzymatischer Geranylgeranyl-Reduktase-Aktivität für die Röntgenstrukturanalyse, NMR-Spektroskopie, molecular modeling, und drug design eingesetzt werden, um auf der Basis der aus diesen Verfahren gewonnenen Erkenntnisse Inhibitoren und/oder Effektoren der Geranylgeranyl-Reduktase und somit potentielle Herbizide zu identifizieren oder synthetisieren.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zur Herstellung herbizidtoleranter Pflanzen. So können für Geranylgeranyl-Reduktase kodierende Sequenzen mittels Standard-Methoden verändert oder um neue Sequenzelemente erweitert werden und anschließend auf Pflanzenzellen übertragen werden. Die Einbringung von aus den erfindungsgemäßen Sequenzen abgeleiteten Sequenzen kann z. B. dazu genutzt werden, die Eigenschaften der Pflanzen dahingehend zu verändern, daß in der transgenen Pflanze mehr oder weniger funktionell aktive Geranylgeranyl-Reduktase oder eine Variante der Geranylgeranyl-Reduktase mit veränderten Eigenschaften gebildet wird oder daß das Expressionsniveau des in der trans­ genen Pflanze vorhandenen chl P-Gens vermindert wird. So kann mittels einer Erhöhung der CHL P-Aktivität eine Erhöhung der Toleranz gegenüber Herbiziden, welche die Chlorophyllbiosynthese inhibieren, erreicht werden. Ebenso kann z. B. die Expression veränderter Geranylgeranyl-Reduktase-Gene in transgenen Pflanzenzellen mit einer Erhöhung der Herbizidtoleranz verbunden sein.

Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemaßen Nukleinsäuresequenzer oder eines durch sie kodierten Proteins zur Herstellung von Antikörpern.

Die vorliegende Erfindung umfaßt somit jede mögliche Form des Einsatzes der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, deren Gegenwart und ggf. Expression in Pflanzen eine Veränderung des Tocopherolgehalts und/oder Chlorophyllgehalts bewirkt, sowie des Einsatzes der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon, deren enzymatische Aktivität eine solche Veränderung herbeiführt.

Für den genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in den für die Transformation gewählten Pflanzen funktionale Promotor in Betracht, der die Bedingung erfüllt, daß die von ihm regulierte Expression zu einer veränderten Tocopherolsyntheseleistung führt. Im Hinblick auf die Verwendung der transgenen Pflanzen als Nahrungs- bzw. Futterpflanzen erscheinen hierfür besonders solche Promotoren sinnvoll, die eine samenspezifische Expres­ sion gewährleisten. Beispiele für solche Promotoren sind der USP-Promotor, Hordein- Promotor und Napin-Promotor.

Falls solche Promotoren nicht bekannt sind oder nicht zur Verfügung stehen, ist auf jeden Fall das Konzept zur Isolierung solcher Promotoren dem Fachmann bekannt. Dabei wird in einem ersten Schritt ans Samengewebe die poly(A)⁺ RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)⁺ RNA-Molekülen aus einem nicht aus Samen stammenden Gewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)⁺ RNA-Moleküle lediglich im Samengewebe exprimiert werden. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNA's Promotoren isoliert, die sodann für die Expression der hier beschriebenen kodierenden Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können. Analog können andere gewebespezifische oder entwicklungsspezifische oder durch abiotische Stimuli induzierbare Promotoren isoliert und erfindungsgemäß eingesetzt werden.

Alternativ kann erstrebenswert sein, daß die Pflanze in vielen Bereichen aufgrund der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle einen veränderten, vorzugsweise erhöhten Tocopherolgehalt aufweist. In diesem Fall bietet sich die Verwendung eines konstitutiven Promotors, beispielsweise des 35S RNA Promotors aus Cauliflower Mosaic Virus, an.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine mit der biologischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase kodieren oder biologisch aktive Fragmente davon und die mit einem der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle hybridi­ sieren. Der Begriff biologisch aktive Fragmente bezieht sich auf Fragmente, die eine Veränderung des Tocopherolgehalts bewirken können. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben sind.

Nukleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemaßen Molekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nukleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., supra). Zur Identifizierung und Isolierung derartiger Nukleinsäuremoleküle können auch von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen abgeleitete Sequenzfolgen, beispielsweise degenerierte Oligonukleotidprimer, verwendet werden.

Somit betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz oder Teile davon zur Identifizierung und Isolierung homologer Sequenzen aus Pflanzen oder anderen Organismen.

Als Hybridisierungssonde können z. B. Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt oder im wesentlichen die oben aufgeführten Nukleotidsequenzen oder Teile dieser Sequenzen aufweisen. Bei den als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten Proteine erforderlich. Hierzu stehen dem Fachmann eine Reihe von molekularbiologischen, biochemischen und biotechnologischen Standardverfahren zur Verfügung.

Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA- Moleküle, die für eine Geranylgeranyl-Reduktase kodieren oder ein biologisch, d. h. enzymatisch aktives Fragment davon. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nukleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um ein Polypeptid oder Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase oder einer vergleichbaren enzymatischen Aktivität, die einen veränderten Tocopherolgehalt bedingt, zu kodieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere ein Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküler können dabei durch Deletion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.

Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nukleinsäuremolekülen oder den durch sie kodierten Proteinen besteht. Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispiels­ weise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Modifika­ tionen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten handeln.

Üblicherweise weisen die von den verschiedenen Varianten und Derivaten der erfindungsgemaßen Nukleinsäuremoleküle kodierten Proteine bestimmte gemeinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören. Weitere gemeinsame Charakteristika können physikalische Eigenschaften wie z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, pH-Optimum, Temperatur-Optimum etc. darstellen. Des weiteren können natürlich die Produkte der von den Proteinen katalysierten Reaktionen gemeinsame oder ähnliche Merkmale aufweisen.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch­ molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation können die Plasmid- DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl bekannter Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Mikroinjektion und Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist in der Regel die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.

Je nach Einführungsmethode kann neben dem gewünschten Gen bzw. Gene die Anwesenheit weiterer DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri- Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Molecular and General Genetics 163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 515; Hoekema in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrokkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985) Chapter V; Fraley et al. (1993) Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4, 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blätter, Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzen­ zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten können, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplasten-Transformation sind bekannt (vgl. z. B. Wilmitzer L. (1993) Transgenic Plants, in: Biotechnology, A Mulii-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.) Vol. 2, 627-659, V.C.H. Weinheim - New York - Basel - Cambridge).

Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium-basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei et al. (1994) Plant J. 6, 271-282; Deng et al. (1990 ) Science in China 33, 28-34; Wilmink et al. (1992) Plant Cell Reports 11, 76-80; May et al. (1995) Bio/Technology 13, 486-492; Conner und Domiss (1992) Int. J. Plant Sci. 153, 550-555; Ritchie et al. (1993) Transgenic Res. 2, 252-265).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformationen mittels des biolistischen Ansatzes (Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al. (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 79, 625-631; Altpeter et al. (1996) Plant Cell Reports 16, 12-17), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.

Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8, 833-844; Gordon- Kamm et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618; Koziel et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200). In EP 292 435 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe dessen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen, granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können. Shillito et al. ((1989) Bio/Technology 7, 581) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Regenerierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwendig ist, von Kallus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich teilende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivierungszeit von sieben bis acht Monaten erhalten Shillito et al. Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen.

Prioli und Söndahl ((1989) Bio/Technology 7, 589) beschreiben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais-Protoplasten, der Cateto-Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1. Die Autoren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu fertilen Pflanzen von einer Anzahl verschiedener Faktoren, wie z. B. vom Genotyp, vom physiologischen Zustand der Donor-Zellen und von den Kultivierungsbedingungen, abhängig ist.

Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, supra; Ritala et al., supra) und für Weizen (Nehra et al. (1994) Plant J. 5, 285-297; Altpeter et al., supra).

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl-Harnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollie daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich eines veränderten Tocopherolgehalts untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.

Die Expression der erfindungsmäßen Proteine mit Geranylgeranyl-Reduktase-Aktivität kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden erfolgen. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern Blot-Analyse zum Nachweis Geranylgeranyl-Reduktase-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von Geranylgeranyl-Reduktase-spezifischer RNA, eine Southern-Blot Analyse zur Identifizierung für Geranylgeranyl-Reduktase kodierender DNA-Sequenzen oder eine Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen kodierten Proteins, vorzugsweise CHL P. Der Nachweis der enzymatischen Aktivität der Geranylgeranyl-Reduktase kann beispielsweise mit dem von Soll und Schultz (1981) in Biochem. Bitophys. Res. Commun. 99, 907-912 beschriebenen Enzymassay über die Bildung von Chlorophyll-Phytyl erfolgen.

Die Erfindung basiert auf der erfolgreichen Isolierung eines für eine Geranylgeranyl- Reduktase kodierenden cDNA-Klons aus einer cDNA-Library aus Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1. Die Sequenz dieses cDNA-Klons, die einen vollständigen offenen Leserahmen umfaßt, ist in SEQ : ID NO. 1 dargestellt. Unter Verwendung der Sequenz gemäß SEQ : ID No. 1 gelang die Erzeugung transgener Pflanzen, die einen gegenüber Wildtyppflanzen veränderten Tocopherolgehalt aufweisen.

Der die DNA-Sequenz gemäß SEQ : ID NO. 1 enthaltende cDNA-Klon wurde in Escherichia coli transformiert und der entsprechende E. coii-Stamm am 16.10.1997 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, unter der Hinterlegungsnummer DSM 11816 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

BEISPIELE Beispiel 1 Klonierung einer Tabak-cDNA, die eine Geranylgeranyl-Reduktase (CHL P) kodiert

Zur Identifizierung der Geranylgeranyl-Reduktase-cDNA aus Tabak wurde eine Lambda ZAP II cDNA-Bibliothek (Nicotiana tabacum SRI, Stratagene, USA) unter Verwendung eines für den Locus 4D9T7P kodierenden EST aus Arabidopsis thaliana nach Vorschrift gescreent. Die verwendete EST-Sequenz weist eine Ähnlichkeit zu den bekannten bch P/chl P-Sequenzen aus Rhodobacter capsulatus (Young et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218, 1-12; Bollivar et al. (1994) J. Mol. Biol. 237, 622-640; Bollivar et al. (1994) Biochemistry 33, 12763-12768) und Synechocystis PCC68O3 (Addlesee et al. (1996) FEBS Lett. 389, 126-130) auf.

Die verwendete Hybridisierungssonde umfaßt den Bereich der in 4D9T7P (Accession No. T04791) dargestellten EST-Sequenz von Base 1 bis Base 364. Die Sonde wurde als Notl/SalI-Restriktionsfragment aus der PRL2-Library von A. thaliana (Vektor: λZipLox) (Newman et al. (1994) Plant Physiol. 106: 1241-1255) isoliert und mit [α-³²P]dCTP mittels Nicktranslation (Life Technologies, Eggenstein) radioaktiv markiert.

Die Hybridisierung wurde nach folgendem Protokoll durchgeführt.

• - 2 h Vorhybridisierung bei 55°C mit Hybridisierungslösung folgender Zusammensetzung: 5 × SSC, 0,1% SDS, 5 × Denhardtreagenz, 100 µg/ml denaturierte Salmonsperm-DNA;
• - 12 h Haupthybridisierung bei 55°C mit frischer Hybridisierungslösung der oben genannten Zusammensetzung plus radioaktiv markierte Sonde;
• - Waschen:
  2 × 10 min. bei 55°C mit 2 × SSC und 0,1% SDS,
  und
  1 × 5 min. bei 55°C mit 1 × SSC und 0,1% SDS.

Die nach cDNA-Bank-Screening isolierte Plasmid-DNA wurde sequenziert. Die identifizierte und in SEQ : ID NO. 1 dargestellte chl P-cDNA-Sequenz umfaßt 1510 Nukleotide (ohne polyA-Schwanz), von denen die Nukleotide 1 bis 1392 für ein 52 kDa- Protein von 464 Aminosäuren (einschließlich des Start-Methionins, und ohne das Stopkodon (Nukleotide 1393 bis 1395) gerechnet) kodieren. Die abgeleitete Aminosäure­ sequenz des CHL P ist in SEQ : ID NO. 2 gezeigt. Die in SEQ : ID NO. 1 gezeigte Nukleotidsequenz umfaßt einen 3, untranslatierten Bereich von Nukleotid 1396 bis 1510.

Zur DNA-RNA-Isolieiung, Sequenzanalye, Restriktion, Klonierung, Geielektrophorese, radioaktive Markierung, Southern, Northen und Western Blot Analysen, Hybridisierung und dergleichen wurden gängige Methoden angewandt, wie sie in einschlägigen Laborhandbüchern, wie Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben sind.

Beispiel 2 Transformation von Tabakpflanzen und Regeneration intakter Pflanzen

Für die Herstellung transgener Pflanzen, die CHL P überexprimieren und daher einen gegenüber nicht-transformierten Pflanzen erhöhten Tocopherolgehalt aufweisen, wurde die DNA-Sequenz gemäß SEQ : ID NO. 1 mittels der Restriktionsenzyme BamHI und SalI in der multiplen Klonierungsschnittstelle des pBluescript-Vektors aus dem Vektor herausgeschnitten und in Sense-Orientierung in den binären Vektor BinAR-TX (Höfgen and Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221-230), einem pBIB-Abkömmling (Becker (1990) Nucleic Acid Res. 18, 203), der mit den selben Restriktionsendonukleasen verdaut wurde, hinter den CaMV 35S-Promotor hineinligiert. Zur Verdeutlichung ist eine Restrik­ tionskarte des Vektors BinAR-TX als Abb. 3 beigefügt.

Anstelle des genannten binären Vektors BinAR-TX kann jeder beliebige für die Pflanzentransformation geeignete Vektor für die Herstellung eines chimären Gens, bestehend aus einer Fusion des CaMV 35S-Promotors oder eines anderen Promotors, der die Transkription und Translation in Pflanzenzellen gewährleistet, und DNA-Sequenzen, die für CHL P kodieren, verwendet werden.

Der rekombinante Vektor pCHLPbin wurde sodann in Agrobacterium tumefaciens (Stamm GV2260; Horsch et al. (1985) Science 227, 1229-1231) transformiert und zur Transformation von Tabakpflanzen (SNN) mittels der Blattscheiben-Transformationstechnik (Horsch et al., supra) eingesetzt.

Hierzu wurde eine Übernachtkultur des entsprechenden Agrobacterium tumefaciens-Klons für 10 Minuten bei 5000 rpm abzentrifugiert, und die Bakterien wurden in 2YT-Medium resuspendiert. Junge Tabakblätter einer Sterilkultur (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) wurden in kleine, ca. 1 cm² große Stücke zerschnitten und kurzzeitig in die Bakterien­ suspension gelegt. Die Blattstücke wurden anschließend auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 15, 473; 0,7% Agar) gelegt und zwei Tage im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Blattstücke zur Sproßinduktion auf MS-Medium (0,7% Agar) mit 1,6% Glukose, 1 mg/l 6-Benzylaminopurin, 0,2 mg/l Naphthyl- essigsäure, 500 mg/l Claforan (Cefotaxim, Hoechst, Frankfurt) und 50 mg/l Kanamycin gelegt. Das Medium wurde alle sieben bis zehn Tage gewechselt. Wenn sich Sprosse entwickelt hatten, wurden die Blattstücke in Glasgefäße, die dasselbe Medium enthielten, überführt. Entstehende Sprosse wurden abgeschnitten und auf MS-Medium mit 2% Saccharose und 250 mg/l Claforan gegeben und zu ganzen Pflanzen regeneriert.

Beispiel 3 Analyse transgener Tabakpflanzen, die den rekombinanten Vektor pCHLPbin enthalten

Transgene Tabakpflanzen wurden wie oben beschrieben transformiert, selektioniert und regeneriert. Nach Bewurzelung in Sterilkultur wurden ca. 100 unabhängige Transformanten im Gewächshaus in Erde überführt. Die Tabakpflanzen wurden im Gewächshaus bei 60% Luftfeuchtigkeit und 20-25°C für 16 Stunden im Licht und 18-20°C für 8 Stunden in Dunkelheit gehalten.

Die Transformanten mit normalen oder erhöhten Tocopherol- bzw. Chlorophyllgehalten zeigten weder hinsichtlich ihres Phänotyps ein verändertes Aussehen noch eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen veränderte Wachstumsrate.

Einige der Primärtransformanten zeigten einen gegenüber Wildtyppflanzen bis zu 4- bis 6fach-gesteigerten Tocopherolgehalt. Diese Steigerung des Tocopherolgehalts konnte in Nachkommen der T1- und T2-Generation und in homozygoten Tochterpflanzen' die durch übliche Selbstbestäubung und anschließende Bestimmung des Aufspaltungsmusters der Samen auf Kanamycin-haltigem Medium gewonnen wurden, zusätzlich erhöht werden.

Des weiteren konnte beobachtet werden, daß die Tocopherolgehalte in transgenen Pflanzen unter Streßbedingungen, wie z. B. Anzucht unter tiefen und erhöhten Temperaturen bzw. Starklicht, und in seneszenten Blättern gegenüber Kontrollpflanzen zusätzlich erhöht waren.

Die Bestimmung des Tocopherolgehalts erfolgte nach folgendem Protokoll:
Blattscheiben wurden in flüssigem Stickstoff homogenisiert und dreimal in Methanol extrahiert. Die Extrakte wurden gesammelt und auf einer LiCrospher 100 HPLC RP-18- Säule (Merck, Darmstadt, Deutschland) bei einem Fluß von 1 ml/min mit folgendem Gradienten eluiert: 94% Laufmittel B (100% Methanol)/6% Laufmittel A (30% Methanol, 10% 0,1 M Ammoniumacetat, pH 5,1) für 7 min, für weitere 17 min 99% Laufmittel B/1% Laufmittel A, dann weitere 26 min 94% Laufmittel B/6% Laufmittel A.

Alternativ wurden die gesammelten Extrakte mittels HPLC in einem isokratischen Gradienten analysiert (Gradient besteht zu 2% aus Lösung A [10% Methanol und 10% Essigsäure] und zu 98% aus Methanol (Lösung B); Flußrate 1 ml/min). Es wurde eine Waters LC-Modul-Anlage mit Shimadzu RF 551 Fluoreszenzdetektor (295 nm_ex, 325 nm_em) verwendet.

Das Ergebnis eines Tocopherolassays ist in Abb. 4 in Form eines Balkendiagramms dargestellt. Der Vergleich der Blätter 6, 9, 12 (gezählt von der Pflanzenspitze) von den Transformanten 28 und 30 mit den entsprechenden Blättern der Kontrollpflanze (SNN) belegt einen bis zu 6-fach gesteigerten Gehalt an Tocopherol in den transgenen Linien.

Unabhängig von ihrer Fähigkeit, auf Kanamycin-haltigem Medium zu wachsen, wurden die transgenen -Tabakpflanzen auch im Southern Blot analysiert. Hierbei ergaben sich nach Hybridisierung mit einem markierten cDNA-Fragment für CHL P zusätzliche radioaktiv­ markierte Banden der mit Restriktionsenzymen verdauten genomischen DNA der Transformanten im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

Eine Northern Blot-Analyse ergab eine gegenüber den CHL P-RNA-Gehalten der Kontrollpflanzen erhöhte Menge an spezifischer RNA in den Transformanten.

Eine erhöhte Geranylgeranyl-Reduktase-Expression in den transgenen Pflanzen konnte auch im Western Blot nachgewiesen werden. Die Transformanten zeigten gegenüber Kontrollpflanzen eine erhöhte Menge an CHL P-Protein.

Zusätzlich konnte in Plastiden-Importexpenmenten (durchgeführt nach Grimm et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13, 583-593) bestätigt werden, daß das durch die Sequenz gemäß SEQ : ID NO. 1 kodierte CHL P-Vorstufenprotein nach in vitro-Transkription und -Translation in die Plastiden importiert wurde.

Beispiel 4 Herstellung von CHL P-Antisense-Konstrukten und Übertragung auf Tabak

Während die in den Beispielen 2 und 3 erzeugten und analysierten transgenen Pflanzen einen aufgrund der Überexpression der erfindungsgemaßen DNA-Sequenzen erhöhten Tocopherolgehalt aufwiesen, wurde für die Herstellung von transgenen Tabakpflanzen, die eine reduzierte Aktivität von CHL P aufweisen, folgendes Antisense-Konstrukt erzeugt und auf Tabak übertragen.

Die cDNA-Sequenz gemäß SEQ : ID NO. 1 wurde mittels der Restriktionsenzyme KpnI und XbaI in der multiplen Klonierungsschnittstelle des pBluescript-Vektors aus dem Vektor herausgeschnitten und in Antisense-Orientierung in den binären Vektor BinAR-TX (siehe Beispiel 2), der mit den selben Restriktionsenzymen verdaut wurde, mit dem 35S-Promotor von Cauliflower Mosaic Virus fusioniert. Der hieraus resultierende rekombinante Vektor pCHLPASbin wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mittels Agrobacterium tumefaciens­ vermittelter Leaf Disc-Transformation auf Tabak übertragen. Anschließend wurden transgene Pflanzen regeneriert. Ungefähr 100 unabhängige transgene Linien wurden regeneriert und die Insertion von Kopien des Transgens mittels üblicher Verfahren (z. B. Southern Blot-Hybridisierung) bestätigt.

Die Transformanten zeigten einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen verminderten Wuchs, einen ausgebleichten Phänotyp, reduzierte RNA- und Proteingehalte für CHL P, einen hohen Gehalt an Geranylgeranyl-Chlorophyll (bis zu 50% des Gesamt-Chlorophyllgehalts im Vergleich zu 100% Phytyl-Chlorophyll der Wildtyppflanzen) sowie einen verminderten Chlorophyll- und Tocopherolgehalt.

Beispiel 5 Überexpression aktiver Geranylgeranyl-Reduktase in Escherichia coli

Für die Herstellung von Expressionsklonen, die das rekombinante CHL P in E. coli überexprimieren, wurde der offene Leserahmen für ein vermutlich reifes (prozessiertes) Protein mittels der Oligonukleotid-Primer

von der DNA-Sequenz gemäß SEQ : ID No. 1 mittels PCR amplifiziert (1 min 94°C; 2 min. 60°C; 3 min. 72°C für 25 Zyklen). Das amplifizierte PCR-Fragment wurde aufgereinigt und mit-den Restriktionsenzymen Ncol und BgIII geschnitten und in den mit den selben Enzymen verdauten Expressionsvektor pQE60 (Qiagen, Hilden) hineinligiert. Hinter dem Initiationskodon ATG (Bestandteil der Erkennungssequenz für NcoJ) folgte die kodierende ChI P-Sequenz, beginnend mit dem Nukleotid Nr. 148 des offenen Leserahmens der CHL P-cDNA-Sequenz. Daraus resultiert nach dem Methionin der Einbau eines Glycins (Aminosäure Nr. 50 des aus der cDNA-Sequenz übersetzten Proteins).

Für die Expression des pflanzlichen CHL P wurden die E. coli-Stämme XL 1 Blue (Stratagene, LaJolla, CA, USA) oder SG 13009 (Gottesman et al. (1981) J. Bacteriol. 148, 265-273) mit dem rekombinanten Vektor transformiert. Nach Induktion der Transkription des rekombinanten Gens mittels IPTG wurde in den E. coli-Stämmen ein Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 47 kDa exprimiert. Das Protein wurde in der pelletierbaren Fraktion des Bakterienextraktes nachgewiesen und aus dem Gesamtextrakt unter denaturierenden Bedingungen über eine Nickel-Affinitätssäule gemäß den Instruktionen des Anbieters (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.

Das aufgereinigte Protein wurde zur Antikörperherstellung in Kaninchen injiziert.

Das Protein aus dem Gesamtextrakt besitzt eine Geranylgeranyl-Reduktase-Aktivität in einem kombinierten Enzymassay mit bakterieller Bacteriochlorophyllsynthase unter Verwendung von Chlorophyllid und GGPP. Der Enzymassay wurde gemäß dem Protokoll in Oster et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 9671-9676, durchgeführt.

Die Auftrennung von Chlorophyll-GG und Chlorophyll-Phytol erfolgte auf einer HPLC mit der RP 18-Säule unter Verwendung der Lösungsmittelgemische Lösung A (60% Aceton) und Lösung B (100% Aceton). Der Gradient an Lösungsmitteln wurde eingesetzt: t₀ 75% Lösung A und 25% Lösung B, 2 min.;innerhalb t_2-4 auf 45% Lösung A und 55% Lösung B; innerhalb t_4-13 auf 30% Lösung A und 70% Lösung B; innerhalb t_13-17 auf 100% Lösung B; t_17-21 100% Lösung B isokratisch; anschließend innerhalb von 5 min. auf 75% Lösung A und 25% Lösung B; dann weitere 5 min. 75% Lösung A und 25% Lösung B isokratisch. Zur Detektion der Tetrapyrrole wurde ein Fluoreszenzdetektor verwendet (λ_ex 425 nm, λ_em 665 nm).

Beispiel 6 Co-Expression des CHL P-Gens und des HPD-Gens in Nicotiana tabacum

Mittels der Oligonukleotid-Primer

wurde aus einer Arabidopsis thaliana-cDNA-Bibliothek die Sequenz der HPD-cDNA (Accession No.: AF 000228) zwischen Nukieotid 37 und 1404 amplifiziert, kloniert und ansequenziert. Das Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und SalI geschnitten und in den KpnI/SalI-geschnittenen binären Vektor Bin-Hyg-TX hineinligiert. Bei dem Vektor Bin-Hyg-TX handelt es sich (wie bei dem in Beispiel 2 verwendeten Vektor BinAR-TX) um einen pBIB-Abkömmling (Becker, supra), der die Expression einer in die multiple Klonierungsstelle einligierten kodierenden Region unter Kontrolle des 35S RNA Promotors aus Cauliflower Mosaic Virus ermöglicht. Im Unterschied zu dem für die Expression des CHL P-Gens eingesetzten Vektors BinAR-TX, der in Pflanzenzellen eine Selektion auf Kanamycin ermöglicht, trägt der binäre Vektor Bin-Hyg-TX ein Hygromycinresistenzgen als Selektionsmarker für Pflanzenzellen. Zur Verdeutlichung ist eine Restriktionskarte des Vektors Bin-Hyg-TX als Abb. 5 beigefügt.

Anstelle des genannten binären Vektors Bin-Hyg-TX kann jeder beliebige für die Pflanzentransformation geeignete Vektor für die Herstellung eines chimären Gens, bestehend aus einer Fusion des CaMV 35S-Promotors oder eines anderen Promotors, der die Transkription und Translation in Pflanzenzellen gewährleistet und DNA-Sequenzen, die für HPD kodieren, verwendet werden.

Dann erfolgte die Übertragung des erhaltenen, rekombinanten Vektor pBinHygHPD auf Tabak SNN mittels Agrobacterium tumefaciens wie in obigem Beispiel 2 beschrieben, wobei transgene Tabaksprosse auf Hygromycin-haltigem Medium selektiert wurden. Die nach Regeneration erhaltenen Pflanzen dienten als Kontrollpflanzen.

Zusätzlich wurden die in Beispiel 2 beschriebenen Transformanten 28 und 30 und wahlweise andere Transformanten, die das CHL P-Gen unter Kontrolle des 35S RNA Promotors überexprimieren, mittels Leaf Disc Transformation mit dem rekombinanten Vektor pBinHygHPD transformiert und ganze Pflanzen unter Selektion auf Kanamycin und Hygromycin regeneriert.

In sämtlichen transgenen Pflanzen wurde die erfolgreiche Übertragung und Expression des chimären HPD-Gens durch geeignete Southern- und Northernblot-Experimente mit dem oben erwähnten PCR-Fragment für HPD als Sonde bestätigt.

Ein Vergleich der Tocopherolgehalte (Analyse wie in Beispiel 3) in Blättern von Pflanzen, die nur das CHL P-Gen exprimieren (siehe Beispiel 3, Transformanten 28 und 30), und solchen Pflanzen, die das HPD-Gen und das CHL P-Gen co-exprimieren (Transformanten 28+HPD und 30+HPD) zeigte, daß der Tocopherolgehalt durch die gleichzeitige Expression des Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase-Gens zusätzlich gesteigert werden konnte.

Alternativ können transgene Pflanzen, die sowohl das CHL P-Gen als auch das HPD-Gen exprimieren, auch durch Kreuzung homozygoter "CHL P-Linien" mit homozygoten "HPD- Linien" erhalten werden.

Eine zusätzliche Steigerung des Tocopherolgehalts in Doppeltransformanten (bzw. Doppelkreuzungen) ist unter Streßbedingungen (z. B. erhöhte Temperatur, Lichtstreß u.ä.) zu erwarten.

Neben den vorangehend beschriebenen Doppeltransformanten, die HPD und CHL P exprimieren, wurden auch transgene HPD-Linien auf ihren Tocopherolgehalt und den Einfluß von Streßbedingungen auf den Tocopherolgehalt untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Überexpression von HPD in Tabakblättern eine 2- bis 3-fache Steigerung des Tocopherolgehalts zur Folge hat und daß insbesondere die Werte unter Streßbedingungen gegenüber nichttransgenen Kontrollpflanzen ansteigen.

Abb. 6 zeigt Tocopherolgehalte in den Blättern 4, 7 und 10 von 12 Wochen-alten transgenen Takaklinien (# 2, 6 und 33), die das Arabidopsis-Enyzm Hydroxyphenyl- Pyruvat-Dioxygenase (HPD) überexprimieren, im Vergleich zu Kontrollpflanzen (SNN). Die Pflanzen wurden entweder bei 38°C oder bei 10°C und einer Lichtintensität von ca. 200 µmol Photonen/m²/s abgezogen. Tocopherol wird mit zunehmendem Blattalter in den Pflanzen verstärkt angereichert. Insbesondere in den älteren Blättern steigt der Gehalt des Tocopherols in den unter 38°C angezogenen Pflanzen sehr viel steiler an und erreicht die zweifache Menge gegenüber den Kontrollpflanzen. Dagegen sind die Tocopherolgehalte in den Transformanten in der Kälte nur leicht gegenüber denen der Wildtyppflanzen erhöht.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß HPD bei erhöhtem Bedarf an Tocopherolen, also insbesondere unter Streßbedingungen, die Regeneration dieser Antioxidantien in transgenen Pflanzen besonders begünstigt.

Beispiel 7 Erhöhte Resistenz der transgenen Pflanzen gegenüber oxidativem Streß

Nach Beispiel 2 und 3 hergestellte transgene Pflanzen wurden in einem Blattscheiben- Inkubationsversuch auf den Einfluß inhibitorischer und oxidativer Substanzen untersucht. 15 Keimlinge wurden in 20 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,1) für 10 h im Licht inkubiert. Neben den Kontrollansätzen (Wasser) wurden die Pflanzen in Ansätzen mit 3,3 µM (niedrige Konzentration = NK) oder 33 µM (hohe Konzentration = HK) Acifluorfen (BASF, Ludwigshafen, Deutschland), einem Hemmstoff der Protoporphyrinogen-Oxidase, und in anderen Ansätzen mit 1,7 µM (niedrige Konzentration = NK) oder 17 µM (hohe Konzentration = HK) Bengalosa (4,5,6,7-Tetrachlor-2',4',5',7'-tetrajodfluorescein, Sigma- Aldrich, Deisenhofen, Deutschland), einem Erzeuger von reaktiven Sauerstoffspezies, iukubiert. Der Gehalt an Tocopherol ist in den untersuchten transgenen Linien (28, 30) sowohl in den Puffer-Kontrollansatzen wie auch unter oxidativen Streßbedingungen gegenüber Wildtyppflanzen (SNN) jeweils um das 2- bis 3-fache erhöht. Die Ergebnisse sind in Abb. 7 veranschaulicht.

Die Ergebnisse deuten daraufhin, daß sich die erfindungsgemäßen Pflanzen dank ihres gegenüber Wildtyppflanzen erhöhten Tocopherolgehalts durch eine erhöhte Resistenz gegenüber oxidativem Streß auszeichnen. Ein erhöhter antioxidativer Schutz der zellulären Membranen vor reaktiven Sauerstoffspezies in den erfindungsgemäßen Pflanzen ist somit zu erwarten.

Beispiel 8 Tocopherolgehalt in Samen von transgenen Pflanzen

Tocopherol wurde wie oben beschrieben aus Samen von transgenen Pflanzen extrahiert, die sich aufgrund der Expression von CHL P unter Kontrolle des CaMV 35S-Promotors (vgl. Beispiel 2) durch einen im Vergleich zu Wildtyppflanzen erhöhten Tocopherolgehalt in Blättern auszeichnen. Die Ergebnisse der mittels HPLC durchgeführten Tocopherolquantifizierung sind im Vergleich zu Tabakkontrollpflanzen in Abb. 8 dargestellt.

Neben α-Tocopherol wurde auch γ-Tocopherol quantifiziert. Letzteres liegt grundsätzlich in Tabaksamen in größeren Mengen vor; das Verhältnis von γ-Tocopherol zu α-Tocopherol beträgt in Tabaksamen ca. 10 : 1. Die Gehalte an beiden Formen der Tocopherole, insbesondere α-Tocopherol, sind im Vergleich zu den Kontrollpflanzen in den transgenen Pflanzen mit erhöhter Geranylgeranyl-Reduktase-Expression um das 2- bis 3-fache erhöht.

Diese Ergebnisse, die die Auswirkungen einer konstitutiven CHL P-Expression unter Kontrolle des 35S-Promotors auf den Tocopherolgehalt im Samen wiedergeben, zeigen deutlich, daß bei Einsatz eines samenspezifischen Promotors (bzw. eines in Samen induzierbaren Promotors) die Expression der Geranylgeranyl-Reduktase im Samen und hierdurch der Tocopherolgehalt in Samen von transgenen Pflanzen zusätzlich gesteigert werden kann.

Sollten in irgendeiner Weise molekularbiologische Arbeiten nicht hinreichend beschrieben worden sein, so wurden diese nach Standardmethoden, wie bei Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben, durchgeführt. Bezüglich der Transformation von Pflanzen wird auf allgemein bekannte Übersichtsartikel sowie auf die oben genannten Veröffenflichungen verwiesen.

BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Abb. 1: SEQ : ID NO. 1 zeigt die Nukleotid-Sequenz einer chl P-cDNA der Geranylgeranyl-Reduktase (CHL P) aus Nicotiana tabacum.

Abb. 2: SEQ : ID NO. 2 zeigt eine Aminosäuresequenz des Enzyms CHL P aus N tabacum, abgeleitet von der in Abb. 1 gezeigten SEQ:ID NO. 1.

Abb. 3: Restriktionskarte des für die Pflanzentransformation eingesetzten binären Vektors BinAR. BinAR (Höfgen and Willmitzer (1990) Plant Science 66 221) ist ein Bin19-Derivat (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711), das eine Expressionskassette für die konstitutive Expression von chimären Genen in Pflanzen enthält, wobei die Expressionskassette über die EcoRJ- und HindIII-Restriktionsschnittstellen von Bin19 kloniert ist. Die Kassette umfaßt ein 770 Bp.-EcoRI/HindIII-Fragment, das den CaMV 35S- Promotor, einen teilweisen pUC18-Polylinker und das Terminationssignal des Octopinsynthase-Gens (OCS) enthält. Für die Insertion kodierender Sequenzen eignen sich besonders die unikalen Schnittstellen des pUC18- Polylinkers, nämlich KpnI, SmaI, BamHI, XbaI und SalI. Als Pflanzenselektionsmarker trägt der binäre Vektor BinAR ein Kanamycinresistenzgen.

Abb. 4: Balkendiagramm, das den Tocopherolgehalt in den Blättern 6, 9, 12 (gezählt von der Pflanzenspitze) von transgenen Tabakpflanzen (Linien 28 und 30) versus den entsprechenden Blättern von Kontrollpflanzen (SNN) zeigt.

Abb. 5: Restriktionskarte des für die Pflanzentransformation eingesetzten binären Vektors Bin-Hyg-TX, bei dem es sich um ein pBlB-Derivat (Becker, supra; Bevan, supra) handelt, das eine Expressionskassette für die konstitutive Expression von chimären Genen in Pflanzen enthält. Für die Insertion kodierender Sequenzen eignen sich besonders die unikalen Schnittstellen des pUC18-Polyliukers, nämlich HpaI, KpnI, SmaI, XbaI und SalI. Als Pflanzenselektionsmarker trägt der binäre Vektor Bin-Hyg- TX ein Hygromycinresistenzgen.

Abb. 6: Säulendiagramm der Tocopherolgehalte in den Blättern 4, 7 und 10 in 12 Wochen-alten transgenen Linien (# 2, 6, 33), die das Arabidopsis-Enzym HPD überexprimieren, und in Kontrollpflanzen (SNN).

Abb. 7: Tocopherolgehalt in 12 Tage-alten Keimlingen, die während einer 10stündigen Belichtung in 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,1, Kontrolle = Wasser), mit 3,3 µM (NK) bzw. 33 µM (HK) Acifluorfen oder mit 1,7 µM (NK) bzw. 17 µM (HK) Bengalrosa inkubiert wurden (SNN = Wildtyp-Kontrollpflanzen, 28 und 30 = transgene Linien).

Abb. 8: relative Werte an α-Tocopherol und γ-Tocopherol in Samen von transgenen Tabakpflanzen (# 7, 39, 67, 96) und Wildtyptabakpflanzen (SNN). 100% α-Tocopherol entspricht 6 ng/mg Samen; 100% γ-Tocopherol entspricht 62,8 ng/mg Samen.

Claims (44)

1. Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Protein mit der Aktivität einer Geranylgeranyl- Reduktase oder ein aktives Fragment davon kodiert.

2. Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein pflanzliches Protein kodiert.

3. Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Protein aus Tabak kodiert.

4. Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ : ID No. 1.

5. Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in dem Klon DSM 11816 enthalten ist.

6. Allele und Derivate der Nukleinsäuressequenz gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Protein mit der Aktivität einer Geranylgeranyl- Reduktase oder ein aktives Fragment davon kodieren.

7. Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der vorangehenden Ansprüche umfaßt.

8. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäuressequenz gemäß einem der Ansprüche 1-6 in Kombination mit regulatorischen Elementen umfaßt, die die Transkription und Translation in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

9. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1-6 in Kombination mit Promotoren umfaßt, die die Transkription und Translation in Pflanzenzellen gewährleisten.

10. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Promotor um einen konstitutiven, induzierbaren, gewebespezifischen oder entwicklungsspezifischen Promotor handelt.

11. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Promotor um einen samenspezifischen Promotor handelt.

12. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 7-11, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Enhancer-Sequenzen, für Signalpeptide kodierende Sequenzen oder andere regulatorische Sequenzen umfaßt.

13. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 7-12, in dem die kodierende Nukleinsäuresequenz in der Sense-Orientierung vorliegt.

14. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 7-12, in dem die kodierende Nukleinsäuresequenz in der Antisense-Orientierung vorliegt.

15. Protein mit der biologischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase oder ein aktives Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine DNA-Sequenz oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche kodiert wird.

16. Protein mit der biologischen Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase oder ein aktives Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ : D NO. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder Bereiche davon aufweist.

17. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1-14 enthält.

18. Transgene Pflanzen, die eine Nukleinsäuresequenz, eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1-14 enthalten, sowie Teile dieser Pflanzen und deren Vermehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklinge, usw., sowie die Nachkommen dieser Pflanzen.

19. Pflanzen gemäß Anspruch 18, die einen gegenüber Wildtypflanzen veränderten Tocopherolgehalt aufweisen.

20. Pflanzen gemäß Anspruch 19, die einen gegenüber Wildtyppflanzen erhöhten Tocopherolgehalt aufweisen.

21. Pflanzen gemäß Anspruch 18, die einen gegenüber Wildtyppflanzen veränderten Gehalt an Vitamin K₁ aufweisen.

22. Pflanzen gemäß Anspruch 21, die einen gegenüber Wildtyppflanzen erhöhten Gehalt an Vitamin K₁ aufweisen.

23. Pflanzen gemäß Anspruch 18, die einen gegenüber Wildtyppflanzen veränderten Chlorophyllgehalt aufweisen.

24. Pflanzen gemäß Anspruch 23, die einen gegenüber Wildtyppflanzen erhöhten Chlorophyllgehalt aufweisen.

25. Dikotyle Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 18-24.

26. Pflanzen gemäß Anspruch 25, bei denen es sich um Nutzpflanzen, Nahrungs- und/oder Futterpflanzen, insbesondere Raps, Soja, Tomate, Kartoffel, Zuckerrübe, Klee, handelt.

27. Monokotyle Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 18-24.

28. Pflanzen gemäß Anspruch 27, bei denen es sich um Nutzpflanzen, Nahrungs- und/oder Futterpflanzen, insbesondere Getreide, wie Weizen, Gerste, Mais, Hafer, Roggen, Reis, Säß- und Weidegräser, handelt.

29. Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 18-28, in denen eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1-6 integriert im Genom der Pflanze vorliegt, sowie Teile dieser Pflanzen und deren Vermehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklinge, usw., sowie die Nachkommen dieser Pflanzen.

30. Transgene Pflanzenzellen, einschließlich Protoplasten, die eine Nukleinsäuresequenz, eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1-14 enthalten.

31. Pflanzenzellen gemäß Anspruch 30, einschließlich Protoplasten, die einen gegenüber nicht-transformierten Pflanzenzellen veränderten, insbesondere erhöhten, Tocopherol-, Vitamin K₁- und/oder Chlorophyllgehalt aufweisen.

32. Pflanzen bzw. Pflanzenzellen gemäß einem der Ansprüche 18-31, die zusätzlich eine für Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten.

33. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen gemäß einem der Ansprüche 18-32, folgende Schritte umfassend:

• a) Herstellung einer Nukleinsäuresequenz, bestehend aus den folgenden Bestandteilen, die in der 5'-3'-Orientierung aneinandergereiht sind:
  • - ein in Pflanzen funktionsfähiger, insbesondere samenspezifischer, Promotor,
  • - mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase oder ein aktives Fragment davon kodiert und
  • - gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript, sowie ggf. davon abgeleitete DNA-Sequenzen;
• b) Übertragung der Nukleinsäuresequenz aus a) auf pflanzliche Zellen und gegebenenfalls Integration der Nukleinsäuresequenz in das pflanzliche Genom,
• c) falls erwünscht, Regeneration vollständig transformierter Pflanzen und gegebe­ nenfalls Vermehrung dieser Pflanzen.

34. Verwendung einer Pflanze gemäß einem der Ansprüche 18-29 und 32 als Nahrungs- oder Futterpflanze.

35. Verwendung einer Pflanze gemäß einem der Ansprüche 18-29 und 32 als Produktionsstätte für Tocopherole und/oder Vitamin K₁.

36. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz oder eines Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1-14 zur Identifizierung, Isolierung oder Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der Aktivität einer Geranylgeranyl-Reduktase oder ein aktives Fragment davon kodiert.

37. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1-16 zur Herstellung von Antikörpern.

38. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz oder eines Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1-14 zur Herstellung transgener Pflanzen bzw. Pflanzenzellen.

39. Verwendung gemäß Anspruch 38, worin die Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen veränderten Tocopherolgehalt aufweisen.

40. Verwendung gemäß Anspruch 38, worin die Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen veränderten Chlorophyllgehalt aufweisen.

41. Verwendung gemäß Anspruch 38, worin die Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen veränderten Vitamin K₁-Gehalt aufweisen.

42. Verwendung gemäß Anspruch 38, worin die Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eine gegenüber Wildtyppflanzen erhöhte Herbizidtoleranz aufweisen.

43. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 38-42, worin die Pflanzen bzw. Pflanzenzellen zusätzlich eine für Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten.

44. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, eines Nukleinsäuremoleküls, eines Proteins oder eines Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1-17 zur Auffindung von Effektoren pflanzlicher Geranylgeranyl-Reduktase.