DE19918949A1 - Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase in Pflanzen - Google Patents
Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase in PflanzenInfo
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Abstract
Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen durch Überexpression eines DXPRI-Gens.
Description
Die Erfindung betrifft eine DNA kodierend für ein Polypeptid mit
1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase(DXPRI)-Aktivität
pflanzlichen Ursprungs. Zudem betrifft die Erfindung die
Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für ein Polypeptid mit
DXPRI-Aktivität pflanzlichen Ursprungs zur Herstellung von Pflan
zen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Carotinoiden, Vitamin K,
Chlorophyllen und Polyterpenen, speziell die Verwendung der DNA-
Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit dieser hybridisierenden DNA-Sequen
zen, einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem
Gehalt an Tocopherolen, Carotinoiden, Vitamin K, Chlorophyllen
und Polyterpenen, sowie die derart hergestellte Pflanze selbst.
Ein wichtiges Ziel pflanzenmolekulargenetischer Arbeiten ist bis
her die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Zuckern,
Enzymen und Aminosäuren. Wirtschaftlich interessant ist jedoch
auch die Entwicklung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitami
nen, wie z. B. der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes.
Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Ak
tivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell
schaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die erste Gruppe (1a-d)
stammt von Tocopherol ab, die zweite Gruppe besteht aus Derivaten
des Tocotrienols (2a-d):
1a, α-Tocopherol: R1 = R2 = R3 = CH3
1b, β-Tocopherol [148-03-8]: R1 = R3 = CH3, R2 = H
1c, γ-Tocopherol [54-28-4]: R1 = H, R2 = R3 = CH3
1d, δ-Tocopherol [119-13-1]: R1 = R2 = H, R3 = CH3
1b, β-Tocopherol [148-03-8]: R1 = R3 = CH3, R2 = H
1c, γ-Tocopherol [54-28-4]: R1 = H, R2 = R3 = CH3
1d, δ-Tocopherol [119-13-1]: R1 = R2 = H, R3 = CH3
2a, α-Tocotrienol [1721-51-3]: R1 = R2 = R3 = CH3
2b, β-Tocotrienol [490-23-3]: R1 = R3 = CH3, R2 = H
2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2]: R1 = H, R2 = R3 = CH3
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R1 = R2 = H, R3 = CH3
2b, β-Tocotrienol [490-23-3]: R1 = R3 = CH3, R2 = H
2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2]: R1 = H, R2 = R3 = CH3
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R1 = R2 = H, R3 = CH3
Wirtschaftlich große Bedeutung besitzt α-Tocopherol.
Der Entwicklung von Kulturpflanzen mit erhöhtem Gehalt an Toco
pherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen
durch Gewebekultur oder Samenmutagenese und natürliche Auswahl
sind Grenzen gesetzt. So muß einerseits beispielsweise der Toco
pherol-Gehalt bzw. der Gehalt des gewünschten Stoffwechselendpro
duktes bereits in Gewebekultur erfaßbar sein und andererseits
können nur diejenigen Pflanzen über Gewebekulturtechniken manipu
liert werden, deren Regeneration zu ganzen Pflanzen aus Zell
kulturen gelingt. Außerdem können Kulturpflanzen nach Mutagenese
und Selektion unerwünschte Eigenschaften zeigen, die durch teil
weise mehrmalige Rückkreuzungen wieder beseitigt werden müssen.
Auch wäre beispielsweise die Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes
durch Kreuzung auf Pflanzen der selben Art beschränkt.
Aus diesen Gründen ist das gentechnische Vorgehen, beispielsweise
die für die Tocopherol Syntheseleistung kodierenden, essentiellen
Biosynthesegene zu isolieren und in Kulturpflanzen gezielt zu
übertragen, dem klassischen Züchtungsverfahren überlegen. Dieses
Verfahren setzt voraus, daß die Biosynthese und deren Regulation
bekannt ist und daß Gene, die die Biosyntheseleistung beeinflus
sen, identifiziert werden.
Isoprenoide oder Terpenoide bestehen aus verschiedenen Klassen
lipidlöslicher Moleküle und werden teilweise oder vollständig aus
C5-Isopren-Einheiten gebildet. Reine Prenyllipide (z. B.
Carotinoide) bestehen aus C-Gerüsten, die ausschließlich auf Iso
pren-Einheiten zurückgehen, während gemischte Prenyllipide (z. B.
Chlorophylle, Tocopherole und Vitamin K) eine Isoprenoid-Seiten
kette besitzen, die mit einem aromatischen Kern verbunden ist.
Ausgangspunkt der Biosynthese von Prenyllipiden sind 3 × Acetyl-
CoA-Einheiten, die über β-Hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) und
Mevalonat in die Ausgangs-Isopren-Einheit (C5), dem Isopentenyl
pyrophosphat (IPP), umgewandelt werden. Kürzlich wurde durch in
vivo Fütterungsexperimente mit C13 gezeigt, daß in verschiedenen
Eubakterien, Grünalgen und pflanzlichen Chloroplasten ein Mevalo
nat unabhängiger Weg zur Bildung von IPP beschritten wird
(Abb. 1). Dabei werden Hydroxyethylthiamin, das durch De
carboxylierung von Pyruvat entsteht, und Glycerinalde
hyd-3-Phosphat (3-GAP) in einer durch die 1-Deoxy-D-Xylu
lose-5-Phosphat Synthase (DOXS) vermittelten "Transketolase"-Re
aktion zunächst in 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat umgewandelt
(Lange et al. 1998; Schwender et al. 1997; Arigoni et al. 1997;
Lichtenthaler et al. 1997; Sprenger et al. 1997). Dieses wird
dann durch eine intramolekulare Umordnung durch die DXPRI in
2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat und im weiteren zu IPP umge
setzt (Arigoni et al. 1997; Zeidler et al. 1998). Biochemische
Daten deuten darauf hin, daß der Mevalonat-Weg im Zytosol ope
riert und zur Bildung von Phytosterolen führt. Das Antibiotikum
Mevinolin, ein spezifischer Inhibitor der Mevalonat-Bildung,
führt lediglich zur Inhibition der Sterol-Biosynthese im Zyto
plasma, während die Prenyllipid-Bildung in den Plastiden unbeein
flußt ist (Bach & Lichtenthaler, 1993). Der Mevalonat-unabhängige
Weg ist dagegen plastidär lokalisiert und führt vornehmlich zur
Bildung von Carotinoiden und plastidären Prenyllipiden (Schwender
et al. 1997; Arigoni et al. 1997).
IPP steht im Gleichgewicht mit seinem Isomer, dem Dimethylallyl
Pyrophosphat (DMAPP). Eine Kondensation von IPP mit DMAPP in
Kopf-Schwanz-Anlagerung ergibt das Monoterpen (C10) Geranyl-Pyro
phosphat (GPP). Die Addition von weiteren IPP Einheiten führt zum
Sesquiterpen (C15) Farnesy-Pyrophosphat (FPP) und zum Diterpen
(C20) Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat (GGPP). Die Verknüpfung zweier
GGPP Moleküle führt zur Bildung der C40-Vorläufer für
Carotinoide.
Bei gemischten Prenyllipiden ist die Isopren-Seitenkette ver
schiedener Länge mit Nicht-Isopren Ringen verbunden wie
beispielsweise ein Porphyrin-Ring bei Chlorophyll a und b. Die
Chlorophylle und Phylloquinone enthalten eine C20 Phytyl-Kette,
in der nur die erste Isopren-Einheit eine Doppelbindung enthält.
GGPP wird durch die Geranylgeranyl-Pyrophosphat-Oxidoreduktase
(GGPPOR) zum Phytyl-Pyrophosphat (PPP) umgeformt, dem Ausgangs
stoff für die weitere Bildung von Tocopherolen.
Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur
Bildung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Quinone,
deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen. Die aroma
tischen Aminosäuren Phenylalanin bzw. Tyrosin werden in Hydroxy
phenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homo
gentisinsäure überführt wird. Das Chorismat wird einerseits über
Erythrose-4-Phosphat, 3'-Dehydrochinat, 3'-Dehydroshikimat, Shi
kimat, Shikimat-3-Phosphat und 5'-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat
gebildet (Abb. 1). Dabei werden Fruktose-6-Phosphat und Glyce
rinaldehyd-3-Phosphat zu Xylulose-5-Phosphat und Eryt
hrose-4-Phosphat umgesetzt. Die oben beschriebene Homogentisin
säure wird anschließend an PPP gebunden, um den Vorläufer von
α-Tocopherol und α-Tocoquinon, das 2-Methyl-6-phytylquinol, zu
bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosylmethionin als
Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6-phytylqui
nol, dann durch Zyklisierung α-Tocopherol und durch nochmalige
Methylierung α-Tocopherol (Richter, Biochemie der Pflanzen, Georg
Thieme Verlag Stuttgart, 1996).
In der Literatur finden sich Beispiele die zeigen, daß die Mani
pulation eines Enzyms den Metabolit-Fluß direktional beeinflussen
kann. In Experimenten mit einer veränderten Expression der Phy
toen Synthase, welche zwei GGPP-Moleküle zu 15-cis-Phytoen mit
einander verknüpft, konnte ein direkter Einfluß auf die Carotino
id-Mengen dieser transgenen Tomatenpflanzen gemessen werden (Fray
und Grierson, Plant Mol. Biol. 22(4), 589-602(1993); Fray et al.,
Plant J., 8, 693-701(1995)). Wie zu erwarten, zeigen transgene
Tabakpflanzen mit verringerten Mengen an Phenylalanin-Ammonium
Lyase reduzierte Phenylpropanoid-Mengen. Das Enzym Phenylalanin-
Ammonium Lyase katalysiert den Abbau von Phenylalanin, entzieht
es also der Phenylpropanoid-Biosynthese (Bate et al.,Proc. Natl.
Acad. Sci USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al., Plant
Physiol. 112. 1617-1624(1996)).
Über die Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Toco
pherol-Gehaltes in Pflanzen durch Überexpression einzelner Bio
synthesegene ist bisher wenig bekannt. Lediglich WO 97/27285 be
schreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch ver
stärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hy
droxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung einer
transgenen Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin
K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen.
Die Aufgabe wurden überraschenderweise gelöst durch die Über
expression eines 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase
(DXPRI)-Gens in den Pflanzen.
Um beispielsweise den Metabolit-Fluß aus dem Primärstoffwechsel
in die Tocopherol-Biosynthese zu verstärken, wurde die Bildung
von 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-P als essentiellem Ausgangssubstrat
für alle plastidären Isoprenoide erhöht. Zu diesem Zweck wurde in
transgenen Pflanzen die Aktivität der DXPRI durch Überexpression
des DXPRI-Gens aus Arabidopsis thaliana erhöht. Dies kann prinzi
piell auch durch Expression homologer oder heterologer DXPRI-Gene
erreicht werden. Eine Nukleotidsequenz codierend für eine DXPRI
wurde aus E.coli beschrieben (Accession Nummer AB 013300; Ku
zuyama et al., 1998; Takahashi et al., 1998).
In Beispiel 1 wird erstmals ein pflanzliches DXPRI-Gen (Abb. 2,
SEQ-ID No. 1) aus Arabidopsis thaliana beschrieben und in trans
genen Pflanzen verstärkt exprimiert. Um eine Plastidenlokalisa
tion zu gewährleisten wird der DXPRI-Nukleotidsequenz aus Arabi
dopsis thaliana eine Transitsignalsequenz (Abb. 3, Abb. 4) voran
gestellt. Fragment A (529 bp) in Abb. 4 beinhaltet den 35S-
Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Nukleotide 6909 bis 7437
des Cauliflower-Mosaik-Virus). Fragment B (259 bp) beinhaltet das
Transitpeptid der Transketolase. Fragment E beinhaltet das Gen
der DXPRI. Fragment D (192 bp) enthält das Polyadenylierungssi
gnal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al.,
1984) zur Transkriptionstermination. Auch geeignet als Expres
sionskassette ist eine DNA-Sequenz, die für ein DXPRI-Gen co
diert, das mit SEQ-ID No. 1 hybridisiert und das aus anderen Or
ganismen bzw. aus anderen Pflanzen stammt.
Das durch die zusätzliche Expression des DXPRI-Gens nun vermehrt
zur Verfügung stehende 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-P wird weiter in
Richtung Tocopherole, Carotinoide, Vitamin K, Chlorophylle und
Polyterpene umgesetzt.
Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt durch Transforma
tion der Pflanzen mit einem das DXPRI-Gen enthaltenden Konstrukt.
Als Modellpflanzen für die Produktion von Tocopherolen, Vitamin
K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen wurden Tabak und
Raps eingesetzt.
Antisensekonstrukte sowie homologe bzw. heterologe pflanzliche
DXPRI-Gene wurden unabhängig voneinander in Pflanzen transfor
miert (Abb. 5). Fragment A (529 bp) in Abb. 5 beinhaltet den
35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Nukleotide 6909 bis
7437 des Cauliflower-Mosaik-Virus). Fragment B (259 bp) beinhal
tet das Transitpeptid der Transketolase (Abb. 3). Fragment E
beinhaltet das Gen der DXPRI in Antisense-Orientierung. Frag
ment D (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3
der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al., 1984) zur
Transkriptionstermination. Messungen an DXPRI-Antisensepflanzen
ergaben bezüglich des Gehaltes an Tocopherolen und Carotinoiden
eine drastische Abnahme. Dies belegt den direkten Einfluß der
plastidären pflanzlichen DXPRI auf die Synthese von Carotinoiden
und Tocopherolen.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der DNA-Sequenz
SEQ-ID No. 1 aus Arabidopsis thaliana, die für eine DXPRI oder
deren funktionelle Äquivalente kodieren, zur Herstellung einer
Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Carotinoiden, Vita
min K, Chlorophyllen und Polyterpenen. Die Nukleinsäuresequenz
kann dabei z. B. eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion
in eine Expressionskassette geeignete kodierende Sequenzen sind
beispielsweise solche, die für eine DXPRI kodieren und die dem
Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Tocopherolen,
Carotinoiden, Vitamin K, Chlorophyllen und Polyterpenen verlei
hen.
Die Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nuklein
säuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in
der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende
der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am
3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere
regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden ko
dierenden Sequenz für das DXPRI-Gen operativ verknüpft sind.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle
Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf.
weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen
Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Se
quenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüp
fung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind
Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokali
sation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochon
drium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Öl
körperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker
wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et
al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Ta
bak-Transformationsvektor pBinAR-Hyg eingebaut werden. Abb. 6
zeigt die Tabaktransformationsvektoren pBinAR-Hyg mit 35S-Promo
tor (A) bzw. pBinAR-Hyg mit samenspezifischem Promotor Phaseolin
796 (B):
- - HPT: Hygromycin-Phosphotransferase
- - OCS: Octopin-Synthase-Terminator
- - PNOS: Nopalin-Synthase-Promotor
- - außerdem sind solche Restriktionsschnittstellen eingezeich net, die nur einmal den Vektor schneiden.
Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder
Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen
steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen
pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvi
rus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor
aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980),
285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche
Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer
Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des
eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989),
2195-2202).
Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren
Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen DXPRI-
Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert wer
den kann. Derartige Promotoren wie z. B. der PRP1-Promotor (Ward
et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salizyl
säure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesul
fonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin-
induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein
durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch
Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor
können u. a. verwendet werden.
Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die
Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen
beispielsweise die Biosynthese von Tocopherol bzw. dessen Vorstu
fen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine
blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der
Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI
Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989),
2445 - 245).
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremd
protein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten lösli
chen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen expri
miert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995),
1090-1094). Die Expressionskassette kann daher beispielsweise
einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin-
Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al., Mol. Gen.
Genet. (1991) 225 (3), 459-467) oder LEB4-Promotor (Fiedler und
Conrad, 1995)), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen
und ein ER-Retentionssignal enthalten.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion
eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten DXPRI-DNA-Sequenz
und vorzugsweise einer zwischen Promotor und DXPRI-DNA-Sequenz
inserierten DNA, die für ein chloroplastenspezifisches Transit
peptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen
Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise
in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. En
quist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Labora
tory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.
and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den
Apoplasten, in Plastiden, in die Vakuole, in das Mitochondrium,
in das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen ent
sprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment
des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev.
Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423). Für die Menge der Proteinakku
mulation in transgenen Pflanzen besonders förderlich erwiesen hat
sich eine Lokalisation im ER (Schouten et al., Plant Mol. Biol.
30 (1996), 781-792).
Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren DNA-
Sequenz für ein DXPRI-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des
Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des
Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloroplasten spezi
fische Transitpeptide, welche nach Translokation des DXPRI-Gens
in die Chloroplasten vom DXPRI-Teil enzymatisch abgespalten wer
den. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der
plastidären DXPRI oder einem funktionellen Äquivalent dieses
Transitpeptids (z. B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit
der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase) abgeleitet
ist.
Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen von drei Kassetten des
Plastiden-Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Kar
toffel in drei Leserastern als KpnI/BamHI Fragmente mit einem
ATG-Codon in der NcoI Schnittstelle:
Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine DXPRI kann
synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine
Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen ent
halten, sowie aus verschiedenen heterologen DXPRI-Genabschnitten
verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthe
tische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen
bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können
aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden,
die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert wer
den. Bei der Präparation einer Expressionskassette können ver
schiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Se
quenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Rich
tung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet
ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an
die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regio
nen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker,
der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion die
ser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker
1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktions
stellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatori
schen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger
als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ
bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze
sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkrip
tionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein DXPRI-
Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination.
Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig
austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt
stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrikti
onsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen,
Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans
versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre
pair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten
Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffül
len von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden
der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Von Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg kann u. a. das An
hängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schou
ten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die
durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis
vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natür
licherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen
Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt wer
den.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny
lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-
Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, ins
besondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids
pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff)
oder funktionelle Äquivalente.
Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven
Promotor (bevorzugt den CaMV 35 S-Promotor), das LeB4-Signalpep
tid, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthal
ten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz
KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.
Vorzugsweise wird die fusionierte Expressionskassette, die für
ein DXPRI-Gen kodiert, in einen Vektor, beispielsweise pBin19,
kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans
formieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien
können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen,
insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Tabakpflanzen,
verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder
Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend
in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von
Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F. F.
White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic
Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von
S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den
transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke
können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden,
die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Ex
pression eines DXPRI-Gens enthalten.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine DXPRI
kodierenden DNA wird eine Expressionskassette als Insertion in
einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzli
che funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für
Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind
unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Bio
technology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrie
ben.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und
Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete
Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in
E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a.
pBR332, pUC-Serien, N13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet
sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobak
terien replizieren können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung
einer Expressionskassette enthaltend DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1
oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen zur Transformation
von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise
ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes an Tocophero
len, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen der
Pflanze.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch
in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze er
folgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie
deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Ge
genstand der vorliegenden Erfindung.
Die Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transforma
tion von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen
und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Tocophero
len, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyll und Polyterpenen einge
setzt werden.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird
als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen
Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen
Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten
transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme,
das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte
particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation
trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion
und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genann
ten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques
for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and
Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic
Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Phy
siol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben.
Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor
kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans
formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res.
12 (1984), 8711).
Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können
ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen,
insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Hafer, Soja,
Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf,
Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschie
denen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z. B. indem
verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung
gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Funktionell äquivalente Sequenzen, die für ein DXPRI-Gen kodie
ren, sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotid
sequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle
Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der
hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch che
mische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze
angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere
auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich
isolierten für eine DXPRI kodierende Sequenz, welche weiterhin
die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutio
nen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen
eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise
auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung
mit umfaßt, welche man durch Modifikation der DXPRI-Nukleotid
sequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die
weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz
oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnitt
stellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funk
tion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abge
schwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie,
wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise
der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes in der Pflanze durch Über
expression des DXPRI-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche
artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rücküber
setzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die
DXPRI-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt
werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die
durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die
Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spe
zifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden
vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter
Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu
nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Be
standteil des Fusionsproteins ein DXPRI-Polypeptid oder ein funk
tionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusion
sproteins kann z. B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer
Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren
Hilfe ein Nachweis auf DXPRI-Expression möglich ist (z. B. myc-tag
oder his-tag). Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine re
gulative Proteinsequenz, wie z. B. ein Signal- oder Transitpeptid,
das das DXPRI-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.
Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen,
Carotinoiden und Polyterpenen bedeutet im Rahmen der vorliegenden
Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Bio
syntheseleistung dieser Verbindungen durch funktionelle Über
expression des DXPRI-Gens in der Pflanze gegenüber der nicht gen
technisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer
Pflanzengeneration.
Der Biosyntheseort von Tocopherolen beispielsweise ist im allge
meinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression
des DXPRI-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die
Tocopherol-Biosynthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein
muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze -
beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen
kann.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen
DXPRI-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine indu
zierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten DXPRI-
Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristenvermehrung
ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Ex
pression des DXPRI-Gens und deren Auswirkung auf die Tocopherol-
Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen gete
stet werden.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, trans
formiert mit einer Expressionskassette enthaltend die Sequenz
SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen, sowie
transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflan
zen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie
z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle,
Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak,
Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß-
und Weinspezies.
Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen
oder Algen.
Da es sich bei diesem Biosyntheseweg um einen ausschließlich
chloroplastidär-lokalisierten Stoffwechselweg handelt, bietet er
optimale Targetenzyme für die Entwicklung von Inhibitoren. Da
sich nach heutigem Stand der Technik kein mit der Arabidopsis
thaliana DXPRI identisches oder ähnliches Enzym in anderen höhe
ren Organismen befindet, ist davon auszugehen, daß Inhibitoren
sehr spezifisch auf Pflanzen wirken sollten. Der Wirkort eines
Inhibitors, Fosmidomycin (3-(N-formyl-N-hydroxyamino)-propyl
phosphonsäure; Fujisawa Pharmaceutical Co.) konnte als DXPRI
identifiziert werden. Im biochemischen Assay findet man eine ef
fektive Hemmung der enzymatischen Aktivität (Abb. 7). Folgende
Abkürzungen wurden in Abb. 7 verwendet: DOX = 1-Deoxy-D-xylulose,
ME = Methylerythritol. Die gleiche Wirkung findet man in einem
Pflanzenassay, in dem Gerstenkeimlinge nach Fosmidomycinwirkung
auf ihren Chlorophyll- und Carotinoidgehalt untersucht werden.
Beide Substanzen, die sich aus Vorläufern des Isoprenoidstoff
wechsels ableiten, sind in ihren Mengen stark erniedrigt
(Abb. 8).
Durch Überexpression der für eine DXPRI kodierenden Gensequenz
SEQ-ID No. 1 bzw. SEQ-ID No. 3 in einer Pflanze kann prinzipiell
eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der DXPRI erreicht
werden. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind eben
falls Gegenstand der Erfindung.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind:
- - Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn zeichnet, daß man Expressionskassetten enthaltend eine DNA- Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Se quenzen in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzen einbringt.
- - Verwendung der Expressionskassette enthaltend eine DNA-Se quenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Se quenzen zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der DXPRI durch verstärkte Expression der DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisie rende DNA Sequenzen.
- - Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hy bridisierende DNA-Sequenzen zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Carotinoiden und Polyterpenen durch Expression einer DXPRI DNA-Sequenz in Pflanzen.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert,
ist aber nicht auf diese beschränkt:
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonie
rungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gel
elektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nu
kleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von
DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von
Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter
DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor La
boratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-I Blue)
wurden von Stratagene bezogen. Der zur Pflanzentransformation
verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tumefaciens, C58C1
mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et
al. in Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777 beschrieben. Alternativ
können auch der Agrobakterienstamm LBA4404 (Clontech) oder andere
geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die
Vektoren pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119)
pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitro
gen), pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984),
8711-8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66
(1990), 221-230) benutzt werden.
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem
Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch
MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).
Ausgehend von der in der Genbank abgelegten Sequenz der E. coli
DXPRI konnten in Gendatenbanken andere DXPRI-homologe bakterielle
Proteinsequenzen identifiziert werden. Ein Vergleich der je le
diglich 400 Aminosäuren langen Proteinsequenzen zeigte mehrere
konservierte Aminosäure-Sequenzmotive. Ein solches Motiv zeigte
Homologien mit einer abgelegten genomischen Arabidopsis-Sequenz
(Accession Nummer AB009053).
Da die bakteriellen DXPRI-Sequenzen nahe am vermeintlichen N-Ter
minus eine konservierte Aminosäurensequenz aufweisen, wurde der
Beginn eines funktionellen Teils der Arabidopsis-DXPRI-Sequenz
sehr genau in abgelegten genomischen Sequenzen lokalisiert. Das
C-terminale Ende der Sequenz (Stop-Codon) konnte durch einen Ver
gleich mit dem EST-Klon (Accession Nummer AA586087) gefunden wer
den. Es wurde ein 1215 bp großes Fragment der DXPRI kloniert,
welches durch heterologe Expression auf enzymatische
Funktionalität untersucht wurde.
Es wurde mRNA aus Arabidopsis thaliana (var. Columbia) isoliert
und cDNA (nach Herstellerangaben Stratagene) erzeugt. Es wurden
aus den Sequenzen AB009053 und AA586087 PCR-Primer abgeleitet,
mit welchen aus der hergestellten cDNA ein 1215 bp großes DNA-
Fragment amplifiziert wurde. Der Primer ATRv3 besitzt eine BamHI-
Schnittstelle und ist so gewählt, daß nach Restriktionsverdau und
Ligation in pBluescript oder pET5b (Expressionsplasmid; Promega)
die kodierende Sequenz ab der N-terminalen ersten konservierten
Sequenz im Leserahmen der Proteintranslation einligiert wird.
Die Primer Atrv3 und Atrr1 enthielten eine BamHI- bzw. eine
EcoRI-Schnittstelle (jeweils unterstrichen). Das PCR-Produkt
(Atrv3/Atrr1) wurde mittels Gene-Clean-Kit (Dianova GmbH, Hilden)
gereinigt und mit BamHI und EcoRI verdaut. Zur Ligation wurden
der Vektor pET5b ebenfalls mit BamHI und EcoRI geschnitten. Die
Ligationsprodukte wurden in E. coli XL1Blue (Stratagene) trans
formiert.
Das Plasmid pET5bAtr enthält ein Genfragment kodierend für DXPRI
aus Arabidopsis thaliana. Dessen Sequenz wurde bestimmt
(Abb. 2, SEQ-ID No. 1). Die aus dem Plasmid pET5bAtr erhaltene Nu
cleotid-Sequenz läßt sich mit den Sequenzen AB009053 und AA586087
abgleichen. Demnach enthält die genomische Sequenz AB009053 10
Introns.
Der Expressionsvektor pET5b (Promega) ist ein Expressionsvektor
für die Expression rekombinanter Proteine in E. coli. Das Plasmid
ist abgeleitet von pBR322 und trägt für die Expression einen Bak
teriophage T7-Promotor. Zur Expression wird das Plasmid in einem
E. coli-Stamm vermehrt, welcher ein induzierbares Gen für die
T7-Polymerase trägt (z. B. JM109(DE3); Promega). Die Expression
des rekombinanten Proteines wird aktiviert über die Induktion der
T7-Polymerase.
pET5bAtr codiert für ein Fusionsprotein mit 420 Aminosäuren
Länge. Die Aminosäuren 1 bis 14 stammen aus pET5b (Fusionspeptid;
Abb. 3). Die Aminosäuren 15 bis 420 stammen aus dem klonier
ten DXPRI-Fragment (Abb. 2). In Abb. 3 ist die DNA-Sequenz für
das Fusionspeptid unterstrichen. Aus der gesamten Sequenz läßt
sich ein Molekulargewicht von 45,6 KDa für das Protein berechnen.
Der transgene Stamm wurde im Anzuchtsmedium "2x YT" (pro 1 l:
Bacto-Trypton 16 g, Hefe-Extrakt 10 g, NaCl 5 g) inkubiert. Die
Anzucht erfolgte bei 37°C bis zu einer OD560 nm von 0,6. Nach Zu
gabe von IPTG (1 mM) erfolgte das Wachstum weitere 10 min bei 37°C,
dann weitere 4 h bei 22° bis zur Ernte. Die Zellen wurden abzentri
fugiert und in 1% NaCl gewaschen. Nach Aufbruch der Zellen (50
bis 500 ml Zellkultur (OD560 nm von 1,0) mittels French Press wurde
ein Protein-Rohextrakt für Enzymtests verwendet (in 4 ml Extrak
tionspuffer (Tris/HCl (pH 7,5) 100 mM, MgCl2 5 mM, DTT 2 mM, PMSF
0,1 mM). Zur Aufbewahrung wurden die Rohextrakte mit 20% Glycerin
bei -20°C eingefroren.
Für den Enzymtest wurden 15 µl (auf 1 bis 7 mg Protein/ml ver
dünnt) Proteinextrakt mit MnCl2 (1 mM), NaF (5 mM), NADPH2 (0,5
mM) und 14C-1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat (0,25 mM, 3 KBq) für 30
min. bei 30°C inkubiert. Das Abstoppen der Reaktion erfolgte bei
100°C (30 sec.) durch Zugabe von CaCl2 (auf 100 mM) und alkali
scher Phosphatase (0.5 units). Das Dephosphorylieren des Produk
tes erfolgte für 2 h bei 30°C. Die Detektion erfolgte durch die
dünnschichtchromatographische Auftrennung des Produktes auf
Kieselgel 60 (Merck) mit Aceton/Ethylacetat/Wasser (50+50+2) mit
anschließender Auswertung via Instant Imager. Man erhält 1-Deoxy-
D-xylulose (DOX; Rf 0,4) und Methylerythritol (ME; Rf 0,2).
Abb. 9 gibt die dünnschichtchromatographische, autoradiogra
phische Auswertung nach heterloger Expression der DXPRI aus Ara
bidopsis thaliana in E. coli und Enzymassay bei Einsatz verschie
dener Gesamt-Proteinkonzentrationen (µg Protein/µl) wieder.
K = Kontrolle E. coli JM 109 (DE3) mit Plasmid pET5b ohne DXPRI.
Proben: E. coli JM 109 (DE3) mit Plasmid pET5b ohne DXPRI aus Ara bidopsis thalania. Die Bildung von ME kann effektiv inhibiert werden durch Verwendung von Fosmidomycin in verschiedenen Konzen trationen. Dies zeigt den "mode-of-action" von Fosmidomycin als Inhibitor der DXPRI.
K = Kontrolle E. coli JM 109 (DE3) mit Plasmid pET5b ohne DXPRI.
Proben: E. coli JM 109 (DE3) mit Plasmid pET5b ohne DXPRI aus Ara bidopsis thalania. Die Bildung von ME kann effektiv inhibiert werden durch Verwendung von Fosmidomycin in verschiedenen Konzen trationen. Dies zeigt den "mode-of-action" von Fosmidomycin als Inhibitor der DXPRI.
Für die Herstellung von DOXP wurde aus Chlamydomonas reinhardtii
klonierte DOXS verwendet (pET5b, E. coli JM109(DE3)).
Enzymextrakte aus mit IPTG induzierten E. coli-Zellen wurde mit
[3-14C]-Pyruvat und DL-GAP inkubiert. Die Reaktion wurde abge
stoppt nach 30 min. durch Hitzedenaturierung der Proteine. Nach
Abzentrifugieren wurde der Umsatz des radioaktiven Pyruvats
mittels DC/Autoradiographie überprüft und der Überstand als Sub
strat für die Reduktoisomerase verwendet.
DOXP als Reaktionsprodukt wurde nach folgenden Kriterien identi
fiziert:
- 1. Es entsteht ein radioaktives Produkt, welches nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase sich in DC-Trennungen weniger po lar verhält. Dies legt nahe, daß ein phosphoryliertes Produkt aus 14C-Pyruvat und GAP gebildet wurde.
- 2. Das dephosphorylierte Produkt läuft in der DC (Kieselgel,
Aceton/Ethylacetat/Wasser-50/50/2) gleich mit einer syntheti
schen Probe von 1-Desoxy-D-Xylulose.
Der Reaktionsansatz enthielt Proteinextrakt (20 µl/100 µl An satz), Tris/HCl (pH 7,5) 100 mM, DTT 2 mM, MgCl2 5 mM, Na- EDTA 500 µM, PMSF 100 pH, NaF 5 mM, TPP 1 mM, Na-Pyruvat 1 mM, Na-[2-14C] Pyruvat 20 KBq/100 µl und DL-Glycerinalde hyd-3-Phosphat 3,75 mM.
Zur Klonierung der DXPRI in einen binären Vektor wurden die Pri
mer so gewählt, daß nach Restriktionsverdau und Ligation in
pBin19AR-TP (Promega) die kodierende Sequenz ab der N-terminalen
ersten konservierten Sequenz im Leserahmen der Proteintranslation
einligiert wird.
Die Primer AtrvpBin1 und AtrpBin2 enthielten eine BamHI- bzw.
eine SmaI-Schnittstelle (jeweils unterstrichen). Das PCR-Produkt
(AtrvpBin1/AtrrpBin2) wurde mittels Gene-Clean-Kit (Dianova GmbH,
Hilden) gereinigt und mit BamHI und SmaI verdaut. Zur Ligation
wurden der Vektor pBin19AR-TP ebenfalls mit BamHI und SmaI ge
schnitten, der zusätzlich das Transitpeptid der Transketolase aus
Kartoffel hinter dem CaMV 355 Promotor enthält. Das Transitpeptid
gewährleistet die plastidäre Lokalisierung. Das Konstrukt ist in
Abb. 4 dargestellt.
Zur Klonierung der DXPRI in einen binären Vektor in Antisense-
Orientierung wurden folgende Primer gewählt.
Die Primer AtrvpBin3 und AtrrpBin4 enthielten eine SmaI- bzw.
eine BamHI-Schnittstelle (jeweils unterstrichen). Das PCR-
Produkt (AtrvpBin3/AtrrpBin4) wurde mittels Gene-Clean-Kit (Dia
nova GmbH, Hilden) gereinigt und mit SmaI und BamHI verdaut. Zur
Ligation wurden der Vektor pBin19AR-TP ebenfalls mit SmaI und
BamHI geschnitten, der zusätzlich das Transitpeptid der Trans
ketolase aus Kartoffel hinter dem CaMV 35S Promotor enthält. Das
Transitpeptid gewährleistet die plastidäre Lokalisierung. Das
Konstrukt ist in Abb. 5 dargestellt.
Tabakpflanzen mit reduzierter DXPRI-Aktivität wurden einer Selb
stung unterzogen und der erhaltene Samen geerntet. Zur weiteren
Analyse der Pflanzen wurde Samen aus der F1-Generation verwendet.
Alle untersuchten Antisense-Pflanzen zeigten hinsichtlich der
Pflanzengröße deutliche Unterschiede auf. Es wurden Pflanzen ge
funden, die die gleiche Größe hatten wie der Wildtyp, bis hin zu
ganz kleinen Pflanzen. Die nachfolgenden Generationen waren also
nicht einheitlich. Dies gilt auch für die Reduktion in der DXPRI-
Aktivität, die innerhalb einer Linie nicht einheitlich war, d. h.
man kann eine Linie nicht durch eine spezifische Reduktion in der
DXPRI-Aktivität definieren, sondern die Linien spalten auf (Sedo
heptulose-1,7-Bisphosphatase-antisense-Tabak-Pflanzen weisen ein
vergleichbares Phänomen auf; vgl. Harrison et al. 1998, Planta
204: 27-36).
Die Biomassen-Analyse ergab eine Korrelation zwischen Reduktion
der DXPRI-Aktivität und Reduktion in der Biomasse.
- - 100 mg Feuchtgewicht Blattmaterial
- - Extraktionspuffer: 80% Ethanol, 10 mM Hepes pH 7,0, 1 mM Ascorbat
- - Extraktion: 1 : 5 (w/v)
- - Inkubation bei 50°C, 30 Minuten
- - Keine Zentrifugation
- - Zugabe von ½ Volumen n-Hexan zu dem Extrakt
- - Vortex und Zentrifugation (5 Minuten, Raumtemperatur)
- - Gewinnung der oberen sehr grün gefärbten Phase
- - Wiederholung der n-Hexan Extraktion mit der unteren Phase
- - Vereinigung der n-Hexan Phasen
- - Vakuum Trocknung (2-3 Stunden für 1 ml n-Hexan bei Raumtem peratur)
- - Wiederauflösung des Rückstandes in ca. 1/5 des ursprünglichen n-Hexan Volumens
- - Injektion von 30-50 µl auf die HPLC
- - HPLC-Detektion für Tocopherol
- - Detektion der Fluoreszenz: Anregung bei 295 nm, Emission bei 330 nm
- - pH-Säule: RP-18 (Nucleosil 100, C18, 3 µm, Fa. Knauer)
- - Isokratisches System: n-Hexan plus 0,2% 2-Propanol
- - Fluß: 0,8 ml/min (Druck: 110 bar) Standards von Sigma oder Merck
- - Laufzeit: 15 Minuten
Die Extrakton phenolischer Substanzen aus Blättern wurde wie bei
Yao et al., The Plant Cell, 7 (1955), 1787 beschrieben durchge
führt.
Für die Herstellung transgener Tabakpflanzen, die einen veränder
ten Prenyllipidgehalt aufweisen, wurden Tabakblattscheiben mit
Sequenzen der DXPRI (SEQ-ID No. 1), kloniert wie in Beispiel 4
beschrieben in den Transformationsvektor pBin19AR-TP, transfor
miert. Zur Transformation von Tabakpflanzen wurden 10 ml einer
unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tu
mefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Bakte
rien in gleichem Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspen
diert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steri
ler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakteriensuspension
gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen
auf MS-Medium (Murashige und Skoog, Physiol. Plant (1962) 15,
473) mit 2% Saccharose und 0.8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tä
giger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit
100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan, mg/l Benzylaminopurin
(BAP), 0.2 mg/l Naphtylessigsäure (NAA), 1.6% Glukose und 0.8%
Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht/8
Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf
hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und
0.8% Bacto-Agar überführt.
Die Herstellung der transgenen Rapspflanzen, die einen veränder
ten Prenyllipidgehalt aufweisen, orientierte sich an einem Proto
koll von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Po
trykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Sprin
ger Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzungen
der verwendeten Medien und Puffer angegeben sind.
Die Transformationen erfolgten mit dem Agrobacterium tumefaciens
Stamm LBA4404 (Clontech GmbH, Heidelberg). Als binäre Vektoren
wurden das bereits in Beispiel 4 beschriebene binäre Konstrukt
mit der gesamten cDNA der DXPRI aus Arabidopsis thaliana (SEQ-ID
No. 1) verwendet. In allen hier verwendeten binären Vektoren
wurde die NOS-Terminatorsequenz durch das Polyadenylierungssignal
des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al.,
1984) zur Transkriptionstermination ersetzt. Brassica napus Samen
wurden mit 70% (v/v) Ethanol oberflächensteril gemacht, 10 min
bei 55°C in H2O gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v
Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 min inkubiert und sechsmal mit
sterilem H2O für jeweils 20 min gewaschen. Die Samen wurden drei
Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glas
kolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehre
ren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices
entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange
Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explante werden 30
min mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einen 300 ml Kolben
überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallus-Induktionsmedium wurden
die Kulturen für 24 h bei 100 U/min inkubiert.
Vom Agrobacterium-Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in Lu
ria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in
50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 h bei 29°C bis zu
einer OD600 von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der
Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml
Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der
Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD600
von 0.3 eingestellt.
Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit ste
rilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt,
vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien-
Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml
Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus-
Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h
auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co-
Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums
gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und
zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min
gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Pe
trischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten ent
fernt.
Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explante in 90 mm Petri
schalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kana
mycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor
verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16
Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden
die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-
Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regenera
tion ganzer Pflanzen wurde wie von Bade, J. B. und Damm, B. (in
Gene Transfer to Plants, Petrykus, I. und Spangenberg, G., eds.
Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben
durchgeführt.
Die Überexpression der DXPRI aus Arabidopsis thaliana in Tabak
erfolgte wie in Beispiel 8 beschrieben.
Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Takakpflanzen
wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Toco
pherolgehalt der Gesamtpflanze bzw. der Samen der Pflanze bes
timmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentration im Verg
leich zur nicht transfomierten Pflanze erhöht.
Die cDNA der DXPRI aus Arabidopsis thaliana (SEQ-No.1) wurde mit
einem CaMV35S-Promotor versehen und in Raps unter Verwendung des
35S-Promotors überexprimiert. Parallel dazu wurde der samenspezi
fische Promotor des Phaseolingenes verwendet, um den Tocopherol
gehalt spezifisch im Rapssamen zu erhöhen. Mit den entsprechenden
Konstrukten transformierte Rapspflanzen wurden im Gewächshaus an
gezogen. Anschließend wurde der α-Tocopherolgehalt der Gesamt
pflanze bzw. der Samen der Pflanze bestimmt. In allen Fällen war
die α-Tocopherolkonzentration im Vergleich zur nicht transfomier
ten Pflanze erhöht.
Claims (8)
1. DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 und damit hybridisierende DNA-Se
quenzen kodierend für eine pflanzliche 1-Desoxy-D-Xylu
lose-5-Phosphat Reduktoisomerase.
2. Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für eine 1-Desoxy-
D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase zur Herstellung von
Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K,
Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen.
3. Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 oder einer mit die
ser hybridisierenden DNA-Sequenz kodierend für eine 1-Desoxy-
D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase zur Herstellung von
Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K,
Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen.
4. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an
Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und
Polyterpenen, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz
SEQ-ID No. 1 oder eine mit dieser hybridisierenden DNA-Se
quenz in Pflanzen exprimiert wird.
5. Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn
zeichnet, daß man eine Expressionskassette enthaltend einen
Promotor und eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder eine mit die
ser hybridisierende DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle, in
Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflan
zenzellen einbringt.
6. Verfahren zur Transformation von Pflanzen gemäß Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe des
Stammes Agrobacterium tumefaciens, der Elektroporation oder
der particle bombardment Methode erfolgt.
7. Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K,
Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen enthaltend eine
Expressionskassette gemäß Anspruch 5.
8. Pflanze nach Anspruch 7, ausgewählt aus der Gruppe Soja, Ca
nola, Gerste, Hafer, Weizen, Raps, Mais oder Sonnenblume.
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