DE10030647A1 - Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des Shikimatweges - Google Patents
Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des ShikimatwegesInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Vitamin E, Vitamin K und Ubichinon durch Kultivierung von Organismen, insbesondere Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen sowie die transgenen Organismen selbst.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verfahren zur Herstellung
von Feinchemikalien, insbesondere Vitamin E, Vitamin K und/oder
Ubichinon durch Kultivierung von Organismen, insbesondere
Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten
Shikimatweg aufweisen, sowie die transgenen Organismen selbst.
Organismen, insbesondere Pflanzen, weisen eine Reihe von Stoff
wechselprodukten auf, die als Feinchemikalien einen hohen wirt
schaftlichen Wert haben. Als Feinchemikalien sind beispielsweise
aromatische Aminosäuren, Salicylsäurederivate, Phenylpropanoide,
Flavonoide, Stilbene, Xanthone und Chinone, insbesondere die
gemischten Prenyllipid-Verbindungen mit Vitamin E oder Vitamin K
Aktivität zu nennen.
In biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von Fein
chemikalien werden Organismen, die in der Lage sind diese
Feinchemikalien herzustellen, kultiviert und die gewünschten
Feinchemikalien aus den Organismen isoliert.
Für wirtschaftliche Verfahren zur biotechnologischen Herstellung
von Feinchemikalien, aber auch für die Verwendung der Organismen
als prozessierte oder nicht prozessierte Lebens- oder Futter
mittel, ist es wünschenswert, den Gehalt an Feinchemikalien
in den Organismen gezielt zu verändern, wie beispielsweise den
Gehalt der gewünschten Feinchemikalie zu erhöhen und/oder den
Metabolitfluß zu nicht gewünschten Feinchemikalien zu hemmen.
Wirtschaftlich bedeutende Feinchemikalien sind beispielsweise
Plastochinone, Ubichinone sowie Verbindungen mit Vitamin E- oder
Vitamin K-Aktivität, die eine Isoprenoid-Seitenkette aufweisen,
die mit einem aromatischen Kern verbunden ist.
Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-
Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell
schaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die Gruppe der Toco
pherole (1a-d) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe
der Tocotrienole (2a-d) eine ungesättigte Seitenkette:
1a, α-Tocopherol: R1 = R2 = R3 = CH3
1b, β-Tocopherol: R1 = R3 = CH3, R2 = H
1c, γ-Tocopherol: R1 = H, R2 = R3 = CH3
1d, δ-Tocopherol: R1 = R2 = H, R3 = CH3
1b, β-Tocopherol: R1 = R3 = CH3, R2 = H
1c, γ-Tocopherol: R1 = H, R2 = R3 = CH3
1d, δ-Tocopherol: R1 = R2 = H, R3 = CH3
2a, α-Tocotrienol: R1 = R2 = R3 = CH3
2b, β-Tocotrienol: R1 = R3 = CH3, R2 = H
2c, γ-Tocotrienol: R1 = H, R2 = R3 = CH3
2d, δ-Tocotrienol: R1 = R2 = H, R3 = CH3
2b, β-Tocotrienol: R1 = R3 = CH3, R2 = H
2c, γ-Tocotrienol: R1 = H, R2 = R3 = CH3
2d, δ-Tocotrienol: R1 = R2 = H, R3 = CH3
In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle vor
stehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin-E-
Aktivität verstanden.
Diese Verbindungen mit Vitamin-E-Aktivität sind wichtige natür
liche fett-lösliche Antioxidantien. Ein Mangel an Vitamin E führt
bei Menschen und Tieren zu pathophysiologischen Situationen.
Vitamin E-Verbindungen haben daher einen hohen wirtschaftlichen
Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich, in pharma
zeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.
Die in der Natur vorkommenden Verbindungen mit Vitamin K-Aktivi
tät sind Derivate des 1,4-Naphthochinons (Ullmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell
schaft, Chapter 5., 488-506, Vitamin K).
Phyllochinon (frühere Bezeichnung: Vitamin K1) weist eine größten
teils gesättigte Seitenkette auf, während die Gruppe der Mena
chinone-n (frühere Bezeichnung: Vitamin K2) eine ungesättigte
Seitenkette mit 4 bis 13 Isoprenylresten aufweist.
In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin K alle Ver
bindungen mit Vitamin K-Aktivität verstanden, insbesondere die
vorstehend erwähnten Verbindungen.
Ausgangspunkt der Biosynthese der Isoprenoidseitenkette ist Iso
pentenylpyrophosphat (IPP). IPP steht im Gleichgewicht mit seinem
Isomer Dimethylallyl Pyrophosphat (DMAPP). Eine Kondensation von
IPP mit DMAPP in Kopf-Schwanz Anlagerung ergibt das Monoterpen
(C10) Geranyl-Pyrophosphat (GPP). Die Addition von weiteren IPP
Einheiten führt zum Sesquiterpen (C15) Farnesy-Pyrophosphat (FPP)
und zum Diterpen (C20) Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat (GGPP).
Phyllochinon enthält eine C20 Phytyl-Kette, in der nur die erste
Isopren-Einheit eine Doppelbindung enthält. GGPP wird durch die
Geranylgeranyl-Pyrophosphat-Oxidoreduktase (GGPPOR) zum Phytyl-
Pyrophosphat (PPP) umgeformt, dem Ausgangsstoff für die weitere
Bildung von Tocopherolen.
Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur
Bildung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Chinone,
deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen.
Chorismat wird ausgehend von Erythrose-4-Phosphat und Phos
phoenolpyruvat (PEP) durch deren Kondensation zu 3-deoxy-D-
Arabino-heptulosonat-7-Phosphat (DAHP) über die Zwischenstufen
3'-Dehydroquinat, 3'-Dehydroshikimat, Shikimat, Shikimat-3-
Phosphat und 5'-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat gebildet. Dabei
wird das Erythrose-4-Phosphat vom Calvinzyklus gebildet und das
PEP von der Glykolyse bereitgestellt.
In höheren Pflanzen wird Tyrosin ausgehend von Chorismat über
Prephenate und Arogenat gebildet. Die aromatische Aminosäure
Tyrosin wird in Hydroxyphenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch
Dioxygenierung in Homogentisinsäure überführt wird.
Unter Shikimatweg wird in der vorliegenden Erfindung, ins
besondere für höhere Pflanzen der vorstehend beschriebene Bio
syntheseweg ausgehend von D-Erythrose-4-Phosphat über Shikimat,
Chorismat, Prephenat, Arogenat, Tyrosin bis einschließlich
zu 4-Hydroxyphenylpyruvat verstanden (G. Michal, Biochemical
Pathways, Biochemie-Atlas, Spektrum Akademischer Verlag
Heidelberg, Berlin, 1999, Seite 59 bis 60, Abb. 4.7-1 und
Kapitel 4.7.1).
Die Homogentisinsäure wird anschließend an Phytylpyrophosphat
(PPP) bzw. Geranylgeranylpyrophosphat gebunden, um die Vorläufer
von α-Tocopherol und α-Tocotrienol, das 2-Methyl-6-phytylhydro
chinon bzw. das 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon zu bilden.
Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosylmethionin als Methyl-
Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6-phytylquinol, dann
durch Zyklisierung γ-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung
α-Tocopherol.
Es ist bekannt, durch Überexpression bzw. Herunterregulation von
Biosynthesegenen des Tocopherolbiosyntheseweges, unter dem in
der vorliegenden Erfindung der Biosyntheseweg von Hydroxyphenyl
pyruvat bis Tocopherol verstanden wird, den Gehalt an Vitamin E
in Pflanzen zu modifizieren.
WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes
durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des
Enzyms p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).
WO 99/04622 bzw. D. Della Penna et al., Science 1998, 282,
2098-2100 beschreiben Gensequenzen codierend für eine γ-Toco
pherolmethyltransferase aus Synechocystis PCC6803 und Arabidopsis
thaliana und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen
modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.
Ferner ist bekannt, durch Überexpression bzw. Herunterregulation
von Biosynthesegenen des Biosyntheseweges der Isoprenoid-Seiten
kette, den Gehalt an Vitamin E in Pflanzen zu modifizieren.
WO 99/23231 zeigt, daß die Expression einer Geranylgeranyl-
Reductase in transgenen Pflanzen eine gesteigerte Tocopherol
biosynthese zur Folge hat.
WO 00/08169 beschreibt Gensequenzen codierend eine
1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und eine Geranyl-Geranyl-
Pyrophosphat Oxidoreduktase und deren Einbau in transgene
Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.
Alle diese Methoden liefern zwar Organismen, insbesondere
Pflanzen, die einen modifizierten Gehalt an der Feinchemikalie
Vitamin E aufweisen, dennoch ist oft die Höhe des Gehalts an
Vitamin E für Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch
Isolierung aus diesen transgenen Organismen noch nicht zufrieden
stellend.
Weitere Nachteile dieser Methoden sind, daß häufig nur der Gehalt
der Tocopherole und Tocotrienole verschoben wird, jedoch keine
Erhöhung des Gesamt-Vitamin-E-Gehalts in Pflanzen erreicht wird.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde ein weiteres Ver
fahren zur Herstellung von Feinchemikalien durch Kultivieren von
Organismen, bzw. transgene Organismen die Feinchemikalien her
stellen können, mit optimierten Eigenschaften zur Verfügung zu
stellen, die die geschilderten Nachteile des Standes der Technik
nicht aufweisen.
Demgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien
gefunden, indem man Organismen kultiviert, die gegenüber dem
Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen.
Unter Feinchemikalien werden Stoffwechselprodukte des Organismus
verstanden, die aus dem Shikimatweg resultieren. Der Shikimatweg
beginnt dabei bei D-Erythrose-4-Phosphat und endet bei 4-Hydroxy
phenylpyruvat, wie vorstehend beschrieben. Für diese Stoff
wechselprodukte stellen die Ausgangsverbindung D-Erythrose-4-
Phosphat, die Endverbindung 4-Hydroxyphenylpyruvat sowie alle,
vorstehend erwähnten, Zwischenstufen des Shikimatweges, die
Ausgangsverbindungen, nachstehend auch Zwischenverbindungen
bezeichnet, dar, die biosynthetisch vom Organismus in die Stoff
wechselprodukte umgewandelt werden.
Vorzugsweise wird in der vorliegenden Erfindung unter Shikimat
weg der Stoffwechselweg von Shikimat bis 4-Hydroxyphenylpyruvat,
besonders bevorzugt der Stoffwechselweg von Chorismat bis
4-Hydroxyphenylpyruvat verstanden, wobei für Pflanzen der
Stoffwechselweg ab Chorismat über Prephenat, Arogenat und
Tyrosin verläuft.
Bevorzugte Feinchemikalien sind die aromatischen Aminosäuren,
wie beispielsweise Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, Salicyl
säurederivate, Folsäurederivate, Phenylpropanoide, wie beispiels
weise Lignin, Lignane oder Coumarine, insbesondere Scopoletin
oder Scopolin, Flavonoide, wie beispielsweise Chalcone, Flava
none, Flavanole, Anthocyanidine oder Isoflavonoide, Stilbene,
Xanthone, oder Chinonderivate, wie beispielsweise Vitamin E,
Vitamin K, Ubichinone, Plastochinone oder Shikonin.
Besonders bevorzugte Feinchemikalien sind Vitamin E, Vitamin K
oder Ubichinon, insbesondere Vitamin E.
Je nachdem ob die genetische Veränderung des Shikimatweges zu
einer Erhöhung oder Erniedrigung des Metabolitflusses zu einer
bestimmten Zwischenverbindung - die Teil des Shikimatweges ist -
führt, erhöht sich bzw. erniedrigt sich der Gehalt der Fein
chemikalie die biosynthetisch im Organismus aus dieser Zwischen
verbindung hergestellt wird.
Genetische Veränderung des Shikimatweges die zu einer Erhöhung
des Metabolitflusses zu einer Zwischenverbindung und damit der
entsprechenden Feinchemikalie führen, sind beispielsweise
die Überexpression eines Stoffwechselgens des Shikimatweges und damit die Erhöhung der entsprechenden Enzymaktivität, die zu dieser Zwischenverbindung führt,
das Ausschalten von negativen Regulationsmechanismen von zur Zwischenverbindung führenden Stoffwechselwegen, wie beispiels weise das Ausschalten der Feedback-Inhibierung oder das Ein bringen von orthologen Genen die im gewünschten Organismus keiner Regulation unterliegen,
die Inaktivierung von Genen die Enzyme kodieren, die mit den Enzymen des Stoffwechselwegs, der zum gewünschten Produkt führt, konkurrieren oder
die Expression eines Gens zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist. Dieses Gen kann beispielsweise den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrücken und durch die neue Gen funktion eine Erhöhung des Stofflusses zu der Zwischenverbindung bewirken, bei der die Überbrückung endet.
die Überexpression eines Stoffwechselgens des Shikimatweges und damit die Erhöhung der entsprechenden Enzymaktivität, die zu dieser Zwischenverbindung führt,
das Ausschalten von negativen Regulationsmechanismen von zur Zwischenverbindung führenden Stoffwechselwegen, wie beispiels weise das Ausschalten der Feedback-Inhibierung oder das Ein bringen von orthologen Genen die im gewünschten Organismus keiner Regulation unterliegen,
die Inaktivierung von Genen die Enzyme kodieren, die mit den Enzymen des Stoffwechselwegs, der zum gewünschten Produkt führt, konkurrieren oder
die Expression eines Gens zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist. Dieses Gen kann beispielsweise den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrücken und durch die neue Gen funktion eine Erhöhung des Stofflusses zu der Zwischenverbindung bewirken, bei der die Überbrückung endet.
Genetische Veränderung des Shikimatweges die zu einer Erniedri
gung des Metabolitflusses zu einer Zwischenverbindung und damit
der entsprechenden Feinchemikalie führen, sind beispielsweise
die Überexpression eines Stoffwechselgens des Shikimatweges und damit die Erhöhung der entsprechenden Enzymaktivität, die von dieser Zwischenverbindung wegführt,
die Inaktivierung von Genen die Enzyme kodieren, die zu dieser Zwischenverbindung führen oder
die Expression eines Gens zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist. Dieses Gen kann beispielsweise den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrücken und durch die neue Gen funktion eine Erniedrigung des Stofflusses zu den überbrückten Zwischenverbindungen bewirken.
die Überexpression eines Stoffwechselgens des Shikimatweges und damit die Erhöhung der entsprechenden Enzymaktivität, die von dieser Zwischenverbindung wegführt,
die Inaktivierung von Genen die Enzyme kodieren, die zu dieser Zwischenverbindung führen oder
die Expression eines Gens zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist. Dieses Gen kann beispielsweise den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrücken und durch die neue Gen funktion eine Erniedrigung des Stofflusses zu den überbrückten Zwischenverbindungen bewirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens führt die genetische Veränderung des Shikimatweges
im Organismus zu einer Erhöhung des Metabolitflusses zu einer
Zwischenverbindung und damit der entsprechenden gewünschten
Feinchemikalie.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs
gemäßen Verfahrens erfolgt die genetische Veränderung des
Shikimatweges im Organismus durch die Expression eines Gens zu
dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist. Dieses Gen codiert
ein Enzym, daß den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps
überbrücken kann und durch die neue enzymatische Aktivität eine
Erhöhung des Stofflusses zu der Zwischenverbindung bewirkt, bei
der die Überbrückung endet. Diese neue enzymatische Aktivität
unterliegt keiner Regulation durch den Organismus, schließt
also den Stoffwechselweg kurz um beispielsweise limitierende
Regulationsstellen im Stoffwechsel zu umgehen. Dadurch ist es
möglich, den Metabolitfluß zu limitierenden Substanzen von vor
handenen Regulationen zu entkoppeln.
Dementsprechend betrifft die Erfindung vorzugsweise das vor
stehend beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren, dadurch gekenn
zeichnet, daß man den Shikimatweg des Organismus gegenüber dem
Wildtyp durch Einbringen mindestens eines Gens verändert, zu dem
der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist.
Weiterhin betrifft die Erfindung insbesondere das vorstehend
beschriebene erfindungsgemäße Verfahren, dadurch gekennzeichnet,
daß man durch das mindestens eine eingebrachte Gen den Stoff
wechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrückt.
Unter einem zum Wildtyp orthologen Gen wird ein Gen verstanden,
daß aus einem anderen Organismus stammt, wobei die Enzymaktivität
die das Gen kodiert bereits im Wildtyp vorhanden ist.
Dementsprechend wird unter der Formulierung "Gen, zu dem der
Wildtyp kein orthologes Gen aufweist" ein Gen aus einem anderen
Organismus verstanden, wobei die Enzymaktivität die das Gen
kodiert vor der Transformation im Wildtyp nicht vorhanden oder
nicht aktiviert war.
Unter Organismen werden prokaryontische Organismen oder
eukaryontische Organismen, wie beispielsweise Bakterien, Hefen,
Algen, Moose, Pilze oder Pflanzen, verstanden, die in der Lage
sind, als Wildtyp oder durch genetische Veränderung die vor
stehend erwähnten Feinchemikalien herzustellen. Bevorzugte
Organismen sind photosynthetisch aktive Organismen, wie bei
spielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, die
bereits als Wildtyp in der Lage sind, die vorstehend erwähnten
Feinchemikalien herzustellen.
Besonders bevorzugte Organismen sind Pflanzen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs
gemäßen Verfahrens verwendet man deshalb Pflanzen als zu
transformierende Organismen. In diesem Fall eignen sich für
das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise bakterielle Gene
als Gene zu denen die Pflanze kein orthologes Gen aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver
fahrens wird der Stoffwechselweg des Shikimatweges der Pflanze
durch das mindestens eine eingebrachte Gen überbrückt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs
gemäßen Verfahrens bringt man eine Nukleinsäure, codierend eine
Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase, im folgenden auch tyrA
genannt, oder eine Prephenatdehydrogenase in eine Pflanze ein.
Für die bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver
fahrens eignen sich alle Gene die eine Chorismatmutase-Prephenat
dehydrogenase oder eine Prephenatdehydrogenase kodieren.
In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform des erfindungs
gemäßen Verfahrens bringt man eine Nukleinsäure, codierend eine
Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase in eine Pflanze ein. Da in
den Pflanzen aber in der Regel die enzymatische Aktivität einer
Chorismatmutase bereits vorhanden ist, ist diese Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens auch durch Einbringen einer
Nukleinsäure, die eine Prephenatdehydrogenase codiert, ausführ
bar.
Beispiele für Nukleinsäuren, die eine Prephenatdehydrogenase
codieren und im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden
können sind die bekannten und beispielsweise in Datenbanken im
Internet zugänglichen Prephenatdehydrogenasegene aus Lactococcus
lactis (Accession X78413), Synechocystis spec PCC 6803 (slr2081),
Deinococcus radiodurans (AAF10695) oder Bacillus subtilis
(P20692). Weitere Beispiele können durch Vergleich der Homologien
der Sequenzen mit diesen bekannten Prephenatdehydrogenasegenen
gefunden werden, wie beispielsweise die potentiellen Prephenat
dehydrogenase aus Termotoga maitima (AAD35430) oder Heliobacter
pylori 26695 (Accession AAD08422).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver
fahren unter Verwendung eines Prephenatdehydrogenasegens bringt
man man eine Nukleinsäure ein, die ein Protein kodiert, ent
haltend die Aminosäuresequenz der Prephenatdehydrogenase aus
Synechocystis spec PCC 6803 oder eine von dieser Sequenz durch
Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete
Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30%, vorzugsweise
mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, besonders bevorzugt
mindestens 90% auf Aminosäureebene mit der Sequenz der Pre
phenatdehydrogenase aus Synechocystis spec PCC 6803 und die
enzymatische Eigenschaft Prephenatdehydrogenase aufweist.
Es ist jedoch vorteilhaft, gegebenenfalls in Kombination mit
der erfindungsgemäßen Überbrückung des Stoffwechselweges weitere
Enzyme des Shikimatweges überzuexprimieren, um einen erhöhten
Metabolitfluß zu den gewünschten Feinchemikalien zu erreichen.
Da das tyrA-Gen, ein Protein codiert, daß sowohl die
enzymatischen Eigenschaften einer Chorismatmutase als auch
einer Prephenatdehydrogenase aufweist, wird durch Einbringen
einer Nukleinsäure eine enzymatische Aktivität überexprimiert,
bzw. eine enzymatische Aktivität eingebracht, die keiner
Regulation unterliegt (Chorismatmutase) und eine orthologe
enzymatische Eigenschaft (Prephenatdehydrogenase) neu eingeführt.
Unter einer Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase wird ein Enzym
verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Chorismat
über Prephenat in 4-Hydroxyphenylpyruvat umzuwandeln.
Unter einer Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase werden
weiterhin auch zwei Enzyme verstanden, wobei das eine Enzym
die Aktivität einer Chorismatmutase und das andere Enzym die
Aktivität einer Prephenatdehydrogenase aufweist. Für diese Aus
führungsform ist es notwendig, zwei verschiedene Nukleinsäuren,
die jeweils eines dieser Enzyme kodieren, in die Pflanze ein
zubringen.
Unter einer Chorismatmutase wird ein Enzym verstanden, das
die enzymatische Aktivität aufweist, Chorismat in Prephenat
umzuwandeln.
Unter einer Prephenatdehydrogenase wird ein Enzym verstanden,
das die enzymatische Aktivität aufweist, Prephenat in 4-Hydroxy
phenylpyruvat umzuwandeln.
Wie vorstehend ausgeführt, bringt man in einer insbesondere
bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
mindestens eine Nukleinsäure, codierend eine Chorismatmutase-
Prephenatdehydrogenase (tyrA) in eine Pflanze ein.
Abb. 1 zeigt beispielsweise das Biosyntheseschema ausgehend
von Erythrose-4-Phosphat zu den Tocopherolen. Durch die zusätz
liche Expression des tyrA-Gens wird der Shikimatweg des Wildtyps
genetisch verändert und der Metabolitfluß zu Hydroxyphenylpyruvat
erhöht. Das nun vermehrt zur Verfügung stehende Hydroxyphenylpy
ruvat wird weiter in Richtung Tocopherole umgesetzt. Ein erhöhter
Gehalt an Hydroxyphenylpyruvat kann auch zu einer erhöhten
Umsetzung Richtung Tocotrienole und/oder Vitamin K führen.
In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Verfahren bringt man eine Nukleinsäure
ein die ein Protein kodiert, enthaltend die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution,
Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz,
die eine Homologie von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens
50%, bevorzugter mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens
90% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 und die
enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase-Prephenatdehydro
genase (tyrA) aufweist.
Die Nukleinsäure kann beispielsweise eine RNA-, DNA- oder cDNA-
Sequenz sein.
Das Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 stellt die
Chorismatmutase-Prephenatedehydrogenase (tyrA) aus E. coli K12
dar.
Weitere bevorzugte Beispiele für Chorismatmutase-Prephenat
dehydrogenasen bzw. die codierenden Nukleinsäuren, die
erfindungsgemäß verwendet werden können sind beispielsweise die
Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenasegene aus Erwinia herbicola
(Accession X60420; dieses Protein kann durch Deletion eins 109 Bp
Bereiches am 5'Ende auch in eine monofunktionelle Prephenat
dehydrogenase umgewandelt werden und dann beispielsweise wie vor
stehend beschrieben als Prephenatdehydrogenase verwendet werden)
oder Bordetella bronchiseptica (Accession AAF01289) oder lassen
sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische
Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäure
sequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nuklein
säuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID. NO. 2 oder den
anderen vorstehend beschriebenen Sequenzen leicht auffinden,
wie beispielsweise die potentielle Chorismatmutase-Prephenatde
hydrogenasegene aus Methanococcus janaschii (Accession Q58029).
Unter Substitution ist der Austausch einer oder mehrerer Amino
säuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevor
zugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen
die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die
ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch
Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr.
Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte
Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini
des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen
Proteindomänen.
Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptid
kette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere
Aminosäuren ersetzt wird.
Unter Homologie zwischen zwei Proteinen wird die Identität der
Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden,
vorzugsweise die Identität die durch Vergleich mit Hilfe des
Programmalgorithmus GAP (UWGCG, University of Wisconsin, Genetic
Computer Group) unter Einstellung folgender Parameter berechnet
wird:
Gap Weight: 12
Length Weight: 4
Average Match: 2,912
Average Mismatch: -2,003
Gap Weight: 12
Length Weight: 4
Average Match: 2,912
Average Mismatch: -2,003
Unter einem Protein, das eine Homologie von mindestens 30%
auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 aufweist,
wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Ver
gleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO. 2, vorzugsweise
nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine
Homologie von mindestens 30% aufweist.
Weitere geeignete Nukleinsäuresequenzen sind durch Rücküber
setzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhält
lich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend
der Organismus spezifischen codon usage häufig verwendet werden.
Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen
anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht
ermitteln.
Soll das Protein beispielsweise in einer Pflanze exprimiert
werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Pflanze
bei der Rückübersetzung zu verwenden.
Weiter bevorzugte Nukleinsäuren codieren eine tyrA aus Bakterien.
Eine besonders bevorzugte Nukleinsäure hat die Sequenz
SEQ ID NO. 1. Diese Nukleinsäure stellt eine prokaryontische
genomische DNA aus E. Coli K12 dar, die die tyrA der Sequenz
SEQ ID NO. 2 codiert.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Fein
chemikalien wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der
transgenen Organismen ein Ernten der Organismen und ein Iso
lieren der Feinchemikalien aus den Organismen angeschlossen.
Das Ernten der Organismen erfolgt in an sich bekannter Weise
dem jeweiligen Organismus entsprechend. Mikroorganismen, wie
Bakterien, Moose, Hefen und Pilze oder Pflanzenzellen, die durch
Fermentation in flüssigen Nährmedien kultiviert werden, können
beispielsweise durch Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtrieren
abgetrennt werden. Pflanzen werden in an sich bekannter Weise
auf Nährböden gezogen und entsprechend geerntet.
Die Isolierung der Feinchemikalien aus der geernteten Biomasse
erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch
Extraktion und gegebenenfalls weiterer chemische oder physika
lischer Reinigungsprozesse, wie beispielsweise Fällungsmethoden,
Kristallographie, thermische Trennverfahren, wie Rektifizier
verfahren oder physikalische Trennverfahren, wie beispielsweise
Chromatographie.
Die Isolierung von Vitamin E aus Ölhaltigen Pflanzen er
folgt beispielsweise bevorzugt durch chemische Umwandlung und
Destillation aus Pflanzenölen oder aus den bei der Desodorierung
pflanzlicher Öle anfallenden Wasserdampfdestillate (Dämpfer
kondensate).
Weitere Isolierverfahren von Vitamin E aus Dämpferkondensaten
sind beispielsweise in DE 31 26 110 A1, EP 171 009 A2,
GB 2 145 079, EP 333 472 A2 und WO 94/05650 beschrieben.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend
beschriebenen Nukleinsäuren, die eine tyrA oder Prephenatde
hydrogenase codieren oder die tyrA oder Prephenatdehydrogenase
selbst zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
Vorzugsweise weisen diese transgenen Pflanze gegenüber dem
Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Feinchemikalien, insbesondere
an Ubichinon, Vitamin E und/oder Vitamin K auf.
Es ist bekannt, daß Pflanzen mit einem hohen Vitamin-E-Gehalt
eine erhöhte Resistenz gegenüber ablotischem Streß aufweisen.
Unter abiotischem Streß wird beispielsweise Kälte, Frost,
Trockenheit, Hitze und Salz verstanden.
Daher betrifft die Erfindung weiterhin die Verwendung der vor
stehend erwähnten Nukleinsäuren zur Herstellung transgener
Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Resistenz
gegenüber abiotischem Streß aufweisen.
Die nachstehenden Erläuterungen beziehen sich auf die bevorzugte
Ausführungsform der Verwendung eines tyrA-Gens, sind aber nicht
auf tyrA beschränkt sondern analog auf alle erfindungsgemäß ver
wendbaren Nukleinsäuren übertragbar.
Die vorstehend beschriebenen tyrA-Proteine und tyrA-Gene können
zur Herstellung von Feinchemikalien in transgenen Organismen,
vorzugsweise zur Herstellung von Vitamin E, Vitamin K und/oder
Ubichinon in transgenen Pflanzen verwendet werden.
Die Herstellung der transgenen Organismen, insbesondere Pflanzen
erfolgt durch Transformation der Organismen, insbesondere
Pflanzen, mit einem das tyrA-Gen enthaltenden Nukleinsäure
konstrukt.
Vorzugsweise enthält dieses Nukleinsäurekonstrukt eine
Expressionskassette, die die Expression des tyrA-Gens in
dem Wirtsorganismus, insbesondere in Pflanzen gewährleistet.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Nukleinsäure
konstrukt, enthaltend eine, vorstehend beschriebene Nukleinsäure,
codierend für eine tyrA, die mit einem oder mehreren Regulations
signalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und
Translation im Wirtsorganismus, insbesondere in Pflanzen gewähr
leisten.
Zur Insertion in eine Expressionskassette geeignete kodierende
Sequenzen sind, wie vorstehend beschrieben, beispielsweise
solche, die für eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase
kodieren und die dem Wirtsorganismus die Fähigkeit zur Erhöhung
des Gehalts an Feinchemikalien, insbesondere von Vitamin E,
Vitamin K oder Ubichinon verleihen.
Die Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nuklein
säuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in
der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende
der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am
3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere
regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden
kodierenden Sequenz für das tyrA-Gen operativ verknüpft sind.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle
Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf.
weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen
Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden
Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäure
konstrukte, Expressionskassetten für Pflanzen und Verfahren zur
Herstellung von transgenen Pflanzen beschrieben.
Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf be
schränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung
der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in
Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER),
im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und
Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-
Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987),
8693-8711).
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in ein
Derivat des Transformationsvektors pBin-19 mit 35 s Promotor
(Bevan, M., Nucleic Acids Research 12: 8711-8721 (1984)) ein
gebaut werden. Abb. 2 zeigt ein Derivat des Transformations
vektors pBin-19 mit samenspezifischem Legumin B4-Promotor.
Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder
Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen
steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen
pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzen
virus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor
aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980),
285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche
Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer
Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des
eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989),
2195-2202).
Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren
Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen tyrA-
Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert
werden kann. Derartige Promotoren wie z. B. der PRP1-Promotor
(Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch
Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch
Benzenesulfonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetra
zyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404),
ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein
durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334)
Promotor können u. a. verwendet werden.
Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die
Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen
beispielsweise die Biosynthese der entsprechenden Feinchemika
lien, insbesondere Vitamin E bzw. dessen Vorstufen stattfindet.
Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische
Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cyto
solischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus
Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremd
protein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten
löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen
exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995),
1090-1094). Die Expressionskassette kann daher beispielsweise
einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin-
Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al., Mol.
Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467), LEB4-Promotor (Fiedler
und Conrad, 1995), Sucrose-Bindeprotein-Promotor (Zitat),
das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein
ER-Retentionssignal enthalten.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion
eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten tyrA-Nuklein
säure-Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und tyrA-
Nukleinsäure-Sequenz inserierten Nukleinsäure, die für ein
chloroplastenspezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem
Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und
Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis,
E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
(1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist,
Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.
and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den
Plastiden gewährleisten.
Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren
Nukleinsäure-Sequenz für ein tyrA-Fusionsprotein kodiert, wobei
ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die
Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die
Chloroplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translo
kation der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase in die Chloro
plasten vom tyrA-Teil enzymatisch abgespalten werden. Ins
besondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plasti
dären Nicotiana tabacum Transketolase oder einem anderen Transit
peptid (z. B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der
Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der
Isopentenylpyrophosphat Isomerase-2) oder dessen funktionellem
Äquivalent abgeleitet ist.
Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen von drei Kassetten des
Plastiden-Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Tabak
in drei Leserastern als KpnI/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon
in der NcoI Schnittstelle:
Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine Chorismat
mutase-Prephenatdehydrogenase kann synthetisch hergestellt oder
natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und
natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen
heterologen tyrA-Genabschnitten verschiedener Organismen
bestehen.
Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische
Nukleotid-Sequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt
werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons
mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den
meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei
der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene
DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu
erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest
und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die
Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente
Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-
Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Poly
linker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die
Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel
hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis
6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb
der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp,
häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor
kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog
zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der
5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die
für ein tyrA-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale
Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander
beliebig austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktions
schnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder
Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo
Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen
und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese,
"primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.
Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing
back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können
komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung
gestellt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Poly
adenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen
T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens,
insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des
Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984),
835 ff) oder funktionelle Äquivalente.
Zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, im folgenden
auch transgene Pflanze bezeichnet, wird die fusionierte
Expressionskassette, die für ein tyrA-Gen kodiert, vorzugsweise
in einen Vektor, beispielsweise pBin19, kloniert, der geeignet
ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Mit einem
solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in
bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere
von Kulturpflanzen verwendet werden, indem beispielsweise ver
wundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung
gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter
anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in
Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and
Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic
Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der
verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter
Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die
Expressionskassette integriertes Gen für die Expression eines
tyrA-Gens enthalten.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine
Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase kodierenden DNA wird
eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten
Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle
Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation
oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem
in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology"
(CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und
Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete
Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise
in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a.
pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet
sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agro
bakterien replizieren können.
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung der vorstehend be
schriebenen Nukleinsäure, codierend eine tyrA, der vorstehend be
schriebenen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere der Expressions
kassetten zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen oder
zur Transformation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzen
teilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des
Gehaltes der Pflanze oder Pflanzenteile an Feinchemikalien, ins
besondere des Gehalts an Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch
in den Blättern, in den Samen, Blütenblättern oder anderen Teilen
der Pflanze erfolgen.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird
als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen
Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen
Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten
transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme,
das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte
particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation
trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion
und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die
genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al.,
Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1,
Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und
R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu.
Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)
beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt
in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium
tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan
et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können
ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen,
insbesondere von Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter
Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte,
Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer,
Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs,
Baumwolle, Hanf, Brassicacaen wie beispielsweise Raps oder
Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Nuß- und Weinspezies oder Holz
gewächse wie beispielsweise Espe oder Eibe, verwendet werden,
z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agro
bakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien
kultiviert werden.
Die Expressionskassette kann über die Pflanzen hinaus auch
zur Transformation von Bakterien, insbesondere Cyanobakterien,
Moosen, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen mit dem Ziel einer
Erhöhung des Gehaltes an Feinchemikalien, insbesondere von
Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon eingesetzt werden.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren
zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen indem man
eine vorstehend beschriebene Nukleinsäure oder ein vorstehend
beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt in das Genom des Ausgangs
organismus einführt.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Transformation einer Pflanze dadurch gekennzeichnet, daß
man Expressionskassetten enthaltend eine tyrA-Sequenz in eine
Pflanzenzelle oder Protoplasten von Pflanzen einbringt und
diese zu ganzen Pflanzen regeneriert.
Die Erfindung betrifft auch die genetisch veränderte Organismen,
wobei die genetische Veränderung den Metabolitfluß des Shikimat
weges gegenüber dem Wildtyp verändert und der Organismus gegen
über dem Wildtyp einen veränderten Gehalt an Feinchemikalien auf
weist.
Wie vorstehend erwähnt, weisen bevorzugte Organismen einen
erhöhten Gehalt an Feinchemikalien, insbesondere einen erhöhten
Gehalt an Vitamin E, Vitamin K und Ubichinon gegenüber dem Wild
typ auf.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der genetisch ver
änderten Organismen verursacht die genetische Veränderung gegen
über dem Wildtyp die Genexpression einer Nukleinsäure, codierend
eine tyrA.
Als Organismen und zur Herstellung von Organismen mit einem
erhöhten Gehalt an Feinchemikalien im Vergleich zum Wildtyp
werden in einer bevorzugten Ausführungsform, wie vorstehend
erwähnt, photosynthetisch aktive Organismen wie beispielsweise
Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, besonders bevorzugt
Pflanzen als Ausgangsorganismen und dementsprechend auch als
genetisch veränderte Organismen verwendet. Solche transgenen
Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen,
-gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung.
Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen.
Bevorzugte Pflanzen sind, wie vorstehend erwähnt beispielsweise
Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja,
Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte, Kartoffel, Mais,
Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen,
Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf,
Brassicacaen wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe,
Zuckerrohr, Nuß- und Weinspezies oder Holzgewächse wie beispiels
weise Espe oder Eibe.
Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Tagetes erecta,
Brassica napus, Nicotiana tabacum, Canola, Kartoffeln sowie
weitere Ölsaaten, wie beispielsweise Soja.
Die genteisch veränderten Organismen, insbesondere Pflanzen
können, wie vorstehend beschrieben zur Herstellung von Fein
chemikalien, insbesondere zur Herstellung von Vitamin E,
Vitamin K und Ubichinon verwendet werden.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch
veränderte Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Feinchemikalien,
insbesondere mit einem erhöhten Gehalt an Vitamin-E, Ubichinon
und/oder Vitamin K können auch beispielsweise direkt oder nach
an sich bekannter Prozessierung als Nahrungsmittel oder Futter
mittel verwendet werden.
Erhöhung des Gehaltes an Feinchemikalien bedeutet im Rahmen der
vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer
erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen in der Pflanze
gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die
Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Im Falle der Erhöhung des Gehalts an Vitamin E kann sowohl der
Gehalt an Tocopherolen oder Tocotrienolen gesteigert werden. Vor
zugsweise wird der Gehalt an Tocopherolen gesteigert. Aber es ist
auch möglich unter bestimmten Bedingungen vorzugsweise den Gehalt
an Tocotrienolen zu steigern.
Der Biosyntheseort von Vitamin E beispielsweise ist in Pflanzen
unter anderem das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische
Expression des tyrA-Gens sinnvoll ist. Dies ist jedoch nicht
einschränkend, da die Expression auch in allen übrigen Teilen
der Pflanze - besonders in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch
erfolgen kann.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft deshalb eine
samenspezifische Expression des tyrA-Gens.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen tyrA-
Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare
Expression wünschenswert erscheinen.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten tyrA-
Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung
ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte
Expression des tyrA-Gens und deren Auswirkung auf die Tocopherol-
Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen
getestet werden.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert,
ist aber nicht auf diese beschränkt:
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem
Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch
MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).
Die DNA kodierend für das tyrA-Gen wurde mittels polymerase
chain reaction (PCR) aus E. coli K12 unter Verwendung eines sense
spezifischen Primers (tyrA5' SEQ ID NO. 3) und eines antisense
spezifischen Primers (tyrA3' SEQ ID NO. 4) amplifiziert.
Die PCR Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR erfolgte in einem 50 µl Reaktionsansatz in dem enthalten war:
Die PCR erfolgte in einem 50 µl Reaktionsansatz in dem enthalten war:
- - 2 µl einer E. coli K12 Zellsuspension
- - 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP
- - 1,5 mM Mg(OAc)2
- - 5 µg Rinderserum-Albumin
- - 40 pmol tyrA5'
- - 40 pmol tyrA3'
- - 15 µl 3,3 × rTth DNA Polymerase XLPuffer (PE Applied Biosystems)
- - 5 U rTth DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems)
Die PCR wurde unter folgenden Zyklus Bedingungen durchgeführt:
Schritt 1: 5 Minuten 94°C (Denaturierung)
Schritt 2: 3 Sekunden 94°C
Schritt 3: 1 Minute 55°C (Annealing)
Schritt 4: 2 Minuten 72°C (Elongation)
30 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4
Schritt 5: 10 Minuten 72°C (Post-Elongation)
Schritt 6: 4°C (Warteschleife)
Schritt 1: 5 Minuten 94°C (Denaturierung)
Schritt 2: 3 Sekunden 94°C
Schritt 3: 1 Minute 55°C (Annealing)
Schritt 4: 2 Minuten 72°C (Elongation)
30 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4
Schritt 5: 10 Minuten 72°C (Post-Elongation)
Schritt 6: 4°C (Warteschleife)
Das Amplikon wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den
PCR Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) kloniert. Die Identität
des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Ver
wendung des M13F (-40) Primers bestätigt.
Transgene Nicotiana tabacum und Arabidopsis thaliana Pflanzen
wurden erzeugt, die die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase
aus E. coli K12 unter Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotor des
CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., Cell 21: 285-294,
1980) exprimieren. Die Grundlage des zur konstitutiven Expression
der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 erzeug
ten Plasmides war der pBinAR-TkTp-10 (Ralf Badur, Dissertation
Universität Göttingen, 1998). Dieser Vektor ist ein Derivat des
pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sci. 66: 221-230, 1990) und
enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck
et al., 1980) das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens
(Gielen et al., EMBO J. 3 : 835-846, 1984) sowie die für das
Transitpeptid der Nicotiana tabacurn plastidären Transketolase
kodierenden DNA Sequenz. Die unter Berücksichtigung des korrekten
Leserasters erfolgte Klonierung der Chorismatmutase-Prephenat
dehydrogenase aus E. coli K12 in diesen Vektor, erzeugt eine
Translationsfusion der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase mit
dem plastidären Transitpeptid. Dadurch erfolgt ein Transport des
Transgens in die Plastiden.
Zur Erstellung dieses Plasmides wurde das tyrA-Gen unter Ver
wendung der flankierenden SmaI bzw. SalI Restriktionsschnitt
stellen aus dem Plasmid pGEM-T/tyrA isoliert. Dieses Fragment
wurde unter Anwendung von Standardmethoden in einen SmaI/SalI
geschnittenen pBinAR-TkTp-10 ligiert (siehe Abbildung. X) Dieses
Plasmid (pBinAR-TkTp-10/tyrA) wurde zur Erzeugung transgener
Nicotiana tabacum und A. thaliana Pflanzen verwendet.
Fragment A (529 bp) in Abb. 2 beinhaltet den 35S-Promotor
des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus),
Fragment B (245 bp) kodiert für das Transitpeptid der Nicotiana
tabacum Transketolase, Fragment C (1232 Bp) kodiert für das
tyrA-Gen aus E. coli K12, Fragment D (219 Bp) kodiert für das
Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.
Zur Herstellung von chimären DNA Konstrukten zur Erzeugung trans
gener Arabidopsos thaliana, Nicotiana tabacum bzw. Brassica napus
Pflanzen, die die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus
E. coli K12 unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors
exprimieren, wurde der Vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 verwendet.
Dieser Vektor ist ein Derivat des pGPTVkan (D. Becker, E. Kemper,
J. Schell, R. Masterson. Plant Molecular Biology 20: 1195-1197,
1992) dem das uidA Gen deletiert wurde. Stattdessen enthält der
Vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 den samenspezifischen Promotor des
Legumin B4 Gens (Kafatos et al., Nuc. Acid. Res., 14(6): 2707-2720,
1986), die Sequenz kodierend für das Transitpeptid der A. thaliana
plastiden-spezifischen Isopentenyl-pyrophosphat Isomerase-2
(IPP-2) (Badur, unveröffentlicht) und das Terminationssignal der
Nopalinsynthase aus A. tumefaciens (Depicker et al., J. Mol. Appl.
Genet. 1, 561-73, 1982).
Das DNA Fragment kodierend für das tyrA-Gen aus E. coli K12 wurde
als SmaI/SalI Fragment mit durch die T4-Polymerase aufgefüllten
stumpfen Enden in den Vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 (Abb. 3)
kloniert, wodurch eine Translationsfusion mit dem Transitpeptid
der IPP-2 erzeugt wurde. Somit konnte ein Import der Chorismat
mutase-Prephenatdehydrogenase in die Plastiden gewährleistet
werden. Dieses Plasmid (pPTVkanLeP-IPP-TP-9/TyrA) wurde zur
Erzeugung transgener Nicotiana tabacum, A. thaliana bzw. Brassica
napus Pflanzen verwendet.
Fragment A (2700 bp) in Abb. 3 beinhaltet den Promotor
des Legumin B4 Gens aus Vicia faba, Fragment B (206 bp) Fragment
kodierend für das Transitpeptid der A. thaliana Isopentenyl-pyro
phosphat-Isomerase-2. Fragment C (1234 Bp) kodiert für das tyrA-
Gen aus E. coli K12. Fragment D (272 Bp) für das Terminationssignal
des Nopalin-Synthase Gens.
Wildtyp Arabidopsis thaliana Pflanzen (Columbia) wurden mit dem
Agrabacterium tumefaciens Stamm (GV3101 [pMP90]) auf Grundlage
einer modifizierten Vakuuminfiltrationsmethode transformiert
(Steve Clough und Andrew Bent. Floral dip: a simplified method
for Agrobacterium mediated transformation of A. thaliana. Plant J
16(6):735-43, 1998; der Bechtold, N. Ellis, J. und Pelltier, G.,
in: Planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration
of adult Arabidopsis thaliana plants. CRAcad Sci Paris, 1993,
1144(2): 204-212). Die verwendeten Agrobacterium tumefaciens
Zellen waren im Vorfeld mit den Plasmiden pBinAR-TkTp-10/tyrA
bzw. pPTVkanLeP-IPP-TP-9/TyrA (Abb. 2 bzw. 3) transformiert
worden.
Samen der Primärtransformanden wurden auf Grundlage der
Antibiotikaresistenz selektioniert. Antibiotika resistente
Keimlinge wurden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte
Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.
Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientierte sich an
einem Protokoll von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer
to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab
Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die
Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.
Die Transformationen erfolgten mit dem Agrobacterium tumefaciens
Stamm GV3101 [pMP90]. Zur Transformation wurde das Plasmid
pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA verwendet (Abb. 3). Samen von
Brassica napus var. Westar wurden mit 70% Ethanol (v/v) ober
flächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in
1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für
20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils
20 Minuten gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filter
papier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml
Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca.
10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die ver
bleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die
so gewonnenen ca. 600 Explantate wurden 30 Minuten mit 50 ml
Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml Kolben überführt. Nach
Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium wurden die Kulturen für
24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.
Vom Agrobacterium Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in
Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in
50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis
zu einer OD600 von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der
Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml
Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der
Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD600
von 0,3 eingestellt.
Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit
sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobakterium-Lösung hinzu
gefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agro
bacterien-Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min
mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend
100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung
wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durch
geführt. Die Co-Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-
Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils
1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Wasch
medium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten
wurde in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen
Pipetten entfernt.
Zur Regeneration wurden jeweils 20 bis 30 Explante in 90 mm
Petrischalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit
Kanamycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen
Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden
von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage
wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen
mit Sproß-Induktionsmedium umgesetzt. Alle weiteren Schritte zur
Regeneration ganzer Pflanzen wurden wie von Bade, J. B und Damm,
B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg,
G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38)
beschrieben durchgeführt.
Zehn ml YEB-Medium mit Antibiotikum (5 g/l Rinder-Extrakt, 1 g/l
Hefe-Extrakt, 5 g/l Pepton, 5 g/l Saccharose und 2 mM MgSO4.)
wurden mit einer Kolonie von Agrobacterium tumefaciens beimpft
und über Nacht bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden 20 min bei
4°C, 3500 U/min in einer Tischzentrifuge pelletiert und danach in
frischem YEB-Medium ohne Antibiotika unter sterilen Bedingungen
resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für die Transformation
eingesetzt.
Die Wildtyp-Pflanzen aus Sterilkultur wurden durch vegetative
Replikation erhalten. Dazu wurde nur die Spitze der Pflanze
abgeschnitten und auf frisches 2MS-Medium in ein steriles Ein
weckglas überführt. Vom Rest der Pflanze wurden die Haare auf
der Blattoberseite und die Mittelrippen der Blätter entfernt.
Die Blätter wurden mit einer Rasierklinge in etwa 1cm2 große
Stücke geschnitten. Die Agrobakterienkultur wurde in eine kleine
Petrischale überführt (Durchmesser 2 cm). Die Blattstücke wurden
kurz durch diese Lösung gezogen und mit der Blattunterseite auf
2MS-Medium in Petrischalen (Durchmesser 9 cm) gelegt, so daß sie
das Medium berührten. Nach zwei Tagen im Dunkeln bei 25°C wurden
die Explantate auf Platten mit Kallusinduktionsmedium überführt
und in der Klimakammer auf 28°C temperiert. Das Medium mußte alle
7-10 Tage gewechselt werden. Sobald sich Kalli bildeten, wurden
die Explantate in sterile Einweckgläser auf Sproßinduktionsmedium
mit Claforan (0,6% BiTec-Agar (g/v), 2,0 mg/l Zeatinribose,
0,02 mg/l Naphtylessigsäure, 0,02 mg/l Gibberelinsäure, 0,25 g/ml
Claforan, 1,6% Glukose (g/v) und 50 mg/l Kanamycin) überführt.
Nach etwa einem Monat trat Organogenese ein und die gebildeten
Sprosse konnten abgeschnitten werden. Die Kultivierung der
Sprosse wurde auf 2MS-Medium mit Claforan und Selektionsmarker
durchgeführt. Sobald sich ein kräftiger Wurzelballen gebildet
hatte, konnten die Pflanzen in Pikiererde getopft werden.
Es wurden die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte in Blätter
und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten transformierten
Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Nicotiana
tabacum) analysiert. Dazu wurden die transgenen Pflanzen im
Gewächshaus kultiviert und Pflanzen die das Gen kodierend für die
Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 exprimieren
auf Northern- und Western Ebene analysiert. In Blättern und Samen
dieser Pflanzen wurde der Tocopherolgehalt und der Tocotrienol
gehalt mittels HPLC ermittelt. In allen Fällen war der Toco
pherol- und oder Tocotrienol-Gehalt in transgenen Pflanzen, die
zusätzlich ein tyrA-Gen exprimieren, im Vergleich zu nicht trans
formierten Pflanzen erhöht.
Tabelle 1A (junge Blätter) und 1B (seneszierende Blätter) zeigen
die Gehalte [µg/gFG] an α-Tocopherol, γ-Tocopherol, α-Tocotrienol
und Gesamt-Vitamin E in Blättern unterschiedlichen Alters in
Nicotiana tabacum, cv. SNN-Wildtyp (angegebene Werte MW +/-SD,
n = 9) und Pflanzen, die das Tyr A Gen aus E. coli über
exprimieren.
Claims (22)
1. Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien durch Kulti
vierung von Organismen die gegenüber dem Wildtyp einen
genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
den Shikimatweg des Organismus gegenüber dem Wildtyp durch
Einbringen mindestens eines Gens verändert, zu dem der Wild
typ kein orthologes Gen aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
durch das mindestens eine eingebrachte Gen den Stoffwechsel
weg des Shikimatweges des Wildtyps überbrückt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn
zeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsäure codierend eine
Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase oder eine Prephenat
dehydrogenase in eine Pflanze einbringt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Nukleinsäure einbringt die ein Protein kodiert, ent
haltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 oder eine von
dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion
von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie
von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz
SEQ ID NO. 2 und die enzymatische Eigenschaft einer
Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aufweist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Nukleinsäure bakterieller Herkunft verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Nukleinsäure verwendet, die die in SEQ ID NO. 1
dargestellten Sequenz enthält.
9. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis
8 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die
transgene Pflanze gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt
an Feinchemikalien aufweist.
11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
die transgene Pflanze gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte
Resistenz gegenüber abiotischem Streß aufweist.
12. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß
einem der Ansprüche 5 bis 8, die mit einem oder mehreren
Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die
Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten.
13. Genetisch veränderter Organismus, wobei die genetische Ver
änderung den Metabolitfluß des Shikimatweges gegenüber dem
Wildtyp verändert und der Organismus gegenüber dem Wildtyp
einen veränderten Gehalt an Feinchemikalien aufweist.
14. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 13, wobei die
genetische Veränderung die Genexpression einer Nukleinsäure
gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 gegenüber einem Wildtyp
verursacht.
15. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 13 oder 14,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze
verwendet.
16. Verwendung eines genetisch veränderten Organismus nach einem
der Ansprüche 13 bis 15 zur Herstellung von Feinchemikalien.
17. Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten
Organismen gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch
gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure gemäß einem der
Ansprüche 5 bis 8 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß
Anspruch 12 in das Genom des Ausgangsorganismus einführt.
18. Verwendung der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8
oder der Nukleinsäurekonstrukte gemäß Anspruch 12 zur
Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen.
19. Verwendung der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8
oder der Nukleinsäurekonstrukte gemäß Anspruch 12 zur Er
höhung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen.
20. Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 5 oder 6 oder der
Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Her
stellung von Feinchemikalien in transgenen Organismen.
21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei man als Feinchemikalie
Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon herstellt.
22. Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 5 oder 6 oder
der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 nach
Anspruch 20 zur Herstellung von Vitamin E, Vitamin K oder
Ubichinon in transgenen Pflanzen.
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