CZ20024144A3 - Způsob změny obsahu maloobjemových chemikálií v organismech s geneticky modifikovanou šikimátovou cestou - Google Patents
Způsob změny obsahu maloobjemových chemikálií v organismech s geneticky modifikovanou šikimátovou cestou Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20024144A3 CZ20024144A3 CZ20024144A CZ20024144A CZ20024144A3 CZ 20024144 A3 CZ20024144 A3 CZ 20024144A3 CZ 20024144 A CZ20024144 A CZ 20024144A CZ 20024144 A CZ20024144 A CZ 20024144A CZ 20024144 A3 CZ20024144 A3 CZ 20024144A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- chorismate mutase
- organism
- plant
- gene
- Prior art date
Links
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical class O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 63
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 53
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims abstract description 42
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 154
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 137
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 137
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 120
- 108010000898 Chorismate mutase Proteins 0.000 claims description 90
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 87
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 60
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N chorismic acid Chemical compound O[C@@H]1C=CC(C(O)=O)=C[C@H]1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N 0.000 claims description 55
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 46
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 28
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 claims description 28
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 claims description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 17
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 16
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 claims description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 14
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 13
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 11
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 11
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 11
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- 235000010382 gamma-tocopherol Nutrition 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002478 γ-tocopherol Substances 0.000 claims description 6
- QUEDXNHFTDJVIY-DQCZWYHMSA-N γ-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 QUEDXNHFTDJVIY-DQCZWYHMSA-N 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 claims description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 4
- IGMNYECMUMZDDF-UHFFFAOYSA-N homogentisic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC(O)=CC=C1O IGMNYECMUMZDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 4
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- JRKXPKXHZJQQAJ-UHFFFAOYSA-N 2-ethyl-6-methylbenzene-1,4-diol Chemical compound CCC1=CC(O)=CC(C)=C1O JRKXPKXHZJQQAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 claims 1
- 235000017471 coenzyme Q10 Nutrition 0.000 abstract description 10
- ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q10 Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 abstract description 9
- NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N reduced coenzyme Q9 Natural products COC1=C(O)C(C)=C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)C(O)=C1OC NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 229940035936 ubiquinone Drugs 0.000 abstract description 9
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 abstract description 6
- GZIFEOYASATJEH-VHFRWLAGSA-N δ-tocopherol Chemical compound OC1=CC(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 GZIFEOYASATJEH-VHFRWLAGSA-N 0.000 abstract description 3
- WIGIZIANZCJQQY-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-3-methyl-N-[2-[4-[[[(4-methylcyclohexyl)amino]-oxomethyl]sulfamoyl]phenyl]ethyl]-5-oxo-2H-pyrrole-1-carboxamide Chemical compound O=C1C(CC)=C(C)CN1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCC(C)CC2)C=C1 WIGIZIANZCJQQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 150
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 105
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 46
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 46
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 45
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 45
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 31
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 29
- 101150083154 tyrA gene Proteins 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 101710194862 Chorismate mutase 2 Proteins 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 17
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 16
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 16
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 16
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 16
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 16
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 15
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000011731 tocotrienol Substances 0.000 description 11
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 10
- 229930003802 tocotrienol Natural products 0.000 description 10
- 235000019148 tocotrienols Nutrition 0.000 description 10
- GJJVAFUKOBZPCB-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-(4,8,12-trimethyltrideca-3,7,11-trienyl)-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound OC1=CC=C2OC(CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)(C)CCC2=C1 GJJVAFUKOBZPCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 8
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 8
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 8
- 125000002640 tocopherol group Chemical group 0.000 description 8
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 8
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 8
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N D-erythrose 4-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- KXFJZKUFXHWWAJ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoylformic acid Natural products OC(=O)C(=O)C1=CC=C(O)C=C1 KXFJZKUFXHWWAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 235000019149 tocopherols Nutrition 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 6
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 6
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 6
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 6
- OINNEUNVOZHBOX-QIRCYJPOSA-K 2-trans,6-trans,10-trans-geranylgeranyl diphosphate(3-) Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O OINNEUNVOZHBOX-QIRCYJPOSA-K 0.000 description 5
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 5
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- OINNEUNVOZHBOX-XBQSVVNOSA-N Geranylgeranyl diphosphate Natural products [P@](=O)(OP(=O)(O)O)(OC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C)O OINNEUNVOZHBOX-XBQSVVNOSA-N 0.000 description 5
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 5
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 5
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 5
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 5
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 4
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 4
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 3
- MIEILDYWGANZNH-DSQUFTABSA-N L-arogenic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1(C(O)=O)C=CC(O)C=C1 MIEILDYWGANZNH-DSQUFTABSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 3
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- RZFHLOLGZPDCHJ-DLQZEEBKSA-N alpha-Tocotrienol Natural products Oc1c(C)c(C)c2O[C@@](CC/C=C(/CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)\C)(C)CCc2c1C RZFHLOLGZPDCHJ-DLQZEEBKSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- IPFXNYPSBSIFOB-UHFFFAOYSA-N isopentyl pyrophosphate Chemical compound CC(C)CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O IPFXNYPSBSIFOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 2
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- GVVPGTZRZFNKDS-YFHOEESVSA-N Geranyl diphosphate Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/COP(O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-YFHOEESVSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 101150000102 LEB4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710094902 Legumin Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 2
- ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N Menaquinone 1 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108010035004 Prephenate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229940064063 alpha tocotrienol Drugs 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L disodium;4-(4-chloro-2-methylphenoxy)butanoate;4-(2,4-dichlorophenoxy)butanoate Chemical compound [Na+].[Na+].CC1=CC(Cl)=CC=C1OCCCC([O-])=O.[O-]C(=O)CCCOC1=CC=C(Cl)C=C1Cl NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 150000004141 diterpene derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 2
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N geranyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229930015704 phenylpropanoid Natural products 0.000 description 2
- 125000001474 phenylpropanoid group Chemical group 0.000 description 2
- MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N phylloquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N 0.000 description 2
- 235000019175 phylloquinone Nutrition 0.000 description 2
- 239000011772 phylloquinone Substances 0.000 description 2
- 229960001898 phytomenadione Drugs 0.000 description 2
- CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N prenyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229940058287 salicylic acid derivative anticestodals Drugs 0.000 description 2
- 150000003872 salicylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- RODXRVNMMDRFIK-UHFFFAOYSA-N scopoletin Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C1C=C(OC)C(O)=C2 RODXRVNMMDRFIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001629 stilbenes Chemical class 0.000 description 2
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 150000003712 vitamin E derivatives Chemical class 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- JNELGWHKGNBSMD-UHFFFAOYSA-N xanthone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3OC2=C1 JNELGWHKGNBSMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZFHLOLGZPDCHJ-XZXLULOTSA-N α-Tocotrienol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)(C)CCC2=C1C RZFHLOLGZPDCHJ-XZXLULOTSA-N 0.000 description 2
- 235000019145 α-tocotrienol Nutrition 0.000 description 2
- 239000011730 α-tocotrienol Substances 0.000 description 2
- WGVKWNUPNGFDFJ-DQCZWYHMSA-N β-tocopherol Chemical compound OC1=CC(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C WGVKWNUPNGFDFJ-DQCZWYHMSA-N 0.000 description 2
- PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N (+)-catechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N 0.000 description 1
- GJJVAFUKOBZPCB-ZGRPYONQSA-N (r)-3,4-dihydro-2-methyl-2-(4,8,12-trimethyl-3,7,11-tridecatrienyl)-2h-1-benzopyran-6-ol Chemical class OC1=CC=C2OC(CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)(C)CCC2=C1 GJJVAFUKOBZPCB-ZGRPYONQSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 150000000191 1,4-naphthoquinones Chemical class 0.000 description 1
- SUFZKUBNOVDJRR-HAVVHWLPSA-N 2,3-dimethyl-6-phytylhydroquinone Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCC\C(C)=C\CC1=CC(O)=C(C)C(C)=C1O SUFZKUBNOVDJRR-HAVVHWLPSA-N 0.000 description 1
- GTWCNYRFOZKWTL-UHFFFAOYSA-N 2-Methyl-6-phytylhydroquinone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=CCC1=CC(O)=CC(C)=C1O GTWCNYRFOZKWTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFRQBZFETXBLTP-RCIYGOBDSA-N 2-[(2e,6e,10e,14e,18e)-3,7,11,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaen-1-yl]-3-methyl-1,4-dihydronaphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 PFRQBZFETXBLTP-RCIYGOBDSA-N 0.000 description 1
- OHMZYQILGPQFLA-PEAGZHFBSA-N 2-[(2e,8e)-2,3,9,13-tetramethyl-6-propan-2-ylidenetetradeca-2,8,12-trienyl]benzene-1,4-diol Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC(=C(C)C)CC\C(C)=C(/C)CC1=CC(O)=CC=C1O OHMZYQILGPQFLA-PEAGZHFBSA-N 0.000 description 1
- OTXNTMVVOOBZCV-UHFFFAOYSA-N 2R-gamma-tocotrienol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)(C)CCC2=C1 OTXNTMVVOOBZCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGIJRRREJXSQJR-UHFFFAOYSA-N 2h-thiazine Chemical compound N1SC=CC=C1 AGIJRRREJXSQJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710099475 3'-phosphoadenosine 5'-phosphate phosphatase Proteins 0.000 description 1
- AAALVYBICLMAMA-UHFFFAOYSA-N 4,5-dianilinophthalimide Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC=1C=C2C(=O)NC(=O)C2=CC=1NC1=CC=CC=C1 AAALVYBICLMAMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000209134 Arundinaria Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 101100315627 Caenorhabditis elegans tyr-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N Chalcone Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- GZIFEOYASATJEH-UHFFFAOYSA-N D-delta tocopherol Natural products OC1=CC(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 GZIFEOYASATJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 241000192091 Deinococcus radiodurans Species 0.000 description 1
- XEHFSYYAGCUKEN-UHFFFAOYSA-N Dihydroscopoletin Natural products C1CC(=O)OC2=C1C=C(OC)C(O)=C2 XEHFSYYAGCUKEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 1
- CITFYDYEWQIEPX-UHFFFAOYSA-N Flavanol Natural products O1C2=CC(OCC=C(C)C)=CC(O)=C2C(=O)C(O)C1C1=CC=C(O)C=C1 CITFYDYEWQIEPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710196411 Fructose-1,6-bisphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710186733 Fructose-1,6-bisphosphatase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101710109119 Fructose-1,6-bisphosphatase, cytosolic Proteins 0.000 description 1
- 101710198902 Fructose-1,6-bisphosphate aldolase/phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 101710153679 Isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100039618 Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase 2 Human genes 0.000 description 1
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical group CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000203353 Methanococcus Species 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101150101414 PRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000009164 Petroselinum crispum Species 0.000 description 1
- 235000002770 Petroselinum crispum Nutrition 0.000 description 1
- ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N Phe-Pro-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101100368710 Rattus norvegicus Tacstd2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- 101100342406 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRS1 gene Proteins 0.000 description 1
- MEGPURSNXMUDAE-UHFFFAOYSA-N Scopoline Natural products C1C(O2)CC3N(C)C1C2C3O MEGPURSNXMUDAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228160 Secale cereale x Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710198996 Sucrose-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 241000192593 Synechocystis sp. PCC 6803 Species 0.000 description 1
- 235000012308 Tagetes Nutrition 0.000 description 1
- 241000736851 Tagetes Species 0.000 description 1
- 235000012311 Tagetes erecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000000785 Tagetes erecta Species 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 206010047631 Vitamin E deficiency Diseases 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 229930014669 anthocyanidin Natural products 0.000 description 1
- 235000008758 anthocyanidins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940066595 beta tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 description 1
- 150000001789 chalcones Chemical class 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 1
- GZCJJOLJSBCUNR-UHFFFAOYSA-N chroman-6-ol Chemical class O1CCCC2=CC(O)=CC=C21 GZCJJOLJSBCUNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229940088530 claforan Drugs 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 1
- 235000010389 delta-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001877 deodorizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229930004069 diterpene Natural products 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 150000002206 flavan-3-ols Chemical class 0.000 description 1
- 235000011987 flavanols Nutrition 0.000 description 1
- 229930003949 flavanone Natural products 0.000 description 1
- 235000011981 flavanones Nutrition 0.000 description 1
- 150000002208 flavanones Chemical class 0.000 description 1
- NWKFECICNXDNOQ-UHFFFAOYSA-N flavylium Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=C(C=CC=C2)C2=[O+]1 NWKFECICNXDNOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTXNTMVVOOBZCV-YMCDKREISA-N gamma-Tocotrienol Natural products Oc1c(C)c(C)c2O[C@@](CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)(C)CCc2c1 OTXNTMVVOOBZCV-YMCDKREISA-N 0.000 description 1
- 125000002350 geranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229930013032 isoflavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000003817 isoflavonoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000012891 isoflavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- WBAVLTNIRYDCPM-UHFFFAOYSA-N isoscopolin Natural products COC1=CC=2OC(=O)C=CC=2C=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O WBAVLTNIRYDCPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930013686 lignan Natural products 0.000 description 1
- 150000005692 lignans Chemical class 0.000 description 1
- 235000009408 lignans Nutrition 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 125000000695 menaquinone group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229930003658 monoterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000002773 monoterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000002577 monoterpenes Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001189 phytyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@](C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@](C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000004059 quinone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- FWYIBGHGBOVPNL-UHFFFAOYSA-N scopoletin Natural products COC=1C=C2C=CC(OC2=C(C1)O)=O FWYIBGHGBOVPNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGTCGCCQZOUMJJ-YMILTQATSA-N scopolin Chemical compound COC1=CC=2C=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SGTCGCCQZOUMJJ-YMILTQATSA-N 0.000 description 1
- SGTCGCCQZOUMJJ-UHFFFAOYSA-N scopolin Natural products COC1=CC=2C=CC(=O)OC=2C=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O SGTCGCCQZOUMJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229930004725 sesquiterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000004354 sesquiterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N shikimate-3-phosphate Chemical compound O[C@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003036 tocotrienol group Chemical group 0.000 description 1
- 229940068778 tocotrienols Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 150000003669 ubiquinones Chemical class 0.000 description 1
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 150000007964 xanthones Chemical class 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 235000007680 β-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011590 β-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000019150 γ-tocotrienol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011722 γ-tocotrienol Substances 0.000 description 1
- OTXNTMVVOOBZCV-WAZJVIJMSA-N γ-tocotrienol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)(C)CCC2=C1 OTXNTMVVOOBZCV-WAZJVIJMSA-N 0.000 description 1
- 239000002446 δ-tocopherol Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Způsob změny obsahu maloobjemových chemikálii s geneticky modifikovanou šikimátovou cestou
Oblast techniky
Předložený vynález se týká způsobu výroby maloobjemových chemikálií, obzvláště vitamínu E, vitamínu K a/nebo ubichinonu pěstováním organismů, obzvláště rostlin, jejichž šikimátová cesta je geneticky modifikována oproti cestě divokého typu, a transgenních organismů samotných.
Dosavadní stav techniky
Organismy, obzvláště rostliny, vykazují řadu metabolitů, které jsou ekonomicky velmi významné jako maloobjemové chemikálie. Maloobjemové chemikálie, které lze například uvést jsou aromatické aminokyseliny, deriváty kyseliny salicylové, fenylpropanoidy, flavonoidy, stilbeny, xanthony a chinony, obzvláště smíšené prenylové lipidové sloučeniny s aktivitou vitamínu E nebo vitamínu K.
S využitím biotechnologických způsobů výroby maloobjemových chemikálií se pěstují organismy schopné tvorby těchto maloobjemových chemikálií, přičemž požadované maloobjemové chemikálie se z těchto organismů isolují.
U ekonomických způsobů biotechnologické produkce maloobjemových chemikálií, ale také pro použití organismů jako zpracovaných nebo nezpracovaných potravin nebo krmiv, je žádoucí modifikovat obsah maloobjemových chemikálií v organismu cíleným způsobem, jako je například zvýšení • · obsahu požadované maloobjemové chemikálie a/nebo inhibice přeměny metabolitu na nežádoucí maloobjemové chemikálie.
Příklady ekonomicky důležitých maloobjemových chemikálií jsou plastochinony, ubichinony a sloučeniny s aktivitou vitamínu E nebo vitamínu K, které mají isoprenosidní postranní řetězec napojený na aromatické jádro.
Přirozeně se vyskytujících osm sloučenin s aktivitou vitamínu E jsou deriváty 6-chromanolu (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, díl A 27 (1996) , VCH Verlaggesselschaft, kapitola 4, 478 až 488, Vitamin E). Tokoferolová skupina (la-d) vykazuje nasycený postranní řetězec, zatímco tokotrienolová skupina (2a-d.) vykazuje nenasycený postranní řetězec:
(1)
| la, | α-tokoferol: | R1 = | R2 | = R3 | = ch3 |
| lb, | β-tokoferol: | R1 = | R3 | = R2 | = H |
| lc, | γ-tokoferol: | R1 = | H, | R2 = | R3 = CH3 |
| ld, | δ-tokoferol: | R1 = | R2 | = H, | R3 = CH3 |
• · · · • · · ·
| 2a, | α-tokotrienol: | R1 == | R2 | = R3 | = ch3 |
| 2b, | β -1 o ko t rie n o 1: | R1 =- | R3 | = ch2 | , R2 = H |
| 2c, | γ-tokotrienol.: | R1 = | H, | R2 = | R3 = CH3 |
| 2 cl, | δ -1 o k o t r i e η o 1: | pý = | R2 | = H, | R3 = CH3 |
V předloženém vynálezu se rozumí, že vitamín E zahrnuje všechny výše uvedené tokoferoly a tokotrienoly s aktivitou vitamínu E.
Tyto sloučeniny s aktivitou vitamínu E jsou důležitými přírodními antioxidanty rozpustnými v tucích. Nedostatek vitamínu E vede k u lidí a zvířat patofyziologickým situacím,. Sloučeniny vitamínu E mají tedy velký ekonomický význam jako přísady v oblasti potravin a krmiv, ve farmaceutických prostředcích a v kosmetických aplikacích.
Přirozeně se vyskytující sloučeniny s aktivitou vitamínu E jsou deriváty 1,4-naftochinonu (Ullman's Encyclopedia, of Industrial Chemistry, díl A 27 (1996), VCH Veilaggesselschaft, kapitola 4, 488 až 456, Vitamin K). Fylochinon (předchozí název: vitamín Ki) má převážně nasycený postranní řetězec, zatímco skupina menachinonů (předchozí název; vitamin K2) má převážně nenasycený postranní řetězec se 4 až 13 isoprenylovými zbytky.
V předloženém vynálezu se rozumí, že vitamín K zahrnuje všechny sloučeniny s aktivitou vitaminu K, obzvláště výše uvedené sloučeniny.
výchozím bodem syntézy isoprenosidního postranního řetězce je isopentlypyrofosfát (IPP). IPP je v rovnováze se svým isomerem dimethylallylpyrofosfátem • · · · • · • · · · • · · • · • · · • · · · (DMA.PP) . Kondenzace IPP s DMAPP způsobem hlava k ocasu vede ke vzniku monoterpenu (Cio) geranylpyrofosfátu (GPP).
Přidání dalších jednotek IPP vede ke vzniku seskviterpenu (C15) f arnes v Ipyrof osf átu (FPP) a ke vzniku diterpenu (C20) geranylgernanyipyrofosfátu (GGPP).
Fyllochinon obsahuje C2o fytylový řetězec, ve kterém pouze orvní isoprenová jednotka obsahuje dvojnou vazbu. GGPP se převede na fytylpyrofosfát (PPP), což je výchozí materiál, pro další tvorbu tokoferolů pomocí geranylgeranyIpyrofosfát oxidoreduktázy (GGPPOR).
Kruhové struktury smíšených prenyllipidů, které vede ke tvorbě vitamínů E a K jsou chinony, jejichž výchozí metabolity tsou odvozeny od šikimátové cesty.
Chořísmát se tvoří z erythróza-4-fosfátu a rosfoerioipyzu vátu (PEP) kondenzací těchto sloučenin přes meziprodukty ·'-dehydrochinát, 3'-dehydrošikimát, šikimát, šikimát-3-fosfát a 5'-enolpyruvylšikimát-3-fosfát k získání 3-deoxy-D-ar:ab_r.ooeptulózonát-7-fosfát (DAPH) . Erythróza-3fosfát se tvoří v Calvinově cyklu, zatímco EPP se získá glykolýzou.
pres prereru se převede ~ d' rostlin se tyrosin tvoří z chorismátu a arogenát. Aromatická aminokyselina tyrosin nvdroxyfenylpyruvát, který se převede na kyselinu toncaert i.sovou dioxygenací , kyte’ na homogentisová se následně naváže na íyfylpyrofo-uír (PPP)nebo na geranylgeranylpyrofosfát (GGPP) k vytromí prekurzorů α-tokoferolu a a-tokotrienolu, yv:v -vité 2-methyl-6--fytylhydrochinonu respektive
2-methyl-6-geranylgeranylhydrochinonu. Methylační kroky pomocí S-adenosylmethioninu jako donoru methylové skupiny napřed vedou ke vzniku 2,3-dimethyl-6-fytylchinolu, následná cyklizace vede ke vzniku γ-tokoferolu a další methylace ke vzniku a-tokoferolu.
Je známo jak modifikovat obsah vitamínu E v rostlinách nadměrnou expresí nebo down-regulací biosynt.etických genů syntetické cesty tokoferolu, čímž se pro účely tohoto vynálezu rozumí biosyntetická cesta z hydroxylenclpyruvátu na tokoferol.
WO 9 0. 27285 popisuje modifikaci obsahu tokoferolu zvýšenou expresi nebo down-regulací enzymu p-hydroxyfenylpyruvátdÍoxyaenázy (HPPD).
WO 99/04622 a D. DellaPenna a kol., Science, 282,
0 95 až 2100 (0.9 98) popisují genové sekvence kódující γ-tukofercj.retlyitransferázu ze Synechocystis PCC6803 a Arafcidopsic fhaliana a jeho inkorporaci do transgenních rostlin s módíti kovaným obsahem vitamínu E.
Je the známo jak modifikovat obsah vitamínu E v rostlinácn nadměrnou expresí nebo down-regulací biosyntetické cesty iscprenoidního postranního řetězce.
WO- 99/23231 ukazuje, že exprese geranylgerary.lredukrl.cy vede ke zvýšené biosyntéze tokoferolu.
vío· 00 /08169 popisuje genové sekvence kódující 1deoxy-D-xyióoa.-ú-fosfétsyntázu a geranylgeranylpyrofosfátoxidoreduktáru e jejich inkorporaci do transgenních rostlin s modifíkovan/ho oosahem vitaminu E.
• · · ·
Zatímco všechny tyto způsoby vedou ke vzniku organismů, obzvláště rostlin, s modifikovaným obsahem maloobjemove chemikálie vitamínu E, hladina obsahu vitamínu E je stále často neuspokojivá pro způsoby výroby vitamínu. E izolací z transgenních organismů.
Podstata vy··-·· 1yy u
Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout další způsob výroby maloobjemových chemikálií pěstováním organismů nebo transgenních organismů, které jsou schopny tvorby maloob'! emových chemikálií, s optimalizovanými vlastnostmi, kreré nevykazují výše popsané nedostatky dosavadního stavu techniky.
Původci nalezli, že tohoto předmětu se dosáhne způsobem výrobo maloobjemových chemikálií, kde se pěstují organismy, jejichž šikimátová cesta je geneticky modifikována ooooti cestě divokého typu.
še kmetovou cestou se pro účely tohoto vynálezu rozumí, obzvláště pro vyšší rostliny, výše popsaná bíosyntetickz cesta vycházející z D-erythróza—4-fosfátu přes šikimát, chorismát, prefenát, arogenát, tyrosin až na a včetně 4-hydroxyfenylpyruvátu (G. Michal, Biochemical Pathways, Biochnmie-Atlas, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, (1999), str. 59 až 60, obr. 4.7-1 a kapitola i , :
Vjdvvisě se šikimátovou cestou pro účely tohoto vynálezu rozumí metabolická cesta vycházející z • 4 • · 4 · • · ···· • · · · · ·
Šikímátu na 4-hydroxyfenylpyruvát, obzvláště výhodně metabolické cesta z chorismátu na. 4-hydroxyfenylpyruvát, přičemž metabolícká cesta pro rostliny jde z chorismátu přes prefenát, arogenát a tyrosin.
Maloobjemovými chemikáliemi se rozumí metabolické produkty organismu, které jsou výsledkem šikimátové cesty.
V tomto kontextu začíná šikimátová cesta D-erythróza-4-fosřát.em a končí 4-hydroxyfenylpyruvátem, jak je popsáno výše. Pro tyto metabolity výchozí sloučenina D-erythróza-4-fosfát, konečný produkt 4-hydroxyfenylpyruvát a všechny výše uvedené meziprodukty šikimátové cesty představují výchozí sloučeniny, zde dále rovněž označované jako meziprodukty., které se biotransformují organismem na metabolity,
Výhodnými maloobjemovými chemikáliemi jsou aromatické aminokyseliny jako je například fenylalanin, tyrosin a tryptofan, deriváty kyseliny salicylové, fenyIpropanoidy, jako je například lignin, lignany nebo kumariny, obzvláště skopoletin nebo skopolin, flavonoidy, jako jsou napo. řad chalkony, flavanony, flavanoly, anthokyanidiny zeoo isoflavonoidy, stilbeny, deriváty xanthonu nebo chinonu, jako jsou například vitamín E, vitamín Κ, nbi ch.í nony, plastochinony nebo šikonin.
Obrnivšcě výhodnými maloobj emovými chemikáliemi jsou vitamin b vitamín K nebo ubichinon, obzvláště vitamín E„
V závzslosti na tom, zda genetická modifikace šikimátové cour.· vede ke zvýšení nebe· snížení přeměny metabolity zz zstý meziprodukt, který tvoří část • · • ·· · • · ···· • ·
• · šikimátové cesty, je obsah maloobjemové chemikálie, která je v organismu biosyntetizována ze svého meziproduktu, zvýšen nebo snížen. Genetickou modifikací šikimátové cesty se výhodně rozumí zvýšení nebo snížení přeměny metabolitu na meziprodukt šikimátové cesty.
Genetické modifikace šikimátové cesty, které vedou ke zvýšené přeměně metabolitu na meziprodukt a tedy odpovídající maloobjemové chemikálie jsou například následující opatření A, B nebo C:
A; Zvýšená akcivita alespoň jednoho enzymu šikimátové cesty divokého typu, například nadměrnou expresí genů šikimátové cesty, které kódují proteiny s enzymatickou aktivitou vypnutím negativních regulačních mechanismů metabolícké cesty, které vedou k meziproduktu, jako je například vypnutí zpětnovazebně inhibice nebo zavedení ortologní cb. genů, které nejsou v požadovaném organismu podřízeny regulaci..
B: Zavedeni do organismu alespoň jednoho genu, ke kterému v divokém. ’.ycn neexistuje žádný ortologní gen a který přemosťuje metabolickou cestu šikimátové cesty divokého t.ypu. Tento gen může například zapříčinit, v důsledku nové funkce genu, zvýšenou přeměnu na meziproďút·'· tam, kde můstek končí.
C: Inaktivace genů, které kódují enzymy, které soutěží s enzymy netabolické cesty vedoucí k požadovanému produkru.
• · · ·*
Genetické modifikace šikimátové cesty, které vedou ke snížené přeměně metabolitu na meziprodukt a tedy odpovídající maloobjemové chemikálie jsou například následující opatření D, E nebo F:
D: Nadměrné, exprese metabolického genu a tedy zvýšení aktivity odpovídajícího enzymu, která vede od tohoto meziproduktu;
E: Inaktivace genů, které kódují enzymy, které vedou
k. tomuto meziproduktu, například protismyslné technologie nebo kosuprese;
F: Exprese genu, ke kterému v divokém typu neexistuje žádný ortologní gen. Tento gen například může přemostit metabolickou cestu šikimátové cesty divokého uvpu a, v důsledku nové funkce genu, zapříčinit zvýšenou přeměnu na přemostěné meziprodukt y,
Ve výuodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu vede genetická modifikace šikimátové cesty v organismu ke zvýšené přeměně na požadovaný meziprodukt a tedy ke zvýšeni odpovídající maloobjemové chemikálie.
Je výhodné zvýšit přeměnu metabolitů na požadovaný meziorodukt šikimátové cesty a tedy na požadovanou ma iooojemovou chemikálii alespoň jedním opatřením zvoleným ze skupiny opatření A a B, tj. opatřením A a/nebo B, přičemž opatření A a B mají výše uvedené významy, • · · * » Φ 4 '
Φ» ·« •ί ··♦· • φ φφφ φφφ f φ ·
Výhodné ztělesnění způsobů podle tohoto vynálezu tedy zahrnuje provedení alespoň jednoho opatření zvoleného ze skupiny opatření A a B pro genetickou modifikaci šikimátové cesty, přičemž A a 3 mají následující významy:
A: Zvýšená aktivita alespoň jednoho enzymu šikimátové cesty divokého typu;
B: Zavedení do organismu alespoň jednoho genu, ke kterému v divokém typu neexistuje žádný ortologní gen a který přemosťuje metabolickou cestu šikimátové cesty divokého typu.
Zvýšení aktivity alespoň jednoho enzymu šikimátové cesty divokého typu podle opatření A se může provést, například nadměrnou expresí nukleových kyselin, tj . genů šikimátové cesty, které kódují proteiny s touto enzymatickou aktivitou, vypnutím negativních regulačních mechanismů metabolické cesty vedoucí k meziproduktu, jako je například vypnutí zpětnovazebně inhibice nebo zavedení ortologních genů, které nejsou v požadovaném organismu podřízeny regulaci.
Výhodně se aktivita alespoň jednoho enzymu šikimátové cesty divokého typu zvýší podle opatření A nadměrnou expresí nukleových kyselin šikimátové cesty, které kódují proteiny s touto enzymatickou aktivitou.
Ve výhodném ztělesnění způsobu se opatření A provede zavedením do organismu nukleové kyseliny kódující c h or ísmá tmut ázu.
• « • · · ·
Chorismátmutázou se rozumí protein, který má enzymatickou aktivitu konvertující chorismát na prefenát.
• ··· “11
V principu mohou být použity při způsobu podle tohoto vynálezu všechny chorismátmutázy, jako je například chorismátmutáza z Petroselinum crispum (přístupové číslo: T14902, T14901). chorismátmutáza ze Streptomyces ceolicolor (T36865) , choří srriátmutáza z Bacillus subtilis (A33894), chorismátmutáza z Aspergilus niduans (AAD30065) nebo chorismátmutázy z Arabidopsis thaliana popsané zde dále nebo chorismátmutázová aktivita chorismátrnutáza-prefenátdehydrogenázy (tyrA) z E. coli popsaná zde dále.
Ve výhodném ztělesnění se použijí geny chorismátmutázy,, které kódují chorismátmutázu, jejíž aktivita je v organismu podřízena snížené posttranslační regulaci. Sníženou regulací se rozumí ne více než 99% regulace aktivity, výhodně ne více než 70%, zvláště výhodně 50%, obzvláště výhodně 0%, tj. žádná regulace aktivity, ve srovnání s regulací divokého typu.
Geny chorismátmutázy, které kódují chorismátmutázu, jejíž aktivita je v organismu podřízena snížené, obzvláště žádné, regulaci jsou například geny chorismátmutázy z různých druhů nebo geny chorismátmutázy ze stejného organismu nebo organismů příbuzného druhu, které jsou v organismu podřízena snížené, obzvláště žádné, posttranslační regulaci v místě exprese.
Organismy se podle tohoto vynálezu rozumí prokaryotické organismy nebo eukaryotické organismy, jako jsou naprírlad baktérie, kvasinky, řasy, mechy, houby nebo rostliny, Které jsou schopny, jako divoký typ nebo pomocí • · • · · · • · • «
genetické modifikace, tvorby výše uvedených maloobjemových chemikálií. Výhodnými organismy jsou fotosynteticky aktivní organismy jako jsou například cyanobaktérie, mechy, řasy nebo rostliny, které jsou již schopny v divokém typu tvorby výše uvedených maloobjemových chemikálií.
Obzvláště výhodnými organismy jsou rostliny.
V dalším výhodném ztělesnění opatření A způsobu podle tohoz.o vynálezu se geny chorismátmutázy, které, kódují chorismátmutázu, jejíž aktivita je v rostlinách podřízena snížené posttranslační regulaci, zavedou do rostlin.
Jsou jimi například některé geny bakteriální chorismátmutázy nebo geny chorismátmutázy z nich odvozené, tj. nukleové kyseliny, které kódují protein obsahující aminokyselinovou sekvenci bakteriální chorismátmutázy, jejíž aktivita je v rostlinách podřízena snížené posttranslační .-egulaci, například nukleových kyselin zde dále. popsaných kódujících chorismátmutázovou aktivitu chorismátmutáza--prefenátdehydrogenázy (tyrA) z E. coli nebo sekvence odvozené od této sekvence substitucí, inzercí nebo deleci aminokyselin, která má alespoň 30% homologii, výhodně alespoň 50% homologii, výhodněji alespoň 70% homologii, obzvláště výhodně alespoň 90% homologii na úrovní aminokyselin se sekvenci bakteriální chorismátmutázy a která má enzvnatické vlastnosti chorismátmutázy.
Pojmem „substituce se rozumí, v popisu, záměna jedné nebo vzce aminokyselin jednou nebo více aminokyselin,zrní Je výhodné provádět tzv. konzervativní záměny, při jevených má nahrazující aminokyselina podobné • · • · · ·
vlastnosti jako aminokyselina původní, například záměna Asp za Glu, Asn za Gin, Ile za Val, Ile za Leu a Thr za Ser.
Delece je nahrazení aminokyseliny přímou vazbou. Výhodné polohy pro deleci jsou na konci polypeptidu a na spojích mezi jednotlivými doménami proteinu.
Inzerce jsou zavedením aminokyselin do polypeptidového řetězce, kde je přímá vazba formálně nahrazena jednou nebo více aminokyselinami.
Homologii mezi dvěma proteiny se výhodně rozumí shoda aminokyselin po celé délce proteinu, která se výhodně vypočítá porovnámím za pomoci programového algoritmu GAP (UWCGC, University of Wisconsin, Genetic Computer Group), přičemž se nastaví následující parametry:
Váha GAP: 12
Váha délky: 4
Průměrná shoda; 2,912
Pr ůměrná nes hoda: -2,003
Proteinem, který má alespoň 30% homologii na úrovni aminokyselin se sekvencí výše popsané chorismátmutázy E. eoii,, se tudíž rozumí protein, který po porovnání jeho sekvence se sekvencí výše popsané chorismátmutázy, výhodně za použití, výše uvedeného programového algoritmu s výše uvedeno;; sestavou parametrů, má alespoň 30% homologii .
Gery bakteriální chorismátmutázy nebo geny chorismátmutázy z nich odvozené mohou kódovat proteiny, které mají vlastnosti chorismátmutázy a vlastnosti dalšího • ·
enzymu jako je například gen chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy (ryrA) z E. coli K12, který je zde dále popsán. Jak je zde dále popsáno, toto ztělesnění je obzvláště výhodné při provádění opatření A a B v kombinaci.
V obzvláště výhodném ztělesnění opatření A způsobu podle tohoto vynálezu, obzvláště při provádění opatření A sainouného, se geny chorismátmutázy zavedou na specifická místa v organismu, na nichž jsou odpovídající chorismátmutázy podřízeny snížené posttranslační regulaci.
V tomto kontextu je výhodné použít nukleové kyseliny kódující chorismátmutázu ze stejného organismu nebo z organismů příbuzného druhu, které jsou v místě exprese podři zeny snížené posttranslační regulaci.
Isoformy chorismátmutáz isolovaných z různých korapartmentů organismu se liší s ohledem na svou regulaci.
Odpovídající geny chorismátmutázy ze specifického korapartmentů organismu nebo z organismů příbuzného druhu se mohou zavést do jiných kompartmentů organismu, které kódují chorismátmutázy, které nejsou podřízeny posttranslační regulací.
v obzsláště výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu v rostlinách, se do plastidů rostlin k provedeni opioření A zavede nukleová kyselina kódující c h o r i smá t mu t á z u
Nukleovými kyselinami, které jsou vhodné k tomuto účelu, jsou v principu všechny nukleové kyseliny, které kódují rostlinnou cytosolovou chorismátmutázu, výhodně • · · · • · • · · ·
nukleové kyseliny, které kóduji cytosolovou chorismátmutázu Arabidopsis thaliana (Seq. ID No. 3) a přirozené nebo nepřirozené nukleové kyseliny z nich odvozené.
Bylo nalezeno, že v různých organismech existuje chorismátmutáza v různých isoformách. Z Arabidopsis thaliana byly isolovány 3 různé chorismátmutázy (Eberhard a kol., FE3S, 33_4,. 233 až 236 (1993), Eberhard a kol., Plant J., ±0, 815 až 821 (1996), Mobley a kol., Gene 15, 240(1), 115 až 123 (1999)).
Tyto isoformy se navzájem liší pokud jde o jejich umístění a jejich enzymatické vlastnosti. Chorismátmutáza-1 je tedy lokalizována v plastidech a je regulována allosterickv aromatickými aminokyselinami.
Cytcsclický enzym chorismátmutáza-·2 není podřízena žádné známé regulaci (Benešova, Μ., Bode, R., Phytochemistry, 31, 2983 až 2987 (1932)).
Nuklenvými kyselinami, které kódují cytosolovou chorismátmutáza Arabidospis thaliana a přirozené nebo nepřirozené nuk Leové kyseliny z nich odvozené, se rozumí nukleové kyseliny, které kóduji protein obsahující aminokyselinovou sekvenci cytosolové chořismátrnutázy (SEQ ID No. 4) nebo sekvenci z této sekvence odvozenou substitucí, inzercí nebo deleci aminokyselin, která má alespoň 30% homologii, výhodně alespoň 50% homologii, výhodněji alespoň 70% homologii, obzvláště výhodně alespoň 90% homologii na úrovní aminokyselin se sekvencí SEQ ID No. 4 a která má enzymatické vlastnosti chorismátmutázy.
·♦ ··· · *· · ·’ · · :. : · : :. :
·..* :i6 ........
Proteinem, který má alespoň 30% homologii na úrovni aminokyselin se sekvenci SEQ ID No. 4, se tudíž rozumí protein., který po porovnání jeho sekvence se sekvencí SEQ ID No. 4, výhodně za použití výše uvedeného programového algoritmu s výše uvedenou sestavou parametrů, má alespoň 30% homologii.
V dalším, výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu se do plastidů rostlin zavede nukleová kyselina kódující cytosoíovou chorismátmutázu Arabidopsis thaliana (SEQ ID No. 4).
Vhodné sekvence nukleových kyselin se mohou získat například zpětným překladem polypeptidové sekvence podle genetického kódu.
Kodóny,, které se k tomuto účelu výhodně použijí jsou kodóny často používané v souladu, s použitím kodónu specifického pro rostliny. Použití kodónu může být snadno určeno s odkazem na počítačová vyhodnocení jiných známých genů příslušné rostliny.
V dalším zvláště výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu se do plastidů rostlin zavede nukleová kyselina SEQ ID No. 3.. SEQ ID No. 3 představuje gen cytosolové chořismátrnutázy (chorismát-mutáza-2)
A r a b i d o p s i s t h a i i a n a.
Zavedení} do plastidů rostlin, nukleových kyselin kódujících chorismátmutázu se může dosáhnout například podle popisu uvedeného v detailu zde dále pro chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu zavedením, do rostlin, expresních kazet, jejichž sekvence nukleové kyseliny kóduje •17 chorismátmutázový fúzní protein, přičemž část tohoto fúzního proteinu je adresový peptid, který řídí translokaci polypeptidu. Výhodné jsou adresové peptidy specifické pro chloroplasty, které jsou enzymaticky odštěpeny z chorismátmutázové části po translokaci cytosolové chorismátmutázy do chloroplastů.
V dalším, zvláště výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu se do rostliny zavede konstrukt nukleové kyseliny zahrnující nukleovou kyselinu kódující plastidový adresový peptid a nukleovou kyselinu, která kóduje protein obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 4 nebo sekvenci z této sekvence odvozenou substitucí, inzercí nebo delecí aminokyselin, která má alespoň 30% homoiogii na úrovni aminokyselin se sekvencí SEQ ID No. 2 a která má enzymatické vlastnosti chorismátmutázy.
adresové pep plastidového transketoláz KpnI/BamHI s kleovými kyselinami kódujícími plastidové tidv jsou například DNA sekvence tří kazet adresového peptidu tabákové plastidové y ve třech čtecích rámcích jako fragmenty kodónem ATG v místě štěpení Ncol:
pTP09
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC
CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA
ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG
TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGA
TCC_BamHI • 4 ····
ρΤΡΙΟ
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC
CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA
ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG
TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG
GATCC_BamHI pTPll
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGG ATCC_BamHI, nebo nukleové kyseliny kódující plastidový adresový peptid pxastidové cnorxsmátinutazy-1 (SEQ ID No. 7) z Arabidopsis thaliana:
KpnI_GGCGTCATTGTTGATGAGATCGTCTTGTTGCTCCTCTGCGATTGGTGGGTTCTTCGACCA
TCGACGTGAATTATCAACCTCAACACCCATTTCCACTCTTCTTCCTCTTCCATCAACCAAATCT
TCTTTCTCTGTTCGTTGTTCTCTTCCTCAGCCATCAAAGCCACGCTCTGGAACCAGCTCTGTTCA
CGCCGTTATGACACTCG_NCol
Nukleová kyselina kódující plastidový adresový peptid plastidcvé chorismátmutázy-1 (SEQ ID No. 7) z Arabidopsis thaliana se výhodně použije pro lokalizaci cytosolové chorismátmutázy v plastidech.
V dalším zvláště výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu se tedy do rostliny zavede konstrukt χ ····
0 0 0··
000.
·*19· nukleové kyseliny zahrnující nukleovou kyselinu kódující plastidový adresový peptid chorismátmutázy-1 z Arabidopsis thaliana a nukleové kyseliny, která kóduje protein obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 4 nebo sekvenci z této sekvence odvozenou substitucí, inzercí nebo delecí aminokyselin, která má alespoň 30% homologii na úrovni aminokyselin se sekvencí SEQ ID No. 4a která má e n zyma t i c ké v1a s t no st i ch ori smátrnut á z y.
,Je obzvláště výhodné z hlediska opatření A způsobu podle tohoto vynálezu zavést do rostlin konstrukt nukleové kyseliny obsahující sekvenci SEQ ID No. 5.
SEý) ID No. 5 tvoří konstrukt nukleové kyseliny z nukleové kyseliny kódující plastidový adresový peptid chorismátmutázy-1 z Arabidopsis thaliana a nukleové kyseliny kódující cytosolovou chořísmátmut.ázu-2 z Arabidopsis thaliana.
Předložený vynález se týká obzvláště těchto konstruktů nukleových kyselin a jejich použití při opatření A způsobu podle tohoto vynálezu.
Obr. 3 příkladmo ukazuje biosyntetické schéma vycházející, z erythróza-4-fosfátu vedoucí k vitamínu E.
V důsledku další exprese genu chorismátmutázy je šikimátová cesta divokého typu geneticky modifikována a metabolická přeměna na hydroxyfenylpyruvát je zvýšena. Hydroxyfenylpyruvát, jehož jsou nyní dostupná větší množství, reaguje dále na tokoferoly. Zvýšený obsah hydroxyfenylpyruvátu vede ke zvýšené přeměně na vitamín E a/nebo vitamín K. Zvýšený obsah hydroxyfenylpyruvátu pravděpodobně vede ke zvýšenému obsahu vitaminu 2.
··♦·
Μ ·*·* ·· ·«··
··
Expresní kazeta se vytvoří podle detailního popisu uvedeného zde dále fúzí vhodného promotoru s vhodnou sekvencí nukleové kyseliny pro chorismátmutázu a nukleové kyseliny výhodně vložené mezi promotor a sekvenci nukleové kyseliny pro chorismátmutázu, která kóduje plastidový adresový peptid;. t j . výhodně fúzí vhodného promotoru s vhodným výše popsaným konstruktem nukleové kyseliny a s polyadenylačním signálem za použití obvyklých rekombinančn.í.ch a klonovacích techniky, jak jsou popsány například v T. Maniatis, E. F. Fritsch a J Sambrook, Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) a T. J. Šilhavý, M. L, Berman a L. W. Enquist, Experimente with Gene Fusíons, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) a Ausubel, F. M. a kol., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. And Willey Interscience (1987).
Opatření B pro modifikaci šikimátové cesty divokého typu se provádí podle popisu uvedeného zde výše pro zavádění do organismu alespoň jednoho genu, ke kterému v divokém typu neexistuje žádný ortologní gen a který přemosťuje metabolickou cestu šikimátové cesty divokého typu. Tento gen kóduje enzym, který v důsledku nové enzymatické aktzvity přináší zvýšenou přeměnu na meziprodukt tam, kde můstek končí. Tato nová enzymatická aktivita není výhodně v organismu podřízena žádné regulaci, tj. zkracuje metabolickou cestu k obejití například omezujících regulačních míst v metabolismu. To umožňuje oddělit metabolickou přeměnu na omezující látky od existuj ících regulací.
• · · · « ·
• · · · • · · · • « · · · • « · · · *
V · * ·
Genem, který je ortologní k divokému typu, se rozumí gen, který je odvozen z jiného organismu, přičemž enzymatická aktivita, kterou gen kóduje, je již v organismu divokého typu přítomna.
Tudíž pojmem „gen, pro který neexistuje žádný ortologní gen v divokém typu, se rozumí gen z jiného organismu, přičemž enzymatická aktivita, kterou gen kóduje, není v organismu divokého typu před transformací přítomna nebo nebyla aktivována.
Genem, který je ortologní k divokému typu, se výhodně rozumí funkční ekvivalent z jiného organismu, přičemž funkčním ekvivalentem se rozumí celkové vlastnosti produktu genu (protein).
Tudíž pojmem „gen, pro který neexistuje žádný ortologní gen v divokém typu, se rozumí gen pro který v divokém typu neexistuje žádný funkční ekvivalent podle výše uvedené definice, čímž tedy ustavuje metabolické vlastnosti, které generují alternativní metabolickou cestu k vytvoření produktu v rostlině již přítomného (obsažený metabolit),
Organismy se podle tohoto vynálezu jak je zde popsáno pro opatření A, rozumí prokaryotické organismy nebo eukaryotické organismy, jako jsou například baktérie, kvasinky, řasý, mechy, houby nebo rostliny, které jsou schopny, jako divoký typ nebo v důsledku genetické modifikace, tvorby výše uvedených máloobjemových chemikálií. Výhodnými organismy jsou fotosynteticky aktivní organismy jako jsou například cýanobaktérie, mechy, řasy ···· ·· ···· • · · t * • · · · * « · · · • · · * · ·*· · 2 •..22: ........
nebo rostliny, které jsou již schopny v divokém typu tvorby výše uvedených maloobjemových chemikálií.
Obzvláště výhodnými organismy jsou rostliny.
V obzvláště výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu se tedy použijí rostliny jako organismy k transformaci. V tomto případě jsou geny, pro které v rostlině neexistuje žádný ortologní gen, jež jsou výhodně vhodné pro provádění opatření B, bakteriální geny.
V obzvláště výhodném ztělesnění opatřeni B způsobu podle tohoto vynálezu se do rostliny zavede nukleová kyselina kódující prefenátdehydrogenázu.
Prefenátdehydrogenázou se rozumí enzym, který má Enzymatickou aktivitu konvergující prefenát na 4-hydroxyfenylpyruvát
Příklady nukleových kyselin, které kódují prefenátdehydrogenázu a které mohou být použity při způsobu podle tohoto vynálezu jsou geny prefenátdehydrogenázy z Lactococcus lactis (přístupové číslo X78413),
Synechocystis spec. PCC 6803 (slr2081), Deinococcus radiodurans (AAF10695) nebo Bacillus subtilis (P20692), z nichž všechny jsou známy a přístupné např. v internetových databázích. Další příklady mohou být nalezeny homologickými přiřazeními sekvencí k těmto známým genům prefenátdehydrogenázy, jako jsou například potenciální geny z Termotoga maítima (AAD35430) nebo Relicobacter pylori 26695 (přístupové číslo AAD8422).
• · · · • · • ·
Ve výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu využívajícího gen prefenátdehydrogenázy se zavede nukleová kyselina, která kóduje protein obsahující aminokyselinovou sekvenci prefenátdehydrogenázy
Synechocystis spec. PCC 6803 nebo sekvenci odvozenou od této sekvence substitucí, inzercí nebo delecí aminokyselin, která má alespoň 30% homologii, výhodně alespoň 50% homologii, výhodněji alespoň 70% homologii, obzvláště výhodně alespoň 90% homologii na úrovni aminokyselin se sekvencí prefenátdehydrogenázy Synechocystis spec. PCC 6803 a která má enzymatické vlastnosti prefenátdehydrogenázy.
Proteinem, který má alespoň 30% homologii na úrovni aminokyselin se sekvenci výše popsané prefenátdehydrogenázy Synechocystis spec. PCC 6803, se tudíž rozumí protein, krerý po přiřazení jeho sekvence k sekvenci výše popsané prefenátdehydrogenázy Synechocystis spec. PCC 6803, výhodně za použiti výše uvedeného programového algoritmu s výše uvedenou sestavou parametrů, má alespoň 30% homologii.
Obr. 1 příkladmo ukazuje biosyntetické schéma vycházející z erythróza-4-fosfátu vedoucí k tokoferolům.
V důsledku další exprese genu prefenátdehydrogenázy je šikimátová cesta divokého typu geneticky modifikována a metabolická přeměna na hydroxyfenylpyruvát je zvýšena. Hydroxyfenylpyruvát, jehož jsou nyní dostupná větší množství, reaguje dále na tokoferoly. Zvýšený obsah hydroxyfenylpyruvátu vede ke zvýšené přeměně na vitamín E a/nebo vitamín K. Zvýšený obsah hydroxyfenylpyruvátu pravděpodobně vede ke zvýšenému obsahu vitamínu E.
• ·· · • · • · · · • · • · · ·
Je však výhodné, pokud příhodné v kombinaci s přemostěním metabolické cesty podle tohoto vynálezu k nadměrné expresi dalších enzwů šikimátové cesty k dosažení metabolické přeměny na požadované maloobjemové chemikálie.
V dalším výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu se tedy opatření A a B provádějí v kombinaci.
Ve zvláště výhodném ztělesnění varianty způsobu podle tohoto vynálezu se do rostliny zavede nukleová kyselina kódující prefenátdehydrogenázu v kombinaci s nukleovou kyselinou k'dující chorismátmutázu.
Například se tato kombinace může provádět zavedením dvou nukleových kyselin, přičemž každá z nich kóduje enzym s aktivitou chorismátmutázy a enzym s aktivitou prefenátdehydrogenázy. P.ro toto ztělesnění je nezbytné zavést do rostliny dvě rozdílné nukleové kyseliny, přičemž každá z nich kóduje jeden z těchto enzymů.
V obzvláště výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu se tato kombinace provede v jedné nukleové kyselině, zavedením do rostliny nukleové kyseliny kódující c h o r i s má tmu t. á z a ~ prefenátdehydrogenázu.
Gen chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy kóduj e protein, který má enzymatické aktivity jak chorismátmutázy, tak prefenátdehydrogenázy. Zavedení nukleové kyseliny tedy vede k nadměrné expresi enzymatické aktivity nebo zavede enzymatickou aktivitu, která je podřízena snížené posttranslační regulaci (chorismátmutáza) a nově se zavádí enzymatická aktrvita (prefenátdehydrogenáza).
• · • · · · • · • · · · •25 «
Chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázou se rozumí enzym, který má enzymatickou aktivitu konverze chorismátu na 4-hydroxyfenylpyruvát.
V dalším, obzvláště výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu využívajícího gen prefenátdehydrogenázy se zavede nukleová kyselina, která kóduje protein obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2 nebo sekvenci odvozenou od této sekvence substitucí, inzercí nebo delecí aminokyselin, která má alespoň 30% homologii, výhodně alespoň 50% homologii, výhodněji alespoň 70% homologii, obzvláště výhodně alespoň 90% homologii na úrovni aminokyselin se sekvencí SEQ ID No. 2a která má enzymatické vlastnosti chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy.
Protein s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 tvoří chořísmátmutáza-prefenátdehydrogenázu (tyrA) z E. coli K12,
Proteinem, který má alespoň 30% homologii na úrovni aminokyselin se sekvenci SEQ ID No. 2, se tudíž rozumí protein, který po přiřazení jeho sekvence k sekvenci SEQ ID No. 2, výhodně za použití výše uvedeného programového algoritmu s výše uvedenou sestavou parametrů, má alespoň 30% homologii.
Všechny nukleové kyseliny uvedené v popisu mohou být například sekvence RNA, DNA nebo cDNA.
• · · « • · · ·
Vhodné sekvence nukleových kyselin se mohou získat podle výše uvedeného popisu zpětným překladem polypeptidové sekvence podle genetického kódu.
Kodóny, které se k tomuto účelu výhodně použijí jsou kodóny často používané v souladu s použitím kodónu specifického pro organismus. Použití kodónu může být snadno určeno s odkazem na počítačová vyhodnocení jiných známých genů příslušného organismu.
Pokud se má například protein exprimovat v rostlině, je často výhodné použít pro zpětný překlad rostlinný kodón.
Dalšími výhodnými chorismátmutázami-prefenátdehydrogenázami nebo jejich kódujícími sekvencemi jsou obzvláště nukleové kyseliny bakteriálního původu, jako jsou například geny chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy z Erwinia herbícola (přístupové číslo X60420, tento protein se také může převést na monofunkční prefenátdehydrogenázu deleci oblasti o velikosti 109 párů bází na 5'-konci a poté použít podle výše uvedeného popisu jako prefenátdehydrogenázu) nebo Bordetella bronchiseptica (přístupové číslo AAF1289) .. Nebo se snadno může identifikovat z různých organismů, jejichž genomové sekvence je známa homologickým přiřazením aminokyselinových sekvencí nebo odpovídajících zpětně přeložených sekvencí nukleových kyselin z databází se SEQ ID No. 2 nebo s jinými sekvencemi zde výše popsanými, jako jsou například potenciální geny chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázv z Methanococcus janaschii (přístupové číslo Q58029).
• · • · · · • · · · • · · · · · · • · · · · · ··· · · * · · ··· · · · · · · · · • ·27 · ........
Obzvláště výhodně použité nukleové kyseliny kódují bakteriální chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu.
Nukleová kyselina, která je obzvláště výhodně použita má SEQ ID No. 1. Tato nukleová kyselina tvoří genomovou DNA prokaryotické E. coli K12, která kóduje chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu SEQ ID No. 2, rovněž je nazývána gen tyrA.
Obr. 1 příkladmo ukazuje biosyntetické schéma vycházející z erythróza-4-fosfátu vedoucí k tokoferolům.
V důsledku další exprese genu chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy je šikimátová cesta divokého typu geneticky modifikována a metabolická přeměna na hydroxyfenylpyruvát je zvýšena.. Hydroxyfenylpyruvát, jehož jsou nyní dostupná větší množství, reaguje dále na tokoferoly. Zvýšený obsah hydroxyfenylpyruvátu vede ke zvýšené přeměně na vitamín E a/nebo vitamín K. Zvýšený obsah hydroxyfenylpyruvátu pravděpodobně vede ke zvýšenému obsahu vitamínu E.
V dalším, obzvláště výhodném ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu pro výrobu maloobjemových chemikálií je krok, při kterém se pěstují transgenní organismy následován sběrem organismů a isolaci maloobjemových chemikálií z: organismů.
Organismy se sbírají způsobem známým jako takovým vhodným pro příslušný organismus. Mikroorganismy, jako jsou baktérie, mechy, kvasinky a houby nebo rostliny, které se pěstují v kapalném nutričním médiu fermentaci, se mohou připravit například odstředěním, slitím nebo filtrací.
• · · ••28 ·
Rostliny se pěstují na výživných substrátech způsobena známým jako takovým a v souladu s tím sklizeny.
Maloobjemové chemikálie se isolují ze sebrané biomasy způsobem známým jako takovým, například extrakcí a, pokud je to příhodné, dalšími chemickými nebo fyzikálními čisticími způsoby, jako jsou například precipitační způsoby nebo způsoby fyzikální separace, jako je například chromatografíe,
Například vitamín E se výhodně isoluje z rostlin obsahujících olej chemickou konverzí a destilací z rostlinných olejů nebo z parních destilátů (deodorízátorové kondenzáty) získaných deodorizací rostlinných olejů.
Další způsoby isolace vitamínu E z deodorizátorových kondenzátů jsou popsány například v DE 31 26 110 Al, EP 171 009 A2, GB 2 145 079, EP 333 472 A2 a
WO 94/05650.
Transgenní organismy, obzvláště rostliny, se výhodně generují transformací výchozích organismů, obzláště rostlin, pomocí konstruktu, nukleových kyselin, který obsahuje výše popsané nukleové kyseliny, obzvláště nukleové kyseliny kódující ehorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu nebo výše uvedené konstrukty nukleových kyselin, obzvláště konstrukt nukleové kyseliny kódující plastidový adresový peptid a cytosolovou ehorismátmutázu, přičemž tyto nukleové kyseliny...
• · • · · · • · « · · ·
Tyto konstrukty nukleové kyseliny, kde sekvence kódující nukleové kyseliny nebo konstrukt kódující nukleové kyseliny je nebo jsou funkčně spojeny do jednoho nebo více regulačních signálů, které v organismech, obzvláště v rostlinách, zajišťují transkripci a translaci jsou také zde dále označeny jako expresní kazety.
Předložený vynález se tudíž dále týká konstruktů nukleové kyseliny, které působí jako expresní kazeta a které zahrnují nukleovou kyselinu popsanou výše, obzvláště nukleovou kyselinu kódující chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu nebo výše uvedené konstrukty nukleových kyselin, obzvláště konstrukt nukleové kyseliny kódující plastidový adresový peptid a cytosolovou chorismátmutázu, které jsou funkčně spojeny do jednoho nebo více regulačních signálů, které v hostitelském organismu, obzvláště v rostlinách, zajišťují transkripci a translaci.
Expresní kazeta výhodně zahrnuje nukleovou kyselinu kódující plastidový adresový peptid, který zajišťuje lokalizaci v plastidech.
Expresní kazety zahrnují regulační signály, také regulační sekvence nukleových kyselin, které řídí expresi kódující sekvence v hostitelské buňce. Podle výhodného ztělesnění zahrnuje expresní kazeta horní, tj . 5'--konec, kódující sekvence, promotor a dolní, tj. 3'-konec kódující sekvence, polyadenylační signál a, pokud je to příhodné, další regulační prvky operabilně spojené s vloženou kódující sekvencí pro alespoň jeden z výše popsaných genů. Operabilním spojením se rozumí sekvenčí uspořádání promotoru, kódující sekvence, terminátoru a, pokud je to • · • fc· · • · fcfcfcfc ··· ···· · · · •30 · ·· ·· ·· ·· příhodné, dalších regulačních prvků takovým způsobem, že každý z regulačních prvků může plnit svou zamýšlenou funkci při expresi kódující sekvence.
Následující text prostřednictvím příkladu popisuje výhodné konstrukty nukleových kyselin, rostlinné expresní kazety a způsoby generování transgenních rostlin.
Sekvencemi výhodnými pro operabilní spojeni jsou zaměřovači sekvence pro zajišťování subbuněčné lokalizace v apoplastu, ve vakuole, v plastidech, v mitochondriích, v endoplasmatickém retikuklu (ER), v jádře, v elaioplastech nebo v jiných kompartmentech, a zesilovače translace, jako je 5' vodicí sekvence viru tabákové mozaiky (Gallie a kol·., Nucl, Acids Res,,, 15, 8693 až 8711 (1987)), výčet tím však není omezen.
Promotory expresních kazet, které jsou vhodné je v principu jakýkoli promotor, který je schopen řídit expresi cizích genů v rostlinách. Výhodně se využije obzvláště rostlinný promotor nebo promotor odvozený z rostlinného viru. Obzvláště výhodný je promotor CaMV 35S viru květákové mozaiky (Franěk a kol., Cell, 21, 285 až 294 (1980). Jak je známo, tento promotor obsahuje různé rozpoznávací sekvence pro transkripční efektory, což vcelku vede k trvalé a konstitutivní expresi genu, který byl vložen (Benfey a kol., EMBO J. , _8, 2195 až 2202 (1989)).
Expresní kazeta také může obsahovat chemicky indukovatelný promotor pomocí nějž se exprese exogenního genu tyrA v rostlině může řídit v určitý čas. Příklady takových promouorů, které mohou být použity jsou promotor PRP1 (Ward a kol·., Plant. Mol. Biol., 22, 361 až 366 • ··· • · · · · · · · · ··· · · · · · · (1993), promotor indukovatelný kyselinou salicylovou (WO 95/19443), promotor indukovatelný benzensulfonamidem (EP-A 388186), promotor indukovatelný tetracyklinem. (Gatz a kol., Plant J., 2, 397 až 404 (1992)), promotor indukovatelný kyselinou absidovou (EP-A 335528) nebo promotor indukovatelný ethanolem nebo cyklohexanonem (WO 93/2134) .
Dále jsou výhodnými promotory obzvláště promotory, které zajišťují expresi v tkáních nebo orgánech rostlin ve kterých například probíhá biosyntéza příslušné maloobjemové chemikálie, obzvláště vitamínu E nebo jeho prekurzorů. Promotory, které musí být uvedeny obzvláště jsou promotory, které zajišťují expresi specificky v listech. Promotory, které mohou být uvedeny jsou bramborový cytosolový promotor FBPázy nebo bramborový promotor ST-LSI (Stockhaus s kol., EMBO J., 8, 2445 až 245 (1989) ) .
Cizí protein se exprimuje stabilně až do 0,67 % celkového rozpustného semenného proteinu v semenech transgenních tabákových rostlin pomocí promotoru specifického pro semena (Fiedler a Conrad, Bio/Technology, 10, 1090 až 1094 (1995)). Expresní kazeta tedy může obsahovat například promotor specifický pro semena (výhodně fazeolínový promotor (US patent č. 5 504 200), promotor USP (Baumlein, H. a kol., Mol. Gen. Genet., 225(3), 459 až 467 (1991)), promotor LEB4 (Fiedler a Conrad (1995)), promotor proteinu vážícího sacharózu (citát), signální peptid LEB4, gen, který má být exprimován a zadržovací signál pro ER.
Expresní kazeta se generuje například fúzí vhodného promotoru na vhodnou výše popsanou nukleovou kyselinu, obzvláště sekvenci nukleové kyselin kódující ·· ··*· ·4 ···· ·· ···· • · ··· · · · ·
chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu a, výhodně, nukleovou kyselinu, která se vloží mezi promotor a sekvenci nukleové kyseliny a která kóduje adresový peptid specifický pro chloroplast a na polyadenylační signál za použití obvyklých rekombinančních a klonovacích technik., jak jsou popsány například v T. Maniatis, E. F. Fritsch a J Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) a T. J. Šilhavý, M. L. Berman a L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) a Ausubel, F. M. a kol., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. And Willey Interscience (1987).
Vložené sekvence, které, jak je popsáno výše pro chorismátmutázu, zajišťují adresování do plastidů jsou obzvláště výhodné.
Je také možné použít expresní kazety, jejichž sekvence nukleové kyseliny kóduje fúzní protein, obzvláště chorismátmutázový, prefenátdehydrogenázový nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázový fúzní protein, přičemž část fúzního proteinu je adresový peptid, který řídí translokaci polypeptidu. Výhodné jsou adresové peptidy specifické pro chloroplast, které se enzymaticky odštěpí z proteinové části, obzvláště z chorismátmutázové, prefenátdehydrogenázové a/nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázové části, poté co proteiny, obzvláště chorismátrnutáza, prefenátdehydrogenáza nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenáza byly přemístěny do chloroplastu. Obzvláště výhodný je adresový peptid, který je odvozen z jiného adresového peptidu (například adresového peptidu malé a 0 0000 * » 99 t t
9999
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 •13 0 >e t« 00 «a podjednotky Rubisco nebo adresového peptidu ferredoxin NADP oxidoreduktázy a také adresového peptidu isopentenylpyrofosfátizomerázy-2) nebo jeho funkční ekvivalent.
Použití adresového peptidu plastidové chorismátmutázy nebo jej kódující nukleové kyseliny je obzvláště výhodné pro použití cytosolové chorismátmutázy nebo nukleové kyseliny kódující cytosolovou chorismátmutázu jak je popsáno zde výše.
Obzvláště výhodné pro použití podle předloženého vynálezu jiných nukleových kyselin podle tohoto vynálezu jsou sekvence DNA tří kazet plastidového adresového peptidu tabákové plastidové transketolázy ve třech čtecích rámcích jako fragmenty KpnI/BamHI s kodónem ATG v místě štěpení Ncol:
pTP09
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC
CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA
ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG
TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGA
TCC_BamHI pTPlO
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG GATCC BamHI • · · · • · · · • « • · · · * * • · • · pTPll
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC
CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA
ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG
TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGG
ATCC_BaxnHI
Dalším příkladem plastidového adresového peptidu je adresový peptid plastidové isopentylpyrofosfátizomerázv-2 (IPP-2) z Arabidopsis thaliana.
Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, obzvláště nukleové kyseliny kódující chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu se mohou syntetizovat nebo získat přirozeně nebo mohou obsahovat směs syntetických a přirozených konstituentů nukleových kyselin nebo taký mohou být složeny z různých heterologních genových segmentů z různých organismů.
Podle výše uvedeného popisu jsou výhodné syntetické nukleotidové sekvence s kodóny, které jsou upřednostňovány rostlinami. Tyto kodóny, které jsou upřednostňovány rostlinami, se mohou určit z kodónů s nejvyšší proteinovou frekvencí, které jsou exprimovány ve většině příslušných rostlinných druhů.
Při přípravě expresní kazety se mohou různé fragmenty DNA manipulovat k získání nukleotidové sekvence, která se rychle čte ve správném směru a která je poskytnuta se správným čtecím rámcem. K vzájemnému připojení fragmentů DNA se k fragmentům mohou přidat adaptéry nebo linkery.
c · • · · · . · · * .» ··
Oblasti promotoru a terminátoru se mohou rychle poskytnout, ve směru transkripce, s linkerem nebo polylinkerem obsahujícím jedno nebo více restrikčních míst pro inzerci této sekvence. Zpravidla má linker 1 až 10, ve většině případů 1 až 8, výhodně 2 až 6, restrikčních míst. Obecně má linker uvnitř regulačních oblastí velikost menší než 100 párů bází, často méně než 60 párů bází, ale alespoň 5 párů bází. Promotor může být buď negativní nebo homologní nebo také cizí nebo heterologní vůči hostitelské rostlině. Expresní kazeta výhodně obsahuje, ve směru transkripce 5'-3', promotor, kódující sekvenci nukleové kyseliny nebo konstrukt nukleové kyseliny a oblast pro ukončení transkripce. Podle potřeby mohou být vzájemně zaměněny různé ukončovací oblasti.
Dále se mohou použít manipulace, které poskytnou vhodná restrikční štěpící místa nebo která eliminují přebytečnou DNA nebo restrikční štěpící místa. In vitro mutageneze, oprava primeru, restrikce nebo ligace se mohou použít v případech, kdy jsou vhodné inzerce, delece nebo substituce, jako jsou například tranzice a transverze.
Komplementární konce fragmentů mohou být poskytnuty pro ligaci v případě vhodných manipulací, jako jsou například restrikce, přežvýkán nebo vyplnění převisů tupých konců.
Výhodnými polyadenylačními signály jsou rostlinné polyadenylační signály, výhodně polyadenylační signály, které v podstatě odpovídají polyadenylačním signálům T-DNA Agrobacterium tumefaciens, obzvláště polyadenylačním signálům genu 3 T-DNA (oktopinsyntetáza) plasmidu Ti « · a · • ·
3, 835 a násl. (1984)) pTIACH5 (Gielen a kol., EMBO J„, nebo funkční ekvivalenty.
Tento vynález se dále týká použití výše popsaných nukleových kyselin, obzvláště nukleových kyselin kódujících chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu nebo výše uvedené konstrukty nebo proteiny, obzvláště chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu, pro tvorbu transgénních rostlin.
Výhodně je obsah maloobjemových chemikálií těchto transgénních rostlin, obzvláště ubichinonu, vitamínu E a/nebo vitamínu K, výhodně vitamínu E, zvýšený oproti divokému typu.
Je známo, že rostliny s vysokým obsahem vitamínu E mají zvýšenou odolnost proti abiotickému stresu. Abiotickým stresem se rozumí například nízké teploty, mráz, sucho, vysoké teploty a sůl.
Tento vynález se dále týká použití výše uvedených nukleových kyselin pro vytváření transgénních rostlin, jejichž odolnost vůči abiotickému stresu je zvýšená ve srovnání s divokým typem.
Výše uvedené proteiny a nukleové kyseliny mohou být použity pro tvorbu maloobjemových chemikálií v transgénních organismech, výhodně pro tvorbu vitamínu E, vitamínu K a/nebo ubichinonu, obzvláště vitamínu E, v transgénních rostlinách.
• · · * • · ♦ ·
Přenos cizích genů do genornu organismu, obzvláště rostlin, se nazývá transformace. V rostlinách, obzvláště, se mohou pro přechodnou nebo stabilní transformaci použít způsoby známé jako takové pro transformaci a regeneraci rostlin z rostlinných tkání nebo rostlinných buněk.
λ/hodnými způsoby pro transformaci rostlin jsou transformace protoplastů příjmem DNA indukovaným polyethylenglvkolem, biolistický způsob používající genovou pušku - tzv. způsob bombardování částicemi, elektroporace, inkubace suchých embryí v roztocích obsahujících DNA, mikroinjekce a výše popsaný přenos zprostředkovaný agrobacteriem. Výše uvedené způsoby jsou popsány například v B. Jenes a kol., Techniques for Gene Transfer, v Transgenic Plants, díl 1, Engineering and Utilization, redigovali S. D. Kung a R. Wu, Academie Press, 128 až 143 (1993) a v Potrykus, Annu. Rev., Plant Physiol. Plant Molec. Biol,., 42, 205 až 225 (1991).
Konstrukt k expresi se výhodně klonuje do vektoru, který je vhodný pro transformaci Agrobacterium tumefaciens, například pBinl9 (Bevan a kol., Nucl. Acid Res., 12, 8711 (1984)).
Tento vynález se tudíž dále týká vektorů obsahujících výše popsané nukleové kyseliny, konstrukty nukleových kyselin nebo expresních kazet.
Agrobacteria transformovaná pomocí expresní kazety se mohou, použít známým způsobem pro transformaci rostlin, například lázní zjizvených listů nebo listových řezů v roztoku agrobakterií a jejich následnou kultivací ve vhodném médiu.
• · <· • · · » • · · ·
Expresní kazeta se může použít nejen u rostlin, ale také při transformaci bakterií, obzvláště cyanobakterií, mechů, kvasinek, vláknitých hub a řas.
Pro výhodnou generaci geneticky modifikovaných rostlin, zde dále také nazývaných transgenní rostliny, se výhodně do vektoru klonuje fúzní expresní kazeta, která kóduje protein podle tohoto vynálezu, obzvláště chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo cborismátmutázaprefenátdehydrogenázu, například pBin.19, která je vhodná pro transformaci Agrobacterium tumefaciens.
Agrobacteria transformovaná takovým vektorem se poté mohou použit známým způsobem pro transformaci rostlin, obzvláště pěstovaných rostlin, například lázní zjizvených listů nebo listových řezů v roztoku agrobakterií a jejich následnou kultivací ve vhodném médiu.
Transformace rostlin pomocí agrobakterií je známa, mezi jinými, z F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, v Transgenic Plants, díl 1, Engineering and Utilization, redigovali S. D. Kung a R. Wu, Academie Press, 15 až 38 (1993;. Transgenní rostliny, které obsahují, integrován do expresní kazety, gen pro expresi nukleových kyselin kódujících chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu, se mohou regenerovat známým způsobem z transformovaných buněk zjizvených listů nebo řezů listů.
K transformaci hostitelské rostliny pomocí nukleové kyseliny kódující chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu, *· · φ · · * ζ : : . · : ·. . ι .
. » · · ; :. . .·· » · ’ -» ·· ’· se zahrne expresní kazeta do rekombinantního vektoru, jehož vektorová DNA zahrnuje další funkční regulační signály, například sekvence pro replikaci nebo integraci. Vhodné vektory jsou popsány mezi jinými v „Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press), kapitola 6/7, 71 až 119 (1993)).
Například rostlinná expresní kazeta se může zahrnout do derivátu transformačního vektoru pBin-19 pomocí promotoru 35S (Bevan a kol., Nucl. Acid Res., 12, 8711 (1984)). Obr. 2 ukazuje derivát transformačního vektoru pBin-19 pomocí promotoru leguminu specifického pro semena.
S použitím výše citovaných rekombinačních a klonovacích technik se expresní kazeta může klonovat do vhodných vektorů, 'které umožňují jejich replikaci, například do E. coli. Příklady vhodných klonovacích vektorů jsou pBR332, řada pUC, řada Ml3mp a pACY184. Binární vektory, které jsou schopné replikace jak v E. coli a v agrobakteríích, jsou obzvláště vhodné.
Tento vynález se tedy týká použití výše popsaných nukleových kyselin, obzvláště nukleových kyselin kódujících chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu nebo výše popsaných konstruktů nukleových kyselin, obzvláště exprsních kazet pro tvorbu geneticky modifikovancýh rostlin nebo pro transformaci rostlin, rostlinných buněk, rostlinných tkání nebo rostlinných částí. Výhodným účelem použití je zvýšení obsahu maloobjemových chemikálií v rostlině nebo rostlinných částech, obzvláště obsahu vitamínu E, vitamínu K nebo ubichinonu, výhodně obsahu vitamínu E.
« · · · • ·
V závislosti na volbě promotoru může exprese probíhat specificky v listech, semenech, okvětních lístcích nebo v jiných částech rostliny.
Tento vynález se tudíž dále týká způsobu tvorby geneticky modifikovaného organismu zavedením do genomu výchozího organismu výše. popsané nukleové kyseliny nebo výše popsaného konstruktu nukleové kyseliny.
Tento vynález se výhodně týká způsobu transformace rostliny, který 2:ahrnuje zavedení expresních kazet obsahujících sekvence nukleových kyselin kódujících ehorismátmutázu.- prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-pref enátdehydrogenázu do rostlinné buňky nebo do rostlinných protoplastů a jejich regenerací k. získání intaktních rostlin.
Tento vynález se také týká geneticky modifikovaných organismů, přičemž genetická modifikace modifikuje metabolickou přeměnu šikimátové cesty oproti divokému typu a obsahu maloobjemových chemikálií v modifikovaném organismu oproti divokému typu.
Jak je uvedeno výše, obsah maloobjemových chemikálií, obzvláště vitamínu E, vitamínu K a/nebo ubichinonu, výhodně vitamínu E, ve výhodném geneticky modifikovaném organismu je zvýšen ve srovnání s divokým typem.
Geneticky modifikovaným organismem se podle tohoto vynálezu rozumí obzvláště organismus, ve kterém genetická modifikace,
I · · · ·>
« • * * v
• · v případě, že výchozí organismus obsahuje příslušnou nukleovou kyselinu, zvyšuje genovou expresi nukleové kyseliny kódující chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu oproti divokému typu nebo v případě, že výchozí organismus neobsahuje příslušnou nukleovou kyselinu, zavádí genovou expresi nukleové kyseliny kódující chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu oproti divokému typu.
Ve výhodném ztělesnění, jak je uvedeno výše se jako výchozí organismy a tudíž jako geneticky modifikované organismy, používají fotosynteticky aktivní organismy jako jsou například cyanobaktérie, mechy, řasy nebo rostliny, obzvláště výhodně rostliny, jako organismy pro tvorbu organismů, jejichž obsah maloobjemových chemikálií je zvýšen oproti divokému typu.
Takové transgenní rostliny, jejich propagační materiál a jejich rostlinné buňky, rostlinné tkáně nebo rostlinné části jsou dalším předmětem předloženého vynálezu.
Rostlinami pro účely tohoto vynálezu jsou obzvláště jednoděložné a dvouděložné.
Výhodnými rostlinami jsou Tagetes, slunečnice, Arabidopsis, rabák, paprika, sója, rajče, lilek, sladká paprika, mrkev, brambora, kukuřice, saláty a zelí, obilniny, alfalfa, oves, ječmen, žito, pšenice, triticale, čirok a proso, rýže, vojtěška, len, bavlna, konopí, « · • · . · «· << ·
Brassicaceae, jako jsou například řepka olejka nebo canola, cukrová řepa, cukrová třtina, druhy ořechů a hroznového vína nebo dřeva, jako například osika nebo tis.
Obzvláště výhodné jsou Arabidopsis thaliana, Tagetes erecta, Brassica napus, Nicotiana tabacum, canola, brambory a další olejové plodiny, jako je například sója.
Geneticky modifikované organismy, obzvláště rostliny, se mohou použít podle výše uvedeného popisu pro výrobu maloobjemových chemikálií, obzvláště pro výrobu vitamínu E, vitamínu K a ubichinonu.
Geneticky modifikované rostliny podle tohoto vynálezu, které mohou lidé a zvířata požívat mají zvýšený obsah maloobjemových chemikálii, obzvláště zvýšený obsah vitamínu E, ubichinonu a/nebo vitamínu K, výhodně vitamínu E, mohou také být použity jako potraviny nebo krmivá, například přímo nebo po zpracování způsobem známým jako takovým.
Zvyšování obsahu maloobjemových chemikálií znamená pro účely tohoto vynálezu uměle zvýšenou schopnost zvýšené biosyntézy těchto sloučenin v rostlině ve srovnání s rostlinou, která není modifikována genetickým inženýrstvím v jedné rostlinné generaci.
Zvýšeným obsahem vitamínu E se rozumí zpravidla zvýšený obsah celkového tokoferolu. Zvýšeným obsahem vitamínu E se však také rozumí obzvláště modifikovaný obsah výše popsaných 8 sloučenin s tokoferolovou aktivitou.
• ό
Například zavedení genu chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy do rostliny překvapivě vede k obzvláštnímu zvýšení obsahu tokotrienolu.
Při zvýšení obsahu vitamínu E může být zvýšen jak obsah tokoferolu, tak tokotrienolu. Je výhodné zvýšit obsah tokoferolu. Je však také možné za jistých podmínek výhodně zvýšit obsah tokotrienolu.
Například místem biosyntézy vitamínu E v rostlinách je mezi jinými listová tkáň, takže specifická exprese nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, obzvláště nukleových kyselin kódujících chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu, má smysl. To však nepředstavuje omezení rozsahu vynálezu, protože exprese může také probíhat specifickým způsobem ve všech dalších částech rostliny, obzvláště v olejových semenech.
Další výhodné ztělesnění se tedy týká exprese pro semena specifických nukleových kyselin podle tohoto vynálezu obzvláště nukleových kyselin kódujících chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutázaprefenátdehydrogenázu.
Navíc konstitutivní exprese exogenního genu chorismátmutázy, prefenátdehydrogenázy nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy je výhodná. Na druhou stranu mohou být také žádoucí indukovatelné exprese.
Expresní účinnost rekombinantně exprimované chorismátmutázy, prefenátdehydrogenázy nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogeriázy může být určena například in • · · *
vitro propagací výhodnku meristemu. Změny v povaze a úrovni exprese genu chorismátmutázy, prefenátdehydrogenázy nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy a jejich účinek na syntézu vitamínu E mohou také být testovány na testovacích rostlinách ve skleníkových experimentech.
Tento vynález je nyní ilustrován formou příkladů, které následují, ale vynález nijak neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Obecné experimentální podmínky:
Sekvenční analýza rekombinantní DNA
Molekuly rekombinantní DNA se sekvencují za použití laserového fluorescenčního sekvenátoru DNA Licor (dostupý od MWG Biotech, Ebersbach) za použití Sangerova způsobu (Sanger a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA, 74_, 5463 až 5467 (1977)) .
Příklad 1
Klonování genu tyrA kódujícího chorismátmutáza-prefenátdehvdrogenázu E., coli K12
DNA kódující cen tyrA se amplifikuje z E. coli K12 pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) za použití primeru specifického pro templátovou sekvenci (tyrA5' SEQ ID No. 10) a prrmeru specifického pro sekvenci komplementární k templátové (tyrA3' SEQ ID No. 9).
Podmínky PCR jsou následující:
• * »
PCR se provádí v reakční směsi o objemu 50 μΐ, která obsahuje:
μΐ buněčné suspenze E. coli K12 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 1,5 mM Mg (Ac) 2 μg hovězího sérového albuminu 40 pmol tyr5' pmol tyr3' μΐ 3,3 x rTth DNA polymerázového pufru XL (PE Applied Biosystems) jedn. rTth DNA polymerázového pufru XL (PE Applied Biosystems)
PCR se provádí za následujících podmínek cyklu:
Krok 1: 5 minut při teplotě 94 °C (denaturace)
Krok 2: 3 sekundy při teplotě 94 °C
Krok 3: 1 minuta při teplotě 55 °C (žíhání)
Krok 4: 2 minuty při teplotě 72 °C (prodlužování)
Kroky 2 až 4 se 30-krát opakuji
Krok 5; 10 minut při teplotě 72 °C (postelongace)
Krok 6: 4 °C (čekající klička) pGEM-T
Amplíkon se klonuje do PCR klonovacího vektoru (Promega) za použití standardních způsobů. Identita generovaného amplikonu se potvrdí sekvenováním za použití primem M13F (-40).
Příklad 2 « · · • · « ·« * ♦ ·
Generování expresních kazet obsahujících gen tyrA kódující chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu E. coli K12
Generují se transgenní rostliny Nicotiana tabacum a Arabidopsis thaliana, které exprimují chorismátmutázapref enátdehydrogenázu E. coli K12 za řízení konstitutivního promotoru 35S CaMV (virus květákové mozaiky) (Franck a kol., Cell, 21, 285 až 294 (1980)). Základ generovaného plasmidu pro konstitutivní expresi chořismátrnutázaprefenátdehydrogenázy E. coli K12 je pBin-TkTp-10 (Ralf badur, doktorsk práce, University of Gottingen (1998)). Tento vektor je derivátem pBinAR (Hófgen a Willmitzer,
Plant Sci., 66, 221 až 230 (1990)) a zahrnuje CaMV (virus květákové mozaiky) (Franck a kol., (1980)), terminační signál genu oktopinsyntetázy (Gielen a kol., EMBO J., 3,
835 až 846 (1984)) a DNA sekvenci kódující adresový peptid plastidové transketolázy Nicotiana tabacum. Klonování chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy E. coli K12 do tohoto vektoru, kdy se bere ohled na správný čtecí rámec generuje translační fúzi chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy s plastidovým adresovým peptidem. To způsobuje, že je transgen transportován do plastidů.
Ke konstrukci tohoto plasmidu se isoluje gen tyrA z plasmidu pGEM-T/tyrA za použiti lemujících restrikčních míst Smál nebo Sáli. Tento fragment se připojí na pBinAR-TkTp-lCVtyrA rozstřižený v místě Smal/Sall (viz obr. 2). Tento plasmíd (pBinAR-TkTp-10/tyrA) se použije ke generování transgenních rostliny Nicotiana tabacum a Arabidopsis thaliana.
Fragment A (529 párů bází) na obr. 2 zahrnuje promotor 35S CaMV (nukleotidy 6909 až 7437 viru květákové • ·
mozaiky), fragment Β (245 párů bází) kóduje adresový peptid transketolázy Nicotiana tabacum, fragment C (1232 párů bází) kóduje gen tyrA E. coli K12 a fragment D (219 párů bází) kóduje rerminační signál genu oktopinsyntetázy.
Příklad 3
Generování konstruktů nukleových kyselin pro expresi chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy E. coli K12 za řízení promotoru specifického pro semena
Ke generování chimérriích konstruktů DNA pro generování transgénních rostlin Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum a Brassica napus, které exprimují chorismátmutáza-prefenátclehydrogenázu E. coli K12 za řízení promotoru specifického pro semena se vytvoří z vektoru pPTVkanLeP-IPP-TP-9.
Tento vektor je derivátem pGPTVkan (D. Becker, E. Kemper, J. Schell, R. Masterson, Plant Molecular Biology,
20, 1195 až 1197 (1992)) jehož gen uidA byly deletován. Místo toho vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 obsahuje promotor genu pro legumin B4 specifický pro semena (Kafatos a kol., Nuc. Acid Res., 14 (6), 2707 až 2720 (1986)), sekvenci kódující adresový peptid isopentylpyrofosfátisomerázy-2 (IPP--2) specifický pro plastidv A. thaliana (Badur, nepublikováno) a terminaci nopalin syntetázy A. tumefaciens (Depicker a kol., J. Mol. Appl. Genet., jL, 561 až 573 (1982)) .
Fragment nukleové kyseliny kódující tyrA E. coli K12 se klonuje do vektoru pPTVkanLeP-IPP-TP-9 jako fragment Smal/Sall s tupými konci vyplněnými T4-polymerázou (obr.
« ·
3), což dává vzniknout translační fúzi s adresovým peptidem IPP-2. Tím se tedy zajistí import chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy do plastidu.. Tento plasmid. (pPTVkanLePIPP-TP-9/tyrA) se použije ke generování transgenních rostliny Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana a Brassica napus.
Na obr. 3 fragment A (2700 párů bází) zahrnuje promotor genu legumin B4 z Vicía faba, fragment B (206 párů bází) kóduje adresový peptid isopentylpyrofosfátisomerázy-2 A. thaliana, fragment C (1234 párů bází) kóduje gen tyrA E. coli K12 a fragment D (272 párů bází) kóduje terminační signál genu nopalinsyntetázy.
Příklad 4
Generování transgenních rostlin Arabidopsis thaliana, které exprimují gen tyrA
Rostliny Arabidopsis thaliana divokého typu (Kolumbie) se transformují pomocí kmene Agrobacter tumefaciens (GV3101 [pMP90]) na základě modifikovaného vakuového infiltračního způsobu (Steve Clough a Andrew Bent. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of A. thaliana, Plant J., 16(6),
735 až 743 (1998), Bechtold, N„, Ellis, J. a Peltier, G. v Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CRAcad Sc. Paris, 1144 (2) ,, 204 až 212 (1993)). Použité buňky Agrobacterua tumefaciens se předtím transformují pomocí plasmidů pBinAR-TkTp-10/tyrA a pPTVka.nLeP-IPP-TP-9/tyrA (obr. 2 a 3).
• ·
Semena primárních transformantů se vyberou na základě odolnosti vůči antibiotikům. Semenáčky, které jsou rezistentní na antibiotika se zasadí do půdy a plně vyvinuté rostliny se použijí pro biochemickou analýzu.
Příklad 5
Generování transgenních rostlin Brassica napus, které exprimuj i gen tyrA
Generování transgenních rostlin řepky olejky se provádí podle principu postupu, který popsali Bade, J. B. a Damm, B. (v Gene Transfer to Plants, Potrykus I. a
Spananberg, G., redaktoři, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 30 až 38 (1995)), který také ukazuje složení použitých médií a pufrů.
Transformace se provádějí pomocí kmene Agrobacter tumefaciens (GV3101 [pMP90]). Pro transformaci se použije plasmid pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA (obr. 3). Semena Brassica napus var. Westar se povrchově sterilizují 70% ethanolem (objemově), 10 minut se promývají při teplotě 55 °C ve vodě, 20 minut se inkubuji v 1% roztoku chlornanu (objemově 25% Teepol, objemově 0,1% Tween 20) a. 6-krát se promyjí sterilní vodou vždy po 20 minutách. Semena se suší 3 dny na filtračním papíře, přičemž 10 až 15 semen vyklíčí ve skleněné lahvi obsahující 15 ml klíčícího média. Z několika semenáčků (přibližná velikost 10 cm) se odstraní kořeny a vrcholky a podděložní články, které zůstanou, se rozsekají na části dlouhé přibližně 6 mm.. Takto získaných přibližně 600 rostlin se 30 minut promývá ve 50 ml základního média a přenese se do lahve o objemu 300 ml. Po přidání 100 ml • · kalusového induktoru se kultury 24 hodin inkubují při frekvenci otáček 100 za minutu.
Celonoční kultivace kmene Agrobacteria se provede v bujónovém médiu Luria doplněném kanamycinem (20 mg/litr) při teplotě 29 °C, přičemž 2 ml tohoto bujónového média se inkubují v 50 mi bujónového média Luria bez kanamycinu 4 hodiny při teplotě 29 °C až se dosáhne Οϋβοο 0,4 až 0,5. Po peletování kultury po dobu 25 minut při frekvenci otáček 2000 za minutu se buněčná peleta resuspenduje ve 25 ml bazálního média, bakteriální koncentrace v roztoku se upraví na OD6oo 0,3 přidáním dalšího bazálního média.
Kalusové indukční médium se od explantátů řepky olejky odstraní pomocí sterilních pipet, přidá se 50 ml agrobakteriálního roztoku a reakční směs se opatrně promísí a 20 minut se inkubuje. Agrobakteriální suspenze se odstraní, explantáty řepky olejky se 1 minutu promývají 50 ml kalusového indukčního média a následně se přidá 100 ml kalusového indukčního média. 24 hodin se provádí souběžná kultivace na kruhové třepačce při frekvenci otáček 100 za minutu. Souběžná kultivace se zastaví odnětím, kalusového .indukčního média a explantáty se dvakrát vždy 1 minutu promývají 25 ml a dvakrát vždy 60 minut 100 ml promývacího média při frekvenci otáček 100 za minutu. Promývací médium spolu s explantáty se přenese do 15cm Petriho misek a médium se odstraní za použití sterilních pipet.
Pro regeneraci se v každém případě 20 až 30 explantátů přenese do 90mm Petriho misek obsahujících 25 ml média pro indukci výhonků doplněného kanamycinem. Petriho misky se uzavřou 2 vrstvami Leukoporu a inkubují se při teplotě 25 °C a 2000 luxech při fotoperiodách 16 hodin • ♦ · · • · · - · . ···· • · r z......’
·..· : ........
světla/8 hodin tmy. Každých 12 dní se kalusy, které se vyvinou, přenesou na čerstvé Petriho misky obsahující médium indukce výhonků. Všechny další kroky regenerace intaktních rostlin se provádějí podle popisu Bade, J. B. a Damm, B. (v Gene Transfer to Plants, Potrykus I. a Spananberg, G., redaktoři, Sprínger Lab Manual, Springer Verlag, 30 až 38 (1995).
Příklad 6
Generování transgenních rostlin Nicotiana tabacum, které exprimují ς;εη tyrA ml média YEB doplněného antibiotikem (5 g/litr hovězí extrakt, 1 g/litr kvasinkový extrakt, 5 g/litr pepton, 5 g/litr sacharóza a 2 mM síran hořečnatý) se ínokuluje kolonií Agrobacterium tumefaciens a kultura se pěstuje přes noc při teplotě 28 °C. Buňky se 20 minut peletují při teplotě 4 °C, frekvence otáček 3500 za minutu, za použití lavicové odstředivky a poté se resuspendují za sterilních podmínek v čerstvém médiu YEB bez antibiotik. Buněčná suspenze se použije pro transformaci.
Rostliny divokého typu pěstované za sterilních podmínek se získají vegetativním množením. K tomu se odstřihne pouze vrcholek rostliny a přenese se do čerstvého média 2MS ve sterilní zavařovací sklenici. Pokud jde o zbytek rostliny, odstraní se trichomy z horních stran listů a centrální vény. Za použití žiletky se listy nařežou na. částí s přibližnou velikostí 1 cm2. Agrobakteriální kultura se přenese na malou Petriho misku )průměr 2 cm). Listové řezy se krátce protáhnou tímto roztokem a umístí se spodkem listů na médium 2MS v Petriho miskách (průměr 9 cm) tak, že • · · · se média dotýkají. Po 2 dnech ve tmě při teplotě 25 °C se explantáty přenesou na desky s kalusovým indukčním médiem a ohřejí se na teplotu 28 °C v místnosti s řízeným prostředím. Médium se musí měnit každých 7 až 10 dní. Jakmile se vytvoří kalusy, explantáty se přenesou do sterilních zavařovacích sklenic do média pro indukci výhonků doplněného klaforanem (0,6 % (hmotnost/objem) agar BiTec, 2,0 mg/lítr zeatinribóza, 0,02 mg/litr kyselina naftylocotová, 0,02 mg/litr gibberellic, 0,25 g/ml klaforan, 1,6 % (hmotnost/objem) glukóza a 50 mg/litr kanamycin). Organogeneze započne přibližně za 1 měsíc a je možné odstřihnout výhonky, které se vytvořily. Výhonky se pěstují v médiu 2MS doplněném klaforanem a selekčním markérem. Jakmile se vytvoří základní kořenový val, je možné rostliny přesadit do kořenáčů se semenným kompostem.
Příklad 7
Charakterizace transgenních rostlin z příkladů 4, 5 a 6
Analyzuje se obsah tokoferolu a tokotrienolu v listech a semenech rostlin transformovaných výše popsanými konstrukty (Arabidopsis thaliana, Brassica napus a Nicotiana tabacum). K tomu se transgenní rostliny pěstují ve skleníku, přičemž rostliny, které exprimují gen kódující chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu. E. coli K12 se analyzují pomocí metodik Northern blot a Western blot.
Obsah tokoferolu a obsah tokotrienolu v listech a semenech cěchto rostlin se stanoví pomocí HPLC. Ve všech případech je obsah tokoferolu a/nebo obsah tokotrienolu v transgenních rostlinách, které dodatečně exprimují gen tyrA, zvýšený ve srovnání s netransformovanými rostlinami.
• · · ·
Tabulka IA (mladé listy) a 1B (staré slity) ukazuje obsahy [gg/g FW] a-tokoferolu, γ-tokoferolu, atokotrienolu a celkového vitaminu E v listech různých stáří v Nícotiana tabacum, kultivar SNN divokého typu (uvedená data: MW +/-SD, n = 9) a rostliny, které nadměrně exprimují gen tyrA E. coli.
Tabulka A: mladé listy
| a-tokoferol | γ-tokoferol | a.-tokotrienol | Celkový vitamín E | |
| Divoký typ | 19,0 ±2,9 | 0,31 ±0,03 | <0,20 | 19,3 ±2,8 |
| SNN | ||||
| Linie 8 | 27,6 | 1,25 | 1,03 | 30,0 |
| Linie 15 | 35,7 | 0,73 | 1,00 | 37,4 |
| Linie 54 | 32,3 | 4,60 | 1,60 | 38,7 |
| Linie 86 | 15,7 | 4,47 | 0,98 | 21,4 |
| Linie 113 | 32,3 | 0,71 | 0,62 | 33,6 |
Tabulka B: staré listy
| • a-tokoferol | γ-tokoferol | a-tokotrienol | Celkový vitamín E | ||||
| Divoký typ SNN | 32,9 | ±2,1 | 0,31 | ±0,05 | <0,20 | 33,1 | ±2,1 |
| Linie 8 | 50,7 | 0,69 | 2,69 | 54,2 | |||
| Linie 15 | 54,7 | 0,69 | 0,81 | 56,2 | |||
| Linie 54 | 37,0 | 2,60 | 0,35 | 40,0 | |||
| Linie 86 | 36,5 | 1,51 | 0,43 | 38,4 | |||
| Linie 113 | 46,2 | 0,45 | 2,29 | 48,9 |
Příklad 8 • ·· ·
Klonování subfragmentu genu kódujícího chořismátrnutázu-1 Arabidopsis thaliana, která se exprimuje v plastidech
DNA kódující adresový peptid chorismátmutázy-1 se amplifikuje z Arabidopsis thaliana pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) za použití primeru specifického pro templátovou sekvenci (CM-1TP5' SEQ ID No. 11) a primeru specifického pro sekvenci komplementární k templátové (CM1TP3' SEQ ID No,. 12) .
Podmínky PCR jsou následující:
PCR se provádí v reakční směsi o objemu 50 μΐ, kt e rá ob sáhu j e:
μΐ buněčné cDNA z Arabidopsis thaliana 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 1,5 mM Mg(Ac)2 ug hovězího sérového albuminu 40 pmol primeru CM-1TP 5' pmol primeru CM-1TP 3' μΐ 3,3 x rTth DNA polymerázového pufru XL (PE Applied Biosystems) jedn. rTth DNA polymerázového pufru XL (PE Applied Biosystems)
PCR se provádí za následujících podmínek cyklu:
Krok 1: 5 minut při teplotě 94 °C (denaturace)
Krok 2: 3 sekundy při teplotě 94 °C
Krok 3: 1 minuta při teplotě 55 °C (žíhání)
Krok 4: 2 minuty při teplotě 72 °C (prodlužování)
Kroky 2 až 4 se 30-krát opakuji • · · · ··* ·
Krok 5: 10 minut při teplotě 72 °C (postelongace)
Krok 6: 4 °C (čekající klička)
Amplikon se klonuje do PCR klonovacího vektoru pCR-skriptu (stratagene) za použití standardních způsobů. Identita generovaného amplikonu se potvrdí sekvenováním za použití primeru specifického pro vektor.
Příklad 9
Klonování genu kódujícího chořísmátmutázu-2 Arabidopsis thaliana, která se exprimuje v cytosolu
DNA kódující gen chorismátmutázy-2 se amplifikuje z Arabidopsis thaliana pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) za použití primeru specifického pro templátovou sekvenci (CM-2 5' SEQ ID No. 13) a primeru specifického pro sekvenci komplementární k templátové (CM-2 3' SEQ ID No.
14) .
Podmínky PCR jsou následující:
PCR se provádí v reakční směsi o objemu 50 μΐ, která obsahuje:
μΐ buněčné cDNA z Arabidopsis thaliana 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 1,5 mM Mg(Ac)2 gg hovězího sérového albuminu 40 pmo.1 primeru CM-1TP 5' pmol primeru CM-1TP 3' μΐ 3,3 x rTth DNA polymerázového pufru XL (PE
Applied
Biosystems) ·· ·»·· jedn. rTth DNA polymerázového pufru XL (PE Applied
Biosystems) » » · « ·· ·*
PCR se provádí za následujících podmínek cyklu:
Krok 1:
Krok 2:
Krok 3:
Krok 4: Kroky 2 Krok 5:
Krok 6:
minut při teplotě 94 0 sekundy při teplotě 94 minuta při teplotě 55 minuty při teplotě 72 až 4 se 30-krát opakují 10 minut při teplotě 72 °C (čekající klička)
C (denaturace) °C °C (žíhání) °C (prodlužování) °C (postelongace)
Amplíkon se klonuje do PCR klonovacího vektoru pGEM-T (Promega) za použití standardních způsobů. Identita generovaného amplikonu se potvrdí sekvenováním za použití prime ru MISE'' (-40) .
Příklad 10
Generování chimérního genového konstruktu CM-l-TP-CM-2 složeného z DNA sekvence kódující adresový peptid (TP) chorismátmutázy-1 (CM-1) a DNA sekvence kódující chorismátmutázu-2 (CM-2)
Ke generování chimérního genu CM-l-TP-CM-2 se plasmid pCR-Script/CM-l-TP rozstříhá restrikčním enzymem Ncol/Sall.
Fragment DNA chorismátmutázy-2, který byl isolován z plasmidu pGEM-Teasy/CM-2 se pomocí restrikčních enzymů Ncol/Sall liguje do tohoto plasmidu. Translace tohoto chimérního konstruktu DNA (SEQ ID No. 5) (pCRScript/AtCM-lTP-AtCM-2, obr. 4} vede k tvorbě fúzního proteinu, při kterém se adresový peptid CM-1 kombinuje s CM-2 (SEQ ID No. 6).
Příklad 11
Tvorba rostlinných expresních kazet obsahujících chimérní gen CM-l-TP-CM-2
Generují se transgenní rostliny, které exprimují chimérní gen CM-l-TP-CM-2 z A. thaliana napřed za řízení konstitutivního promotoru 35S CaMV (virus květákové mozaiky) (Franck a kol., Cell, 21, 285 až 294 (1980)) a následně za řízení promotoru specifického pro semena leguminového genu Vicia faba (Kafatos a kol., Nuc. Acid Res., 14(6), 2707 až 2720 (1986)).
Základem plasmidu generovaného pro konstitutivní expresi chimérního genu CM-l-TP-CM-2 je vektor pBinAR (Hofgen a Willmitzer, Plant Sci., 66, 221 až 230 (1990)) . Tento vektor obsahuje 35S promotor CaMV (virus květákové mozaiky) (Franck a kol., (1980)) a terminační signál genu oktopinsyntetázy (Gielen a kol.., EMBO J., 3, 835 až 846 (1984)). Ke generování plasmidu se isoluje chimérní gen CMl-TP-CM-2 z plasmidu pCR-Script/AtCM-lTP-AtCM-2 za použití lemujících restrikčních míst KpnI/SalI (obr. 4). Za použití standardních způsobů se tento fragment liguje do pBinAR rozstříhaného pomocí KpnI/SalI. Výsledný plasmid (pBínAR/CM-lTP/CM-2, obr. 5) se použije pro generování transgenní Arabidopsis thaliana a Nicotiaria tabacurn.
K vytvoření plasmidu, který umožňuje expresi genu CM-í-TP/CM-2 specifickou pro semena v rostlinách, použije • · · ·
se promotor genu leguminu B4 specifický pro semena (Kafatos a kol., Nuc. Acid Res., 14(6), 2707 až 2720 (1986)). fragment o velikosti 2,7 tisíce párů bází promotoru genu leguminu B4 se isoluje z plasmídu pGEMTeasy/lepNOS za použití štěpícího místa EcoRI, které lemuje promotor 5' a štěpícího místa KpnI, které lemuje promotor 3'. Plasmid pBinAR/CM-l-TP/CM-2 se také zpracuje pomocí restrikčních enzymů EcoRI a KpnI. V důsledku toho se 35S promotor CaMV vystřihne z plasmidu (viz obr. 5). Promotor genu leguminu se následně klonuje do tohoto vektoru jako fragment EcoI/KpnI, čímž vzniká plasmid, který umístí expresi chimérního genu CM-l-TP-CM-2 pod řízení tohoto promotoru specifického pro semena (viz obr. 6). Tento plasmid pBinLeP/CM-lTP/CM-2, obr. 5) se použije pro generování transgenních rostlin Arabidopsis thaliana a Nicotiana tabacum.
Příklad 12
Generování chimérních rostlin Arabidopsis thaliana, které exprimují chimérní gen CM-l-TP-CM-2
Rostliny se generují analogicky podle příkladu 4 za použití plasmidu (pBinAR/CM-lTP/CM-2) a (pBinLeP/CMiTP/CM-2).
Příklad 13
Generování chimérních rostlin Brassica napus, které exprimují chimérní gen tyrA • · · ·
Rostliny se generují analogicky podle příkladu 5 za použití plasmidů (pBinAR/CM-lTP/CM-2) a (pBinLeP/CM1TP/CM-2).
Příklad 14
Generování chimérních rostlin Nicotiana tabacum, které exprimují chimérní gen tyrA
Rostliny se generují analogicky podle příkladu 4 za použití plasmidů (pBinAR/CM-lTP/CM-2) a (pBinARLeP/CM1TP/CM-2).
Příklad 15
Charakterizace transgenních rostlin z příkladů 12, 13 a 14
Analyzuje se obsah tokoferolu a tokotrienolu v listech a semenech rostlin transformovaných výše popsanými konstrukty (Arabidopsis thaliana, Brassica napus a Nicotiana tabacum). K tomu se transgenní rostliny pěstují ve skleníku, přičemž rostliny, které exprimují gen kódující chořísmátmutáza-prefenátdehydrogenázu E. coli K12 se analyzují pomocí metodik Northern blot a Western blot.
Obsah tokoferolu a obsah tokotrienolu v listech a semenech těchto rostlin se stanoví pomocí HPLC. Ve všech případech je obsah tokoferolu a/nebo obsah tokotrienolu v transgenních rostlinách, které dodatečně exprimují gen chorismátmutázy. zvýšený ve srovnání s netransformovanými rostlinami.
• · · · · · i
Claims (7)
1. Způsob podle nároku 10, vvzna. čuj ící se t i m, že se do rostlin zavede konstrukt nukleové kyseliny sekvence nukleové kyseliny SEQ ID No. 5.
12. Konstrukt nukleové kyseliny zahrnující nukleovou kyselinu kódující plastidový adresový peptid a nukleovou kyselinu, která kóduje protein obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 4 nebo sekvenci z této sekvence odvozenou substitucí, inzercí nebo delecí aminokyselin, která má alespoň 30% homologii na úrovni aminokyselin se sekvencí SEQ ID No. 4 a která má enzymatické vlastnosti chorismátmutázy.
13. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 12, kde nukleová kyselina, která kóduje plastidový adresový peptid plastidové chorismátmutázy, se použije jako nukleová kyselina, která kóduje plastidový adresový peptid.
14. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 13, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny SEQ ID No. 5.
15. Způsob podle kteréhokoli z nároků 2 až 11, v y z n ač u j i c i se t i m, že použitým organismem je rostlina a tím, že pří provádění opatření B se do rostliny zavede nukleová kyselina kódující prefenátdehydrogenázu jako gen, k němuž neexistuje žádný ortologní gen v divokém typu.
16. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 11 a 15, vyznačující se tím, že se do rostliny zavede nukleová kyselina kódující prefenátdehydrogenázu v kombinaci s nukleovou kyselinou kódující chorismátmutázu.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se • · • · · · • · · » · · · · · ♦ * · : » .· tím, že se do rostliny zavede nukleová kyselina kódující chořismátrnutáza-prefenátdehydrogenázu.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se zavede nukleová kyselina, která kóduje protein obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2 nebo sekvenci z této sekvence odvozenou substitucí, inzercí nebo deleci aminokyselin, která má alespoň 30% homologii na úrovni aminokyselin se sekvencí SEQ ID No. 2a která má enzymatické vlastnosti chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázv.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se t i m, že se použije nukleová kyselina bakteriálního původu.
20. Způsob podle nároku 18 nebo 19, vyznačuj ící se ti m, že se použije nukleová kyselina, která obsahuje sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 1.
21. Konstrukt nukleové kyseliny zahrnující nukleovou kyselinu podle kteréhokoli z nároků 3 až 6, 8 a 15 až 17, které jsou funkčně spojeny do jednoho nebo více regulačních signálů, které zajišťují transkripci a translaci v rostlinách.
22. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 21, který dále obsahuje nukleovou kyselinu kódující plastidový adresový peptid.
23. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 22, který obsahuje konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 12.
• » · *
24. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 22 zahrnující nukleovou kyselinu kódující plastidový adresový peptid a nukleovou kyselinu, která kóduje protein obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2 nebo sekvenci z této sekvence odvozenou substitucí, inzercí nebo delecí aminokyselin, která má alespoň 30% homologii na úrovni aminokyselin se sekvencí SEQ ID No. 2a která má enzymatické vlastnosti chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázy.
25. Použití nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 3 až 6, 8a 15 až 17 a konstruktů nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 12 až 14 a 21 až 24 pro generování transgenních rostlin.
26. Použití podle nároku 25, kde obsah maloobjemové chemikálie v transgenní rostlině je zvýšen oproti rostlině divokého typu.
27. Použití podle nároku 25, kde resistence transgenní rostliny vůči abiotickému stresu je zvýšena oproti rostlině divokého typu.7
28. Geneticky modifikovaný organismus, vyznačuj ίο i se ti m, že genetická modifikace modifikuje metabolickou přeměnu šikimátové cesty oproti divokému typu a obsah maloobjemových chemikálii v organismu je modifikován oproti divokému typu.
29. Geneticky modifikovaný organismus podle nároku 28, vyznačující se t I m, že genetická modifikace, « · ·♦ · v případě, že výchozí organismus obsahuje příslušnou nukleovou kyselinu, zvyšuje genovou expresi nukleové kyseliny kódující chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu oproti divokému typu nebo v případě, že výchozí organismus neobsahuje příslušnou nukleovou kyselinu, zavádí genovou expresi nukleové kyseliny kódující chorismátmutázu, prefenátdehydrogenázu nebo chorismátmutáza-prefenátdehydrogenázu oproti divokému typu.
30. Geneticky modifikovaný organismus podle nároku 29, vyznačující se t i m, že je transformován konstruktem nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 21 až 24 .
31. Geneticky modifikovaný organismus podle nároku 29, vyznačující se t i m, že obsahuje konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 21 až 24.
32. Geneticky modifikovaný organismus podle kteréhokoli z nároků 28 až 31, vyznačující se t i m, že použitým, organismem je rostlina.
33. Způsob generování geneticky modifikovaného organuismu podle kteréhokoli z nároků 28 až 32, vyznačuj ící se ti m, že zahrnuje zavedení do genornu výchozího organismu alespoň jedné nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 3 až 6, 8 a 1.5 až 17 nebo alespoň jednoho konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 12 až 14 a 21 až 24.
• · « · · · /-X « « · · · * · » · * ·
OO 4· * 9 9 9 9 9 9 9 9
34. Použití geneticky modifikovaného organismu podle kteréhokoli z nároků 28 až 32 pro výrobu maloobjemových chemikálií.
35. Použití geneticky modifikovaného organismu podle kteréhokoli z nároků 28 až 32 jako krmiv a potravin pro výrobu zpracovaných potravin.
36. Použití nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 3 až 6, 8a 15 až 17 a konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 12 až 14 a 21 až 24 pro zvýšení obsahu maloobjemových chemikálií v organismu.
37. Použití nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 3 až 6, 8a 15 až 17 a konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 12 až 14 a 21 až 24 pro tvorbu maloobjemových chemikálií v organismu.
* ·
Obr. 1
Pep +terythróza-4-P i
- Chorismát γ ' Chorismátmutáza
Prefenát4
Prefenátdeliydrogenáza
Arogenat
Tyrosine
I ¥ —Hydroxyfenylpyruvát Chorismátmutáza-prefenátdehydrogenáza |
Homogentisát
J-Fytyl-PP
1. Způsob výroby maloobjemových chemikálií, vyznač uj i c i se t i m, že se pěstují organismy, jejichž šikimátová cesta je geneticky modifikována oproti cestě divokého typu.
2-Methyl-6-ívtylhydrochinon ' i'
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že se provádí alespoň jedno opatření zvolené ze skupiny opatření A a B pro genetické modifikování šikimátové cesty, přičemž A a B mají následující význam:
A: zvýšení aktivity alespoň jednoho enzymu šikimátové cesty divokého typu,
B: zavedení do organismu alespoň jednoho genu, ke kterému v divokém typu neexistuje žádný ortologní gen a který přemosťuje metabolickou cestu šikimátové cesty divokého typu.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t i m, že v opatření A je aktivita alespoň jednoho enzymu šikimátové cesty zvýšena nadměrnou expresí nukleových kyselin, které kódují proteiny s touto enzymatickou aktivitou.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se t i m, že se do organismu zavede nukleová kyselina kódující chorismátmutázu.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačuj ící • · · · tím, že se do organismu zavede nukleová kyselina kódující chorismátmutázu, jejíž aktivita je v organismu podřízena snížené posttranslační regulací.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se t i m, že se do organismu zavede nukleová kyselina kódující chorismátmutázu, jejíž aktivita je v organismu podřízena snížené posttranslační regulaci v místě exprese.
7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se t í m, že použitým organismem je rostlina.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se t i m, že do plastidů rostliny se zavede cytosolová chorismátrnutá za.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t i m, že se do rostliny zavede konstrukt nukleové kyseliny zahrnující nukleovou kyselinu kódující plastidový adresový peptid a nukleovou kyselinu, která kóduje protein obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 4 nebo sekvenci z této sekvence odvozenou substitucí, inzercí nebo deleci aminokyselin, která má alespoň 30% homologii na úrovni aminokyselin se sekvenci SEQ ID No. 4a která má enzymatické vlastnosti chorismátmutázy.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se t i m, že nukleová kyselina, která kóduje plastidový adresový peptid plastidové chorismátmutázy, se použije jako nukleová kyselina, která kóduje plastidový adresový peptid.
7 3-Dimethyl-6- fytylhydrochmon i
γ-Tokoferol a-Tokoferol i
Obr.2
Obr.3 • · · · • · · · • · · ·
Obr.4 pCR-Script/AtCM1-TP-CM2 • · ♦ · • · · · « · · ·
Obr.5 pBinAR/CM1-TP-CM2 • · • · ♦ ·
I
Obr. 6 •· · ·· ·· ·· ·· pBinl_eP-CM1-TP-CM2 • * ···· · · ··»·
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000130647 DE10030647A1 (de) | 2000-06-29 | 2000-06-29 | Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des Shikimatweges |
| DE2000164454 DE10064454A1 (de) | 2000-12-21 | 2000-12-21 | Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des Shikimatweges |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20024144A3 true CZ20024144A3 (cs) | 2003-05-14 |
Family
ID=26006169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20024144A CZ20024144A3 (cs) | 2000-06-29 | 2001-06-28 | Způsob změny obsahu maloobjemových chemikálií v organismech s geneticky modifikovanou šikimátovou cestou |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7332649B2 (cs) |
| EP (1) | EP1294913B1 (cs) |
| JP (1) | JP2004501649A (cs) |
| CN (1) | CN1439054A (cs) |
| AR (1) | AR030430A1 (cs) |
| AT (1) | ATE389025T1 (cs) |
| AU (1) | AU2001266096A1 (cs) |
| BR (1) | BR0112052A (cs) |
| CA (1) | CA2413049A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20024144A3 (cs) |
| DE (1) | DE50113727D1 (cs) |
| PL (1) | PL360365A1 (cs) |
| WO (1) | WO2002000901A1 (cs) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE316578T1 (de) | 1999-04-15 | 2006-02-15 | Calgene Llc | Nukleinsäuresequenzen für proteine, die an der tocopherolbiosynthese beteiligt sind |
| US6872815B1 (en) | 2000-10-14 | 2005-03-29 | Calgene Llc | Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis |
| CA2418436C (en) | 2000-08-07 | 2017-07-11 | Monsanto Technology, Llc | Methyl-d-erythritol phosphate pathway genes |
| FR2817557B1 (fr) * | 2000-12-05 | 2005-05-06 | Aventis Cropscience Sa | Nouvelles cibles pour herbicides et plantes transgeniques resistantes a ces herbicides |
| AU2007249135B2 (en) * | 2000-12-05 | 2010-03-04 | Bayer S.A.S. | Novel targets for herbicides and transgenic plants resistant to said herbicides |
| EP1392106B1 (en) * | 2001-05-09 | 2008-12-31 | Monsanto Technology LLC | Tyra genes and uses thereof |
| EP1950305A1 (en) * | 2001-05-09 | 2008-07-30 | Monsanto Technology, LLC | Tyr a genes and uses thereof |
| US7244877B2 (en) | 2001-08-17 | 2007-07-17 | Monsanto Technology Llc | Methyltransferase from cotton and uses thereof |
| DE10212703A1 (de) * | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Erhöhung Vitamin-E-Gehalts in Organismen durch Erhöhung der 2-Methyl-6-phytythydrochinon-Methyltransferase-Aktivität |
| DE10231587A1 (de) * | 2002-07-11 | 2004-01-29 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen |
| DE10232483A1 (de) * | 2002-07-17 | 2004-02-05 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen |
| FR2844142B1 (fr) * | 2002-09-11 | 2007-08-17 | Bayer Cropscience Sa | Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree |
| AU2009299926A1 (en) * | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Basf Plant Science Gmbh | Method for producing a transgenic plant cell, a plant or a part thereof with increased resistance biotic stress |
| DE112010000693T5 (de) * | 2009-01-28 | 2012-11-22 | Basf Plant Science Company Gmbh | Transgene Pflanzen mit verändertem Stickstoffmetabolismus |
| CN113061619B (zh) * | 2021-04-30 | 2022-06-24 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 与烟气苯酚释放量相关的突变基因TyrA |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4956282A (en) * | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
| JPS63105688A (ja) * | 1986-10-21 | 1988-05-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| JP2578488B2 (ja) * | 1988-03-04 | 1997-02-05 | 協和醗酵工業株式会社 | アミノ酸の製造法 |
| US5120837A (en) * | 1989-09-20 | 1992-06-09 | The Nutrasweet Company | Dna encoding phe a feedback inhibition resistant enzyme analogues |
| US6087563A (en) | 1996-01-29 | 2000-07-11 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Cloned arabidopsis p-hydroxyphenyl pyruvic acid dioxygenase DNA |
| US6642434B1 (en) | 1997-07-25 | 2003-11-04 | University Of Community College System Of Nevada | Transgenic plants with γ-tocopherol methyltransferase |
| DE19752647C1 (de) | 1997-10-29 | 1999-06-24 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Reduktiion des Chlorophyllgehaltes in Ölpflanzensamen |
| CA2339519A1 (en) | 1998-08-05 | 2000-02-17 | Sungene Gmbh & Co.Kgaa | Dna sequence coding for a 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase and the overproduction thereof in plants |
-
2001
- 2001-06-27 AR ARP010103057A patent/AR030430A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-06-28 US US10/297,661 patent/US7332649B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-28 PL PL36036501A patent/PL360365A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2001-06-28 DE DE50113727T patent/DE50113727D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-28 CA CA002413049A patent/CA2413049A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-28 AT AT01943549T patent/ATE389025T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-06-28 CN CN01811927A patent/CN1439054A/zh active Pending
- 2001-06-28 AU AU2001266096A patent/AU2001266096A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-28 WO PCT/EP2001/007391 patent/WO2002000901A1/de active IP Right Grant
- 2001-06-28 JP JP2002506216A patent/JP2004501649A/ja active Pending
- 2001-06-28 EP EP01943549A patent/EP1294913B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-28 BR BR0112052-2A patent/BR0112052A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-28 CZ CZ20024144A patent/CZ20024144A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7332649B2 (en) | 2008-02-19 |
| US20060057687A1 (en) | 2006-03-16 |
| ATE389025T1 (de) | 2008-03-15 |
| BR0112052A (pt) | 2004-02-10 |
| WO2002000901A1 (de) | 2002-01-03 |
| PL360365A1 (en) | 2004-09-06 |
| JP2004501649A (ja) | 2004-01-22 |
| AR030430A1 (es) | 2003-08-20 |
| CA2413049A1 (en) | 2002-01-03 |
| DE50113727D1 (de) | 2008-04-24 |
| EP1294913B1 (de) | 2008-03-12 |
| EP1294913A1 (de) | 2003-03-26 |
| AU2001266096A1 (en) | 2002-01-08 |
| CN1439054A (zh) | 2003-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4683923B2 (ja) | プレニルキノン生合成能の高い形質転換植物 | |
| JP4755109B2 (ja) | 飽和脂肪酸のレベルが低減されたトランスジェニック植物およびその製造方法 | |
| US20090205079A1 (en) | ACETYL CoA CARBOXYLASE (ACCase) GENE FROM JATROPHA CURAS | |
| US7332649B2 (en) | Changing the fine chemical content in organisms by genetically modifying the shikimate pathway | |
| AU757440B2 (en) | DNA sequence coding for a 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase and the overproduction thereof in plants | |
| US20030084479A1 (en) | Homogentisate phytyl transferase | |
| US6765129B1 (en) | Overexpression of a DNA sequence coding for a 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase in plants | |
| CA2378657A1 (en) | Identification and overexpression of a dna sequence coding for 2-methyl-6-phytylhydroquinone-methyltransferase in plants | |
| US7348167B2 (en) | Increase in the vitamin E content in organisms due to an increase in the tyrosine aminotransferase activity | |
| US20060021085A1 (en) | Method for producing transgenic plants having an elevated vitamin E content by modifying the serine-acetyltransferase content | |
| DE10030647A1 (de) | Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des Shikimatweges | |
| DE10064454A1 (de) | Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des Shikimatweges | |
| DE19845224A1 (de) | DNA-Sequenzen codierend für eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Synthase und eine Geranylgeranyl-Pyrosphat Oxidoreduktase und deren Überproduktion in Pflanzen |