JP2004501649A - シキミ酸経路を遺伝子学的に改変することによる生物中の精製化学物質含量の改変 - Google Patents

Abstract

本発明は、野生型と比べて遺伝子改変されたシキミ酸経路を示す生物（特に、植物）を培養することにより、精製化学物質（特にビタミンＥ、ビタミンＫおよび／またはユビキノン）を生成するための方法に関する。本発明は、トランスジェニック生物自体にも関する。

Description

【０００１】
本発明は、生物（特に野生型のものに比べてシキミ酸経路が遺伝子学的に改変されている植物）を培養することにより、精製化学物質（特にビタミンＥ、ビタミンＫおよび／またはユビキノン）を生成するための方法、ならびにトランスジェニック生物自体に関する。
【０００２】
生物、特に植物は、精製化学物質として高い経済的重要性のある一連の代謝産物を生成する。例として挙げられる精製化学物質としては、芳香族アミノ酸、サリチル酸誘導体、フェニルプロパノイド（ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ）、フラボノイド、スチルベン、キサントンおよびキノン、特に、ビタミンＥまたはビタミンＫ活性を有する混合（ｍｉｘｅｄ）プレニル脂質化合物がある。
【０００３】
精製化学物質の生成のためのバイオテクノロジー的方法を用いて、これらの精製化学物質を生成可能な生物を培養し、該生物から所望の精製化学物質を単離する。
【０００４】
生物中の精製化学含量を特異的に改変すること（例えば、所望の精製化学物質の含量を増やすこと、および／または所望でない精製化学物質への代謝産物の流れを阻害すること）は、精製化学物質のバイオテクノロジー生成のための経済的プロセスのためだけではなく、加工または未加工の食品または飼料としての生物の使用のためにも所望である。
【０００５】
経済的に重要な精製化学物質の例としては、芳香核に連結したイソプレノイド側鎖を示す、プラストキノン、ユビキノン、およびビタミンＥまたはビタミンＫ活性を有する化合物である。
【０００６】
ビタミンＥ活性を有する天然に存在する８つの化合物は、６−クロマノールの誘導体である（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． Ａ ２７ （１９９６）， ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ， ４章， ４７８−４８８， Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ）。トコフェロール群（１ａ−ｄ）は飽和側鎖を示し、トコトリエノール群（２ａ−ｄ）は非飽和側鎖を示す：

１ａ、α−トコフェロール：Ｒ^１＝Ｒ^２＝Ｒ^３＝ＣＨ_３
１ｂ、β−トコフェロール：Ｒ^１＝Ｒ^３＝ＣＨ_３、Ｒ^２＝Ｈ
１ｃ、γ−トコフェロール：Ｒ^１＝Ｈ、Ｒ^２＝Ｒ^３＝ＣＨ_３
１ｄ、δ−トコフェロール：Ｒ^１＝Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^３＝ＣＨ_３

２ａ、α−トコトリエノール：Ｒ^１＝Ｒ^２＝Ｒ^３＝ＣＨ_３
２ｂ、β−トコトリエノール：Ｒ^１＝Ｒ^３＝ＣＨ_３、Ｒ^２＝Ｈ
２ｃ、γ−トコトリエノール：Ｒ^１＝Ｈ、Ｒ^２＝Ｒ^３＝ＣＨ_３
２ｄ、δ−トコトリエノール：Ｒ^１＝Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^３＝ＣＨ_３
本明細書において、ビタミンＥは、ビタミンＥ活性を有する上記全てのトコフェロールおよびトコトリエノールを含むと理解されたい。
【０００７】
ビタミンＥ活性を有するこれらの化合物は、重要な天然脂質可溶性抗酸化剤である。ビタミンＥ不足は、ヒトおよび動物において病態生理学的状態を生じる。従って、ビタミンＥ化合物は、食品および飼料部門、医薬製剤、ならびに化粧品用途における添加物として大いに経済的価値のあるものである。
【０００８】
ビタミンＫ活性を有する天然に存在する化合物は、１，４−ナフトキノンの誘導体である（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． Ａ ２７ （１９９６）， ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ， ５章， ４８８−５０６， Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ）。フィロキノン（初期名：ビタミンＫ_１）はかなり飽和された側鎖を有し、メナキノン（初期名：ビタミンＫ_２）の群は４〜１３のイソプレニル残基を有する非飽和側鎖を有する。
【０００９】
本明細書においてビタミンＫは、ビタミンＫ活性を有する全ての化合物、特に上記化合物を含むと理解されたい。
【００１０】
イソプレノイド側鎖生合成の出発点は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）である。ＩＰＰは、その異性体ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）と平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）である。ＩＰＰとＤＭＡＰＰとの頭−尾での（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ）縮合により、モノテルペン（Ｃ_１０）ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）が生じる。さらにＩＰＰユニットを加えることで、セスキテルペン（Ｃ_１５）ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）およびジテルペン（Ｃ_２０）ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）が生じる。
【００１１】
フィロキノンは、最初のイソプレンユニットのみが二重結合を含むＣ_２０フィチル鎖を含む。ＧＧＰＰは、ゲラニルゲラニルピロリン酸酸化還元酵素（ＧＧＰＰＯＲ）により、フィチルピロリン酸（ＰＰＰ）（すなわちトコフェロールの形成のための出発物質）に転換される。
【００１２】
ビタミンＥおよびＫの形成を導く混合プレニル脂質の環式構造は、出発代謝産物がシキミ酸経路から誘導されるキノンである。
【００１３】
エリトロース−４−リン酸およびホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）から出発し、これらが、中間物質３’−デヒドロキナ酸、３’−デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸および５’−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸を介して縮合して３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸（ｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ）−７−リン酸（ＤＡＨＰ）が生じることにより、コリスミ酸が形成される。エリトロース−４−リン酸は、カルビン回路において形成され、ＰＥＰは解糖により得られる。
【００１４】
より高等な植物においては、コリスミ酸から出発し、プレフェン酸およびアロゲン酸を介してチロシンが形成される。芳香族アミノ酸チロシンは、ヒドロキシフェニルピルビン酸に転換され、これは二原子酸素添加（ｄｉｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）によりホモゲンチジン酸に転換される。
【００１５】
ホモゲンチジン酸は、その後、フィチルピロリン酸（ＰＰＰ）またはゲラニルゲラニルピロリン酸に結合して、α−トコフェロールおよびα−トコトリエノールの前駆体（すなわち、２−メチル−６−フィチル−ヒドロキノンおよび２−メチル−６−ゲラニルゲラニルヒドロキノン）をそれぞれ形成する。メチル基供与体としてのＳ−アデノシルメチオニンでのメチル化ステップでまず２，３−ジメチル−６−フィチルキノールを生じ、その後の環化でγ−トコフェロールを生じ、さらなるメチル化でα−トコフェロールを生じる。
【００１６】
トコフェロール合成経路（本発明の目的において、トコフェロールを介したヒドロキシフェノールピルビン酸からの生合成経路を意味すると理解されたい）の生合成遺伝子を過剰発現またはダウンレギュレートすることによって植物中のビタミンＥ含量を改変することが知られている。
【００１７】
ＷＯ ９７／２７２８５は、酵素 ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）の高度な発現またはダウンレギュレーションによりトコフェロール含量を改変することを記載している。
【００１８】
ＷＯ ９９／０４６２２およびＤ． ＤｅｌｌａＰｅｎｎａら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８， ２８２， ２０９８−２１００は、ラン藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から得たγ−トコフェロールメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列、ならびにそれをビタミンＥ含量を改変されたトランスジェニック植物へ組み込むことを記載している。
【００１９】
イソプレノイド側鎖の生合成経路の生合成遺伝子を過剰発現またはダウンレギュレートすることにより、植物中のビタミンＥ含量を改変することがさらに知られている。
【００２０】
ＷＯ ９９／２３２３１は、トランスジェニック植物におけるゲラニルゲラニルレダクターゼの発現が、高いトコフェロール生合成を生じることを示している。
【００２１】
ＷＯ ００／０８１６９は、１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−リン酸合成酵素およびゲラニルゲラニルピロリン酸酸化還元酵素をコードする遺伝子配列、ならびにそれらをビタミンＥ含量が改変されたトランスジェニック植物に組み込むことを記載している。
【００２２】
これらの方法は全て、精製化学物質であるビタミンＥの含量が改変された生物（特に植物）を産生するが、ビタミンＥ含量のレベルは、トランスジェニック生物からの単離によるビタミンＥ生成のプロセスのためには未だに満足できないものであることが多い。
【００２３】
本発明の目的は、従来技術の上記欠点を示さない最適化性質を有する生物、すなわち精製化学物質を生成可能なトランスジェニック生物を培養することによる、精製化学物質の生成のためのさらなるプロセスを提供することである。
【００２４】
シキミ酸経路が野生型のものに比べて遺伝子学的に改変されている生物を培養することによる、精製化学物質の生産方法により、上記目的が達成できることを発見した。
【００２５】
シキミ酸経路は、本発明の目的において、特により高等な植物について、Ｄ−エリトロース−４−リン酸から出発し、シキミ酸、コリスミ酸、プレフェン酸、アロゲン酸、チロシンを介して４−ヒドロキシフェニルピルビン酸までの生合成経路を意味すると理解されるべきである（Ｇ． Ｍｉｃｈａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ−Ａｔｌａｓ， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， １９９９， ５９−６０頁， 図４．７−１、および４．７．１章）。
【００２６】
シキミ酸経路は、本発明の目的において、好ましくはシキミ酸から４−ヒドロキシフェニルピルビン酸までの代謝経路、特に好ましくはコリスミ酸から４−ヒドロキシフェニルピルビン酸までの代謝経路、コリスミ酸から進み、プレフェン酸、アロゲン酸およびチロシンを介する植物の代謝経路を意味すると理解されるべきである。
【００２７】
精製化学物質は、シキミ酸経路から生じる生物の代謝産物を意味すると理解されるべきである。これに関連して、シキミ酸経路は、上記したように、Ｄ−エリトロース−４−リン酸から出発し、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸で終わる。これらの代謝産物について、出発化合物Ｄ−エリトロース−４−リン酸、最終産物４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、およびシキミ酸経路の上記全ての中間体は、出発化合物（以下、中間体とも呼ぶ）を構成し、これらは生物により代謝産物に生体内変換される。
【００２８】
好ましい精製化学物質は、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなど）、サリチル酸誘導体、葉酸誘導体、フェニルプロパノイド（例えば、リグニン、リグナンまたはクマリン、特にスコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ）またはスコポリンなど）、フラボノイド（例えば、カルコン、フラボノン、フラバノール（ｆｌａｖａｎｏｌ）、アントシアニジンまたはイソフラボノイドなど）、スチルベン、キサントンまたはキノン誘導体（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ユビキノン、プラストキノンまたはシコニンなど）である。
【００２９】
特に好ましい精製化学物質は、ビタミンＥ、ビタミンＫまたはユビキノン、特にビタミンＥである。
【００３０】
シキミ酸経路の遺伝子学的改変によってシキミ酸経路の一部を形成する特定の中間体への代謝の流れを高めるか低下させるかにより、この中間体から生物において生合成される精製化学物質の含量が増加するか減少する。従って、シキミ酸経路の遺伝子学的改変は、シキミ酸経路の中間体への代謝産物の流れの増加または減少を意味すると理解されることが好ましい。
【００３１】
中間体への代謝の流れの増加を生じ、それによって対応する精製化学物質をもたらすシキミ酸経路（従って対応する精製化学物質）の遺伝子学的改変は、例えば、以下の手段Ａ、ＢまたはＣである。
【００３２】
Ａ：例えば、中間体を生じる代謝経路の負の調節機構をスイッチオフすること（例えば、所望の生物において調節を受けないオーソロガス遺伝子のフィードバック阻害または導入をスイッチオフすることなど）により酵素活性を有するタンパク質をコードするシキミ酸経路の遺伝子を過剰発現させて、野生型のシキミ酸経路の少なくとも１つの酵素の活性を増加させること。
【００３３】
Ｂ：野生型シキミ酸経路の代謝経路を橋渡しする遺伝子であって、野生型にオーソロガス遺伝子が存在しない遺伝子を少なくとも１つ生物に導入すること、例えば、この遺伝子は、新規遺伝子機能により、橋渡しの終点の中間体への物質の流れの増加を生じ得る。
【００３４】
Ｃ：所望の生成物を生じる代謝経路の酵素と競合する酵素をコードする遺伝子の不活性化。
【００３５】
中間体への代謝の流れの減少を生じるシキミ酸経路（従って対応する精製化学物質）の遺伝子学的改変は、例えば、以下の手段Ｄ、ＥまたはＦである：
Ｄ：代謝系の遺伝子の過剰発現、つまりこの中間体から経路をはずれる（ｌｅａｄ ａｗａｙ ｆｒｏｍ）、対応する酵素活性の増加；
Ｅ：例えばアンチセンス技術または同時抑制による、この中間体を生じる酵素をコードする遺伝子の不活性化；
Ｆ：例えば、野生型のシキミ酸経路の代謝経路を橋渡しすることができ、野生型にオーソロガス遺伝子が存在しない遺伝子の発現の結果、この新規遺伝子の作用により橋渡しされた中間体への物質の流れを減少させ得ること。
【００３６】
本発明による方法の好適な実施形態では、生物におけるシキミ酸経路の遺伝子学的改変は、所望の中間体への代謝の流れの増加、つまり対応する所望の精製化学物質の増加を生じる。
【００３７】
手段ＡおよびＢからなる群より選択される少なくとも１つの手段により（すなわち手段Ａおよび／またはＢにより）、シキミ酸経路の所望の中間体への代謝の流れ、つまり所望の精製化学物質を増大させることが好ましい。
【００３８】
以下の手段ＡおよびＢ、
Ａ：野生型のシキミ酸経路の少なくとも１つの酵素の活性を増加させること； Ｂ：野生型シキミ酸経路の代謝経路を橋渡しする遺伝子であって、野生型にオーソロガス遺伝子が存在しない遺伝子を少なくとも１つ生物に導入すること、
からなる群より選択される少なくとも１つの手段を実施することを含む。
【００３９】
手段Ａに従って野生型のシキミ酸経路の少なくとも１つの酵素の活性を増加させることは、例えば、中間体を生じる代謝経路の負の調節機構をスイッチオフすること（例えば、核酸、すなわちシキミ酸経路の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の過剰発現、フィードバック阻害をスイッチオフすること等による中間体を生じる代謝経路の負の調節機構をスイッチオフすること、または所望の生物において調節を受けないオーソロガス遺伝子を導入することなどによってなされる。
【００４０】
野生型のシキミ酸経路の少なくとも１つの酵素の活性を、手段Ａに従い、シキミ酸経路のこの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸を過剰発現させることにより、増加させることが好ましい。
【００４１】
この方法の好適な実施形態では、手段Ａは、コリスミ酸ムターゼをコードする核酸を生物に導入することにより行われる。
【００４２】
コリスミ酸ムターゼは、コリスミ酸をプレフェン酸に転換する酵素活性を有するタンパク質を意味すると理解されるべきである。
【００４３】
原則的に、例えば、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ Ｃｒｉｓｐｕｍ）コリスミ酸ムターゼ（受託番号：Ｔ１４９０２、Ｔ１４９０１）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）コリスミ酸ムターゼ（Ｔ３６８６５）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）コリスミ酸ムターゼ（Ａ３３８９４）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）コリスミ酸ムターゼ（ＡＡＤ３００６５）、もしくは以下に記載するシロイヌナズナコリスミ酸ムターゼ、または以下に記載する大腸菌コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）のコリスミ酸ムターゼ活性など、全てのコリスミ酸ムターゼが本発明による方法において使用できる。
【００４４】
好適な実施形態では、生物内において活性が低減翻訳後調節を受けるコリスミ酸ムターゼをコードするコリスミ酸ムターゼ遺伝子を使用する。低減翻訳後調節とは、活性調節が、野生型の調節と比べて９９％以下、好ましくは７０％以下、特に好ましくは５０％以下の特に好ましくは０％ （すなわち無調節）であると理解されるべきである。
【００４５】
生物内において活性が低減調節（特に無調節）を受けるコリスミ酸ムターゼをコードするコリスミ酸ムターゼ遺伝子は、例えば、発現の局所において低減翻訳後調節（特に翻訳後無調節）を受ける、異なる属の生物に由来するコリスミ酸ムターゼ遺伝子、または同じ生物もしくは関連する属の生物に由来するコリスミ酸ムターゼ遺伝子である。
【００４６】
本発明によれば、生物とは、例えば、野生型としてまたは遺伝子改変により上記精製化学物質を生成可能な細菌、酵母、藻類、コケ類、菌類または植物などの原核生物または真核生物を意味すると理解されるべきである。好ましい生物は、例えば、既に野生型として上記精製化学物質を生成可能なシアノバクテリア、コケ類、藻類または植物などの光合成活性生物である。
【００４７】
特に好ましい生物は植物である。
【００４８】
本発明による方法の手段Ａのさらに好適な実施形態では、植物において活性が低減翻訳後調節を受けるコリスミ酸ムターゼをコードするコリスミ酸ムターゼ遺伝子を植物に導入する。
【００４９】
これらは、例えば、一部の細菌コリスミ酸ムターゼ遺伝子、またはこれからもたらされるコリスミ酸ムターゼ遺伝子、すなわち、植物において活性が低減翻訳後活性を受ける細菌コリスミ酸ムターゼのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸（例えば、大腸菌コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）のコリスミ酸ムターゼ活性をコードする以下に記載する核酸）、またはこの配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失により誘導され、アミノ酸レベルで細菌コリスミ酸ムターゼの配列と少なくとも３０％の相同性、好ましくは少なくとも５０％の相同性、より好ましくは少なくとも７０％の相同性、特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、コリスミ酸ムターゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸である。
【００５０】
本明細書において、「置換」という用語は、１つ以上のアミノ酸を１つ以上のアミノ酸で交換することを意味すると理解されるべきである。例えば、ＧｌｕでＡｓｐ、ＧｌｎでＡｓｎ、ＶａｌでＩｌｅ、ＬｅｕでＩｌｅ、およびＳｅｒでＴｈｒを交換するなど、置き換えるアミノ酸が元のアミノ酸と同様の性質を有するいわゆる保存的交換を行うことが好ましい。
【００５１】
欠失は、直接結合させることによってアミノ酸を置き換えることである。欠失の好ましい位置は、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメイン間の連結部である。
【００５２】
挿入は、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の導入であり、１つ以上のアミノ酸できちんと置き換えられた直接結合である。
【００５３】
２つのタンパク質間の相同性は、それぞれの場合のタンパク質の長さ全体におよぶアミノ酸の同一性を意味すると理解されることが好ましく、これは以下のパラメータに設定されたプログラムアルゴリズムＧＡＰ（ＵＷＧＣＧ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）で支援された比較により計算されることが好ましい：
ギャップ重み：１２
長さ重み：４
平均マッチ：２．９１２
平均ミスマッチ：−２．００３
従って、上記大腸菌コリスミ酸ムターゼの配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有するタンパク質は、好ましくは上記パラメータ設定で上記プログラムアルゴリズムを用いて上記コリスミ酸ムターゼの配列と配列を比較した場合に少なくとも３０％の相同性を有するタンパク質を意味すると理解されるべきである。
【００５４】
細菌コリスミ酸ムターゼ遺伝子、またはこれからもたらされるコリスミ酸ムターゼ遺伝子は、コリスミ酸ムターゼの性質および別の酵素（例えば、以下に記載する大腸菌Ｋ１２由来のコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｔｙｒＡ））の性質を有するタンパク質もコードし得る。以下に記載するように、本実施形態は、手段ＡおよびＢを組み合わせて行う場合に特に好ましい。
【００５５】
本発明による方法の手段Ａの特に好適な実施形態では、特に手段Ａのみを行う場合、コリスミ酸ムターゼ遺伝子を、生物において、対応するコリスミ酸ムターゼが低減翻訳後調節を受ける特定の部位に導入する。
【００５６】
これに関連して、発現部位において低減翻訳後調節を受ける、同じ生物に由来するかまたは関連する属の生物に由来するコリスミ酸ムターゼをコードする核酸を使用することが好ましい。
【００５７】
生物の異なる画分から単離されたコリスミ酸ムターゼのアイソフォームは、その調節において相違する。
【００５８】
生物の特定の画分に由来するか、または関連する属の生物に由来する、対応するコリスミ酸ムターゼ遺伝子を、生物において、コードされるコリスミ酸ムターゼが翻訳後調節を受けない別の画分に導入できる。
【００５９】
本発明による方法の特に好適な実施形態では、植物において、植物の細胞質コリスミ酸ムターゼをコードする核酸を、植物のプラスチドに導入して、手段Ａを実施する。
【００６０】
この目的に適した核酸は、原則的に、植物の細胞質コリスミ酸ムターゼをコードする全ての核酸、好ましくはシロイヌナズナの細胞質コリスミ酸ムターゼ（配列番号３）をコードする核酸、およびこれに由来する天然型または非天然型核酸である。
【００６１】
様々な生物において、コリスミ酸ムターゼは様々なアイソフォームで存在することが分かっている。従って、３つの異なるコリスミ酸ムターゼをシロイヌナズナから単離した（Ｅｂｅｒｈａｒｄら１９９３． ＦＥＢＳ ３３４， ２３３−２３６；Ｅｂｅｒｈａｒｄら１９９６． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １０， ８１５−８２１；Ｍｏｂｌｅｙら１９９９． Ｇｅｎｅ １５；２４０（１）：１１５−１２３）。
【００６２】
これらのアイソフォームは、それらの局所化およびそれらの酵素特性が互いと異なる。従って、コリスミ酸ムターゼ−１は、プラスチドに局所化し、芳香族アミノ酸によりアロステリック調節される。
【００６３】
細胞質イソ酵素コリスミ酸ムターゼ−２は、公知の調節を受けない（Ｂｅｎｅｓｏｖａ， Ｍ． Ｂｏｄｅ， Ｒ， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２， ３１， ２９８３−２９８７）。
【００６４】
シロイヌナズナの細胞質コリスミ酸ムターゼをコードする核酸、およびそこから誘導される天然型または非天然型核酸は、細胞質コリスミ酸ムターゼのアミノ酸配列（配列番号４）、またはこの配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失により誘導され、配列番号４の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性、好ましくは少なくとも５０％の相同性、より好ましくは少なくとも７０％の相同性、特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、コリスミ酸ムターゼの酵素特性を有する配列、を含むタンパク質をコードする核酸を意味すると理解される。
【００６５】
従って、配列番号４の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有するタンパク質は、好ましくは上記パラメータ設定で上記プログラムアルゴリズムを用いて配列番号４と配列を比較した場合に、少なくとも３０％の相同性を有するタンパク質を意味すると理解されるべきである。
【００６６】
本発明による方法の別の好適な実施形態では、シロイヌナズナの細胞質コリスミ酸ムターゼ（配列番号４）をコードする核酸を植物のプラスチドに導入する。
【００６７】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝子コードに従ってポリペプチド配列を戻し翻訳（ｂａｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ）することにより得ることができる。
【００６８】
この目的のために好ましく使用されるコドンは、植物特有のコドン利用度において頻繁に使用されるものである。コドン利用は、該当する植物の他の公知遺伝子のコンピュータによる評価を参照することにより容易に決定できる。
【００６９】
本発明による方法のさらに特に好適な実施形態では、配列番号３の配列の核酸を植物のプラスチドに導入する。配列番号３の配列は、シロイヌナズナの細胞質コリスミ酸ムターゼ（コリスミ酸ムターゼ−２）の遺伝子を示す。
【００７０】
植物のプラスチドへの、コリスミ酸ムターゼをコードする核酸の導入は、例えば、コリスミ酸ムターゼプレフェン酸デヒドロゲナーゼについて以下に詳細に記載するように、核酸配列がコリスミ酸ムターゼ融合タンパク質（融合タンパク質の一部はポリペプチドの転位を支配する輸送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ））をコードする発現カセットを植物に導入することにより達成できる。好ましいのは、葉緑体への細胞質コリスミ酸ムターゼの移行の後にコリスミ酸ムターゼ部分から酵素的切断される葉緑体特異的輸送ペプチドである。
【００７１】
本発明による方法のさらなる特に好適な実施形態では、プラスチド輸送ペプチドをコードする核酸と、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、または該アミノ酸配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりもたらされる配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有し、コリスミ酸ムターゼの酵素特性を有する配列、を含むタンパク質をコードする核酸とを含む核酸構築物を、植物に導入する。
【００７２】
プラスチド輸送ペプチドをコードする核酸は、例えば、ＮｃｏＩ切断部位にＡＴＧコドンがあるＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ断片として、３つのリーディングフレームにあるタバコプラスチドトランスケトラーゼのプラスチド輸送ペプチドの以下の３つのカセットのＤＮＡ配列である。
【００７３】
ｐＴＰ０９

ｐＴＰ１０

ｐＴＰ１１

またはシロイヌナズナのプラスチドコリスミ酸ムターゼ−１のプラスチド輸送ペプチドをコードする核酸（配列番号７）：

【００７４】
シロイヌナズナのプラスチドコリスミ酸ムターゼ−１のプラスチド輸送ペプチドをコードする核酸を使用して、プラスチドにおける細胞質コリスミ酸ムターゼの局所化させることが好ましい。
【００７５】
従って、本発明による方法のさらなる特に好適な実施形態では、シロイヌナズナのプラスチドコリスミ酸ムターゼ−１のプラスチド輸送ペプチドをコードする核酸と、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、またはこの配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失により誘導され、配列番号４の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有し、コリスミ酸ムターゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸とを含む核酸構築物を、植物に導入する。
【００７６】
配列（配列番号５）を含む核酸構築物を植物に導入することが、本発明による方法の手段Ａのために特に好ましい。
【００７７】
配列番号５は、シロイヌナズナのプラスチドコリスミ酸ムターゼ−１のプラスチド輸送ペプチドをコードする核酸と、シロイヌナズナの細胞質コリスミ酸ムターゼ−２をコードする核酸との核酸構築物を構成する。
【００７８】
本出願は、特に、これらの核酸構築物、および本発明による方法の手段Ａにおけるそれらの使用に関する。
【００７９】
図１は、例として、エリトロース−４−リン酸から出発しビタミンＥまでの生合成スキームを示す。コリスミ酸ムターゼ遺伝子の追加の発現により、野生型のシキミ酸経路が遺伝子学的に改変され、ヒドロキシフェニルピルビン酸への代謝産物の流れが増加する。この時点で量が増えたヒドロキシフェニルピルビン酸は、さらにトコフェロールに向かって反応する。ヒドロキシフェニルピルビン酸含量が高いことにより、ビタミンＥおよび／またはビタミンＫへの高い変換が生じる。高いヒドロキシフェニルピルビン酸含量は、ビタミンＥ含量の増加を生じることが好ましい。
【００８０】
例えばＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ．Ｆ． ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）、Ｔ．Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ． ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８４）、ならびにＡｕｓｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７）に記載されるように慣習的な組換えおよびクローニング技術を用いて、以下に詳細に記載するように、適切なプロモーターを適切なコリスミ酸ムターゼ核酸配列と融合させ、プロモーターとコリスミ酸ムターゼ核酸配列との間にプラスチド輸送ペプチドをコードする核酸を挿入し（すなわち、好ましくは適切なプロモーターを適切な上記核酸構築物と融合させ）、およびポリアデニル化シグナルと融合させることにより発現カセットを作製する。
【００８１】
野生型のシキミ酸経路を改変するための手段Ｂは、上述したように、野生型にはオーソロガス遺伝子が存在せず、野生型のシキミ酸経路の代謝経路を橋渡しする少なくとも１つの遺伝子を、生物に導入することにより行う。この遺伝子は、新規酵素活性により、橋渡しの終点である中間体への物質の流れの増加を生じる酵素をコードする。この新規酵素活性は、生物による調節を受けないこと、つまり、例えば限られた代謝調節位置を迂回するように代謝経路をショートカットすることが好ましい。これにより、限られた物質への代謝産物の流れを既存の調節から解放することができる。
【００８２】
野生型におけるオーソロガスな遺伝子とは、別の生物から誘導されるがコードする酵素の活性が既に野生型に存在する遺伝子を意味すると理解されるべきである。
【００８３】
従って、「野生型にオーソロガス遺伝子が存在しない遺伝子」という語句は、形質転換前の野生型ではコードする酵素活性が存在しないか、または活性化されていない別の生物に由来する遺伝子を意味すると理解されるべきである。
【００８４】
野生型におけるオーソロガスな遺伝子は、別の生物由来の機能的等価物を意味すると理解されることが好ましい。機能的等価物とは、遺伝子生成物（タンパク質）の性質を備えていることを意味すると理解される。
【００８５】
従って、「野生型にはオーソロガス遺伝子が存在しない遺伝子」という語句は、野生型では上記定義による機能的等価物が存在せず、ゆえに、植物において既に存在する生成物（代謝産物を含む）を生成するための代替的な代謝経路を生成する代謝能力を確立する遺伝子を意味すると理解されることが好ましい。
【００８６】
本発明によれば、手段Ａについて上述したように、生物は、例えば、野生型としてまたは遺伝子改変により上記精製化学物質を生成可能な細菌、酵母、藻類、コケ類、菌類または植物などの原核生物または真核生物を意味すると理解されるべきである。好ましい生物は、例えば、既に野生型として上記精製化学物質を生成可能なシアノバクテリア、コケ類、藻類または植物などの光合成活性生物である。
【００８７】
特に好ましい生物は植物である。
【００８８】
従って、本発明による方法の特に好適な実施形態では、植物を、形質転換される生物として使用する。この場合、植物においてオーソロガス遺伝子が存在せず、手段Ｂを実施するのに好ましい遺伝子としては、細菌遺伝子がある。
【００８９】
本発明による方法の手段Ｂの好適な実施形態では、植物のシキミ酸経路の代謝経路は、導入された少なくとも１つの遺伝子により橋渡しされる。
【００９０】
本発明による方法の手段Ｂの特に好適な実施形態では、プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸を、植物に導入する。プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする全ての遺伝子が、本発明による方法の好適な実施形態に適している。
【００９１】
プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、プレフェン酸を４−ヒドロキシフェニルピルビン酸に転換する酵素活性を有する酵素を意味すると理解されるべきである。
【００９２】
プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードし、本発明による方法において使用できる核酸の例としては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（受託番号Ｘ７８４１３）、ラン藻種ＰＣＣ ６８０３（ｓｌｒ２０８１）、デイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ） （ＡＡＦ１０６９５）、または枯草菌（Ｐ２０６９２）に由来するプレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がある。これらは全て公知であり、例えばインターネットデータベースなどで利用可能である。その他の例は、これらの公知のプレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子との配列の相同性アライメントにより見つけることができ、例えば、好熱性真正細菌（Ｔｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｉｔｉｍａ）（ＡＡＤ３５４３０）またはヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）２６６９５（受託番号ＡＡＤ０８４２２）に由来する潜在的なプレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などがある。
【００９３】
プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を使用する本発明による方法の好適な実施形態では、ラン藻種ＰＣＣ ６８０３プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列、またはこの配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失により誘導され、ラン藻種ＰＣＣ ６８０３プレフェン酸デヒドロゲナーゼの配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性、好ましくは少なくとも５０％の相同性、より好ましくは少なくとも７０％の相同性、特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、プレフェン酸デヒドロゲナーゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸を導入する。
【００９４】
従って、ラン藻種ＰＣＣ ６８０３プレフェン酸デヒドロゲナーゼの配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有するタンパク質は、好ましくは上記パラメータ設定で上記プログラムアルゴリズムを用いてラン藻種ＰＣＣ ６８０３プレフェン酸デヒドロゲナーゼの配列と配列をアライメントした際に、少なくとも３０％の相同性を示すタンパク質を意味すると理解される。
【００９５】
図１は、例として、エリトロース−４−リン酸から出発しトコフェロールまでの生合成スキームを示す。プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の追加の発現により、野生型のシキミ酸経路が遺伝子改変され、ヒドロキシフェニルピルビン酸への代謝産物の流れが増加する。この時点で量が増えたヒドロキシフェニルピルビン酸は、さらにトコフェロールに向かって反応する。高いヒドロキシフェニルピルビン酸含量により、ビタミンＥおよび／またはビタミンＫへの高い転換が生じる。高いヒドロキシフェニルピルビン酸含量は、ビタミンＥ含量の増加を生じることが好ましい。
【００９６】
しかし、本発明による代謝経路の橋渡しとの組合せが適切であれば、シキミ酸経路のさらなる酵素を過剰発現させて、所望の精製化学物質への代謝産物の流れの増加を生じることが有利である。
【００９７】
従って、本発明による方法のさらに好適な実施形態では、手段ＡおよびＢが組み合わせて実施される。
【００９８】
本発明による方法の変法の特に好適な実施形態では、プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸を、コリスミ酸ムターゼをコードする核酸と組み合わせて植物に導入する。
【００９９】
例えば、この組合せは、コリスミ酸ムターゼ活性を有する酵素およびプレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をそれぞれコードする２つの核酸を導入することにより達成可能である。本実施形態のために、それぞれがこれらの酵素のうちの１つをコードする２つの異なる核酸を植物に導入することが必要である。
【０１００】
本発明による方法の特に好適な実施形態では、この組合せは、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸を植物に導入することにより１つの核酸で達成される。
【０１０１】
コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とは、コリスミ酸ムターゼおよびプレフェン酸デヒドロゲナーゼの両方の酵素特性を有するタンパク質をコードする。従って、核酸を導入することで、低減翻訳後調節を受ける酵素活性を過剰発現させるか、または酵素活性を導入し（コリスミ酸ムターゼ）、酵素の性質を新たに導入する（プレフェン酸デヒドロゲナーゼ）。
【０１０２】
コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、コリスミ酸を４−ヒドロキシフェニルピルビン酸に転換する酵素活性を有する酵素を意味すると理解されるべきである。
【０１０３】
本発明によるこの方法の変法のさらに特に好適な実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、または該アミノ酸配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりもたらされる配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性、好ましくは少なくとも５０％の相同性、より好ましくは少なくとも７０％の相同性、特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸を導入する。
【０１０４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質は、大腸菌Ｋ１２コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）を構成する。
【０１０５】
従って、配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有するタンパク質とは、好ましくは上記パラメータ設定で上記プログラムアルゴリズムを用いて配列番号２の配列と配列をアライメントした際に、少なくとも３０％の相同性を有するタンパク質を意味すると理解されるべきである。
【０１０６】
本明細書において言及する全ての核酸は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列であり得る。
【０１０７】
適切な核酸配列は、上述したように、遺伝子コードに従いポリペプチド配列を戻し翻訳することにより得ることができる。
【０１０８】
この目的のために使用される好ましいコドンは、生物特有のコドン利用に従って頻繁に使用されるものである。コドン利用は、該当する生物の他の公知遺伝子のコンピュータによる評価を参照することにより容易に決定できる。
【０１０９】
例えば、タンパク質が植物において発現される場合、戻し翻訳のために植物のコドン利用を使用することが有利である場合が多い。
【０１１０】
さらに好ましいコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらのコード核酸は、特に、例えば、エルウィナ・ハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（受託番号Ｘ６０４２０；このタンパク質は、５’側端部にある１０９ Ｂｐ領域を欠失させることにより単官能プレフェン酸デヒドロゲナーゼにも転換され、その後例えば上述したようにプレフェン酸デヒドロゲナーゼとして使用され得る）、もしくはボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）（受託番号ＡＡＦ０１２８９）に由来するコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などの細菌由来源の核酸であり、またはデータベースから得たアミノ酸配列または対応する戻し翻訳された核酸配列と、配列番号２もしくは上記他の配列（例えばメタン生成古細菌（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎａｓｃｈｉｉ）（受託番号Ｑ５８０２９）由来の潜在的なコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子など）との相同性アライメントによりゲノム配列が公知である様々な生物から容易に同定され得る。
【０１１１】
特に使用されるのに好ましい核酸は、細菌コリスミ酸ムターゼプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする。
【０１１２】
さらに特に使用されるのに好ましい核酸は、配列番号１の配列を有する。この核酸は、配列番号２のコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする原核生物大腸菌Ｋ１２ゲノムＤＮＡ（ｔｙｒＡ遺伝子とも呼ばれる）を構成する。
【０１１３】
図１には、例として、エリトロース−４−リン酸から出発しトコフェロールまでの生合成のスキームを示している。コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の追加の発現により、野生型のシキミ酸経路が遺伝子改変され、ヒドロキシフェニルピルビン酸への代謝産物の流れが増加する。この時点で量が増えたヒドロキシフェニルピルビン酸は、さらにトコフェロールに向かって反応する。高いヒドロキシフェニルピルビン酸含量により、ビタミンＥおよび／またはビタミンＫへの転換が増大する。ヒドロキシフェニルピルビン酸含量が高いことによりビタミンＥ含量の増加がもたらされることが好ましい。
【０１１４】
精製化学物質の生成のための本発明による方法においては、トランスジェニック生物を培養するステップの後、該生物を回収し、該生物から精製化学物質を単離することが好ましい。
【０１１５】
生物は、該当する生物に適した公知の方法で回収する。発酵により液体栄養培地において培養される細菌、コケ類、酵母および菌類などの微生物、または植物細胞は、例えば遠心分離、静注または濾過により分離され得る。植物は、公知の方法で栄養基板上で育てて、それ相応に回収する。
【０１１６】
精製化学物質は、例えば抽出など公知の方法、および適切であれば、さらに化学的または物理的精製方法（例えば沈降法、結晶法（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）、熱分離法（精留（ｒｅｃｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法など）など、または物理的分離法（例えば、クロマトグラフィーなど）により回収されたバイオマスから単離される。
【０１１７】
例えば、ビタミンＥは、植物油または植物油の脱臭（ｄｅｏｄｏｒｉｚａｔｉｏｎ）において得られる蒸気留分（脱臭縮合物）からの化学転換（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）および蒸留により油含有植物から単離されることが好ましい。
【０１１８】
ビタミンＥを脱臭縮合物から単離するさらなる方法は、例えば、ＤＥ ３１ ２６ １１０ Ａ１、ＥＰ １７１ ００９ Ａ２、ＧＢ ２ １４５ ０７９、ＥＰ ３３３ ４７２ Ａ２、およびＷＯ ９４／０５６５０に記載されている。
【０１１９】
トランスジェニック生物（特に植物）は、出発生物（特に植物）を、上記核酸（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、もしくはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸）を含む核酸構築物、または上記核酸構築物（特にプラスチド輸送ペプチドおよび細胞質コリスミ酸ムターゼをコードする核酸構築物）で形質転換することにより生成されることが好ましい。
【０１２０】
コード核酸配列またはコード核酸構築物が、生物（特に植物）における転写および翻訳を確実にする１つ以上の調節シグナルと機能的に連結した、これらの核酸構築物は、以下において発現カセットとも呼ばれる。
【０１２１】
従って、本発明はさらに、発現カセットとして作用し、宿主生物（特に植物）において確実に転写および翻訳する１つ以上の調節シグナルと機能的に連結した上記核酸（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、もしくはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸）を含む核酸構築物、または上記核酸構築物（特にプラスチド輸送ペプチドおよび細胞質コリスミ酸ムターゼをコードする核酸構築物）を含む核酸構築物に関する。
【０１２２】
発現カセットは、プラスチドに確実に局在させるプラスチド輸送ペプチドをコードする核酸を含むことが好ましい。
【０１２３】
発現カセットは、宿主細胞におけるコード配列の発現を支配する調節シグナル、また調節核酸配列を含む。好適な実施形態によれば、発現カセットは上流（すなわち、コード配列の５’側）にプロモーターを、下流（すなわち、３’側）にポリアデニル化シグナルを含み、適切であれば、少なくとも１つの上記遺伝子の介入コード配列に作用可能に連結された追加の調節エレメントを含む。作用可能な連結とは、コード配列が発現された場合に各調節エレメントがその意図する機能を遂行できるような、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および適切であればその他の調節エレメントの逐次的配列を意味すると理解されるべきである。
【０１２４】
以下の記載は、例として、好ましい核酸構築物、植物発現カセット、およびトランスジェニック植物の生成方法を説明する。
【０１２５】
作用可能な連結のために好ましい配列（ただしこれらに限定されない）は、アポプラスト、液胞、プラスチド、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、核、エライオプラスト、または他の画分における細胞内局所化を確実にするターゲティング配列、およびタバコモザイクウイルス５’リーダー配列などの翻訳エンハンサーがある（Ｇａｌｌｉｅら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５ （１９８７）， ８６９３−８７１１）。
【０１２６】
適切な発現カセットのプロモーターは、原則的に、植物における外来遺伝子の発現を支配可能な任意のプロモーターである。特に植物プロモーターまたは植物ウイルスから誘導されたプロモーターを利用することが好ましい。特に好ましいのはカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターである（Ｆｒａｎｃｋら， Ｃｅｌｌ ２１ （１９８０）， ２８５−２９４）。公知の通り、このプロモーターは、挿入された遺伝子の永久的かつ構成的発現を全体的に生じる転写エフェクターのための様々な認識配列を含む（Ｂｅｎｆｅｙら， ＥＭＢＯ Ｊ． ８ （１９８９）， ２１９５−２２０２）。
【０１２７】
発現カセットは、特定の時点において植物中の外因性ｔｙｒＡ遺伝子の発現を支配できる化学的に誘導可能なプロモーターも含み得る。使用可能なこのようなプロモーターの例としては、ＰＲＰ１プロモーター（Ｗａｒｄら， Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２（１９９３）， ３６１−３６６）、サリチル酸誘導可能プロモーター（ＷＯ ９５／１９４４３）、ベンゼンスルホンアミド誘導可能プロモーター（ＥＰ−Ａ ３８８１８６）、テトラサイクリン誘導可能プロモーター（Ｇａｔｚら， （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２， ３９７−４０４）、アブシジン酸誘導可能プロモーター（ＥＰ−Ａ ３３５５２８）、またはエタノール−もしくはシクロヘキサノン誘導可能プロモーター（ＷＯ ９３／２１３３４）がある。
【０１２８】
さらに、好ましいプロモーターは、特に、例えば該当する精製化学物質（特にビタミンＥまたはその前駆体）の生合成が生じる組織または植物器官において確実に発現をもたらすものである。特に言及しなければならないプロモーターは、葉特異的発現を確実にするものである。言及され得るプロモーターは、ジャガイモ細胞質ＦＢＰアーゼプロモーター、またはジャガイモＳＴ−ＬＳＩプロモーターである（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら， ＥＭＢＯ Ｊ． ８ （１９８９）， ２４４５−２４５）。
【０１２９】
種子特異的プロモーターを利用することにより、トランスジェニックタバコ植物の種子中の合計可溶性種子タンパク質の０．６７％まで外来タンパク質を安定して発現した（ＦｉｅｄｌｅｒおよびＣｏｎｒａｄ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０ （１９９５）， １０９０−１０９４）。従って、発現カセットは、例えば、種子特異的プロモーター（好ましくはファセオリンプロモーター（ＵＳ５５０４２００）、ＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ， Ｈ．ら， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． （１９９１） ２２５ （３）， ４５９−４６７）、ＬＥＢ４プロモーター（ＦｉｅｄｌｅｒおよびＣｏｎｒａｄ， １９９５）、スクロース結合タンパク質プロモーター（Ｚｉｔａｔ））、ＬＥＢ４シグナルペプチド、発現される遺伝子、およびＥＲ保持シグナルを含み得る。
【０１３０】
例えばＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ．Ｆ． ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）、ならびにＴ．Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ． ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８４）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７）に記載されるように慣例的な組換えおよびクローニング技術を用いて、例えば、適切なプロモーターを、適切な上記核酸配列（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、もしくはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸）、好ましくはプロモーターと核酸配列との間に挿入され、葉緑体特異的輸送ペプチドをコードする核酸、およびポリアデニル化シグナルと融合させることにより、発現カセットが生成される。
【０１３１】
コリスミ酸ムターゼについて記載したように、プラスチドへのターゲティングを確実にする挿入配列は特に好ましい。
【０１３２】
核酸配列が融合タンパク質（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ融合タンパク質）をコードする発現カセットを使用することも可能である。融合タンパク質の一部はポリペプチドの転位を支配する輸送ペプチドである。好ましいのは、タンパク質（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ）が葉緑体に転位した後に、タンパク質部分（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、および／またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ部分）から酵素的に切断される葉緑体特異的輸送ペプチドである。特に好ましいのは、プラスチドタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）トランスケトラーゼから誘導される輸送ペプチド、または別の輸送ペプチド（例えば、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット輸送ペプチド、またはフェレドキシンＮＡＤＰ酸化還元酵素輸送ペプチド、およびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ−２輸送ペプチド）、またはその機能的等価物である。
【０１３３】
プラスチドコリスミ酸ムターゼの輸送ペプチド、またはそのコード核酸の使用は、上述したように細胞質コリスミ酸ムターゼ、または細胞質コリスミ酸ムターゼをコードする核酸を使用するために特に好ましい。
【０１３４】
本発明による使用のために特に好ましい本発明による他の核酸は、ＮｃｏＩ切断部位においてＡＴＧコドンを有するＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ断片として、３つのリーディングフレームにおけるタバコプラスチドトランスケトラーゼのプラスチド輸送ペプチドの３つのカセットのＤＮＡ配列である。
【０１３５】
ｐＴＰ０９

ｐＴＰ１０

ｐＴＰ１１

プラスチド輸送ペプチドの別の例は、シロイヌナズナプラスチドイソペンチルピロリン酸イソメラーゼ−２（ＩＰＰ−２）の輸送ペプチドである。
【０１３６】
本発明による核酸、特にコリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、合成されるか、または天然に得られるか、または合成および天然型核酸構築物の混合物を含むか、さもなければ様々な生物の様々な異種遺伝子セグメントからなる。
【０１３７】
上述したように好ましいのは、植物に好ましいコドンを有する合成ヌクレオチド配列である。植物に好ましいこれらのコドンは、対象とするほとんどの植物種において発現される最も高いタンパク質頻度を有するコドンから決定され得る。
【０１３８】
発現カセットを調製する場合、様々なＤＮＡ断片を操作して、都合良く正確な方向で読まれる、正確なリーディングフレームを備えるヌクレオチド配列を得ることができる。ＤＮＡ断片を互いと連結するために、アダプターまたはリンカーを断片に加えてもよい。
【０１３９】
プロモーターおよびターミネーター領域に、この配列の挿入のための１つ以上の制限部位を含むリンカーまたはポリリンカーを、転写の方向に都合良く加えてもよい。原則として、リンカーは１〜１０、ほとんどの場合１〜８、好ましくは２〜６の制限部位を有する。一般的に、調節領域内のリンカーは、１００ ｂｐ未満、多くの場合は６０ ｂｐ未満、ただし少なくとも５ ｂｐの大きさを有する。プロモーターは、宿主植物に対して天然（すなわち同種）であっても、さもなくば外来（すなわち異種）のいずれであってもよい。発現カセットは、転写の５’−３’方向に、プロモーター、コード核酸配列または核酸構築物、および転写終結のための領域を含むことが好ましい。所望に応じて、様々な終結領域を互いと置き換えることができる。
【０１４０】
さらに、適切な制限切断部位を提供するか、または過剰ＤＮＡもしくは制限切断部位を排除する操作を採用できる。挿入、欠失または置換（例えばトランジションおよびトランスバージョンなど）が適切な場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー修復、制限またはライゲーションが使用できる。
【０１４１】
適切な操作であれば、ライゲーションのために断片の相補的末端を加えてもよい（例えば、平滑末端を得るために突出部分を制限消化、切取り、または埋めることなど）。
【０１４２】
好ましいポリアデニル化シグナルは、植物ポリアデニル化シグナル、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエン（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔ−ＤＮＡポリアデニル化シグナルに本質的に対応するもの、特に、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（Ｇｉｅｌｅｎら， ＥＭＢＯ Ｊ． ３ （１９８４）， ８３５、以下参照）のＴ−ＤＮＡ（オクトピンシンターゼ）の遺伝子３のもの、または機能的等価物である。
【０１４３】
本発明はさらに、トランスジェニック植物の作製のための、上記核酸（特にコリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼまたはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸）の使用、または上記核酸構築物もしくはタンパク質（特にコリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼもしくはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ）の使用に関する。
【０１４４】
これらのトランスジェニック植物における精製化学物質（特にユビキノン、ビタミンＥおよび／またはビタミンＫ、好ましくはビタミンＥ）の含量は、野生型のものと比べて増加することが好ましい。
【０１４５】
高いビタミンＥ含量の植物は、非生物ストレスに対して高い耐性を有することが知られている。非生物ストレスは、例えば、低温度、氷結、渇水、高温度、および塩類を意味すると理解されるべきである。
【０１４６】
従って、本発明は、野生型と比べて非生物ストレスに対する耐性が高められたトランスジェニック植物を作製するための、上記核酸の使用にさらに関する。
【０１４７】
上記タンパク質および核酸は、トランスジェニック生物において精製化学物質を生成するため（好ましくは、トランスジェニック植物においてビタミンＥ、ビタミンＫおよび／またはユビキノン、特にビタミンＥを生成するため）に使用できる。
【０１４８】
外来遺伝子を生物（特に植物）のゲノムに導入することを、形質転換と呼ぶ。植物において、特に、植物組織または植物細胞から植物を形質転換して再生させるためのそれ自体で公知の方法を、一過性または安定的形質転換のために使用できる。
【０１４９】
植物の形質転換のために適した方法は、ポリエチレン−グリコール誘導型ＤＮＡ摂取によるプロトプラスト形質転換、遺伝子銃を用いたバイオリスティック法（いわゆる粒子衝撃法）、エレクトロポレーション、ＤＮＡ含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクション、および上記アグロバクテリア仲介性遺伝子導入である。上記方法は、例えば、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ， Ｖｏｌ． １， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｓ．Ｄ． ＫｕｎｇおよびＲ． Ｗｕ編集， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９３）， １２８−１４３に掲載のＢ． Ｊｅｎｅｓら， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ならびにＰｏｔｒｙｋｕｓ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ４２ （１９９１）， ２０５−２２５に記載されている。
【０１５０】
発現される構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシエン（例えばｐＢｉｎ１９）を形質転換するのに適したベクターにクローニングされることが好ましい（Ｂｅｖａｎら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２ （１９８４）， ８７１１）。
【０１５１】
従って、本発明は、上記核酸、核酸構築物、または発現カセットを含むベクターにさらに関する。
【０１５２】
発現カセットで形質転換されたアグロバクテリアは、公知の方法で植物を形質転換するために使用できる（例えば、アグロバクテリア溶液中に乱切りした葉または葉切片を浸し、その後適切な培地中で培養するなど）。
【０１５３】
発現カセットは、植物だけではなく、細菌（特にシアノバクテリア、コケ類、酵母、糸状菌類、および藻類）を形質転換するためにも採用できる。
【０１５４】
遺伝子改変された植物（以下、トランスジェニック植物とも呼ぶ）の好ましい生成のために、本発明によるタンパク質（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ）をコードする融合発現カセットを、アグロバクテリウム・ツメファシエンを形質転換するのに適したベクター（例えばｐＢｉｎ１９）にクローニングすることが好ましい。
【０１５５】
このようなベクターで形質転換されたアグロバクテリアは、その後、公知の方法で植物（特に、培養植物）を形質転換するために使用できる（例えば、アグロバクテリア溶液中に乱切りした葉または葉切片を浸し、その後適切な培地中で培養するなど）。
【０１５６】
アグロバクテリアでの植物の形質転換は、特に、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ， Ｖｏｌ． １， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｓ．Ｄ． ＫｕｎｇおよびＲ． Ｗｕ編集， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３， ｐｐ． １５−３８に掲載のＦ．Ｆ． Ｗｈｉｔｅ， Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔｓから公知である。発現カセットに組み込まれた、本発明の遺伝子（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸）の発現用の遺伝子を含むトランスジェニック植物は、公知の方法により、乱切葉または葉切片の形質転換細胞から再生され得る。
【０１５７】
コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸で宿主植物を形質転換するために、発現カセットを、ベクターＤＮＡに機能的調節シグナル（例えば、複製または組込みのための配列）が付加的に含まれている組換えベクターに挿入して組込む。適切なベクターは、特に、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）， ６／７章， ｐｐ． ７１−１１９ （１９９３）に記載されている。
【０１５８】
例えば、植物発現カセットは、３５Ｓプロモーターにより形質転換ベクターｐＢｉｎ−１９の誘導体に取り込まれ得る（Ｂｅｖａｎ， Ｍ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ８７１１−８７２１ （１９８４））。図２は、種子特異的レグミンＢ４プロモーターを有する形質転換ベクターｐＢｉｎ−１９の誘導体を示す。
【０１５９】
上記引用された組換えおよびクローニング技術を用いて、例えば大腸菌における複製を可能にする適切なベクターに発現カセットをクローニングできる。適切なクローニングベクターの例としては、ｐＢＲ３３２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、およびｐＡＣＹＣ１８４がある。大腸菌およびアグロバクテリアの両方において複製可能なバイナリーベクターが特に適している。
【０１６０】
従って、本発明は、上記核酸（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸）の使用、上記核酸構築物（特に、遺伝子改変された植物を作製するため、または植物、植物細胞、植物組織もしくは植物部分の形質転換のための発現カセット）の使用に関する。この使用の好ましい目的は、植物または植物の部分の精製化学物質含量（特に、ビタミンＥ、ビタミンＫまたはユビキノン含量、好ましくはビタミンＥ含量）を増加させることである。
【０１６１】
プロモーターの選択に応じて、葉、種子、花弁、または植物の他の部分において特異的に発現が生じ得る。
【０１６２】
従って、本発明は、上記核酸または上記核酸構築物を出発生物のゲノムに導入することにより、遺伝子改変された生物を生成する方法にさらに関する。
【０１６３】
本発明は、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを、植物細胞または植物プロトプラストに導入すること、およびこれらを再生させて完全な植物を得ることを含む、植物を形質転換する方法に関することが好ましい。
【０１６４】
本発明は、野生型と比べてシキミ酸経路の代謝産物の流れを改変し、生物の精製化学物質含量を野生型のものと比べて改変させるように遺伝子改変された生物にも関する。
【０１６５】
上記したように、好適な遺伝子改変された生物の精製化学物質の含量（特にビタミンＥ、ビタミンＫおよびユビキノンの含量、好ましくはビタミンＥの含量）を、野生型のものと比べて増加させる。
【０１６６】
遺伝子改変された生物とは、本発明によれば、特に、遺伝子改変により、
出発生物が該当する核酸を含む場合には、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、もしくはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸の遺伝子発現を野生型と比べて高められた生物、または
出発生物が該当する核酸を含まない場合には、野生型とは対照的に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、もしくはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸の遺伝子発現が引き起こされた生物、
を意味すると理解されるべきである。
【０１６７】
好適な実施形態では、上記したように、例えばシアノバクテリア、コケ類、藻類または植物などの光合成活性生物、特に好ましくは植物が出発生物として使用され、従って、遺伝子改変された生物としても使用され、野生型と比べて精製化学物質含量が増加した生物を作製するために使用される。
【０１６８】
このようなトランスジェニック植物、その増殖する材料、およびその植物細胞、植物組織、または植物の部分は、本発明のさらなる主題である。
【０１６９】
本発明の目的のための植物は、特に単子葉植物および双子葉植物である。
【０１７０】
好ましい植物は、マンジュギク、ヒマワリ、シロイヌナズナ、タバコ、赤トウガラシ、ダイズ、トマト、ナス、ピーマン、ニンジン、ジャガイモ、トウモロコシ、サラダ用野菜およびキャベツ、穀物、アルファルファ、カラスムギ、オオムギ、ライムギ、コムギ、ライコムギ、モロコシおよび穀粒、コメ、アルファルファ（ｌｕｃｅｒｎｅ）、亜麻、綿、麻、例えばセイヨウアブラナまたはカノーラなどのアブラナ、テンサイ、サトウキビ、ナッツおよびブドウツル種、またはヤマナラシもしくはイチイなどの木種がある。
【０１７１】
特に好ましいのは、シロイヌナズナ、マンジュギク（Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａ）、セイヨウアブラナ（ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、タバコ、カノーラ、ジャガイモ、および例えばダイズなどの他の油料穀物である。
【０１７２】
遺伝子改変された生物、特に植物は、精製化学物質の製造のため、特にビタミンＥ、ビタミンＫおよびユビキノンの製造のために上述のように使用することができる。
【０１７３】
ヒトおよび動物により消費可能であり、精製化学物質の含量が増加（特にビタミンＥ、ユビキノンおよび／またはビタミンＫ、特にビタミンＥの含量が増加）した本発明により遺伝子改変された植物は、食品または飼料としても、例えば、直接使用またはそれ自体で公知の方法で加工した後に使用できる。
【０１７４】
精製化学物質含量を増加することは、本発明の目的において、少なくとも１植物世代にわたり遺伝子操作により改変されていない植物と比べて、植物がこれらの化合物の高生合成能を人工的に獲得したことを意味する。
【０１７５】
ビタミンＥ含量の増加とは、原則的に、全トコフェロールの含量の増加を意味すると理解されるべきである。しかし、ビタミンＥ含量の増加は、特に、上述したトコフェロール活性を有する８つの化合物の含量の変化も意味すると理解されるべきである。
【０１７６】
例えば、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を植物に導入することで、驚くことに、トコトリエノール含量の際立った増加が生じる。
【０１７７】
ビタミンＥ含量を増加させた場合、トコフェロール含量またはトコトリエノール含量の両方が増加され得る。トコフェロール含量を増加させることが好ましい。しかし、特定の条件下において、優先的に、トコトリエノール含量を増加させることも可能である。
【０１７８】
例えば、植物におけるビタミンＥの生合成部位は葉組織であり、特に、本発明による核酸（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸）の葉特異的発現が意味がある。しかし、これは、限定するものではない。なぜなら、発現は、植物の他の全ての部分（特に脂肪種子）において組織特異的にも生じ得るからである。
【０１７９】
従って、さらに好適な実施形態は、本発明による核酸（特に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸）の種子特異的発現に関する。
【０１８０】
さらに、外因性コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の構成的発現が有利である。一方、誘導可能発現も望ましいと思われる。
【０１８１】
組換え発現されたコリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現効率は、例えば、苗条分裂組織増殖によりｉｎ ｖｉｔｒｏで決定できる。また、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、またはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の性質およびレベルの変化、ならびにビタミンＥ生合成に対するそれらの影響は、本質栽培試験において試験植物に対して試験できる。
【０１８２】
ここで、本発明を、限定するものではない以下の実施例により説明する。
【０１８３】
全般的な実験条件：
組換え ＤＮＡ の配列分析
組換えＤＮＡ分子を、Ｌｉｃｏｒレーザ蛍光ＤＮＡシーケンサー（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｅｂｅｒｓｂａｃｈから入手可能）を使用し、Ｓａｎｇｅｒ法（Ｓａｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４ （１９７７）， ５４６３−５４６７）を用いて配列決定した。
【０１８４】
実施例１−大腸菌 Ｋ１２ コリスミ酸ムターゼ − プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする ｔｙｒＡ 遺伝子をクローニングする
ｔｙｒＡ遺伝子をコードするＤＮＡを、センス特異的プライマー（ｔｙｒＡ５’ 配列番号１０）およびアンチセンス特異的プライマー（ｔｙｒＡ３’ 配列番号９）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により大腸菌Ｋ１２から増幅させた。
【０１８５】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった：
ＰＣＲは、以下を含む５０μｌ反応混合液中で行った：
−２μｌの大腸菌Ｋ１２細胞懸濁液
−０．２ ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
−１．５ ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２
−５μｇのウシ血清アルブミン
−４０ ｐｍｏｌ ｔｙｒＡ５’
−４０ ｐｍｏｌ ｔｙｒＡ３’
−１５μｌ ３．３×ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬ緩衝液（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
−５ Ｕ ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
ＰＣＲは以下のサイクル条件下で行った：
ステップ１：９４℃にて５分間（変性）
ステップ２：９４℃にて３秒間
ステップ３：５５℃にて１分間（アニーリング）
ステップ４：７２℃にて２分間（伸長）
ステップ２から４までを３０回繰り返す
ステップ５：７２℃にて１０分間（伸長後）
ステップ６：４℃（待機ループ）
アンプリコンを、標準的方法を用いて、ＰＣＲクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。Ｍ１３Ｆ（−４０）プライマーを用いて配列決定を行うことで、生成したアンプリコンの同定を確認した。
【０１８６】
実施例２−大腸菌 Ｋ１２ コリスミ酸ムターゼ − プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコ ードする ｔｙｒＡ 遺伝子を含む発現カセットの生成
構成的ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）３５Ｓプロモーター（Ｆｒａｎｃｋら， Ｃｅｌｌ ２１：２８５−２９４， １９８０）の制御下で大腸菌Ｋ１２コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼを発現するトランスジェニックタバコおよびシロイヌナズナ植物を生成した。大腸菌Ｋ１２コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼの構成的発現のために生成されたプラスミドの土台は、ｐＢｉｎＡＲ−ＴｋＴｐ−１０（Ｒａｌｆ Ｂａｄｕｒ， ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ， １９９８）であった。このベクターは、ｐＢｉｎＡＲ（ＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ６６： ２２１−２３０， １９９０）の誘導体であり、ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）３５Ｓプロモーター（Ｆｒａｎｃｋら， １９８０）、オクトピンシンターゼ遺伝子の終結シグナル（Ｇｉｅｌｅｎら， ＥＭＢＯ Ｊ． ３： ８３５−８４６， １９８４）、ならびにタバコプラスチドトランスケトラーゼの輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。正確なリーディングフレームを考慮しながらのこのベクターへの大腸菌Ｋ１２コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼのクローニングにより、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼと、プラスチド輸送ペプチドとの翻訳的融合が生じる。これにより、トランスジーンがプラスチドに輸送される。
【０１８７】
このプラスミドを構築するために、隣接するＳｍａＩまたはＳａｌＩ制限切断部位を使用して、ｔｙｒＡ遺伝子をプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ／ｔｙｒＡから単離した。標準的方法を用いて、この断片をＳｍａＩ／ＳＡｌＩ切断ｐＢｉｎＡＲ−ＴｋＴｐ−１０にライゲートさせた（図２を参照）。このプラスミド（ｐＢｉｎＡＲ−ＴｋＴｐ−１０／ｔｙｒＡ）を用いて、トランスジェニックタバコおよびシロイヌナズナ植物を生成した。
【０１８８】
図２の断片Ａ（５２９ ｂｐ）は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（カリフラワーモザイクウイルスのヌクレオチド６９０９〜７４３７）を含み、断片Ｂ（２４５ ｂｐ）は、タバコトランスケトラーゼの輸送ペプチドをコードし、断片Ｃ（１２３２ Ｂｐ）は、大腸菌Ｋ１２ ｔｙｒＡ遺伝子をコードし、断片Ｄ（２１９ Ｂｐ）は、オクトピンシンターゼ遺伝子の終結シグナルをコードする。
【０１８９】
実施例３−種子特異的プロモーターの制御下で大腸菌 Ｋ１２ コリスミ酸ムターゼ − プレフェン酸デヒドロゲナーゼを発現するための核酸構築物の生成
種子特異的プロモーターの制御下で大腸菌Ｋ１２コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼを発現するトランスジェニックシロイヌナズナ、タバコおよびセイヨウアブラナ植物を生成するためのキメラＤＮＡ構築物を生成するために、ベクターｐＰＴＶｋａｎＬｅＰ−ＩＰＰ−ＴＰ−９を利用した。
【０１９０】
このベクターは、ｕｉｄＡ遺伝子が欠失されたｐＧＰＴＶｋａｎ（Ｄ． Ｂｅｃｋｅｒ， Ｅ． Ｋｅｍｐｅｒ， Ｊ． Ｓｃｈｅｌｌ， Ｒ． Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０： １１９５−１１９７， １９９２）の誘導体である。ベクターｐＰＴＶｋａｎＬｅＰ−ＩＰＰ−ＴＰ−９は、代わりに、レグミンＢ４遺伝子（Ｋａｆａｔｏｓら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， １４（６）：２７０７−２７２０， １９８６）の種子特異的プロモーターを含み、この配列は、シロイヌナズナプラスチド特異的イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ−２（ＩＰＰ−２）の輸送ペプチド（Ｂａｄｕｒ、未出版）、およびＡ．ツメファシエンノパリンシンターゼの終結（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １， ５６１−７３， １９８２）をコードする。
【０１９１】
大腸菌Ｋ１２ ｔｙｒＡをコードする核酸断片を、ＳｍａＩ／ＳａｌＩ断片として、Ｔ４−ポリメラーゼで埋められた平滑末端端部を有するベクターｐＰＴＶｋａｎＬｅＰ−ＩＰＰ−ＴＰ−９に（図３）、クローニングして、ＩＰＰ−２輸送ペプチドとの翻訳的融合を生じさせた。このように、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼのプラスチドへの取込みを確実にした。このプラスミド（ｐＰＴＶｋａｎＬｅＰ−ＩＰＰ−ＴＰ−９／ＴｙｒＡ）を、トランスジェニックタバコ、シロイヌナズナおよびセイヨウアブラナ植物を生成するために使用した。
【０１９２】
図３において、断片Ａ（２７００ ｂｐ）は、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）レグミンＢ４遺伝子のプロモーターを含み、断片Ｂ（２０６ ｂｐ）は、シロイヌナズナイソペンテニル−ピロリン酸イソメラーゼ−２の輸送ペプチドをコードし、断片Ｃ（１２３４ ｂｐ）は、大腸菌Ｋ１２ ｔｙｒＡ遺伝子をコードし、断片Ｄ（２７２ ｂｐ）は、ノパリンシンターゼ遺伝子の終結シグナルをコードする。
【０１９３】
実施例４− ｔｙｒＡ 遺伝子を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物の生成
改変した真空浸透方法に基づいて、野生型シロイヌナズナ植物（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を、アグロバクテリウム・ツメファシエン株（ＧＶ３１０１［ｐＭＰ９０］）で形質転換させた（Ｓｔｅｖｅ ＣｌｏｕｇｈおよびＡｎｄｒｅｗ Ｂｅｎｔ． Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ： ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ． Ｐｌａｎｔ Ｊ １６（６）：７３５−４３， １９９８；Ｐｌａｎｔａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｐｌａｎｔｓ． ＣＲＡｃａｄ Ｓｃｉ Ｐａｒｉｓ， １９９３， １１４４（２）：２０４−２１２に掲載のＢｅｃｈｔｏｌｄ， Ｎ． Ｅｌｌｉｓ， Ｊ．およびＰｅｌｌｔｉｅｒ， Ｇ．）。使用したアグロバクテリウム・ツメファシエン細胞は、プラスミドｐＢｉｎＡＲ−ＴｋＴｐ−１０／ｔｙｒＡおよびｐＰＴＶｋａｎＬｅＰ−ＩＰＰ−ＴＰ−９／ｔｙｒＡで予め形質転換されていた（図２および３）。
【０１９４】
一次形質転換体の種子を、抗生物質に対するそれらの耐性に基づき選択した。抗生物質に耐性な実生を土壌に植え、完全に発達した植物を生化学分析に使用した。
【０１９５】
実施例５− ｔｙｒＡ 遺伝子を発現するトランスジェニックセイヨウアブラナ植物の生成
トランスジェニックセイヨウアブラナ植物の生成は、原則的に、Ｂａｄｅ， Ｊ．Ｂ．およびＤａｍｍ， Ｂ．（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ， Ｐｏｔｒｙｋｕｓ． Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ， Ｇ．編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９９５， ３０−３８）の手順に従った。該文献は、使用する培地および緩衝液の組成も示している。
【０１９６】
形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエン株ＧＶ３１０１［ｐＭＰ９０］で行った。プラスミドｐＰＴＶｋａｎＬｅＰ−ＩＰＰ−ＴＰ−９／ｔｙｒＡを、形質転換に使用した（図３）。セイヨウアブラナ・ウェスター（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｖａｒ． Ｗｅｓｔａｒ）の種子を、７０％エタノール（ｖ／ｖ）で表面滅菌し、水中で５５℃にて１０分間洗浄し、１％強度次亜塩素酸塩溶液（２５％ ｖ／ｖＴｅｅｐｏｌ、０．１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で２０分間インキュベートし、滅菌水で６回それぞれ２０分間洗浄した。種子をフィルタ紙上で３日間乾燥させ、１０〜１５の種子を、１５ ｍｌの発芽培地を含むガラスフラスコ中で発芽させた。いくつかの実生（約１０ ｃｍの大きさ）から根および先端をを取り除き、残った胚軸を約６ ｍｍの長さの切片に切断した。このように得た約６００の外植片を、５０ ｍｌの基本培地中で３０分間洗浄し、３００ ｍｌフラスコに移した。１００ ｍｌのカルス誘導培地の添加後、培養物を１００ ｒｐｍにて２４時間インキュベートした。
【０１９７】
アグロバクテリア株の一晩培養物を、カナマイシン（２０ ｍｇ／ｌ）を補充した２９℃のルリアブロス培地中に据え、これの２ ｍｌをカナマイシンを含まない５０ ｍｌのルリアブロス培地中で２９℃にて４時間、ＯＤ_６００が０．４〜０．５に達するまでインキュベートさせた。培養物を２０００ ｒｐｍにて２５分間ペレット化した後、細胞ペレットを２５ ｍｌの基本培地に再懸濁させた。さらに基本培地を添加することにより、溶液の細菌濃度を０．３のＯＤ_６００にした。
【０１９８】
カルス誘導培地を、滅菌ピペットを用いてセイヨウアブラナ外植片から除去し、５０ ｍｌのアグロバクテリア溶液を添加し、反応物を注意深く混合し、２０分間インキュベートした。アグロバクテリア懸濁液を除去し、セイヨウアブラナ外植片を５０ ｍｌのカルス誘導培地で１分間洗浄し、その後１００ ｍｌのカルス誘導培地を添加した。軌道（ｏｒｂｉｔａｌ）シェーカー上で１００ ｒｐｍにて２４時間同時培養を行った。カルス誘導培地を除去することで同時培養を停止し、１００ ｒｐｍにて、外植片を２回それぞれ２５ ｍｌの洗浄培地で１分間洗浄し、２回それぞれ１００ ｍｌの洗浄培地で６０分間洗浄した。外植片の入った洗浄培地を１５ ｃｍペトリ皿に移し、滅菌ピペットを用いて培地を除去した。
【０１９９】
再生のために、それぞれ２０〜３０の外植片を、カナマイシンを補充した２５ ｍｌの苗条誘導培地を含む９０ ｍｍペトリ皿に移した。ペトリ皿を２層のルコポーテープ（ｌｅｕｋｏｐｏｒ）で密封し、２５℃、２０００ルクスで、１６時間は明所／８時間は暗所の光周期でインキュベートした。１２日毎に、発達したカルスを、苗条誘導培地を含む新しいペトリ皿に移した。完全な植物の再生のためのその後の全てのステップは、Ｂａｄｅ， Ｊ．ＢおよびＤａｍｍ， Ｂ．（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ， Ｐｏｔｒｙｋｕｓ， Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ， Ｇ．編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９９５， ３０−３８に掲載）に記載されるように行った。
【０２００】
実施例６− ｔｙｒＡ 遺伝子を発現するトランスジェニックタバコ植物の生成
抗生物質を補充した１０ ｍｌのＹＥＢ培地（５ ｇ／ｌ牛肉抽出物、１ ｇ／ｌ酵母抽出物、５ ｇ／ｌペプトン、５ ｇ／ｌスクロースおよび２ ｍＭ ＭｇＳＯ_４）に、アグロバクテリウム・ツメファシエンのコロニーを接種し、培養物を一晩２８℃にて成長させた。細胞を、ベンチトップ遠心分離機を用いて２０分間４℃にて３５００ ｒｐｍでペレット化し、次いで、滅菌条件下で、抗生物質を含まない新鮮なＹＥＢ培地中に再懸濁させた。細胞懸濁液を形質転換のために使用した。
【０２０１】
栄養繁殖により滅菌培養野生型植物を得た。この目的のために、植物の先端のみを切断し、滅菌保存瓶に入った新鮮な２ＭＳ培地に移した。植物の残りについては、葉の上面の毛、および葉の中心静脈を除去した。カミソリ刃を用いて、葉を約１ ｃｍ^２の大きさの切片に切断した。アグロバクテリア培養物を、小さいペトリ皿（直径２ ｃｍ）に移した。葉切片を、この溶液に手短にくくらせ（ｄｒａｗｎ ｔｈｒｏｕｇｈ）、ペトリ皿（直径９ ｃｍ）に入った２ＭＳ培地の上に葉の下面が培地に接触するように置いた。２５℃にて暗所において２日後、外植片をカルス誘導培地とプレートに移し、制御下環境キャビネット内で２８℃で温めた。培地は７〜１０日毎に変えた。カルスが形成されるとすぐに、外植片を、滅菌保存瓶に入ったクラフォラン（ｃｌａｆｏｒａｎ）を補充した苗条誘導培地（０．６％ ＢｉＴｅｃ寒天（ｗ／ｖ）、２．０ ｍｂ／ｌゼアチンリボース、０．０２ ｍｇ／ｌナフチル酢酸、０．０２ ｍｇ／ｌジベレリン（ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ）、０．２５ ｇ／ｍｌクラフォラン、１．６％グルコース（ｗ／ｖ）、および５０ ｍｇ／ｌカナマイシン）上に移した。約１ヵ月後に器官形成が開始し、形成した苗条を切断することが可能であった。苗条を、クラフォランおよび選択マーカーを補充した２ＭＳ培地上で成長させた。実質的な根巻き（ｒｏｏｔｂａｌｌ）が発達するとすぐに、植物を種子（ｓｅｅｄ）堆肥に鉢植えすることが可能であった。
【０２０２】
実施例７−実施例４、５および６のトランスジェニック植物の特徴決定
上記構築物（シロイヌナズナ、セイヨウアブラナおよびタバコ）で形質転換した植物の葉および種子中のトコフェロールおよびトコトリエノール含量を分析した。この目的のために、トランスジェニック植物をグリーンハウス中で成長させ、大腸菌Ｋ１２コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を発現した植物をノーザンおよびウェスタンレベルで分析した。葉および種子におけるこれらの植物のトコフェロール含量およびトコトリエノール含量はＨＰＬＣで決定した。全ての場合に、ｔｙｒＡ遺伝子をさらに発現するトランスジェニック植物中のトコフェロールおよび／またはトコトリエノール含量が、未形質転換植物と比べて増加していた。
【０２０３】
表１Ａ（若葉）および１Ｂ（老葉）は、タバコ、ｃｖ． ＳＮＮ野生型（示すデータ：ＭＷ＋／−ＳＤ、ｎ＝９）、および大腸菌ＴｙｒＡ遺伝子を過剰発現する植物における異なる年齢の葉中のα−トコフェロール、γ−トコフェロール、α−トコトリエノールおよび合計ビタミンＥの含量［μｇ／ｇ ＦＷ］を示す。

【０２０４】
実施例８−プラスチドにおいて発現されるシロイヌナズナコリスミ酸ムターゼ −１ をコードする遺伝子のサブ断片をクローニングする
コリスミ酸ムターゼ−１遺伝子の輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、センス特異的プライマー（ＣＭ−１ＴＰ５’ 配列番号１１）およびアンチセンス特異的プライマー（ＣＭ−１ＴＰ３’ 配列番号１２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりシロイヌナズナから増幅させた。
【０２０５】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった：
ＰＣＲは、以下を含む５０μｌ反応混合液中で行った：
−２μｌのシロイヌナズナｃＤＮＡ
−０．２ ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
−１．５ ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２
−５μｇのウシ血清アルブミン
−４０ ｐｍｏｌ ＣＭ−１ＴＰ５’プライマー
−４０ ｐｍｏｌ ＣＭ−１ＴＰ３’プライマー
−１５μｌ ３．３μｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬ緩衝液（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
−５ Ｕ ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
ＰＣＲは以下のサイクル条件下で行った：
ステップ１：９４℃にて５分間（変性）
ステップ２：９４℃にて３秒間
ステップ３：５５℃にて１分間（アニーリング）
ステップ４：７２℃にて２分間（伸長）
ステップ２から４までを３０回繰り返す
ステップ５：７２℃にて１０分間（伸長後）
ステップ６：４℃（待機ループ）
アンプリコンを、標準的方法を用いて、ＰＣＲクローニングベクターｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。ベクター特異的プライマーを用いて配列決定を行うことで、生成したアンプリコンの同定を確認した。
【０２０６】
実施例９−細胞質ゾルにおいて発現されるシロイヌナズナコリスミ酸ムターゼ −２ をコードする遺伝子をクローニングする
コリスミ酸ムターゼ−２遺伝子をコードするＤＮＡを、センス特異的プライマー（ＣＭ−２ ５’ 配列番号１３）およびアンチセンス特異的プライマー（ＣＭ−２ ３’ 配列番号１４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりシロイヌナズナから増幅させた。【０２０７】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった：
ＰＣＲは、以下を含む５０μｌ反応混合液中で行った：
−２μｌのシロイヌナズナｃＤＮＡ
−０．２ ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
−１．５ ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２
−５μｇのウシ血清アルブミン
−４０ ｐｍｏｌ ＣＭ−２ ５’プライマー
−４０ ｐｍｏｌ ＣＭ−２ ３’プライマー
−１５μｌ ３．３μｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬ緩衝液（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
−５ Ｕ ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
ＰＣＲは以下のサイクル条件下で行った：
ステップ１：９４℃にて５分間（変性）
ステップ２：９４℃にて３秒間
ステップ３：５５℃にて１分間（アニーリング）
ステップ４：７２℃にて２分間（伸長）
ステップ２から４までを３０回繰り返す
ステップ５：７２℃にて１０分間（伸長後）
ステップ６：４℃（待機ループ）
アンプリコンを、標準的方法を用いて、ＰＣＲクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。Ｍ１３Ｆ（−４０）プライマーを用いて配列決定を行うことで、生成したアンプリコンの同定を確認した。
【０２０８】
実施例１０−コリスミ酸ムターゼ −１（ＣＭ−１） の輸送ペプチド （ＴＰ） をコードする ＤＮＡ 配列、およびコリスミ酸ムターゼ −２（ＣＭ−２） をコードする ＤＮＡ 配列からなるキメラ遺伝子構築物 ＣＭ−１−ＴＰ−ＣＭ−２ の生成
キメラ遺伝子ＣＭ−１−ＴＰ−ＣＭ−２を生成するために、プラスミドｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ／ＣＭ−１−ＴＰを、制限酵素ＮｃｏＩ／ＳａｌＩで消化した。
【０２０９】
制限酵素ＮｃｏＩ／ＳａｌＩによりプラスミドｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ／ＣＭ−２から単離されたＣＭ−２のＤＮＡ断片をこのプラスミドにライゲートした。このキメラＤＮＡ構築物（配列番号５）（ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ／ＡｔＣＭ−１ＴＰ−ＡｔＣＭ−２、図４）の翻訳は、ＣＭ−１の輸送ペプチドがＣＭ−２と組み合わせられた融合タンパク質の形成を生じる（配列番号６）。
【０２１０】
実施例１１−キメラ遺伝子 ＣＭ−１−ＴＰ−ＣＭ−２ を含む植物発現カセットの生成
キメラ遺伝子ＣＭ−１−ＴＰ−ＣＭ−２を発現するトランスジェニック植物を、まず構成的ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）３５Ｓプロモーター（Ｆｒａｎｃｋら， Ｃｅｌｌ ２１： ２８５−２９４， １９８０）の制御下で、次にソラマメレグミン遺伝子の種子特異的プロモーター（Ｋａｆａｔｏｓら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， １４（６）： ２７０７−２７２０， １９８６）の制御下で、シロイヌナズナから生成した。
【０２１１】
キメラ遺伝子ＣＭ−１ＴＰ−ＣＭ−２の構成的発現のために生成したプラスミドの土台は、ベクターｐＢｉｎＡＲであった（ＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ６６： ２２１−２３０， １９９０）。このベクターは、ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）３５Ｓプロモーター（Ｆｒａｎｃｋら， １９８０）、およびオクトピンシンターゼ遺伝子の終結シグナル（Ｇｉｅｌｅｎら， ＥＭＢＯ Ｊ． ３： ８３５−３４６， １９８４）を含んでいる。このプラスミドを生成するために、キメラ遺伝子ＣＭ−１−ＴＰ−ＣＭ２を、隣接する制限切断部位ＫｐｎＩ／ＳａｌＩを用いてプラスミドｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ／ＡｔＣＭ−１ＴＰ−ＡｔＣＭ−２から単離した（図４）。標準的な方法を用いて、この断片を、ＫｐｎＩ／ＳａｌＩ切断ｐＢｉｎＡＲにライゲートした。得られたプラスミド（ｐＢｉｎＡＲ／ＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２、図５）を、トランスジェニックシロイヌナズナおよびタバコを生成するために使用した。
【０２１２】
植物におけるキメラ遺伝子ＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２の種子特異的発現を可能にするプラスミドを生成するために、レグミンＢ４遺伝子の種子特異的プロモーター（Ｋａｆａｔｏｓら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， １４（６）：２７０７−２７２０， １９８６）を使用した。レグミンＢ４遺伝子プロモーターの２．７ ｋｂ断片を、プロモーター５’に隣接するＥｃｏＲＩ切断部位、およびプロモーター３’に隣接するＫｐｎＩ切断部位を用いてプラスミドｐＧＥＭＴｅａｓｙ／ｌｅＰＮＯＳから単離した。プラスミドｐＢｉｎＡＲ／ＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２も制限酵素ＥｃｏＲ１およびＫｐｎ１で処理した。この結果、このプラスミドからＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを切り出した（図５を参照）。その後、レグミン遺伝子プロモーターを、ＥｃｏＲ１／Ｋｐｎ１断片としてこのベクターにクローニングして、この種子特異的プロモーターの制御下でキメラ遺伝子ＣＭ−１ＴＰ−ＣＭ−２の発現を生じるプラスミドを生じさせた（図６を参照）。このプラスミド（ｐＢｉｎＬｅＰ／ＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２）を、トランスジェニックシロイヌナズナおよびタバコ植物を生成するために使用した。
【０２１３】
実施例１２−キメラ遺伝子 ＣＭ−１−ＴＰ−ＣＭ−２ を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物の生成
プラスミド（ｐＢｉｎＡＲ／ＡｔＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２）および（ｐＢｉｎＬｅＰ／ＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２）を用いて、実施例４と同様に植物を生成した。
【０２１４】
実施例１３− ｔｙｒＡ 遺伝子を発現するトランスジェニックセイヨウアブラナ植物の生成
プラスミド（ｐＢｉｎＡＲ／ＡｔＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２）および（ｐＢｉｎＬｅＰ／ＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２）を用いて、実施例５と同様に植物を生成した。
【０２１５】
実施例１４− ｔｙｒＡ 遺伝子を発現するトランスジェニックタバコ植物の生成
プラスミド（ｐＢｉｎＡＲ／ＡｔＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２）および（ｐＢｉｎＡＲｌｅＰ／ＣＭ−１ＴＰ／ＣＭ−２）を用いて、実施例６と同様に植物を生成した。
【０２１６】
実施例１５−実施例１２、１３および１４のトランスジェニック植物の特徴決定
上記構築物（シロイヌナズナ、セイヨウアブラナおよびタバコ）で形質転換した植物の葉および種子中のトコフェロールおよびトコトリエノール含量を分析する。このために、トランスジェニック植物をグリーンハウス中で成長させ、細胞質コリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子を発現した植物をノーザンおよびウェスタンレベルで分析した。葉および種子におけるこれらの植物のトコフェロール含量およびトコトリエノール含量はＨＰＬＣで決定した。全ての場合に、コリスミ酸ムターゼ遺伝子をさらに発現するトランスジェニック植物中のトコフェロールおよび／またはトコトリエノール含量が、未形質転換植物と比べて増加していた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、エリトロース−４−リン酸から出発しビタミンＥまでの生合成スキームを示す。
【図２】
図２は、ｐＢｉｎＡＲ−ＴｋＴｐ−１０／ＴｙｒＡを示す。
【図３】
図３は、ｐＰＴＶＫａｎＬｅＰ−ＩＰＰ−ＴＰ−９／ｔｙｒＡを示す。
【図４】
図４は、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ／ＡｔＣＭ１−ＴＰ−ＣＭ２を示す。
【図５】
図５は、ｐＢｉｎＡＲ／ＣＭ１−ＴＰ／ＣＭ−２を示す。
【図６】
図６は、ｐＢｉｎＬｅＰ／ＣＭ１−ＴＰ／ＣＭ−２を示す。

Claims (37)

1. 野生型のものと比べてシキミ酸経路が遺伝子学的に改変されている生物を培養することによる、精製化学物質の生産方法。
2. 以下の手段ＡおよびＢ、
   Ａ：野生型のシキミ酸経路の少なくとも１つの酵素の活性を高めること；
   Ｂ：野生型シキミ酸経路の代謝経路を橋渡しする遺伝子であって、野生型にオーソロガス遺伝子が存在しない遺伝子を少なくとも１つ生物に導入すること；
   からなる群より選択される少なくとも１つの手段を実施して、シキミ酸経路を遺伝子学的に改変する、請求項１に記載の方法。
3. 前記手段Ａにおいて、シキミ酸経路の少なくとも１つの酵素の活性が、この酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸を過剰発現させることにより高められることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. コリスミ酸ムターゼをコードする核酸を前記生物に導入する、請求項３に記載の方法。
5. 前記生物において、低減翻訳後調節により活性調節されるコリスミ酸ムターゼをコードする核酸を生物に導入する、請求項４に記載の方法。
6. 前記生物における発現部位で低減翻訳後調節により活性調節されるコリスミ酸ムターゼをコードする核酸を該生物に導入する、請求項５に記載の方法。
7. 使用する生物が植物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 細胞質コリスミ酸ムターゼを植物のプラスチドに導入する、請求項７に記載の方法。
9. プラスチド輸送ペプチドをコードする核酸と、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、または該アミノ酸配列のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりもたらされる配列であって配列番号４の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有し、かつコリスミ酸ムターゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸とを含む核酸構築物を、植物に導入する、請求項８に記載の方法。
10. 前記プラスチド輸送ペプチドをコードする核酸として、プラスチドコリスミ酸ムターゼのプラスチド輸送ペプチドをコードする核酸を使用する、請求項９に記載の方法。
11. 配列番号５の核酸配列の核酸構築物を植物に導入する、請求項１０に記載の方法。
12. プラスチド輸送ペプチドをコードする核酸と、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、または該アミノ酸配列のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりもたらされる配列であって配列番号４の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有し、かつコリスミ酸ムターゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸とを含む、核酸構築物。
13. 前記プラスチド輸送ペプチドをコードする核酸として、プラスチドコリスミ酸ムターゼのプラスチド輸送ペプチドをコードする核酸を使用する、請求項１２に記載の核酸構築物。
14. 配列番号５の核酸配列を含む、請求項１３に記載の核酸構築物。
15. 使用する生物が植物であり、かつ前記手段Ｂを実施する場合に、野生型にオーソロガス遺伝子が存在しない遺伝子として、プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸を植物に導入する、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
16. プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸を、コリスミ酸ムターゼをコードする核酸と組み合わせて植物に導入する、請求項１〜１１および１５のいずれか１項に記載の方法。
17. コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸を植物に導入する、請求項１６に記載の方法。
18. 配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、または該アミノ酸配列のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりもたらされる配列であって配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有し、かつコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸を導入する、請求項１７に記載の方法。
19. 細菌由来の核酸を使用する、請求項１８に記載の方法。
20. 配列番号１に示す配列を含む核酸を使用する、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 植物における転写および翻訳を確実にもたらす１つ以上の調節シグナルに機能し得る形で連結された、請求項３〜６、８および１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含む核酸構築物。
22. プラスチド輸送ペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項２１に記載の核酸構築物。
23. 請求項１２に記載の核酸構築物を含む、請求項２２に記載の核酸構築物。
24. プラスチド輸送ペプチドをコードする核酸と、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、または該アミノ酸配列のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりもたらされる配列であって配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性を有し、かつコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸とを含む、請求項２２に記載の核酸構築物。
25. トランスジェニック植物を作製するための、請求項３〜６、８および１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１２〜１４、および２１〜２４のいずれか１項に記載の核酸構築物の使用。
26. 前記トランスジェニック植物の精製化学物質含量を、野生型のものと比べて増加させることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
27. 前記トランスジェニック植物の非生物的ストレスに対する耐性を、野生型のものと比べて増大させることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
28. 野生型のものからシキミ酸経路の代謝経路が改変されて、生物の精製化学物質含量が野生型のものと比べて改変されるように遺伝子学的に改変された生物。
29. 前記遺伝子学的改変が、
    出発生物が該当する核酸を含む場合には、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、もしくはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸の遺伝子発現を野生型に比べて増大させるもの、または
    出発生物が該当する核酸を含まない場合には、野生型と対照的に、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼもしくはコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸の遺伝子発現を引き起こすもの、
    である、請求項２８に記載の遺伝子改変生物。
30. 請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の核酸構築物により形質転換された、請求項２９に記載の遺伝子改変生物。
31. 請求項２１〜２４のいずれか１項の核酸構築物を含む、請求項２９に記載の遺伝子改変生物。
32. 使用する生物が植物である、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
33. 請求項３〜６、８および１５〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸、または請求項１２〜１４および２１〜２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸構築物を、出発生物のゲノムに導入することを含む、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物を生成する方法。
34. 精製化学物質を生産するための、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物の使用。
35. 加工食料を生産するための、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物の食品および飼料としての使用。
36. 精製化学物質含量を高めるための、請求項３〜６、８および１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１２〜１４および２１〜２４のいずれか１項に記載の核酸構築物の使用。
37. 生物において精製化学物質を産生させるための、請求項３〜６、８、および１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１２〜１４および２１〜２４のいずれか１項に記載の核酸構築物の使用。

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