DE10212703A1

DE10212703A1 - Erhöhung Vitamin-E-Gehalts in Organismen durch Erhöhung der 2-Methyl-6-phytythydrochinon-Methyltransferase-Aktivität

Info

Publication number: DE10212703A1
Application number: DE10212703A
Authority: DE
Inventors: Susanne Tropf; Rainer Lemke; Klaus-Dieter Salchert; Michael Geiger
Original assignee: SunGene GmbH
Current assignee: SunGene GmbH
Priority date: 2002-03-21
Filing date: 2002-03-21
Publication date: 2003-10-02
Also published as: WO2003080844A3; WO2003080844A2; AU2003212361A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Kultivierung von Organismen, insbesondere Pflanzen die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität aufweisen, die Verwendung von Proteinen als 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen, sowie die genetisch veränderten Organismen, insbesondere Pflanzen selbst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Kultivierung von Organismen, insbesondere Pflanzen die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität aufweisen, die Verwendung von Proteinen als 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen, sowie die genetisch veränderten Organismen, insbesondere Pflanzen selbst.
Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E- Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die Gruppe der Tocopherole (1a-d) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe der Tocotrienole (2a-d) eine ungesättigte Seitenkette:

1a, α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
1b, β-Tocopherol: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
1c, γ-Tocopherol: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
1d, δ-Tocopherol: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

2a, α-Tocotrienol: R¹ = R² = R³ = CH₃
2b, β-Tocotrienol: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
2c, γ-Tocotrienol: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
2d, δ-Tocotrienol: R¹ = R² = H, R³ = CH₃
In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle vorstehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin-E- Aktivität verstanden.
Diese Verbindungen mit Vitamin-E-Aktivität sind wichtige natürliche fett-lösliche Antioxidantien. Ein Mangel an Vitamin E führt bei Menschen und Tieren zu pathophysiologischen Situationen. Vitamin E-Verbindungen haben daher einen hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich, in pharmazeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.
Ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von Vitamin E-Verbindungen sowie Nahrungs- und Futtermittel mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt sind daher von großer Bedeutung.
Besonders wirtschaftliche Verfahren sind biotechnologische Verfahren unter Ausnutzung natürlicher oder durch genetische Veränderung optimierter Vitamin-E-produzierender Organismen.
Abb. 1 zeigt ein Biosyntheseschema von Tocopherolen und Tocotrienolen.
Im Verlauf der Biosynthese wird Homogentisinsäure (Homogentisat) an Phytylpyrophosphat (PPP) bzw. Geranylgeranylpyrophosphat gebunden, um die Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocotrienol, das 2-Methyl-6-phytylhydrochinon bzw. das 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon zu bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosylmethionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon bzw. 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylhydrochinon. 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon bzw. 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylhydrochinon wird anschließend zu γ-Tocopherol bzw. γ- Tocotrienol cyclisiert. Zur Umsetzung zu α-Tocopherol bzw. α-Tocotrienol erfolgt eine nochmalige Methylierung.
Es besteht ein ständiges Bedürfnis, neue Enzymaktivitäten und damit alternative Verfahren mit vorteilhaften Eigenschaften zur Herstellung von Vitamin E in transgenen Organismen zur Verfügung zu stellen.
Es sind Versuche bekannt, in transgenen Organismen durch Überexpression einzelner Biosynthesegene eine Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Tocopherol- bzw. Tocotrienolgehaltes zu erreichen.
WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).
WO 99/04622 bzw. D. DellaPenna et al., Science 1998, 282, 2098-2100 beschreiben Gensequenzen codierend für eine γ-Tocopherolmethyltransferase aus Synechocystis PCC6803 und Arabidopsis thaliana und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.
WO 99/23231 zeigt, daß die Expression einer Geranylgeranyl- Reductase in transgenen Pflanzen eine gesteigerte Tocopherolbiosynthese zur Folge hat.
WO 00/08169 beschreibt Gensequenzen codierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und eine Geranylgeranyl-Pyrophosphat Oxidoreduktase und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.
WO 00/68393 und WO 00/63391 beschreiben Gensequenzen codierend eine Phytyl/Prenyl-Transferase und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.
In WO 00/61771 wird postuliert, daß die Kombination eines Gens aus dem Sterol-Stoffwechsel in Kombination mit einem Gen aus dem Tocopherolstoffwechsel zu einer Erhöhung des Tocopherolgehalts in transgenen Pflanzen führen kann.
WO 00/10380 und WO 01/04330 beschreiben Gensequenzen codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus Synechocystis spec. PCC 6803 und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen. In WO 00/10380 wird ferner postuliert, dass mit der offenbarten Sequenz aus Synechocystis spec. PCC 6803 pflanzliche 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen durch Methoden des Vergleichs mit Sequenzen der öffentlichen Datenbanken, dbESTs und genomischer Sequenzen oder durch Screenen von cDNA- oder genomischen Banken oder durch PCR Amplifikation mit von der Synechocystis-Sequenz abgeleiteten Primern identifiziert werden können. Jedoch konnte, ausgehend von diesen Sequenzdaten aus Synechocystis spec. PCC 6803, bis heute kein Gen, das für eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase kodiert, aus höheren Pflanzen kloniert werden.
Shintani et al., FEBS Lett. 2002, 511, 1-5, beschreiben die Bedeutung der 2-Methyl-6-phytylhydroquinon-Methyltransferase für die Tocopherol-Zusammensetzung in Synechocystis.
Alle diese Verfahren liefern zwar genetisch veränderte Organismen, insbesondere Pflanzen, die in der Regel einen modifizierten Gehalt an Vitamin E aufweisen, weisen jedoch beispielsweise den Nachteil auf, daß die Höhe des Gehalts an Vitamin E in den im Stand der Technik bekannten genetisch veränderten Organismen noch nicht zufriedenstellend ist.
Teyssier et al., The Plant Journal (19: 96), 10(5), 903-912 postulieren, daß das 37 kDa Polypeptid E37, ein Protein aus der inneren Membran der Plastidenhülle, aus Spinat und Tabak eine S-Adenosyl-Methionin-abhängige Methyltransferase sein könnte. Auf Seite 910, linke Spalte, letzter Absatz wird aufgrund vorläufiger Ergebnisse vermutet, daß E37 nicht an der Tocopherolbiosynthese beteiligt ist.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Kultivierung von Organismen zur Verfügung zu stellen, bzw. weitere transgene Organismen, die Vitamin E herstellen, zur Verfügung zu stellen, die optimierte Eigenschaften, wie beispielsweise einen höheren Gehalt an Vitamin E aufweisen und den geschilderten Nachteil des Standes der Technik nicht aufweisen.
Demgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin E gefunden, indem man Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität aufweisen, wobei die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase die Aminosäuresequenz SEQ. ID. N0. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthält.
Unter 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase verstanden.
Unter einer 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 2-Methyl-6-phytylhydrochinon in 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon umzuwandeln.
Dementsprechend wird unter 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase umgesetzte Menge 2-Methyl-6-phytylhydrochinon bzw. gebildete Menge 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon verstanden.
Bei einer erhöhten 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase die umgesetzte Menge 2-Methyl-6-phytylhydrochinon bzw. die gebildete Menge 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon erhöht.
Vorzusgweise beträgt diese Erhöhung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität des Wildtyps.
2-Methyl-6-phytylhydrochinon wird auch als 2-Methyl-6-(3,7,11,15-tetramethyl-hexadec-2-enyl)-benzene-1,4-diol (Beilstein Registry Number: 6978431) bezeichnet.
2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon wird auch als 2,3-dimethyl-5-(3,7,11,15-tetramethyl-hexadec-2-enyl)-benzene-1,4-diol (Beilstein Registry Number: 6341124) bezeichnet.
Unter einem Wildtyp wird der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus verstanden. Vorzugsweise und insbesondere in Fällen in denen der Organismus oder der Wildtyp nicht eindeutig zuordenbar ist, wird unter Wildtyp für die Erhöhung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität, sowie für die Erhöhung des Gehalts an Vitamin E ein Referenzorganismus verstanden. Dieser Referenzorganismus ist vorzugsweise Brassica napus cv Westar.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren beschriebenen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen enthalten die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 30%, bevorzugter mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweisen. Die Proteine, die eine von SEQ. ID. NO. 2 abgeleitete Sequenz enthalten weisen demnach auch enzymatische Eigenschaft einer 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase auf.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Sequenz SEQ. ID. NO. 2 (Accesion NO. At3g63410, MAA21.40 (Datenbank: "BAC Locus") oder auch Accession NO. T49182 (Datenbank: "Systers Protein Family" (http:/ / systers.molgen.mpg.de)), die in diesen Datenbanken als "puta Live chloroplast inner envelope protein" annotiert wurde, die Aminosäuresequenz der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana darstellt.
Die Sequenz SEQ. ID. No. 2 aus Arabidopsis thaliana weist mit der aus dem Stand der Technik bekannten Aminosäuresequenz der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus Synechocystis sp. PCC 6803 (s110418) eine sehr geringe Identität auf Aminosäureebene von 14,2% auf.
Weitere natürliche Beispiele für 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen und 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gene die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, insbesondere aus Pflanzen, deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ. ID. NO. 2 leicht auffinden.
Weitere natürliche, erfindungsgemäße Beispiele für 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen und die entsprechenden 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gene sind beispielsweise Sequenzen aus

Nicotiana tabacum (Accession NO. Q40501 oder T03230; Nukleinsäure: SEQ. ID. NO. 3, Protein SEQ. ID. NO. 4),
Spinacia oleracea (Accession NO. P23525 oder S14409; Nukleinsäure: SEQ. ID. NO. 5, Protein SEQ. ID. NO. 6),
Lactuca sativa (Nukleinsäure: SEQ. ID. NO. 7, Protein SEQ. ID. NO. 8),
Petunia hybrida (Accession NO. Q9SBQ6; Nukleinsäure: SEQ. ID. NO. 9, Protein SEQ. ID. NO. 10) und
Oryza sativa (Accession NO. Q40706 oder S57781; Nukleinsäure: SEQ. ID. NO. 11, Protein SEQ. ID. NO. 12).
Diese pflanzlichen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen zeigen mit der SEQ. ID. NO. 2 eine Sequenzidentität von > 66% auf Aminosäureebene auf (Abb. 2).
Weitere natürliche Beispiele für 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen und 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aus verschiedenen Organismen, insbesondere Pflanzen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
Die Hybridisierung kann unter moderaten (geringe Stringenz) oder vorzugsweise unter stringenten (hohe Stringenz) Bedingungen erfolgen.
Solche Hybridisierungsbedingungen sund unter anderem bei Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit 2 × SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit 0.2 × SSC bei 50°C, bevorzugt bei 65°C) (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M Natriumchlorid, pH 7.0).
Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von moderaten Bedingungen bei Raumtemperatur, 22°C, bis zu stringenten Bedingungen bei 65°C angehoben werden.
Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt.
Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:

1. Hybridisierungsbedingungen mit zum Beispiel
- a) 4 × SSC bei 65°C, oder
- b) 6 × SSC bei 45°C, oder
- c) 6 × SSC bei 68°C, 100 mg/ml denaturierter Fischsperma-DNA, oder
- d) 6 × SSC, 0.5% SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oder
- e) 6 ×SSC, 0.5% SDS, 100 mg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C, oder
- f) 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C, oder
- g) 50% (vol/vol) Formamid, 0.1% Rinderserumalbumin, 0.1% Ficoll, 0.1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, oder
- h) 2 × oder 4 × SSC bei 50°C (moderate Bedingungen), oder
- i) 30 bis 40% Formamid, 2 × oder 4 × SSC bei 42° (moderate Bedingungen).
2. Waschschritte für jeweils 10 Minuten mit zum Beispiel
- a) 0.015 M NaCl/0.0015 M Natriumcitrat/0.1% SDS bei 50°C, oder
- b) 0.1 × SSC bei 65°C, oder
- c) 0.1 × SSC, 0.5% SDS bei 68°C, oder
- d) 0.1 × SSC, 0.5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
- e) 0.2 × SSC, 0.1% SDS bei 42°C, oder
- f) 2 × SSC bei 65°C (moderate Bedingungen).

Die Proteine, die eine von SEQ. ID. NO. 2 abgeleitete Sequenz enthalten, die eine Identität von mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 30%, bevorzugter mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweisen und auch die enzymatische Eigenschaft einer 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aufweisen, können, wie vorstehend erwähnt, auch durch künstliche Variationen ausgehend von der SEQ. ID. NO. 2 hergestellt werden, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren.
Unter dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr.
Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.
Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptidkette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.
Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, inc.Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:

Multiple alignment parameter:

Gap penalty: 10
Gap length penalty: 10

Pairwise alignment parameter:

K-tuple: 1
Gap penalty: 3
Window: 5
Diagonals saved: 5
Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2, insbesondere nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 20% aufweist.
Im folgenden werden, wenn nicht anders beschrieben, unter dem Begriff "2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase" die erfindungsgemäßen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen verstanden, die die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthalten.
Die Erhöhung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase- Aktivität kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Translations- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase gegenüber dem Wildtyp, beispielsweise durch Induzierung des 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase- Gens durch Aktivatoren oder durch Einbringen von Nukleinsäuren codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase in den Organismus.
Unter Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der Expression des Organismus, insbesondere der Pflanzen eigenen endogenen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen verstanden. Dies kann beispielsweise durch Veränderung der Promotor DNA-Sequenz für 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen kodierende Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine veränderte oder vorzugsweise erhöhte Expressionsrate mindestens eines endogenen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase Gens zur Folge hat, kann durch Deletion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.
Es ist, wie vorstehend beschrieben, möglich, die Expression mindestens einer endogenen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase durch die Applikation exogener Stimuli zu verändern. Dies kann durch besondere physiologische Bedingungen, also durch die Applikation von Fremdsubstanzen erfolgen.
Desweiteren kann eine veränderte bzw. erhöhte Expression mindestens eines endogenen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase Gens dadurch erzielt werden, dass ein im nicht transformierten Organismus nicht vorkommendes oder modifiziertes Regulator-protein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung tritt.
Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Domäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase, wobei die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthält.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase durch Einbringen von Nukleinsäuren, die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen kodieren in den Organismus, wobei die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthalten.
Dazu kann prinzipiell jedes erfindungsgemäße 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gen, also jede Nukleinsäuren die eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase codiert verwendet werden, wobei die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthält.
Bei genomischen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase- Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall, daß der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.
In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gen vor. In dieser bevorzugten Ausführungsform weist der erfindungsgemäße genetisch veränderte Organismus dementsprechend mindestens eine exogene Nukleinsäure, codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase oder mindestens zwei endogene Nukleinsäuren, codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase auf.
Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können beispielsweise eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verwendet man im erfindungsgemäßen Verfahren Nukleinsäuren, die pflanzliche 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen kodieren, insbesondere Nukleinsäuren, die die vorstehend beschriebenen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen aus Arabisopsis thaliana (SEQ. ID. NO. 2), Nicotiana tabacum (SEQ. ID. NO. 4), Spinacia oleracea (SEQ. ID. NO. 6), L. sati va (SEQ. ID. NO. 8), Petunia hybrida (SEQ. ID. NO. 10) und Oryza sativa (SEQ. ID. NO. 12) kodieren.
Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismusspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
Soll das Protein beispielsweise in einer Pflanze exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Pflanze bei der Rückübersetzung zu verwenden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz S. EQ. ID. NO. 1 in den Organismus ein.
Die Sequenz SEQ. ID. NO. 1 stellt die genomische Sequenz aus Arabidopsis thaliana dar, die die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 codiert.
Alle vorstehend erwähnten 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Unter Organismen werden erfindungsgemäß vorzugsweise prokaryontische Organismen oder eukaryontische Organismen, wie beispielsweise Bakterien, Hefen, Algen, Moose, Pilze oder Pflanzen, verstanden, die in der Lage sind, als Wildtyp oder durch genetische Veränderung Vitamin E herzustellen. Bevorzugte Organismen sind photosynthetisch aktive Organismen, wie beispielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, die bereits als Wildtyp in der Lage sind, Vitamin E herzustellen.
Besonders bevorzugte Organismen sind Pflanzen.
Bevorzugte Pflanzen sind Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte, Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf, Brassicacaen, wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Nuß- und Weinspezies oder Holzgewächse wie beispielsweise Espe oder Eibe.
Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Tagetes erecta, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Sonnenblume, Canola, Kartoffel oder Soja.
Unter einem Wildtyp wird, wie vorstehend erwähnt, der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus verstanden. Vorzugsweise und insbesondere in Fällen in denen der Organismus oder der Wildtyp nicht eindeutig zuordenbar ist, wird, wie vorstehend erwähnt, unter Wildtyp für die Erhöhung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität, sowie für die Erhöhung des Gehalts an Vitamin E ein Referenzorganismus verstanden. Dieser Referenzorganismus ist vorzugsweise Brassica napus cv Westar.
Die Bestimmung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität im erfindungsgemäßen Organismus und im Referenzorganismus erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:
Die Messung der Aktivität der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase im jeweiligen Organismus erfolgt nach Isolierung der Chloroplasten. Dazu wird das Blattmaterial im Waring Blendor mit der 5-10fachen Menge (z. B. 5 g in 50 ml) Isolationspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 600 mM Sorbitol, 0,1% Ascorbat, 0,05% Mercaptoethanol, 1 mM Aminocapronsäure) homogentisiert. Das Homogentisat wird durch 4 Schichten Miracloth oder Nylon (50 µm) filtriert. Das Filtrat wird bei 6000 xg für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Das Pellet wird in 5 ml 0.1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8.0 und einem Proteaseinhibitorgemisch (1 Tablette/50 ml) gewaschen. Die Chloroplasten werden dabei mit einem Pinsel resuspendiert. Das Pellet wird schliesslich in 0,6-1 ml des Kaliumphosphatpuffers pH 8.0 mit Proteinaseinhibitoren mit dem Pinsel resuspendiert. Die Probe wird in 2 ml Eppendorf Reaktionsgefäße überführt und mit 0,2% CHAPS versetzt. Die Probe wird bei 4°C für 30-60 Minuten geschüttelt (Vortx Genie2 Stufe 1). Der Aufschluss wird für 10 Minuten bei 4°C und 13 000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen. Die Proteinkonzentration des Überstandes wird nach Standardmethoden bestimmt.
Für den Enzymtest werden 145 µl dieser Proteinsuspension mit:

20 µl 125 mM Tricine-NaOH pH 8,0
100 µl 1,25 M Sorbitol
10 µl 50 mM MgCl₂
20 µl 250 mM Ascorbinsäure (immer frisch ansetzen)
10 µl 5 mM Substrat 2-Methyl-6-phytylhydrochinon

zugesetzt.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 15 µl 0,46 mM SAM ¹⁴C gestartet.
Der Ansatz wird für 3-48 Stunden bei 30°C inkubiert.
Der Enzymtest wird durch Zugabe von 750 µl Chloroform/Methanol (1: 2) und 750 µl 0,9% NaCl gestoppt. Zur Phasentrennung wird für 2 Minuten bei 13 000 rpm zentrifugiert. Die untere Chloroformphase wird in ein neues Eppendorfreaktionsgefäß überführt und im Speed Vac bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 20 µl Ether aufgenommen und über Dünnschichtchromatographie analysiert (feste Phase: HPTLC-Platten: Kieselgel 60 F₂₅₄; flüssige Phase: Toluol). Als Kontrolle werden 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon bzw. das 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylhydrochinonaufgetragen.
Nach beendetem Lauf wird die Dünnschichtplatte getrocknet. Es erfolgt eine Autoradiographie der Dünnschichtplatte.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Vitamin E wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der genetisch veränderten Organismen, im folgenden auch transgene Organismen bezeichnet, ein Ernten der Organismen und ein Isolieren von Vitamin E aus den Organismen angeschlossen.
Das Ernten der Organismen erfolgt in an sich bekannter Weise dem jeweiligen Organismus entsprechend. Mikroorganismen, wie Bakterien, Moose, Hefen und Pilze oder Pflanzenzellen, die durch Fermentation in flüssigen Nährmedien kultiviert werden, können beispielsweise durch Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtrieren abgetrennt werden. Pflanzen werden in an sich bekannter Weise auf Nährböden gezogen und entsprechend geerntet.
Die Isolierung von Vitamin E aus der geernteten Biomasse erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Extraktion und gegebenenfalls weiterer chemischer oder physikalischer Reinigungsprozesse, wie beispielsweise Fällungsmethoden, Kristallographie, thermische Trennverfahren, wie Rektifizierverfahren oder physikalische Trennverfahren, wie beispielsweise Chromatographie.
Die Isolierung von Vitamin E aus ölhaltigen Pflanzen erfolgt beispielsweise bevorzugt durch chemische Umwandlung und Destillation aus Pflanzenölen oder aus den bei der Desodorierung pflanzlicher Öle anfallenden Wasserdampfdestillate (Dämpferkondensate).
Weitere Isolierverfahren von Vitamin E aus Dämpferkondensaten sind beispielsweise in DE 31 26 110 A1, EP 171 009 A2, GB 2 145 079, EP 333 472 A2 und WO 94/05650 beschrieben.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Proteinen enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2, und die die enzymatische Aktivität zur Umwandlung von 2-Methyl-6-phytylhydrochinon in 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon aufweisen, als 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase.
Die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase ist generell in der Lage und kann dazu verwendet werden, 2-Methyl-6-phytylhydrochinonderivate in 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinonderivate, 2-Methyl-6-solanesylhydrochinonderivate in 2,3-Dimethyl-5-solanesylhydrochinonderivate oder 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinonderivate in 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylhydrochinonderivate zu überführen.
Unter Verwendung der Proteine als 2-Methyl-6-phytylhydrochinon- Methyltransferase wird demnach insbesondere die Verwendung der Proteine zur Umwandlung von 2-Methyl-6-phytylhydrochinonderivate in 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinonderivate, 2-Methyl-6-solanesylhydrochinonderivate in 2,3-Dimethyl-5-solanesylhydrochinonderivate oder 2-Methyl-6-geranylgeranyl-hydrochinonderivate in 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylhydrochinonderivate verstanden.
Unter 2-Methyl-6-phytylhydrochinonderivate werden 2-Methyl-6-phytylhydrochinon und davon abgeleitete Phytylhydrochinonverbindungen verstanden, die von den 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen als Substrat akzeptiert werden, wie beispielsweise 2-Methyl-6-phytylhydrochinon.
Unter 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinonderivate werden 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon und davon abgeleitete geranylgeranylhydrochinonverbindungen verstanden, die von den erfindungsgemäßen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen als Substrat akzeptiert werden, wie beispielsweise 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon.
Unter 2-Methyl-6-solanesylhydrochinonderivate werden 2-Methyl-6-solanesylhydrochinon und davon abgeleitete Solanesylhydrochinonverbindungen verstanden, die von den erfindungsgemäßen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen als Substrat akzeptiert werden, wie beispielsweise 2-Methyl-6-solanesylhydrochinon.
Unter 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinonderivate werden dementsprechend die resultierenden Verbindungen der enzymatischen Umsetzung verstanden.
Unter 2,3-Dimethyl-5-geranyl-geranylhydrochinonderivate werden dementsprechend die resultierenden Verbindungen der enzymatischen Umsetzung verstanden.
Unter 2,3-Dimethyl-5-solanesylhydrochinonderivate werden dementsprechend die resultierenden Verbindungen der enzymatischen Umsetzung verstanden.
Die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen sind beispielsweise in der Lage auch 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon, 2,3-Dimethyl-5-geranyl-geranylhydrochinonderivate und 2,3-Dimethyl-5-solanesylhydrochinonderivate in die entsprechenden methylierten Verbindungen zu überführen.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Nukleinsäuren, kodierend die vorstehend erwähnten Proteine zur Expression von Proteinen die eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität aufweisen.
Die Herstellung der transgenen Organismen, insbesondere Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch Transformation der Ausgangsorganismen, insbesondere Pflanzen, mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase enthält, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten.
Diese Nukleinsäurekonstrukte, in denen die kodierende Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten, werden im folgenden auch Expressionskasetten genannt.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere als Expressionskassette fungierende Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten.
Vorzugsweise enthalten die Regulationssignale einen oder mehrere Promotoren, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten.
Die Expressionskassetten beinhalten Regulationssignale, also regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für mindestens eines der vorstehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Bei der Verwendung von Pflanzen als Organismus enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte und Expressionskasetten vorzugsweise eine Nukleinsäure kodierend ein plastidäres Transitpeptid, das die Lokalisation in Plastiden gewährleistet.
Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäurekonstrukte, Expressionskassetten und Vektoren für Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, sowie die transgenen Pflanzen selbst beschrieben.
Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann.
"Konstitutiver" Promotor meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten.
Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140: 281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6: 221-228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202).
Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962,028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), der Pnit-Promoter (Y07648.L, Hillebrand et al. (1998), Plant. Mol. Biol. 36, 89-99, Hillebrand et al. (1996), Gene, 170, 197-200) sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), durch den die Expression des 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2: 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder ablotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogeninduzierbare Promotor des PRP1-Gens (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promoter aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinII-Promoter (EP 375091).
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, b-1,3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4: 111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9: 335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325-342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2: 93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10: 955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3: 191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1: 961-968(1989).
Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinII Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14: 494-498), des wun1 und wun2-Gens (US 5,428,148), des win1- und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), des Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573), des WIP1-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 783-792; E#kelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) The Plant J 6(2): 141-150) und dergleichen.
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifungspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Entwicklungsabhängige Promotoren schließt zum Teil die Gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.
Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Vitamin E bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Bevorzugt sind beispielsweise Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen.
Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos mm et al. (1989) Plant Cell 1(9): 839-53), des 25 Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3): 459-67), des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2): 233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980) oder der Vicillin-Promotor (Weschke et al. 1988, Biochem. Physiol. Pflanzen 183, 233-242; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3): 459-67).
Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lpt1-Gens (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein- Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens).
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren sind beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33) oder der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445-2451).
Blütenspezifische Promotoren sind beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
Antheren-spezifische Promotoren sind beispielsweise der 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), den glob-1 Promotor oder der g-Zein Promotor.
Weitere zur Expression in Pflanzen geeignet Promotoren sind beschrieben (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153: 253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 8402-8406).
Der Biosyntheseort von Vitamin E ist in Pflanzen unter anderem das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase sinnvoll ist. Dies ist jedoch nicht einschränkend, da die Expression auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - besonders in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft deshalb eine samenspezifische Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression von exogenen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Genen von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Besonders bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren sind konstitutive sowie Samen-spezifische Promotoren.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt werden.
Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gens und deren Auswirkung auf die Vitamin E-Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer vorstehend beschriebenen Nukleinsäure kodierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Nukleinsäure-Sequenz inserierten Nukleinsäure, die für ein chloroplastenspezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Insbesondere bevorzugt sind insertierte Nukleinsäure-Sequenzen, die ein Targeting in den Plastiden gewährleisten.
Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren Nukleinsäure-Sequenz für ein 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloroplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase in die Chloroplasten vom 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Teil enzymatisch abgespalten werden.
Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären Nicotiana tabacum Transketolase oder einem anderen Transitpeptid (z. B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat Isomerase-2) oder dessen funktionellem Äquivalent abgeleitet ist.
Besonders bevorzugt sind Nukleinsäure-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der piastidären Transketolase aus Tabak in drei Leserastern als KpnI/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der NcoI Schnittstelle:
Weitere Beispiele für ein plastidäres Transitpeptid sind das Transitpeptid der plastidären Isopentenyl-pyrophosphat Isomerase-2 (IPP-2) aus Arabisopsis thaliana und das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat Carboxylase (rbcS) aus Erbse (Guerineau, F, Woolston, S. Brooks, L, Mullineaux, P (1988) An expression cassettte for targeting foreign proteins into the chloroplstas. Nucl. Acids res. 16: 11380).
Erfindungsgemäße pflanzliche Gene, die eine pflanzliche 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase kodieren, können bereits die Nukleinsäuresequenz, kodierend ein plastidäres Transitpeptid enthalten. In diesem Fall ist ein weiteres Transitpeptid nicht nötig.
Beispielsweise enthält die Sequenz der erfndungsgemäßen 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana (SEQ. ID. NO. 2) bereits ein Transitpeptid. Das 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Gen aus Arabidopsis thaliana weist somit gegenüber der im Stand der Technik bekannten Sequenz aus Synechocystis spec. PCC 6803 den weiteren Vorteil auf, das direkt die gewünschte Translokation möglich ist.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen Nukleinsäure-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet vorzugsweise in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäurekonstrukt und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Ein Beispiel für einen Terminator ist der ocs Terminator (Gielen, J, de Beuckeleer, M, Seurinck, J, Debroek, H, de Greve, H, Lemmers, M, von Montagu, M, Schell, J (1984) The complete sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5. EMBO J. 3: 835-846).
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.
Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewingback" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren kodierend ein 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase oder der vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte oder der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase zur Herstellung von transgenen Organismen, insbesondere Pflanzen.
Vorzugsweise weisen diese transgenen Pflanze gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Vitamin E auf.
Daher betrifft die Erfindung ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte zur Erhöhung des Gehalts an Vitamin E in Organismen, die als Wildtyp in der Lage sind, Vitamin E zu produzieren.
Es ist bekannt, daß Pflanzen mit einem hohen Vitamin-E-Gehalt eine erhöhte Resistenz gegenüber ablotischem Streß aufweisen. Unter ablotischem Streß wird beispielsweise Kälte, Frost, Trockenheit, Hitze und Salz verstanden.
Daher betrifft die Erfindung weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Herstellung transgener Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Resistenz gegenüber ablotischem Streß aufweisen.
Die vorstehend beschriebenen Proteine und Nukleinsäuren können zur Herstellung von Vitamin E in transgenen Pflanzen verwendet werden.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom eines Organismus, insbesondere einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet.
Dazu können insbesondere bei Pflanzen an sich bekannte Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden.
Geeignete Methoden zur Transformation von Pflanzen sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA- Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der, vorstehend beschriebene, durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben.
Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711) oder besonders bevorzugt pSUN2 (WO 02/00900).
Dementsprechend betrifft die Erfindung weiterhin Vektoren enthaltend die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Expressionskasetten.
Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die Expressionskassette kann über die Pflanzen hinaus auch zur Transformation von Bakterien, insbesondere Cyanobakterien, Moosen, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen eingesetzt werden.
Zur bevorzugten Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, im folgenden auch transgene Pflanzen bezeichnet, wird die fusionierte Expressionskassette, die eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase exprimiert, in einen Vektor, beispielsweise pBin19, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren.
Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Expression einer Nukleinsäure codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase enthalten.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase kodierenden Nukleinsäure wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben.
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in ein Derivat des Transformationsvektors pBin-19 mit 35s Promotor (Bevan, M., Nucleic Acids Research 12: 8711-8721 (1984)) eingebaut werden.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Die Erfindung betrifft daher ferner die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, der vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere der Expressionskassetten zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen oder zur Transformation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzenteilen.
Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes der Pflanze oder Pflanzenteile an Vitamin E.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen, Blütenblättern oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen indem man eine vorstehend beschriebene Nukleinsäure oder ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt in das Genom des Ausgangsorganismus einführt.
Die Erfindung betrifft ferner die genetisch veränderten Organismen, wobei die genetische Veränderung die Aktivität einer 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase gegenüber einem Wildtyp erhöht und die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthält.
Wie vorstehend ausgeführt erfolgt die Erhöhung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp vorzugsweise durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon- Methyltransferase.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt, wie vorstehend ausgeführt, die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase durch Einbringen von Nukleinsäuren codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase in den Organismus und damit durch Überexpression von Nukleinsäuren codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase.
Bevorzugte transgene Organismen, enthalten, wie vorstehend erwähnt, mindestens ein exogenes oder mindestens zwei endogene erfindungsgemäße 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase- Gene.
Als Organismen und zur Herstellung von Organismen mit einem erhöhten Gehalt an Vitamin E im Vergleich zum Wildtyp werden in einer bevorzugten Ausführungsform, wie vorstehend erwähnt, photosynthetisch aktive Organismen wie beispielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, besonders bevorzugt Pflanzen als Ausgangsorganismen und dementsprechend auch als genetisch veränderte Organismen verwendet.
Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Unter genetisch veränderten oder transgenen Organismen werden die entsprechenden, transformierten Ausgangsorganismen verstanden.
Bevorzugte Cyanobakterien sind Cyanobakterien der Gattung Synechocystis.
Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.
Bevorzugte Pflanzen sind, wie vorstehend ausgeführt Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte, Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf, Brassicacaen wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Nuß- und Weinspezies oder Holzgewächse wie beispielsweise Espe oder Eibe.
Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Tagetes erecta, Brassica napus, Nicotiana tabacurn, Sonnenblume, Canola, Kartoffel, Soja, sowie weitere Ölsaaten.
Die genetisch veränderten Organismen, insbesondere Pflanzen können, wie vorstehend beschrieben, zur Herstellung von Vitamin E verwendet werden.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitamin-E können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Prozessierung als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Futter- und Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden. Ferner können die genetisch veränderten Organismen zur Herstellung von Vitamin E-haltigen Extrakten der Organismen und/oder zur Herstellung von Futter- und Nahrungsergänzungsmitteln verwendet werden.
Unter einem erhöhten Gehalt an Vitamin E wird in der Regel ein erhöhter Gehalt an Gesamt-Tocopherol verstanden. Unter einem erhöhten Gehalt an Vitamin E wird aber auch insbesondere ein veränderter Gehalt der vorstehend beschriebenen 8 Verbindungen mit Tocopherolaktivität verstanden, ohne dass zwangsläufig der Gesamt- Tocopherolgehalt erhöht sein muß.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

Allgemeine Experimentelle Bedingungen

Sequenzanalyse rekombinanter DNA

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1

Amplifikation einer cDNA, die die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon- Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana mit natürlichem Transitpeptid codiert

Die cDNA, die für die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana codiert, wurde mittels PCR aus A. thaliana Blatt-RNA amplifiziert.
Für die Präparation von Total-RNA aus A. thaliana Columbia, die sechs Wochen im Kurztag gewachsen waren, wurden Rosettenblätter geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das Blattmaterial wurde im Mörser pulverisiert und in Z6-Puffer aufgenommen (Z6-Puffer: 8 M Guanidiniumhydrochlorid, 20 mM MES, 20 mM EDTA eingestellt auf pH 7.0; auf 50 ml Puffer wurden 400 µl β-Mercaptoethanol frisch zugegeben). Die Suspension wurde dann in Reaktionsgefäße überführt und mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25: 24: 1) extrahiert. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 15 000 U/min. wurde der Überstand abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
Die RNA wurde mit 1/20 Volumen 1 N Essigsäure und 0.7 Volumen absolutem Ethanol gefällt. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Pellet zunächst in 3 M Natriumacetatlösung und nach einer weiteren Zentrifugation in 70% Ethanol gewaschen. Anschliessend wurde das Pellet in DEPC Wasser (über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumen Diethylpyrocarbonat bei Raumtemperatur, anschliessend zweimalig autoklaviert) gelöst und die RNA-Konzentration photometrisch bestimmt.
Für die cDNA-Synthese wurden 20 µg Gesamt-RNA zunächst mit 3.3 µl 3 M Natriumacetatlösung, 2 µl 1 M Magnesiumsulfatlösung versetzt und auf 100 µl Endvolumen mit DEPC Wasser aufgefüllt. Dazu wurde 1 µl RNAse-freie DNAse (Roche) gegeben (10-50 × 10³ Units/ml) und 45 min. bei 37°C inkubiert. Anschliessend wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Nach Zentrifugation wurde das RNA-Pellet in 100 µl DEPC Wasser aufgenommen. 2.5 µg der RNA aus dieser Lösung wurden mittels eines cDNA- Kits (GIBCO BRL) nach Herstellerangaben in cDNA umgeschrieben.
Die Nukleinsäure kodierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus A. thaliana wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus A. thaliana unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (AtMT+TP-5': SEQ ID NO. 13) und eines antisense spezifischen Primers (AtMT+His-3': SEQ ID NO. 14) amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Protein mit Transitpeptid codiert, erfolgte in einem 50 µl Reaktionsansatz in dem enthalten war:

- 1 µl einer A. thaliana cDNA. (hergestellt wie oben beschrieben)
- je 0.15 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP
- 40 pmol AtMT+TP-5' (SEQ ID NO. 13)
- 40 pmol AtMT+His-3' (SEQ ID NO. 14)
- 5 µl 10 × PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.75 µl Ex Taq Polymerase (TAKARA)
- 36 µl Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
Die PCR-Amplifikation resultierte in einem 1022 Bp-Fragment, das für ein Protein mit seinem natürlichen Transitpeptid codiert. Es enthält nicht das natürliche Stop-Codon und erlaubte somit eine C-terminale translationale Fusion mit einem His-Tag. Das Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert.
Sequenzierung mit dem T7- und dem SP6-Primer bestätigte eine Sequenz, die sich lediglich im vorletzten Codon in einer Base unterscheidet. Dieser Nukleotidaustausch führt aber nicht zu einem Aminosäureaustausch.
Der Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pQE60 (QIAGEN) verwendet. Die Klonierung in den pQE60 (QIAGEN) erfolgte durch Isolierung des NcoI-BamHI-Fragments aus pGEM-Teasy und Ligierung mit dem NcoI-BamHI geschnittenen pQE60 (Abb. 4, Konstruktkarte).
In dem Konstrukt (Abb. 4) beinhaltet Fragment A (1022 bp) die Sequenz codierend für die A. thaliana 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase mit natürlichem Transitpeptid aber ohne Stop-Codon und Fragment B (30 bp) die Sequenz codierend den His- Tag.

Beispiel 2

Amplifikation einer cDNA, die die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon- Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana ohne Transitpeptid codiert

Das A. thaliana 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferaseprotein wurde über iPSORT (Bannai, H, Tamada, Y, Maruyama, O, Nakai, K, Miyano, S (2001) Views: Fundamental Building Blocks in the Process of Knowledge Discovery. In Proceedings of the 14t^h FLAIRS Conference, 233-238, AAAI Press) analysiert. Das Programm sagt eine N-terminale 30 Aminosäure lange Signalsequenz voraus, die eine Erkennungssequenz für den Chloroplastenimport darstellen soll.
Die cDNA, die für 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus A. thaliana ohne natürliches Transitpeptid codiert, wurde mittels PCR aus A. thaliana Blatt-RNA amplifiziert.
Die Präparation von Total-RNA aus A. thaliana Rosettenblättern erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die cDNA-Synthese erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.
Die Nukleinsäure kodierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase ohne Transitpeptid wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus A. thaliana unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (AtMTdTP-5': SEQ ID NO. 15) und eines antisense spezifischen Primers (AtMT+His-3': SEQ ID NO. 14 bzw. AtMT- His-3': SEQ ID NO. 16) amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Protein mit Transitpeptid codiert, erfolgte in einem 50 µl Reaktionsansatz in dem enthalten war:

- 1 µl einer A. thaliana cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
- je 0.15 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP (TAKARA)
- 40 pmol AtMTdTO-5' (SEQ ID NO. 15)
- 40 pmol AtMT+His-3' (SEQ ID NO. 14) bzw. AtMT-His-3' (SEQ ID NO. 16)
- 5 µl 10 × PCR-Puffer (Stratagene)
- 0.75 µl Pfu Polymerase (Stratagene)
- 36 µl Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID NO. 14 und SEQ ID NO. 15 resultiert in einem 938 Bp-Fragment, das für ein Protein ohne natürliches Transitpeptid und ohne natürliches Stop-Codon codiert. Die Klonierung dieses PCR-Fragmentes in den pQE 60 ermöglicht damit eine C-terminale translationale Fusion mit einem His-Tag.
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID NO. 15 und SEQ ID NO. 16 resultierte in einem 941 Bp-Fragment, das für ein Protein ohne natürliches Transitpeptid aber mit Stop-Codon codiert. Die Klonierung dieses PCR-Fragmentes in den pQE 60 erlaubte somit die Expression ohne C-terminale Fusion.
Die Amplifikate wurden unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert. Sequenzierungen mit dem T7- und dem SP6-Primer bestätigten eine zur Datenbank identische Sequenz, wobei im PCR-Fragment für die Expression als His-Fusionsprotein das natürliche Stop-Codon fehlt, um die Fusion mit dem His-Tag zu erlauben.
Die Klonierung in den pQE60 (QIAGEN) erfolgte durch Isolierung des NcoI-BamHI-Fragmentes aus pGEM-Teasy und Ligierung mit dem NcoI-BamHI geschnittenen pQE60 (Abb. 5 und 6).
In Abb. 5 beinhaltet Fragment A (941 bp) die cDNA codierend für die A. thaliana 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase ohne Transitpeptid und ohne Fusion mit einem His-Tag.
In Abb. 6 beinhaltet Fragment A (938 bp) die cDNA codierend für die A. thaliana 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase ohne Transitpeptid aber als Fusion mit dem C-terminalen His- Tag.

Beispiel 3

Nachweis der Enzymaktivität in E. coli-Extrakten

Die Anzucht der E. coli M15-Zellen, die mit den Expressionsklonen pQE60-AtMT+His bzw. pQE60-AtMT-TP-His bzw. mit pQE60 transformiert worden waren, erfolgte in LB-Medium, dem Kanamycin und Ampicillin zugesetzt wurde. Die Kulturen wurden bei 28°C geschüttelt bis eine optische Dichte von OD₆₀₀ 0,35-0,4 erreicht wurde. Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von ITPG (Endkonzentration: 0,4 mM)induziert. Anschließend wird die Kultur für weitere 2-3 Stunden bei 28°C geschüttelt. Die Zellen werden durch 10minütige Zentrifugation bei 8000 xg geerntet.
Das Pellet wird in 1 ml Lysispuffer pro 100 ml Kultur resuspendiert (Lysispuffer: 10 mM HEPES pH 7,8, 0,24K Sorbitol, SinN DTT). Der Aufschluss der Zellen erfolgte durch einen zweimaligen Ultraschallpuls von jeweils 15 Sekunden. Nach Zugabe von CHAPS (Endkonz.: 0,2%) wird für 30-60 Minuten bei 4°-8°C leicht geschüttelt. Der Ansatz wird anschliessend für 10 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Eppendorf Reaktionsgefäß überführt. Die Proteinkonzentration der Proteinlösungen wird nach Standardmethoden bestimmt.
Für den Enzymtest werden:

Ad 500 µl Proteinlösung
210 µl 125 mM Tricine-NaOH pH 8,0
10 µl 1,25 M Sorbitol
105 µl 50 mM MgCl₂
20 µl 250 mM Ascorbat (frisch)
10 µl 2 mg/ml = 5 mM 2-Methyl-6-phytylhydrochinon

vorgelegt.
Die Reaktion wird mit 15 µl 0,46 mM SAM ¹⁴C gestartet.
Der Ansatz wird 3-48 Stunden bei 30°C inkubiert.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 750 µl Chloroform/Methanol (1 : 2) und 750 µl 0,9% NaCl gestoppt. Nach 2minütiger Zentrifugation wird die obere Phase und die Interphase verworfen. Die Unterphase wird bis zur Trockne im Speed Vac eingeengt.
Der Rückstand wird in 20 µl Ether aufgenommen. Die Analyse des Enzymtests erfolgt über Dünnschichtchromatographie (feste Phase: HPTLC-Platten: Kieselgel 60 F₂₅₄; flüssige Phase: Toluol. Als Kontrolle wird 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinon bzw. 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylhydrochinon auf die Dünnschichtplatte auftragen.
Nach beendetem Lauf wird die Dünnschichtplatte getrocknet. Der Nachweis des radioaktiv markierten Reaktionsproduktes erfolgte durch Verwendung des Phosphoimagers (Molecular Imager®FX, Bio- RAD).
Die Aktivitätsbestimmung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase erfolgte nach vorstehender allgemeinen Vorschrift durch Nachweis des radioaktiv markierten Reaktionsproduktes 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylhydrochinon.
Der Nachweis des radioaktiv markierten. Reaktionsproduktes erfolgt durch Verwendung eines Phosphoimagers.
In Zellextrakten, die die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase ohne Transitpeptid mit oder ohne His-tag exprimierten, konnte die Umsetzung des 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinons zum 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylhydrochinon nachgewiesen werden. Abb. 3A zeigt die enzymatische Umsetzung von 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon; Abb. 3B zeigt die spezifische Aktivität der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus A. thaliana nach Überexpression in E. coli mit Vektor- und Hitzekontrolle.

Beispiel 4

Klonierung der A. thaliana 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase in Hefeexpressionsvektoren

Der Klon pQE60/AtMT+TP+His wird mit NcoI geschnitten und die überhängenden Enden werden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt. Die DNA wird mit BamHI nachgeschnitten, und das 1016 bp-Fragment wird isoliert. Der Hefeexpressionsvektor pESP-3 (Stratagene) wird mit NdeI geschnitten und überhängende Enden werden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt.
Der Vektor wird mit BamHI nachgeschnitten und mit dem AtMT-Fragment ligiert. Der resultierende Expressionsklon erlaubt eine translationale Fusion mit dem Glutathion S Transferase-Peptid (Abb. 7, Konstruktkarte).
In Abb. 7 beinhaltet Fragment A (1156 bp) den Promotor Pnmt1 des Gens nmtI, Fragment B (1013 Bp) die cDNA codierend für die A. thaliana 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase mit Transitpeptid, Fragment C (710 bp) das GST-Peptid und Fragment D (994 bp) den Terminator tnmt1.
Für das Expressionskonstrukt, das für die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase ohne Transitpeptid codiert, wird der Klon pQE60/AtMTdTP+His mit NcoI geschnitten, und die überhängenden Enden werden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt. Es wird mit BamHI nachgeschnitten, um das 938 bp-Fragment zu isolieren. Das Fragment wird in den pESP-3-Vektor (Stratagene) ligiert, der mit NdeI geschnitten, mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und mit BamHI nachgeschnitten wurde. Der resultierende Expressionsklon erlaubt eine translationale Fusion mit dem Glutathion S-Transferase-Peptid (Abb. 8, Konstruktkarte).
In Abb. 8 beinhaltet Fragment A (1156 bp) den Promotor Pnmt1 des Gens nmtI, Fragment B (929 Bp) die: cDNA codierend für die A. thaliana 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase ohne Transitpeptid, Fragment C (710 bp) das GST-Peptid und Fragment D (994 bp) den Terminator tnmt1.

Beispiel 5

Nachweis der Methyltransferase-Aktivität in Hefeextrakten

Die Präparation und Transformation von SP-Q01 Schizosaccharomyces pombe (Stratagene) Zellen erfolgt nach den Angaben des Herstellers (ESP® Yeast Protein Expression and Purification System und ESP® Yeast Protein Expression Vectors).
Rekombinante S. pombe Zellen werden nach den Angaben des Herstellers angezogen, induziert und aufgeschlossen.
Die Expression der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase als Fusionsprotein mit GST erlaubt die Aufreinigung über GST-Affinitätschromatographie nach Angaben des Herstellers.

Beispiel 6

Substratspezifität der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana

Der Enzymtest wurde in E. coli-Extrakten durchgeführt. Die Anzucht der E. coli-Zellen, die Induktion der Proteinexpression, der Zellaufschluss und der Enzymtest erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben.
Als Substrate wurden 2-Methyl-6-phytylhydrochinon, 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon, Monomethyl-solanesylhydrochinon, γ-, β- δ-Tocopherol und γ-, β-, δ-Tocotrienol eingesetzt.
Es konnte der Umsatz von 2-Methyl-6-phytylhydrochinon, 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon und Monomethyl-solanesylhydrochinon zum entsprechenden 2,3-Dimethyl-Produkt nachgewiesen werden. Kein Umsatz erfolgte mit folgenden Substraten: γ-, β-, δ-Tocopherol und γ-, β-, δ-Tocotrienol.
Die Resultate der Enyzmtests zeigten, dass es sich bei dem klonierten Protein um eine Methyltransferase handelt, die neben dem Tocopherol- und Tocotrienol-Vorläufer auch das Monomethyl-solanesylhydrochinon umsetzt. Letzterer ist ein Vorläufer des Plastochinons.

Beispiel 7

Herstellung von Expressionskasetten zur Expression der A. thaliana 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase in Nicotiana tabacum, A. thaliana, Brassica napus

Die Expression in N. tabacum, A. thaliana und B. napus erfolgt unter Kontrolle des konstitutiven Promoters des Nitrilase-Gens Pnit (Y07648.2, Hillebrand et al. (1998) Structural analysis of the nit2/nit3 gene cluster encoding nitrilases, enzymes catalyzing the terminal activation step in indole-acetic acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 36(1), 89-99; Hillebrand et al. (1996) Structure of the gene encoding nitrilase 1 from Arabidopsis thaliana. Gene 170(2), 197-200) und unter Kontrolle des samenspezifischen Promoters des Vicillin Gens aus Vicia faba (Weschke, W, Bassüner, R, Van Hai, N, Czihai, A, Bäumlein, H, Wobus, U (1988) The Structure of a Vicia vaba Vicillin Gene. Biochem. Physiol. Pflanzen 183: 233-242; Bäumlein, H, Boerjan, W, Nagy, I, Bassüner, R, Van Montagu, M, Inzé, D, Wobus, U (1991) A novel seed protein gene from Vicia faba is developmentally regulated in transgenic tobacco and Arabidopsis plants. Mol Gen Gent 225: 459-467). Die Expression erfolgt mit dem natürlichen Transitpeptid.
Für die Klonierung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus A. thaliana wird der binäre Vektor pSUN2 (WO 02/00900) mit Standardmethoden so verändert, dass in einem Konstrukt eine multiple Klonierungsstelle von dem Pnit-Promoter und dem ocs-Terminator (Gielen et al. (1984) ENBO, 3: 835-846) flankiert wird. In einem zweiten Konstrukt liegt der Pvic-Promoter in pSUN2 vor.
Die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase wird mittels PCR amplifiziert, wobei am 5'-Ende eine Smai-Schnittstelle und eine Kozak-Sequenz (Kozak, M (1986) Point Mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eucaryotic ribosomes. Cell 44: 283-292) die eine optimale Translation ermöglichen soll, eingeführt wird (AtMT(Kozak)-5': SEQ ID NO. 17), während am 3'-Ende eine BamHI-Schnittstelle eingeführt wird (AtMT-His, SEQ ID NO. 16).
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Protein mit Transitpeptid codiert, erfolgte in einem 50 µl Reaktionsansatz in dem enthalten war:

- 1 µl einer A. thaliana cDNA (hergestellt wie oben beschrieben)
- je 0.15 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP
- 40 pmol AtMT(Kocak)-5' (SEQ ID NO. 17)
- 40 pmol AtMT-His (SEQ ID NO. 16)
- 5 µl 10 × PCR-Puffer (TAKARA)
- 0.75 µl Ex Taq Polymerase (TAKARA)
- 36 µl Aq. Dest.

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
Das PCR-Produkt wurde in den pGEM-Teasy kloniert und vollständig sequenziert, um die korrekte Sequenz zu bestätigen. Der pGEM- Teasy Klon wird mit BamHI geschnitten, die überhängenden Enden werden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und mit SmaI nachgeschnitten. Das Fragment wird isoliert und in den mit SmaI geschnittenen Vektor pSUN2/Pnit/ocs kloniert.
Der Klon, der die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase in der korrekten Orientierung enthält, heisst pSUN2/Pnit/AtMT/ocs (Abb. 9; Konstruktkarte).
In der Abb. 9 beinhaltet Fragment A (1875 bp) den Pnit-Promoter, Fragment B (1017 bp) die A. thaliana 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase und Fragment C (208 bp) den ocs-Terminator.
Für die Expression unter Kontrolle eines Samen-spezifischen Promoters wird der Klon pSUN2/Pnit/AtMT/ocs mit XhoI und HindIII geschnitten und das 1279 bp-Fragment isoliert. Dieses Fragment wird in den pSUN2/Pvic, der mit XhoI und HindIII geschnitten wurde, kloniert.
Der resultierende Klon heisst pSUN2/Pvic/AtMT/ocs (Abb. 10, Konstruktkarte).
In der Abb. 10 beinhaltet Fragment A (2564 bp) den Vicillin- Promoter, Fragment B (1017 bp) die A. thaliana Methyltransferase und Fragment C (208 bp) den ocs-Terminator.

Beispiel 8

Herstellung transgener A. thaliana Pflanzen

Wildtyp A. thaliana Pflanzen (Columbia) wurden mit dem Agrabacterium tumefaciens Stamm (EHA105) auf Grundlage einer modifizierten Methode (Steve Clough und Andrew Bent. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of A. thaliana. Plant J 16(6): 735-43, 1998) der Vacuum Infiltrationsmethode nach Bechtold und Kollegen (Bechtold, N. Ellis, J. und Pelltier, G.,in planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult A. thaliana plants. CRAcad Sci Paris, 1993. 1144(2): 204-212) transformiert.
Die verwendeten A. tumefaciens Zellen waren im Vorfeld mit den Plasmiden pSUN2/Pnit/AtMT/ocs und pSUN2/Pvic/AtMT/ocs aus Beispiel 7 transformiert worden.
Samen der Primärtransformanden wurden auf Grundlage der Antibiotikaresistenz selektioniert. Antibiotika resistente Keimlinge wurden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.

Beispiel 9

Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen

Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientierte sich an einem Protokoll von Bade, J. B, und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist. Die Transformationen erfolgten mit den Agrobacterium tumefaciens Stämmen EHA105 bzw. GV3101.
Zur Transformation wurden die Plasmide pSUN2/Pnit/AtMT/ocs und pSUN2/Pvic/AtMT/ocs aus Beispiel 7 verwendet. Samen von Brassica napus var. Westar wurden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate wurden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.
Vom Agrobacterium Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD₆₀₀ von 0,3 eingestellt.
Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien- Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus- Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotiationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co- Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.
Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explante in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kanamycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen wurde wie von Bade, J. B und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.

Beispiel 10

Herstellung transgener Nicotiana tabacum Pflanzen

Zehn ml YEB-Medium mit Antibiotikum (5 g/l Rinder-Extrakt, 1 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l Pepton, 5 g/l, Saccharose und 2 mM MgSO₄) wurden mit einer Kolonie von Agrobacterium turne faciens beimpft und über Nacht bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden 20 min bei 4°C, 3500 U/min in einer Tischzentrifuge pelletiert und danach in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika unter sterilen Bedingungen resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für die Transformation eingesetzt.
Zur Transformation wurden die Plasmide pSUN2/Pnit/AtMT/ocs und pSUN2/Pvic/AtMT/ocs aus Beispiel 7 verwendet.
Die Wildtyp-Pflanzen aus Sterilkultur wurden durch vegetative Replikation erhalten. Dazu wurde nur die Spitze der Pflanze abgeschnitten und auf frisches 2MS-Medium in ein steriles Einweckglas überführt. Vom Rest der Pflanze wurden die Haare auf der Blattoberseite und die Mittelrippen der Blätter entfernt. Die Blätter wurden mit einer Rasierklinge in etwa 1 cm² große Stücke geschnitten. Die Agrobakterienkultur wurde in eine kleine Petrischale überführt (Durchmesser 2 cm). Die Blattstücke wurden kurz durch diese Lösung gezogen und mit der Blattunterseite auf 2MS-Medium in Petrischalen (Durchmesser 9 cm) gelegt, so daß sie das Medium berührten. Nach zwei Tagen im Dunkeln bei 25°C wurden die Explantate auf Platten mit Kallusinduktionsmedium überführt und in der Klimakammer auf 28°C temperiert. Das Medium mußte alle 7-10 Tage gewechselt werden. Sobald sich Kalli bildeten, wurden die Explantate in sterile Einweckgläser auf Sproßinduktionsmedium mit Claforan (0,6% BiTec-Agar (g/v), 2,0 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Gibberelinsäure, 0,25 g/ml Claforan, 1,6% Glukose (g/v) und 50 mg/l Kanamycin) überführt. Nach etwa einem Monat trat Organogenese ein und die gebildeten Sprosse konnten abgeschnitten werden. Die Kultivierung der Sprosse wurde auf 2MS-Medium mit Claforan und Selektionsmarker durchgeführt. Sobald sich ein kräftiger Wurzelballen gebildet hatte, konnten die Pflanzen in Pikiererde getopft werden.

Beispiel 11

Charakterisierung der transgenen Pflanzen

Die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte in Blätter und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten transformierten Pflanzen aus Beispiel 8, 9 und 10 (Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Nicolziana tabacum) werden analysiert. Dazu werden die transgenen Pflanzen im Gewächshaus kultiviert und Pflanzen, die das Gen kodierend für die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana exprimieren auf Northern-Ebene identifiziert. In Blättern und Samen dieser Pflanzen wird der Tocopherolgehalt und der Tocotrienolgehalt ermittelt.
Dazu wird das Blattmaterial von Pflanzen direkt nach der Probennahme in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Der daran anschließende Aufschluß der Zellen erfolgt mittels einer Rührapparatur durch dreimalige Inkubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, 1000 rpm in 100% Methanol für 15 Minuten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt wurden.
Weitere Inkubationsschritte ergaben keine weitere Freisetzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen.
Um Oxidation zu vermeiden, wurden die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer HPLC-Anlage (Waters Allience 2690) analysiert. Tocopherole und Tocotrienole wurden über eine reverse Phase Säule (ProntoSil 200-3-C30®, Fa. Bischoff) mit einer mobilen Phase von 100% Methanol getrennt und anhand von Standards (Fa. Merck) identifiziert. Als Detektionssystem diente die Fluoreszenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emision 320 nm) die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszenzdetektors FP 920 nachgewiesen wurde.
In allen Fällen ist die Tocopherol- bzw. Tocotrienol-Konzentration im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen erhöht. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Kultivierung von Organismen die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität aufweisen, wobei die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erhöhung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität die Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase gegenüber dem Wildtyp erhöht, wobei die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon- Methyltransferase die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erhöhung der Genexpression Nukleinsäuren in den Organismus einbringt, die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen kodieren, wobei die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthalten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Nukleinsäuren verwendet, die pflanzliche 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferasen kodieren.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Nukleinsäuren, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 1 einbringt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze verwendet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Kultivieren den Organismus erntet und anschließend Vitamin E aus dem Organismus isoliert.

8. Verwendung von Proteinen enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 und die die enzymatische Aktivität zur Umwandlung von 2-Methyl-6-phytylhydrochinon in 2,3-Dimethyl-6-phytylhydrochinon aufweisen, als 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase.

9. Verwendung von Nukleinsäuren kodierend Proteine gemäß Anspruch 8 zur Expression von Proteinen die eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität aufweisen.

10. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft, eine Nukleinsäure codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist.

11. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Regulationssignale einen oder mehrere Promotoren enthalten, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten.

12. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man Regulationssignale verwendet, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten.

13. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 12, enthaltend zusätzlich eine Nukleinsäure kodierend ein plastidäres Transitpeptid.

14. Genetisch veränderter Organismus, wobei die genetische Veränderung die Aktivität einer 2-Methyl-6-phytylhydrochinon- Methyltransferase gegenüber einem Wildtyp erhöht und die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthält.

15. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Erhöhung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase-Aktivität durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase gegenüber dem Wildtyp bewirkt wird und die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, enthält.

16. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erhöhung der Genexpression Nukleinsäuren in den Organismus einbringt, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 20% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2, und die die enzymatische Eigenschaft einer 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltransferase aufweisen.

17. Genetisch veränderter Organismus nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der genetisch veränderte Organismus gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Vitamin E-Gehalt aufweist.

18. Genetisch veränderter Organismus nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze verwendet.

19. Verwendung eines genetisch veränderten Organismus nach einem der Ansprüche 14 bis 18 zur Herstellung von Vitamin E oder zur Biotransformation von 2-Methyl-6-phytylhydrochinonderivate in 2,3-Dimethyl-5-phytylhydrochinonderivate, 2-Methyl-6-solanesylhydrochinonderivate in 2,3-Dimethyl-5-solanesylhydrochinonderivate oder 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinonderivate in 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylhydrochinonderivate.

20. Verwendung der genetisch veränderten Organismen nach einem der Ansprüche 14 bis 18 als Futter- und Nahrungsmittel, zur Herstellung von prozessierten Lebensmitteln, zur Herstellung von Vitamin E-haltigen Extrakten der Organismen oder zur Herstellung von Futter- und Nahrungsergänzungsmittel.

21. Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man Nukleinsäuren gemäß Anspruch 2 oder Nukleinsäurekonstrukte gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 in das Genom des Ausgangsorganismus einführt.

22. Verwendung der Nukleinsäuren gemäß Anspruch 3 oder der Nukleinsäurekonstrukte gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 zur Erhöhung des Gehalts an Vitamin E in Organismen, die als Wildtyp in der Lage sind, Vitamin E zu produzieren.

23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze verwendet und die transgene Pflanze gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Resistenz gegenüber ablotischem Streß aufweist.