DE10046462A1

DE10046462A1 - Verbesserte Verfahren zur Vitamin E Biosynthese

Info

Publication number: DE10046462A1
Application number: DE10046462A
Authority: DE
Inventors: Michael Geiger; Marcus Ebneth; Irene Kunze
Original assignee: SunGene GmbH
Current assignee: SunGene GmbH
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2000-09-19
Publication date: 2002-05-29
Also published as: EP1326994A2; US20030182679A1; CA2422760A1; AU2002223548A1; WO2002031173A3; WO2002031173A2

Abstract

Die Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Biosynthese von Vitamin E. Diese Verfahren sind gekennzeichnet durch eine Inhibition des Abbaus von Homogentisat über Maleylacetoacetat und Fumarylacetoacetat zu Fumarat und Acetoacetat. Erfindungsgemäß ist ferner die Kombination dieser Inhibition mit Verfahren, die die Homogentisatbereitstellung steigern bzw. die Umsetzung des Homogentisats zu Vitamin E fördern. DOLLAR A Erfindungsgemäß sind Nukleinsäurekonstrukte und Vektoren, mit denen die erfindungsgemäßen Verfahren realisiert werden können, sowie davon ausgehend erzeugte transgene pflanzliche Organismen.

Description

Die Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Biosynthese von Vitamin E. Diese Verfahren sind gekennzeichnet durch eine Inhibition des Abbaus von Homogentisat (HG) über Maleylaceto acetat (MAA), Fumarylacetoacetat (FAA) zu Fumarat und Aceto acetat. Erfindungsgemäss ist ferner die Kombination dieser Inhibition mit Verfahren, die die Homogentisatbereitstellung weiter steigern, bzw. die Umsetzung des Homogentisat zu Vitamin E fördern.

Homogentisat ist ein bedeutender Stoffwechselmetabolit. Es ist ein Abbauprodukt der Aminosäuren Tyrosin und Phenylalanin. In Mensch und Tier wird Homogentisat weiter zu Maleylacetoacetat, infolge zu Fumarylacetoacetat und dann zu Fumarat und Acetoacetat abgebaut. Pflanzen und andere photosynthesebetreibende Mikro organismen verwenden Homogentisat ferner als Ausgangsprodukt für die Synthese von Tocopherolen und Tocotrienolen.

Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E- Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell schaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die Gruppe der Toco pherole (1a-d) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe der Tocotrienole (2a-d) eine ungesättigte Seitenkette:

1a, α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
1b, β-Tocopherol [148-03-8]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
1c, γ-Tocopherol [54-28-4]: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
1d, δ-Tocopherol [119-13-1]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

2a, α-Tocotrienol [1721-51-3]: R¹ = R² = R³ = CH₃
2b, β-Tocotrienol [490-23-3]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2]: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle acht vorstehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin-E- Aktivität verstanden.

Diese Verbindungen mit Vitamin-E-Aktivität sind wichtige natür liche fettlösliche Antioxidantien. Ein Mangel an Vitamin E führt bei Menschen und Tieren zu pathophysiologischen Situationen. Epidemiologische Untersuchungen haben ergeben, dass eine Nahrungsergänzung mit Vitamin E das Risiko, an kardiovaskuläre Erkankungen oder Krebs zu erkranken, reduziert. Ferner ist eine positive Wirkung auf das Immunsystem und eine Prävention von generellen altersbedingten Degenerationserscheinungen beschrieben (Traber MG, Sies H; Annu Rev Nutr. 1996; 16: 321-47). Die Funktion von Vitamin E liegt dabei vermutlich in einer Stabilisierung der biologischen Membranen, sowie in einer Reduktion von freien Radikalen, wie sie zum Beispiel bei der Lipidoxidation von poly- ungesättigten Fettsäuren (PUFA) entstehen.

Die Funktion von Vitamin E in den Pflanzen selber ist kaum unter sucht. Es scheint jedoch eventuell eine wichtige Funktion in der Stressreaktion der Pflanze v. a. auf oxidativen Stress zu haben. Erhöhte Vitamin E Spiegel wurden mit erhöhter Stabilität und Lagerfähigkeit von Pflanzenprodukten in Verbindung gebracht. Der Zusatz von Vitamin E zu Tierernährungsprodukten hat einen positiven Effekt auf die Fleischqualität und die Lagerfähigkit von Fleisch und Fleischprodukten bei z. B. Schweinen, Rindern und Geflügel.

Vitamin E-Verbindungen haben daher einen hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich, in pharma zeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.

In der Natur wird Vitamin E ausschliesslich von Pflanzen und anderen photosynthetisch aktiven Organismen (z. B. Cyanobacterien) synthetisiert. Der Gehalt an Vitamin E variiert stark. Die meisten Grundnahrungsmittelpflanzen (z. B. Weizen, Reis, Mais, Kartofffel) haben einen nur sehr geringen Vitamin E Gehalt (Hess, Vitamin E, α-tocopherol, In Antioxidants in Higher Plants, Her ausgeber: R. Ascher and J. Hess, 1993, CRC Press, Boca Raton, pp. 111-134). Ölsaaten haben in der Regel einen deutlich höher Vitamin E Gehalt, wobei β-,γ-,δ-Tocopherol dominieren. Die empfohlene Tagesdosis an Vitamin E liegt bei 15-30 mg.

Fig. 1 zeigt ein Biosyntheseschema von Tocopherolen und Toco trienolen.

Im Verlauf der Biosynthese wird Homogentisinsäure (Homogentisat; HG) an Phytylpyrophosphat (PPP) bzw. Geranylgeranylpyrophosphat gebunden, um die Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocotrienol, das 2-Methyl-phytylhydrochinon bzw. das 2-Methyl-geranylgeranyl hydrochinon zu bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adeno sylmethionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Di methyl-6-phytylhydrochinon, dann durch Zyklisierung γ-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α-Tocopherol. Ferner kann aus 2-Methyl-phythylhydrochinon durch Methylierung β- und δ-Tocopherol synthetisiert werden.

Über die Erhöhung des Stoffwechselflusses zur Steigerung des Tocopherol- bzw. Tocotrienolgehaltes in transgenen Organismen, beispielsweise in transgenen Pflanzen durch Überexpression ein zelner Biosynthesegene ist bisher wenig bekannt.

WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).

WO 99/04622 beschreibt Gensequenzen codierend für eine γ-Tocopherol-methyltransferase aus Synechocystis PCC6803 und Arabidopsis thaliana und deren Einbau in transgene Pflanzen.

WO 99/23231 zeigt, dass die Expression einer Geranylgeranyloxido reduktase in transgenen Pflanzen eine gesteigerte Tocopherolbio synthese zur Folge hat.

WO 00/10380 zeigt eine Veränderung der Zusammensetzung an Vitamin E unter Verwendung von 2-Methyl-6-phytylplastoquinol-methyltrans ferase.

Shintani and DellaPenna haben gezeigt, dass eine Überexpression der γ-Tocopherolmethyltransferase die Vitamin E Gehalt deutlich steigern kann (Shintani und Dellapenna, Science 282 (5396): 2098-2100, 1998).

Alle Reaktionen der Vitamin E Biosynthese laufen über das Homo gentisat. Bisherige Untersuchungen haben sich meist auf die Über expression von Genen der Vitamin E- oder Homogentisat-Biosynthese beschränkt (siehe oben). Wenig Beachtung wurde bislang den Konkurrenzreaktionen zuteil, die Homogentisat abbauen und so der Vitamin E Biosynthese entziehen.

Der Abbau von Homogentisat über Maleylacetoacetat und Fumaryl acetoacetat zu Fumarat und Acetoacetat ist für nicht photo synthetisch aktive Organismen, vor allem tierische Organismen, beschrieben (Fernandez-Canon JM et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92 (20): 9132-9136). Tierische Organismen benutzen diesen Stoffwechselweg zum Abbau aromatischer Aminosäuren, die vor wiegend über die Nahrung aufgenommen werden. Seine Funktion und Relevanz in Pflanzen ist hingegen unklar. Die Reaktionen werden durch die Homogentisat-1,2-dioxygenase (HGD; EC-Nr.: 1.13.11.5), die Maleylacetoacetatisomerase (MAAI; EC-Nr.: 5.2.1.2.) und die Fumarylacetoacetathydrolase (FAAH; EC-Nr.: 3.7.1.2) katalysiert.

Das Gen der Homogentisat-1,2-dioxygenase (HGD) aus Arabidopsis thaliana ist bekannt (Genbank Acc.-No. AF130845). Das Gen der Fumarylacetoacetathydrolase aus Arabidopsis thaliana war bereits aufgrund einer Homologie zu der Fumarylacetoacetathydrolase aus Emericella nidulans (gb|L41670) als ähnlich zu derselben annotiert (Genbank Acc.-No. AC002131). Es ist jedoch in dem entsprechenden Genbank-Eintrag ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die Annotation allein auf Ähnlichkeit und nicht auf experimentellen Daten beruht. Das Gen der Maleylacetoacetat isomerase (MAAI) aus Arabidopsis war als Gen in der Genbank vorhanden (AC005312), jedoch als eine putative Glutathion- S-Transferase annotiert. Bekannt war eine MAAI aus Emericella nidulans (Genbank Acc.-No. EN 1837).

Tsegaye et al. mutmassen in einem Abstract (Abstract No. 413) zum 1999 Jahrestreffen der American Society of Plant Physiologists (24.-28.07.1999, Baltimore, USA) einen Vorteil in der Kombination einer Kreuzung von HPPD-überexprimierenden Pflanzen mit Pflanzen in denen die HGD durch einen antisense-Ansatz herrunterreguliert wird.

Trotz einiger Erfolge besteht weiterhin Bedarf an einer Opti mierung der Vitamin E Biosynthese. Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, weitere Verfahren zur Verfügung zu stellen, die den Vitamin E-Biosyntheweges beeinflussen und damit zu weiter vor teilhaften transgenen Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitamin E führen.

Die Aufgabe wurde durch Identifikation des Homgentisat-Maleyl acetoacetat-Fumarylacetoacetat-Fumarat Abbauweges als wesent licher Konkurrenzweg zu dem Vitamin E-Biosynthesewegs gelöst. Es wurde gefunden, dass eine Inhibition dieses Abbauweges zu einer Optimierung der Vitamin E-Biosynthese führt.

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft daher Verfahren zu einer Vitamin E Produktion durch Reduktion der HGD, MAAI bzw. FAAH Aktivität. Als besonders vorteilhaft erweist sich eine Kombination der beschriebenen Inhibition des Homogentisat-Abbau weges mit anderen Verfahren, die zu einer verbesserten Vitamin E Biosynthese führen, indem sie die Umsetzung vom Homogentisat zu Vitamin E fördern. Dies kann durch eine erhöhte Zuverfügung stellung von Reaktionspartnern oder durch eine erhöhte Umsetzung des Homogentisates mit eben diesen realisiert werden. Beispiel haft lässt sich dieser Effekt mit einer Überexpression der Homo gentisatphythyltransferase (HGPT), Geranylgeranyloxidoreduktase, der 2-Methyl-6-phytylplastoquinol-methyltransferase oder der γ-Tocopherol-methyltransferase erreichen.

Vorteilhaft ist ferner eine Kombination mit Genen die die Homo gentisatbildung födern, wie zum Beispiel der HPPD oder dem TyrA- Gen.

Die Inhibition des Abbauweges vom Homogentisat, über Maleyl acetoacetat und Fumarylacetoacetat zum Fumarat und Acetatoacetat kann auf vielfältige Art und Weise realisiert werden.

Ein Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäurekonstrukte, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz (anti-MAAI/FAAH), welche zu einer Inhibition des Maleylacetoacetat-Fumarylacetoacetat-Fumarat Weges befähigt ist, oder ein funktionales Äquivalent davon ent halten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft oben beschriebene Nukleinsäurekonstrukte, die neben der anti-MAAI/FAAH Nuklein säuresequenz zusätzlich wenigstens eine Nukleinsäuresequenz (pro-HG), welche zu einer Steigerung der Biosynthese von Homogen tisat (HG) befähigt ist, oder ein funktionales Äquivalent davon oder wenigstens eine Nukleinsäuresequenz (pro-Vitamin E), welche zu einer Steigerung der Vitamin E Biosynthese ausgehend vom Homo gentisat befähigt ist, oder ein funktionales Äquivalent davon oder eine Kombination von pro-HG und pro-Vitamin E bzw. ihrer funktionellen Äquivalente enthalten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäure konstrukte, die eine Nukleinsäuresequenz (anti-HGD) enthalten, welche zu einer Inhibition der Homogentisat-1,2-dioxygenase (HGD) befähigt ist, oder für ein funktionales Äquivalent davon.

Ferner betrifft die Erfindung besagte anti-HGD Nukleinsäure konstrukte, die neben der anti-HGD Nukleinsäuresequenz zusätzlich wenigstens eine Nukleinsäuresequenz, die für eine bifunktionale Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase (TyrA) oder deren funktio nelle Äquivalente, oder wenigstens eine Nukleinsäuresequenz (pro- Vitamin E), welche zu einer Steigerung der Vitamin E Biosynthese ausgehend vom Homogentisat befähigt ist, oder deren funktionale Äquivalente, bzw. eine Kombination von pro-Vitamin E und TyrA- Sequenzen oder deren funktionellen Äquivalenten enthalten.

TyrA kodiert für ein bifunktionale Chorismatmutase-Prephenatdehy drogenase aus E. coli, eine Hydroxyphenylpyruvatsynthase, dass die enzymatischen Aktivitäten einer Chorismatmutase und Prephenatde hydrogenase beinhaltet, und Chorismat zu Hydroxyphenylpyruvat, dem Homogentisatedukt, umsetzt (Christendat D, Turnbull JL. Bio chemistry. 1999 Apr 13; 38(15): 4782-93; Christopherson RI, Heyde E, Morrison JF. Biochemistry. 1983 Mar 29; 22(7): 1650-6.).

Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte, die wenig stens eine Nukleinsäuresequenz (pro-HG), welche zu einer Steige rung der Homogentisat (HG) Biosynthese befähigt ist, oder ein funktionales Äquivalent davon, und wenigstens eine Nukleinsäure sequenz (pro-Vitamin E), welche zu einer Steigerung der Vitamin E Biosynthese ausgehend vom Homogentisat befähigt ist, oder ein funktionales Äquivalent davon, enthalten.

Erfindungsgemäss sind weiterhin funktionelle Analoga der oben erwähnten Nukleinsäurekonstrukte. Funktionelle Analoga meint hier zum Beispiel eine Kombination der einzelnen Nukleinsäuresequenzen

1. auf einem Polynukleotid (Mehrfachkonstrukte)
2. auf mehreren Polynukleotiden in einer Zelle (Kotrans formation)
3. durch Kreuzung verschiedener transgener Pflanzen, die jeweils mindestens eine der besagten Nukleotidsequenzen enthalten.

Bevorzugt sind die in den Nukleinsäurekonstrukte enthaltenen Nukleinsäuresequenzen funktionell mit genetischen Kontroll sequenzen verbunden.

Die erfindungsgemässe Transformation von Pflanzen mit einem pro-HG kodierenden Konstrukt führt zur Steigerung der Homogenti satbildung. Durch gleichzeitige Transformation mit anti-HGD bzw. anti-MAAI/FAAH, insbesondere dem anti-MAAI Konstrukt, wird ein unerwünschter Abfluss dieses Metaboliten vermieden. Eine erhöhte Homogentisatmenge steht in der transgenen Pflanze somit zur Bildung von Vitamin E, zum Beispiel von Tocopherolen, über die Intermediate Methyl-6-phytylquinol und 2,3-Dimethyl-phytylquinol (vgl. Fig. 1), zur Verfügung. Sowohl pro-HG als auch anti-MAAT/ FAAH oder anti-HGD führen zu einer erhöhten Homogentisatbereits tellung zur Vitamin E-Biosynthese. Die Umsetzung von Homogentisat zu Vitamin E kann durch eine kombinierte Transformation mit einem pro-Vitamin E kodierenden Konstrukt verbessert werden und erhöht weiterhin die Biosynthese von Vitamin E.

"Steigerung" der Homogentisat-Biosynthese ist in diesem Zusammen hang weit auszulegen und einfasst die Erhöhung der Homogentisat (HG)-Biosyntheseaktivität in der mit einem erfindungsgemässen pro-HG Konstrukt transformierten Pflanze oder dem Pflanzenteil oder Gewebe. Erfindungsgemäss sind verschiedene Strategien zur Erhöhung der HG-Biosyntheseaktivität umfasst. Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung steht, um die HG-Biosyntheseaktivität in gewünschter Weise zu beeinflussen. Die infolge beschriebenen Verfahren sind insofern beispielhaft und nicht einschränkend zu verstehen.

Die erfindungsgemäss bevorzugte Strategie umfasst die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz (pro-HG), die transkribiert und zu einem Polypeptid translatiert werden kann, das die HG-Biosynthe seaktivität steigert. Beispiele für derartige Nukleinsäuresequen zen sind die p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD) aus ver schiedenen Organismen oder das bakterielle TyrA-Genprodukt. Neben der beschriebenen künstlichen Expression von bekannten Genen, kann man auch deren Aktivität durch Mutagenese der Polypeptid sequenz erhöhen. Ferner ist eine gesteigerte Transkription und Translation der endogenen Gene zum Beispiel durch Verwendung künstlicher Transkriptionsfaktoren vom Typ der Zinkfingerproteine zu erreichen (Beerli RR et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (4): 1495-500). Diese Faktoren lagern sich in der regulatori schen Bereichen der endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endo genen Gens.

Besonders bevorzug für pro-HG ist die Verwendung der durch Nukleinsäuren, die für Polypeptide gemäss SEQ ID NO: 8, 11 oder 16 kodieren, besonders bevorzugt Nukleinsäuren mit den durch SEQ ID NO: 7, 10 oder 15 beschriebenen Sequenzen.

Analog ist die "Steigerung" der Vitamin E Biosyntheseaktivität zu verstehen, wobei hier Gene zum Einsatz kommen, deren Aktivität die Umsetzung von Homogentisat zu Vitamin E (Tocopherolen, Toco trienolen) oder die Synthese von Reaktionspartnern des Homogen tisats, wie zum Beispiel des Phytylpyrophosphat oder Geranyl geranylpyrophosphat, fördert. Beispielhaft seien genannt die Homogentisat-phytyltransferase (HGPT), Geranylgeranyloxido reduktase, 2-Methyl-6-phytylplastoquinol-methyltransferase und γ-Tocopherol-methyltransferase. Besonders bevorzug ist die Verwendung von Nukleinsäuren, die für Polypeptide gemäss SEQ ID NO: 14, 20, 22 oder 24 kodieren, besonders bevorzugt sind mit den durch SEQ ID NO: 13, 19, 21 oder 23 beschriebenen Sequenzen.

"Inhibition" ist im Zusammenhang mit anti-MAAI/FAAH bzw. anti-HGD weit auszulegen und umfasst die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der MAAI/FAAH- bzw. HGD- Enzymaktivität in der mit einem erfindungsgemässen anti-MAAI/ FAAH- bzw. anti-HGD-Konstrukt transformierten Pflanze oder dem Pflanzenteil oder Gewebe. Eine Inhibition im Sinne der Erfindung umfasst auch eine mengenmässige Verringerung von aktiver HGD, MAAI oder FAAH in der Pflanze, bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen von HGD, MAAI oder FAAH-Protein (d. h. feh lende Nachweisbarkeit von HGD bzw. MAAI oder FAAH-Enzymaktivität oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit von HGD, MAAI oder FAAH).

Erfindungsgemäss sind verschiedene Strategien zur Verringerung oder Inhibition der HGD bzw. MAAI oder FAAH-Aktivität umfasst. Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung steht, um die HGD bzw. MAAI oder FAAH-Genexpression oder Enzymaktivität in gewünschter Weise zu beeinflussen.

Die erfindungsgemäss bevorzugte Strategie umfasst die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz (anti-MAAI/FAAH bzw. anti-HGD), welche zu einer antisense-Nukleinsäuresequenz transkribierbar ist, die zur Inhibition der HGD- bzw. MAAI/FAAH-Aktivität befähigt ist, z. B. indem sie die Expression von endogener HGD bzw. MAAI oder FAAH inhibiert.

Die erfindungsgemässen anti-HGD bzw. anti-MAAI/FAAH-Nukleinsäure sequenzen können gemäss einer bevorzugten Ausführungsform die in antisense-Orientierung insertierte kodierende Nukleinsäuresequenz der HGD (anti-HGD) bzw. MAAI oder FAAH (anti-MAAI/FAAH) oder funktional äquivalente Fragment der jeweiligen Sequenzen ent halten.

Besonders bevorzugte anti-HGD-Nukleinsäuresequenzen umfassen Nukleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 3 oder funktionelle Äqui valente davon kodieren. Besonders bevorzug sind Nukleinsäure sequenzen gemäss SEQ ID NO: 1, 2 oder 12 oder funktionelle Äquivalente davon.

Besonders bevorzugte anti-MAAI/FAAH-Nukleinsäuresequenzen umfassen Nukleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide ent haltend eine Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 5 und 18 oder funktionelle Äquivalente davon kodieren. Besonders bevorzug sind Nukleinsäuresequenzen gemäss SEQ ID NO: 4, 6, 9 oder 17 oder funktionelle Äquivalente davon, ganz besonders bevorzugt sind die mit SEQ ID NO: 41 oder 42 wiedergegebenen Teilsequenzen oder deren funktionelle Äquivalente.

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemässen Nuklein säuresequenzen umfasst ein HGD-, MAAI- oder FAAH-Sequenzmotiv gemäss SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 17, 41 oder 42 in antisense- Orientierung. Dies führt zur vermehrten Transkription von Nukleinsäuresequenzen in der transgenen Pflanze, welche komple mentär zur endogenen kodierenden HGD, MAAI bzw. FAAH-Sequenz oder einem Teil davon sind und mit dieser auf DNA- oder RNA-Ebene hybridisieren.

Vorteilhaft kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Ver fahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Zielse quenzen katalytisch spalten (Tanner NK. FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3): 257-75). Dies kann die Effizienz einer antisense Strate gie erhöhen.

Weitere Methoden zur Inhibition der HGD- bzw. MAAI/FAAH- Expression umfassen die zu Kosuppression führende Überexpression homologer HGD- bzw. MAAI/FAAH-Nukleinsäuresequenzen (Jorgensen et al., Plant Mol. Biol. 1996, 31 (5): 957-973), die Induktion des spezifischen RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) (Angell, SM et al., Plant J. 1999, 20(3): 357-362). Diese Methoden werden auch als "post-transcrip tional gene silencing" (PTGS) bezeichnet.

Weitere Methoden sind die Einführung von Nonsense-Mutationen in das Endogen mittels Einführung von RNA/DNA-Oligonukleotiden in die Pflanze (Zhu et al., Nat. Biotechnol. 2000, 18(5): 555-558) oder die Generierung von Knockout-Mutanten mit Hilfe von z. B. T-DNA-Mutagenese (Koncz et al., Plant Mol. Biol. 1992, 20(5): 963-976) oder homolger Rekombination (Hohn, B und Puchta, H, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96: 8321-8323.). Ferner ist eine Genüberexpression oder -repression auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren z. B. mit den oben erwähnten Faktoren vom Typus der Zinkfingertranskriptionsfaktoren. Ferner können Fakto ren in eine Zelle eingebracht werden, die das Zielprotein selber inhibieren. Die Protein-bindenden Faktoren können z. B. Aptamere sein (Famulok M, und Mayer G. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 243: 123-36).

Auf die oben beschriebenen Druckschriften und die darin offen barten Methoden zur Regulation der pflanzlichen Genexpression wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.

Eine anti-HGD bzw. anti-MAAI/FAAH Sequenz im Sinne der vor liegenden Erfindung ist somit insbesondere ausgewählt unter:

a) antisense-Nukleinsäuresequenzen;
b) antisense-Nukleinsäuresequenzen kombiniert mit einem Ribozym-Verfahren
c) für homologe HGD- bzw. MAAI/FAAH-kodierende und zu Kosuppression führende Nukleinsäuresequenzen
d) HGD- bzw. MAAI/FAAH-RNA-Abbau bewirkende virale Nuklein säuresequenzen und Expressionskonstrukte;
e) Nonsense-Mutanten von endogenen HGD- bzw. MAAI/FAAH kodierenden Nukleinsäuresequenzen;
f) für Knockout-Mutanten kodierende Nukleinsäuresequenzen;
g) zu homologer Rekombination geeignete Nukleinsäuresequenzen;
h) Nukleinsäuresequenzen kodierend für spezifische DNA- oder Protein-bindende Faktoren mit anti-HGD- bzw. anti-MAAI/ FAAH-Aktivität

wobei die Expression jeder einzelner dieser anti-HGD bzw. anti- MAAI/FAAH Sequenzen eine "Inhibition" der HGD- bzw. MAAI/FAAH- Aktivität im Sinne der Erfindung bewirken kann. Auch eine kombi nierte Anwendung solcher Sequenzen ist denkbar.

Unter Nukleinsäurekonstrukt oder Nukleinsäuresequenz versteht man erfindungsgemäss beispielsweise eine genomische oder eine komple mentäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder voll synthetische Analoga davon. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulären Form, extrachromosomal oder integriert in das Genom vorliegen. Die pro-HG, pro-Vitamin E, anti-HGD bzw. anti- MAAI/FAAH Nukleotidsequenzen der erfindungsgemässen Konstrukte können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestand teilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen HGD, MAAI/ FAAH, pro-HG oder pro-Vitamin E Genabschnitten verschiedener Orga nismen bestehen. Die anti-HGD bzw. anti-MAAI/FAAH-Sequenz kann von einem oder mehreren Exons oder Introns, insbesondere Exons der HGD, MAAI oder FAAH-Gene abgeleitet sein.

Ausserdem sind artifizielle Nukleinsäuresequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise der Erhöhung des Vitamin E-Gehaltes in der Pflanze durch Überexpression mindestens eines proHG- und/oder proVitamin E-Gens und/oder Expression einer anti-HGD bzw. MAAI/FAAH-Sequenz in Kulturpflanzen vermitteln. Beispielsweise können synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt werden, die von den zu transformierenden Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können anhand der Kodonnutzung aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit in üblicher Weise bestimmt werden. Solche artifiziellen Nukleotid-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die HGD bzw. MAAI/FAAH- bzw. proHG-Aktivität oder proVitamin E-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende Nukleotid- Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäss der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung er halten wurden. Um unerwünschte pflanzliche Regulationsmechanismen zu umgehen, kann man beispielsweise ausgehend von der Aminosäure sequenz einer bakteriellen pro-HG, zum Beispiel des bakteriellen TyrA Gens, und unter Berücksichtigung der pflanzlichen Kodon- Nutzung DNA-Fragmente rückübersetzen und daraus die vollständige, für einen Einsatz in der Pflanze optimierte exogene proHG-Sequenz herstellen. Daraus wird ein proHG-Enzym exprimiert, welches der pflanzlichen Regulation nicht oder nur unzureichend zugänglich ist, wodurch die Überexpression von Enzymaktivität voll zur Geltung gelangen kann.

Alle vorstehend erwähnten Nukleotid-Sequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbau steinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppel helix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamidit methode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Bei der Präparation eines Nukleinsäure konstruktes können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleotid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Für die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. Die Anlagerung syntheti scher Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Funktionale Äquivalente der pro-HG oder pro-Vitamin E Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch für ein Protein mit den erfindungsgemäss gewünschten Funk tionen kodieren, d. h für ein Enzym mit direkt oder indirekt die Homogentisatbildung steigernder Aktivität (pro-HG), bzw. für ein Enzym mit direkt oder indirekt die Umsetzung von Homogentisat zu Vitamin E fördernder Aktivität (pro-Vitamin E).

Funktionale Äquivalente von anti-HGD bzw. anti-MAAI/FAAH umfassen solche Nukleotidsequenzen welche die HGD bzw. MAAI/FAAH-Enzym funktion in der transgenen Pflanze in ausreichendem Masse unter binden. Dies kann z. B. durch Behinderung oder Unterbindung der HGD bzw. MAAI/FAAH-Prozessierung, des Transports von HGD bzw. MAAI/FAAH oder deren mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA-Spleissens, Induktion eines RNA-abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Translationselongation oder -termination erfolgen. Ferner ist eine direkte Repression der endogenen Gene durch DNA-bindende Faktoren, zum Beispiel vom Typ der Zinkfinger- Transkriptionsfaktoren, möglich. Auch eine direkte Inhibition der entsprechenden Polypeptide, zum Beispiel durch Aptamere, ist machbar. Verschiedene Beispiele sind oben gegeben.

Unter einem funktionalen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für HGD bzw. MAAI/FAAH oder pro-HG oder pro-Vitamin E kodierenden Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletio nen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleo tidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidse quenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der HGD bzw. MAAI/FAAH- bzw. proHG oder proVi tamin E-Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodieren den Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktions enzym-Schnittstellen oder die Entfernung überflüssiger DNA sein.

Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Über hängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Unter Substitution ist der Austausch einer oder mehrerer Amino säuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevor zugt werden sogenannte konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr.

Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.

Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptid kette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.

Unter Homologie zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (UWGCG, University of Wisconsin, Genetic Computer Group) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12
Length Weight: 4
Average Match: 2,912
Average Mismatch: -2,003

Unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 20% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO. 6 aufweist, wird dementsprechend eine Sequenz verstanden, das bei einem Ver gleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO. 6 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 20% aufweist.

Funktionelle Äquivalente, abgeleitet von einer der in den erfin dungsgemässen Nukleinsäurekonstrukten oder Vektoren zum Einsatz kommenden Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren bzw. Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 20%, bevorzugt 40%, vorzugsweise mindestens 60%, bevorzugt mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%.

Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemässen Nukleinsäure konstrukten oder Vektoren zum Einsatz kommenden Nukleinsäurese quenzen lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise aus Ara bidopsis thaliana durch Homologievergleiche der Aminosäuresequen zen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken leicht auffinden.

Funktionale Äquivalente umfassen auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abge schwächt oder verstärkt ist, also beispielsweise solche proHG- oder proVitamin E-Gene, welche für eine Polypeptid-Variante mit niedrigerer oder höherer enzymatischer Aktivität als der des Ursprungsgens kodieren.

Als weitere geeignete funktionell äquivalente Nukleinsäuresequen zen sind Sequenzen zu nennen, welche für Fusionsproteine kodie ren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins z. B. ein proHG- bzw. proVitamin E-Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z. B. ein wei teres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität (zum Beispiel ein weiteres proHG- bzw. proVitamin E-Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil davon) sein oder eine antigene Polypeptid sequenz, mit deren Hilfe ein Nachweis der proHG- oder proVita min E-Expression möglich ist (z. B. myc-tag oder his-tag). Bevor zugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinse quenz, wie z. B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das proHG- oder proVitamin E-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft rekombinante Vek toren, die wenigstens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäss obiger Definition, eine Nukleinsäuresequenz, die für eine HGD, MAAI oder FAAH kodiert, oder Kombinationen dieser Möglichkeiten umfassen. Bevorzugt sind die in den Vektoren enthaltenen Nukleinsäure sequenzen oder Nukleinsäurekonstrukte funktionell mit genetischen Kontrollsequenzen verbunden.

Beispiele erfindungsgemässer Vektoren können Expressionskon strukte folgenden Typs umfassen:

a) 5'-Pflanzenspezifischer Promotor/anti-HGD/Terminator-3'
b) 5'-Pflanzenspezifischer Promotor/anti-MAAI/FAAH/Termina tor-3'
c) 5'-Pflanzenspezifischer Promotor/pro-HG/Terminator-3'
d) 5'-Pflanzenspezifischer Promotor/pro-Vitamin E/Termina tor-3'

Ausdrücklich betrifft die Erfindung auch Vektoren, die in der Lage sind Polypeptide mit einer HGD, MAAI, oder FAAH Aktivität zu exprimieren. Die für diese Gene kodierenden Sequenzen stammen bevorzugt aus Pflanzen, Cyanobakterien, Moosen, Pilzen oder Algen. Besonders bevorzugt sind die durch für Polypeptide gemäss SEQ ID NO: 3, 5 und 18 kodierenden Sequenzen.

Hierbei können die kodierende pro-HG oder pro-Vitamin E Sequenz, sowie die zur Expression von Polypeptiden mit HGD, MAAI, oder FAAH Aktivität dienenden Sequenzen auch durch eine kodierende Sequenz für ein Fusionsprotein aus Transitpeptid und der ent sprechenden Sequenz ersetzt sein.

Bevorzugte Beispiele umfassen Vektoren und können eines der folgenden Expressionskonstrukte enthalten:

a) 5'-35S-Promotor/anti-MAAI/FAAH/OCS-Terminator-3'
b) 5'-35S-Promotor/anti-HGD/OCS-Terminator-3';
c) 5'-LeguminB-Promotor/pro-HG/NOS-Terminator-3'
d) 5'-LeguminB-Promotor/pro-Vitamin E/NOS-Terminator-3'
e) 5'-LeguminB-Promotor/HGD/NOS-Terminator-3'
f) 5'-LeguminB-Promotor/MAAI/NOS-Terminator-3'
g) 5'-LeguminB-Promotor/FAAH/NOS-Terminator-3'

Auch hierbei kann die kodierende pro-HG Sequenz oder pro-Vita min E Sequenz auch durch eine kodierende Sequenz für ein Fusions protein aus Transitpeptid und pro-HG oder pro-Vitamin E ersetzt sein.

Für die erfindungsgemässen vorteilhaften Verfahren zur Opti mierung der Vitamin E Biosynthese kann eine Kotransformation mit mehr als einem der oben genannten Beispiele a.) bis g.) erforderlich sein. Ferner kann die Transformation mit einem oder mehr Vektoren, die jeweils eine Kombination der oben genannten Konstrukte enthalten, vorteilhaft sein. Bevorzugte Beispiele umfassen Vektoren, enthaltend folgende Konstrukte:

a) 5'-35S-Promotor/anti-MAAI/FAAH/OCS-Terminator/LeguminB- Promotor/pro-HG/NOS-Terminator-3';
b) 5'-35S-Promotor/anti-MAAI/FAAH/OCS-Terminator/LeguminB- Promotor/pro-Vitamin E/NOS-Terminator-3';
c) 5'-35S-Promotor/anti-HGD/OCS-Terminator/LeguminB- Promotor/pro-Vitamin E/NOS-Terminator-3';
d) 5'-35S-Promotor/pro-HG/OCS-Terminator/LeguminB- Promotor/pro-Vitamin E/NOS-Terminator-3';

Die Konstrukte a) bis d) erlaubt die gleichzeitige Transformation der Pflanze mit pro-HG bzw. pro-Vitamin E und anti-HGD bzw. anti- MAAI/FAAH.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonie rungstechniken können die Nukleinsäurekonstrukte in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agro bakterien replizieren können.

Die erfindungsgemässen Nukleinsäurekonstrukte werden bevorzugt in geeignete Transformationsvektoren insertiert. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben. Vorzugsweise werden sie in einen Vektor, wie beispielsweise pBin19, pBinAR, pPZP200 oder pPTV, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Die mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Raps, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agro bakterienlösung gebadet und anschliessend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agro bakterien ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekann ter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die integriert die oben beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte enthalten.

Die in den erfindungsgemässen Nukleinsäurekonstrukten und Vekto ren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit mindestens einer genetischen Kontrollsequenz funktionell verknüpft sein. Geneti sche Kontrollsequenzen gewährleisten zum Beispiel die Transkrip tion und Translation in prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen Kon strukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Termi nator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz oder der antisense-Sequenz bestimmungsgemäss erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben.

Beispiele sind Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren bin den und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Kontrollsequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentli chen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls gene tisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heisst, es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die vorstehend erwähnten Gene insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Kontrollsequenz so mutiert, dass keine Regu lation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor die natürlichen Gene zur Steigerung der Aktivität gebracht werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt kann ausserdem vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell ver knüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Se quenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen insertiert wer den, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die vorstehend erwähnten Gene können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Zusätzliche zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf beschränkte Sequenzen sind weitere, von den Transitpeptid kodierenden Sequenzen verschiedene, Targeting-Sequenzen zur Ge währleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Re tikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Komparti menten; sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711), und dergleichen.

Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe oder heterologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Bei spiel das endogene Gen gänzlich inaktiviert werden. Es kann fer ner durch ein synthetisches Gen mit erhöhter und veränderter Aktivität ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technolo gie erlauben eine gewebsspezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung des Zielgens aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankie rende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.

Je nach nachstehend näher beschriebenen Wirtsorganismus oder Aus gangsorganismus, der durch Einbringen der Nukleinsäurekonstrukte in einen genetisch veränderten oder transgenen Organismus über führt wird, eignen sich verschiedene Kontrollsequenzen.

Vorteilhafte Kontrollsequenzen für die erfindungsgemässen Nukleinsäurekonstrukte, für die erfindungsgemässen Vektoren, für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Vitamin E und für die nachstehend beschriebenen genetisch veränderten Organismen sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-PR- oder im l-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafter weise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden.

Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilz promotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294), PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1, B33, NOS; FBPaseP (WO 98/18940) oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten.

Als bevorzugte Promotoren für die Nukleinsäurekonstrukte ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumen kohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungs sequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamt heit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des einge führten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202). Ein weiteres Beispiel eines geeigneten Promotors ist der LeguminB-Promotor (Accessionnr. X03677).

Die Nukleinsäurekonstrukte können auch einen chemisch induzierba ren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert wer den kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salicyl säure induzierbarer (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-in duzierbarer (EP-A-0388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397404), ein durch Abscisinsäu re-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können eben falls verwendet werden.

Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Vitamin E bzw. dessen Vorstufen stattfindet oder in denen die Produkte vorteilhafterweise akkumuliert werden. Insbesondere zu nennen sind Promotoren für die ganze Pflanze auf grund konstitutiver Expression, wie beispielsweise der CaMV Promotor, der OCS Promotor aus Agrobacterium (Octopin Synthase), der NOS Promotor aus Agrobacterium (Nopalin synthase), der Ubiquitin Promotor, Promotoren vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines Prolin-reichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991). Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-bisp hosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245). Beispiele für samenspezifische Promotoren sind der Phaseolin-Promotor (US 5504200), der USP-Promotor (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) oder der LEB4-Promotor (Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090) zusammen mit dem LEB4-Signalpeptid.

Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise spezifische Promotoren für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593) oder spezifische Plastiden- oder Chromo plasten-Promotoren, wie beispielsweise der RNA-Polymerase Promotor (WO 97/06250) oder auch der Promotor der Phosphoribosyl pyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein anderer Nodien-spezifischer Promotor wie in EP-A 249676 können vorteilhaft verwendet werden.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula tionssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch syntheti sche Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Ter minator.

Die Herstellung eines Nukleinsäurekonstrukts erfolgt beispiels weise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigne ten anti-HGD, anti-MAAI/FAAH, pro-HG, pro-Vitamin E, HGD, MAAI, oder FAAH Nukleotidsequenz, gegebenenfalls einer für eine Trans itpeptid kodierenden Sequenz, vorzugsweise ein chloroplasten spezifisches Transitpeptid, welche vorzugsweise zwischen dem Promotor und der jeweiligen Nukleotidsequenz angeordnet ist, so wie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwen det man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo ratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrie ben sind.

Wie bereits erwähnt, können auch Nukleinsäurekonstrukte verwen det werden, deren DNA-Sequenz für ein pro-HG, pro-Vitamin E, HGD, MAAI, oder FAAH Fusionsproteine kodiert, wobei ein Teil des Fu sionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Als Beispiel können genannt werden: Chloro plasten-spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation in die Chloroplasten enzymatisch abgespalten werden.

Bevorzugt werden die pro-HG, pro-Vitamin E, HGD, MAAI, oder FAAH- Nukleotidsequenz mit der kodierenden Sequenz eines Pflanzenorga nell-spezifischen Transitpeptids funktional verknüpft. Das Tran sitpeptid besitzt dabei vorzugsweise Spezifität für einzelne Zellkompartimente der Pflanze, zum Beispiel den Plastiden, wie zum Beispiel die Chloroplasten, Chromoplasten und/oder Leuko plasten. Das Transitpeptid lenkt die exprimierten Polypeptide an den gewünschten Zielort in der Pflanze und wird nach dessen Er reichen vorzugsweise proteolytisch abgespalten. Die kodierende Transitpeptid-Sequenz befindet sich im erfindungsgemässen Expres sionskonstrukt vorzugsweise 5'-stromaufwärts von der kodierenden pro-HG, pro-Vitamin E, HGD, MAAI, oder FAAH-Sequenz. Insbesondere ist zu nennen das Transitpeptid, das von der plastidären Nico tiana tabacum Transketolase (TK) oder einem funktionellen Äquiva lent dieses Transitpeptids (z. B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der RubisCO oder der Ferredoxin:NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat Isomerase-2) abgeleitet ist.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organis men, transformiert mit wenigstens einem erfindungsgemässen Nu kleinsäurekonstrukt oder einem erfindungsgemässen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw. - oder Vermehrungs gut abgeleitet von solchen Organismen.

Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden proka ryontische oder eukaryontische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevor zugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.

Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyano bakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis.

Bevorzug sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemässen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agro bacterium tumefaciens.

Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.

Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen. Die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer, sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola,
Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss
Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika,
Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula,
Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,
sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Karotte, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspecies.

Besonders bevorzug sind Arabodopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula vulgaris sowie alle Gattungen und Arten, die sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie Ölsaaten (wie zum Beispiel Raps), Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss.

Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive oder zur Vitamin E Synthese befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose.

Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.

Als Transformation wird die Übertragung von Fremdgenen in das Genom eines Organsimus zum Beispiel einer Pflanze bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylen glykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-halti ger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium ver mittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacte rium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).

Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nuklein säuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermeh rung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression von pro-HG oder pro-Vitamin E Genen und deren Auswir kung auf die Vitamin E-Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind transgene Organismen nach obiger Beschreibung, die zu einer im Vergleich zum untrans formierten Wildtyp verbesserten Vitamin E Produktion befähigt sind.

Erfindungsgemäss sind ferner von den oben beschriebenen trans genen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, transgenes Vermehrungsgut, Saaten oder Früchte.

Eine verbesserte Vitamin E-Produktion bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Beispiel die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung wenigstens einer Verbindung aus der Gruppe der Tocopherole und Tocotrienole, in dem transgenen Organismen gegenüber dem nicht gentechnisch modifizierten Ausgangsorganismus für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration. Dabei ist die Vitamin E-Produktion in dem transgenen Organismus gegenüber dem nicht gentechnisch modifi zierten Ausgangsorganismus bevorzugt um 10%, besonders bevorzugt um 50%, ganz besonders bevorzugt um 100% erhöht. Verbessert kann ebenfalls eine vorteilhaft veränderte qualitative Zusammen setzung des Vitamin E-Gemisches bedeuten.

Der Biosyntheseort von Vitamin E ist im allgemeinen das Blatt gewebe aber auch der Samen, so dass eine blattspezifische oder samenspezifische Expression insbesondere von pro-HG und pro-Vita min E Sequenzen und gegebenenfalls von anti-HGD bzw. anti-MAAI/ FAAH Sequenzen sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, dass die Vitamin E-Biosynthese nicht auf den Samen beschränkt sein muss, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze gewebespezifisch erfolgen kann. Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine indu zierbare Expression wünschenswert sein.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft schliesslich ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin E, das dadurch gekennzeich net ist, dass man aus einer Kultur eines erfindungsgemäss trans formierten pflanzlichen Organismus das gewünschte Vitamin E in an sich bekannter Weise isoliert.

Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemässe, genetisch veränderte Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Polypeptiden, die für eine HGD, MAAI oder FAAH kodieren, der ihnen zugrunde liegenden Gene und cDNAs, bzw. der von ihnen abgeleiteten erfin dungsgemässen Nukleinsäurekonstrukte, erfindungsgemässen Vektoren oder erfindungsgemässen Organismen zur Herstellung von Antikör pern, protein- oder DNA-bindenden Faktoren.

Der Biosyntheseweg von HGD-MAAI-FAAH-Abbauweg bietet Targetenzyme für die Entwicklung von Inhibitoren. Daher betrifft die Erfindung auch die Verwendung von Polypeptiden, die für eine HGD, MAAI oder FAAH kodieren, der ihnen zugrunde liegenden Gene und cDNAs, bzw. der von ihnen abgeleiteten erfindungsgemässen Nukleinsäurekonstrukte, erfindungsgemässen Vektoren oder erfindungsgemässen Organismen als Target zum Auffinden von Inhibitoren der HGD, MAAI oder FAAH.

Um effiziente Hemmstoffe der HGD, MAAI oder FAAH finden zu kön nen, ist es notwendig, geeignete Testsysteme, mit denen Inhibi tor-Enzym-Bindungsstudien durchgeführt werden können, zur Verfü gung zu stellen. Hierzu wird beispielsweise die komplette cDNA- Sequenz der HGD, MAAI oder FAAH in einen Expressionsvektor (zum Beispiel pQE, Qiagen) kloniert und in E. coli überexprimiert. Die HGD, MAAI oder FAAH-Proteine eignet sich besonders zur Auffin dung von für die HGD, MAAI oder FAAH spezifischen Hemmstoffen.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffin den von Inhibitoren der HGD, MAAI oder FAAH unter Verwendung von oben genannten Polypeptiden, Nukleinsäuren, Vektoren oder trans genen Organismen, dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymati sche Aktivität der HGD, MAAI oder FAAH in Gegenwart einer chemi schen Verbindung misst und bei Erniedrigung der enzymatischen Aktivität im Vergleich zur nicht gehemmten Aktivität die chemi sche Verbindung einen Inhibitor darstellt. Dazu kann die HGD, MAAI oder FAAH beispielsweise in einem Enzymtest eingesetzt wer den, bei dem die Aktivität der HGD, MAAI oder FAAH in An- und Abwesenheit des zu testenden Wirkstoffs ermittelt wird. Aus dem Vergleich der beiden Aktivitätsbestimmungen lässt sich eine qua litative und quantitative Aussage über das Hemmverhalten des zu testenden Wirkstoffes machen. Mit Hilfe des erfindungsgemässen Testsystems kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer grossen An zahl von Substanzen gezielt solche mit grosser Wirkstärke auszu wählen, um mit diesen Substanzen anschliessend weitere, dem Fach mann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.

Die Inhibitoren der HGD, MAAI oder FAAH eignen sie sich zur Stei gerung der Vitamin E-Biosynthese funktionell analog den oben be schriebenen anti-HGD bzw. anti-MAAI/FAAH Nukleinsäuresequenzen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Verfahren zur Verbesserung der Vitamin E Produktion unter Verwendung von Inhi bitoren der HGD, MAAI oder FAAH. Die verbesserte Produktion von Vitamin E kann einen positiven Effekt auf die Pflanze bewirken, da diese Verbindungen eine wichtige Funktion im Schutz vor schäd lichen Umwelteinflüssen (Sonnenstrahlung, Sauerstoffradikale) haben. Eine Steigerung der Vitamin E Produktion kann insofern als Wachstumsförderer fungieren. Ein weiterer Gegenstand der Erfin dung ist daher die Verwendung von Inhibitoren der HGD, MAAI oder FAAH, erhältlich durch dem oben beschriebenen Verfahren, als Wachstumsregulatoren.

Sequenzen

SEQ ID NO. 1: Homogentisat-1,2-dioxygense (HGD) Gen aus Arabi dopsis thaliana
SEQ ID NO. 2: Homogentisat-1,2-dioxygense (HGD) cDNA aus Arabi dopsis thaliana
SEQ ID NO. 3: Homogentisat-1,2-dioxygense (HGD) Polypeptid aus Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 4: Fumarylacetoacetathydrolase (FAAH) cDNA aus Arabi dopsis thaliana
SEQ ID NO. 5: Fumarylacetoacetathydrolase (FAAH) Polypeptid aus Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 6: Maleylacetoacetatisomerase (MAAI) Gen aus Arabi dopsis thaliana
SEQ ID NO. 7: TyrA Gen kodierend für eine bifunktionale Choris matmutase/Prephenatdehydrogenase
SEQ ID NO. 8: TyrA Polypeptid kodierend für eine bifunktionale Chorismatmutase/Prephenatdehydrogenase
SEQ ID NO. 9: Fumarylacetoacetathydrolase (FAAH) Gen aus Arabi dopsis thaliana
SEQ ID NO. 10: Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD) cDNA aus Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 11: Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD) Polypeptid aus Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 12: Homogentisat-1,2-dioxygense (HGD) cDNA Fragment aus Brassica napus
SEQ ID NO. 13: Homogentisatphythyltransferase cDNA aus Synechocy stis PCC6803
SEQ ID NO. 14: Homogentisatphythyltransferase Polypeptid aus Syn echocystis PCC6803
SEQ ID NO. 15: Künstliche codonusage optimierte cDNA kodierend für Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPDop) aus Streptomyces avermitilis
SEQ ID NO. 16: Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase Polypeptid aus Streptomyces avermitilis
SEQ ID NO. 17: Maleylacetoacetatisomerase (MAAI) cDNA aus Arabi dopsis thaliana
SEQ ID NO. 18: Maleylacetoacetatisomerase (MAAI) Polypeptid aus Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 19: γ-Tocopherolmethyltransferase cDNA aus Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 20: γ-Tocopherolmethyltransferase Polypeptid aus Arabi dopsis thaliana
SEQ ID NO. 21: 3-Methyl-6-phytylhdrochinonxnethyltransferase cDNA aus Synechocystis PCC6803
SEQ ID NO. 22: 3-Methyl-6-phytylhdrochinonmethyltransferase Poly peptid aus Synechocystis PCC6803
SEQ ID NO. 23: Geranylgeranylpyrophosphatoxidoreduktase cDNA aus Nicotiana tabacum.
SEQ ID NO. 24: Geranylgeranylpyrophosphatoxidoreduktase Poly peptid aus Nicotiana tabacum.
SEQ ID NO. 25: Primer (5'-HGD Brassica napus) 5'-GTCGACGGNCCNATNGGNGCNAANGG-3'
SEQ ID NO. 26: Primer (3'-NOS Terminator) 5'-AAGCTTCCGATCTAGTAACATAGA-3'
SEQ ID NO. 27: Primer (5'-35S Promotor) 5'-ATTCTAGACATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA-3'
SEQ ID NO. 28: Primer (3'-OCS Terminator) 5'-ATTCTAGAGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG-3'
SEQ ID NO. 29: Primer (5'-MAAI A.thaliana) 5'-atgtcgacATGTCTTATGTTACCGAT-3'
SEQ ID NO. 30: Primer (3'-MAAI A.thaliana) 5'-atggatccCTGGTTCATATGATACA-3'
SEQ ID NO. 31: Primer (5'-FAAH A.thaliana) 5'-atgtcgacGGAAACTCTGAACCATAT-3'
SEQ ID NO. 32; Primer (3'-FAAH A.thaliana) 5'-atggtaccGAATGTGATGCCTAAGT-3'
SEQ ID NO. 33: Primer (3'-HGD Brassica napus) 5'-GGTACCTCRAACATRAANGCCATNGTNCC-3'
SEQ ID NO. 34: Primer (5'-Legumin Promotor) 5'-GAATTCGATCTGTCGTCTCAAACTC-3'
SEQ ID NO. 35: Primer (3'-Legumin Promotor) 5'-GGTACCGTGATAGTAAACAACTAATG-3'
SEQ ID NO. 36: Primer (5'-Transitpeptid) 5'-ATGGTACCTTTTTTGCATAAACTTATCTTCATAG-3'
SEQ ID NO. 37: Primer (3'-Transitpeptid) 5'-ATGTCGACCCGGGATCCAGGGCCCTGATGGGTCCCATTTTCCC-3'
SEQ ID NO. 38: Primer (5'-NOS Terminator) 5'-GTCGACGAATTTCCCCGAATCGTTC-3'
SEQ ID NO. 39: Primer (3'-NOS Terminator II) 5'-AAGCTTCCGATCTAGTAACATAGA-3'
SEQ ID NO. 40: Primer (5'-Legumin Promotor II) 5'-AAGCTTGATCTGTCGTCTCAAACTC-3'
SEQ ID NO. 41: Maleylacetoacetatisomerase (MAAI) Gen (Fragment) aus Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 42: Fumarylacetoacetathydrolase (FAAH) Gen (Fragment) aus Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 43: Primer (5'-35S Promotor) 5'-ATGAATTCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA-3'
SEQ ID NO. 44: Primer (3'-OCS Terminator) 5'-ATGAATTCGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG-3'

Beispiele

Die Erfindung wird in den folgenden Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher erläutert. Dabei werden Abkürzungen mit folgender Bedeutung verwendet:
A = 35S-Promotor
B = HGD in antisense-Orientierung
C = OCS Terminator
D = Legumin B-Promotor
E = Transitpeptid der FNR
F = HPPDop (HPPD mit optimierter Codonusage)
G = NOS-Terminator
H = MAAI in antisense-Orientierung
I = FAAH in antisense-Orientierung

Die Richtung von Pfeilen in den Figuren zeigt jeweils der Verlauf der Leserichtung der entsprechenden Gene an. Dabei zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Vitamin E-Biosynthe seweges in Pflanzen;

Fig. 2 Konstruktionsschemata der antiHGD kodierenden Plasmide pBinARHGDanti (I) und pCRScriptHGDanti (II);

Fig. 3 Konstruktionsschemata der HPPDop kodierenden Plasmide pUC19HPPDop (III) und pCRScriptHPPDop (IV);

Fig. 4 Konstruktionsschemata der Transformationsvektoren pPTVHGDanti (V) und des bifunktionalen Transformations- Vektors pPTV HPPDop HGD anti (VI), welcher die HPPDop in Samen transformierter Pflanzen exprimiert und gleichzei tig die Expression der endogenen HGD unterdrückt.

Fig. 5 Konstruktionsschema des Transformationsvektors pPZP200HPPDop (VII).

Fig. 6 Konstruktionsschemata der Transformationsvektoren pGEMT MAAI1 anti (VIII) und pBinAR MAAI1 anti (IX)

Fig. 7 Konstruktionsschemata der Transformationsvektoren pCR- Script MAAI1 anti (X) und pZPNBN MAAI1 anti (XI)

Fig. 8 Konstruktionsschemata der Transformationsvektoren pGEMT FAAH anti (XII)

Fig. 9 Konstruktionsschemata der Transformationsvektoren pBinAR FAAH anti (XIII) und pZPNBN FAAH anti (XIV)

Allgemeine Methoden

Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs schritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, AgaroseGelelektropho rese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Frag menten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequen zierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluo reszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Bio tech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1 Klonierung einer Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) mit für Expression in Brassica napus optimierter DNA-Sequenz

Die Aminosäuresequenz der Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) aus Streptomyces avermitilis (Accessionnr. U11864, SEQ ID NO: 16) wurde unter Berücksichtigung der Codonverwendung in Brassica napus (Raps) in eine DNA-Sequenz zurückübersetzt. Die Codonusage wurde mittels der Datenbank http:/ /www.dna.affrc.go.jp/~naka mura/index.html bestimmt. Die abgeleitete Sequenz wurde unter An heftung von SalI Schnittstellen durch Ligation überlappender Oligonukleotide mit anschliessender PCR-Amplifikation (Rouwendal, GJA; et al. (1997) PMB 33: 989-999) synthetisiert (SEQ ID NO: 15). Die Richtigkeit der Sequenz des synthetischen Gens wurde durch Sequenzierung überprüft. Das synthetische Gen wurde in den Vektor pBluescript II SK+ (Stratagene) kloniert. (Diese kodonoptimierte Sequenz ist infolge auch als HPPDop bezeichnet.)

Beispiel 2 Klonierung einer Homogentisat-Dioxygenase (HGD) aus Brassica napus a) Isolierung von gesamt-RNA aus Blüten von Brassica napus

Von Brassica napus var. Westa wurden offene Blüten geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das Material wurde an schliessend im Mörser pulverisiert und in 26-Puffer (8 M Guanidi nium-Hydrochlorid, 20 mM MES, 20 mM EDTA, auf pH 7,0 mit NaOH eingestellt; versetzt mit 400 ml Mercaptoethanol/100 ml Puffer unmittelbar vor Gebrauch) aufgenommen. Die Suspension wurde dann in Reaktionsgefässe überführt und mit einem Volumen Phenol/Chlo roform/Isoamylalkohol 25 : 24 : 1 ausgeschüttelt. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 15000 U wurde der Überstand in ein neues Reak tionsgefäss überführt und mit 1/20 Volumen 1 N Essigsäure und 0,7 Volumen Ethanol (absolut) die RNA gefällt. Nach erneuter Zentri fugation wurde das Pellet zunächst in 3 M Natriumacetatlösung und nach einer weiteren Zentrifugation in 70% Ethanol gewaschen. An schliessend wurde das Pellet in DEPC (Diethylpyrocarbonat) Wasser gelöst und die RNA-Konzentration photometrisch bestimmt.

b) Herstellung von cDNA aus gesamt RNA aus Blüten von Brassica napus

20 mg Gesamt-RNA wurden zunächst mit 3,3 ml 3 M Natriumacetat lösung, 2 ml 1 M Magnesiumsulfatlösung versetzt und auf 10 ml End volumen mit DEPC Wasser aufgefüllt. Dazu wurde 1 ml RNase-freie DNase (Boehringer Mannheim) gegeben und 45 min bei 37 Grad inkubiert. Nach Entfernen des Enzyms durch Ausschütteln mit Phe nol/Chloroform/Isoamylalkohol wurde die RNA mit Ethanol gefällt und das Pellet in 100 ml DEPC Wasser aufgenommen. 2,5 mg RNA aus dieser Lösung wurden mittels eines cDNA-Kits (Gibco BRL) nach Herstellerangaben in cDNA umgeschrieben.

c) PCR-Amplifikation eines Teilfragments der HGD aus Brassica napus

Durch Vergleich der DNA-Sequenzen der bekannten Homogentisat-Dio xygenasen (HGD) aus Arabidopsis thaliana (Accessionnr. U80668), Homo sapiens (Accessionnr. U63008) und Mus musculus (Accessionnr. U58988) wurden für eine PCR Oligonukleotide abgeleitet, denen am 5'-Ende eine SalI und am 3'-Ende eine Asp718 Restriktionsschnitt stelle angefügt worden war. Das Oligonukleotid am 5'-Ende umfasst die Sequenz:
5'-GTCGACGGNCCNATNGGNGCNAANGG-3' (SEQ ID NO: 25),
beginnend mit der Base 661 des Arabidopsis-Gens. Das Oligo nukleotid am 3'-Ende umfasst die Sequenz:
5'-GGTACCTCRAACATRAANGCCATNGTNCC-3' (SEQ ID NO: 33),
beginnend mit der Base 1223 des Arabidopsis-Gens, wobei N jeweils Inosin bedeutet und R für den Einbau von A oder G in das Oligo nukleotid steht.

Die PCR-Reaktion wurde mit der Tag-Polymerase von TAKARA nach Herstellerangaben durchgeführt. Als Template wurden 0,3 mg der cDNA eingesetzt. Das PCR-Programm lautete:
1 Zyklus 94°C (1 min)
5 Zyklen mit: 94°C (4 sec), 50°C (30 sec), 72°C (1 min)
5 Zyklen mit: 94°C (4 sec), 48°C (30 sec), 72°C (1 min)
25 Zyklen mit: 94°C (4 sec), 46 Grad (30 sec), 72 Grad (1 min)
1 Zyklus mit: 72 Grad (30 min)

Das Fragment wurde mittels NucleoSpin Extract (Machery und Nagel) gereinigt und nach Herstellerangaben in den Vektor pGEMT (Pro mega) kloniert. Die Richtigkeit des Fragments wurde durch Sequen zierung überprüft.

Beispiel 3 Herstellung eines Pflanzentransformations-Konstrukts zur Überexpression der HPPD mit optimierter DNA-Sequenz (HPPDop) und Ausschaltung der HGD

Zur Herstellung von Pflanzen, welche die HPPDop in Samen exprimieren und in denen die Expression der endogenen HGD mittels antisense-Technik unterdrückt ist, wurde ein binärer Vektor ange fertigt, der beide Gensequenzen enthält (Fig. 4, Konstrukt VI).

a) Herstellung einer HPPDop- Nukleinsäurekonstrukt

Dazu wurden zunächst die Komponenten der Kassette zur Expression der HPPDop, bestehend aus dem LeguminB-Promotor (Accessionnr. X03677), dem Transitpeptid der Ferredoxin:NADP+ Oxidoreduktase aus Spinat (FNR; Jansen, T, et al (1988) Current Genetics 13, 517-522) und dem NOS-Terminator (enthalten im pBI101 Accessionnr. U12668) mittels PCR mit den benötigten Restriktionsschnittstellen versehen.

Der Legumin-Promotor wurde aus dem Plasmid plePOCS (Baumlein, H, et al. (1986) Plant J. 24, 233-239) mit dem stromaufwärts-Oligo nukleotid:
5'-GAATTCGATCTGTCGTCTCAAACTC-3' (SEQ ID NO: 34)
und dem stromabwärts-Oligonukleotid:
5'-GGTACCGTGATAGTAAACAACTAATG-3' (SEQ ID NO: 35)
mittels PCR amplifiziert und in den Vektor PCR-Script (Strata gene) nach Herstellerangaben kloniert.

Das Transitpeptid wurde aus dem Plasmid pSK-FNR (Andrea Babette Regierer "Molekulargenetische Ansätze zur Veränderung der Phosphat-Nutzungseffizienz von höheren Pflanzen", P + H Wissen schaftlicher Verlag, Berlin 1998 ISBN: 3-9805474-9-3) mittels PCR mit dem 5'-Oligonukleotid:
5'-ATGGTACCTTTTTTGCATAAACTTATCTTCATAG-3' (SEQ ID NO: 36)
und dem 3'-Oligonukleotid:
5'-ATGTCGACCCGGGATCCAGGGCCCTGATGGGTCCCATTTTCCC-3' (SEQ ID NO: 37)
amplifiziert.

Der NOS-Terminator wurde aus dem Plasmid pBI101 (Jefferson, R. A., et al (1987) EMBO J. 6 (13), 3901-3907) mittels PCR mit dem 5'-Oligonukleotid:
5'-GTCGACGAATTTCCCCGAATCGTTC-3' (SEQ ID NO: 38)
und dem 3'-Oligonukleotid
5'-AAGCTTCCGATCTAGTAACATAGA-3' (SEQ ID NO: 26)
amplifiziert.

Das Amplikon wurde jeweils in den Vektor pCR-Script (Stratagene) nach Herstellerangaben kloniert.

Für die Nukleinsäurekonstrukt wurde zunächst der NOS-Terminator als SalI/HindIII-Fragment in einen entsprechend geschnittenen pUC19-Vektor (Yanisch-Perron, C., et al (1985) Gene 33, 103-119) umkloniert. In dieses Plasmid wurde anschliessend das Transitpep tid als Asp718/SalI-Fragment eingeführt. Der Legumin-Promotor wurde dann als EcoRI/Asp718 Fragment einkloniert. Das Gen HPPDop wurde als SalI-Fragment in dieses Konstrukt eingeführt (Fig. 3, Konstrukt III).

Die fertige Kassette in pUC19 wurde als Template für eine PCR verwendet, wozu für den Leguminpromotor das Oligonukleotid:
5'-AAGCTTGATCTGTCGTCTCAAACTC-3' (SEQ ID NO: 40)
und für den Nos-Terminator das Oligonukleotid:
5'-AAGCTTCCGATCTAGTAACATAGA-3' (SEQ ID NO: 39)
verwendet wurden. Das Amplikon wurde in pCR-Script kloniert und pCR-ScriptHPPDop genannt (Fig. 3, Konstrukt IV).

d) Herstellung einer antiHGD-Nukleinsäurekonstrukt

Für die Ausschaltung der HGD mit antisense-Technik wurde das Gen fragment als SalI/Asp718-Fragment in den Vektor pBinAR (Höfgen, R. und Willmitzer, L., (1990) Plant Sci. 66: 221-230) kloniert, in dem der 35S-Promotor und der OCS-Terminator vorliegen (Fig. 2, Konstrukt I). Das Konstrukt diente als Vorlage für eine PCR Reaktion mit dem Oligonukleotid:
5'-ATTCTAGACATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA-3' (SEQ ID NO: 27),
spezifisch für die 35S-Promotor-Sequenz;
und dem Oligonukleotid:
5'-ATTCTAGAGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG-3' (SEQ ID NO: 28)
spezifisch für OCS-Terminator-Sequenz

Das Amplikon wurde in den Vektor pCR-Script (Stratagene) kloniert und pCRScriptHGDanti genannt (Fig. 2, Konstrukt II).

c) Herstellung des binären Vektors

Zur Erstellung eines binären Vektors zur Raps-Transformation wurde zunächst das Konstrukt HGDanti aus pCRScriptHGDanti als XbaI-Fragment in den Vektor pPTV (Becker, D., (1992) PMB 20, 1195-1197) kloniert (Fig. 4, Konstrukt V). In dieses Plasmid wurde das Konstrukt LegHPPDog aus pCRScriptHPPDop als HindIII Fragment eingefügt. Dieses Plasmid wurde mit pPTVHPPDopHGDanti bezeichnet (Fig. 4, Konstrukt VI).

Beispiel 4 Herstellung von Konstrukten zur Kotransformation zur Über expression von HPPDop und Ausschaltung von HGD in Brassica napus Pflanzen

Zur Kotransformation von Pflanzen mit HPPDop und antiHGD wurde das Konstrukt LeguminB-Promotor/Tansitpeptid/HPPDop/NOS aus dem Vektor pCRScriptHPPDop (Fig. 3, Konstrukt IV) als HindIII-Frag ment herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen Vek tor pPZP200 (Hajdukiewicz, P., et al., (1994) PMB 25(6): 989-94) eingefügt (Fig. 5, Konstrukt VII). Dieses Plasmid diente später zur Kotransformation von Pflanzen zusammen mit dem Vektor pPTVHGDanti (Fig. 4, Konstrukt V) aus Beispiel 3c).

Beispiel 5 Klonierung eines genomischen Fragments der Maleylacetoacetat-Iso merase aus Arabidopsis thaliana a) Isolierung von genomischer DNA aus Blättern von A. thaliana

Der verwendete Extraktionspuffer hat folgende Zusammensetzung:

- 1 Volumen DNA-Extraktionspuffer (0,35 M Sorbitol, 0,1 M Tris, 5 mM EDTA, pH8,25 HCl)
- 1 Volumen Nuclei-Lysispuffer (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA, 2 M NaCl, 2% Hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB))
- 0,4 Volumen 5% Natriumsarkosyl
- 0,38 g/100 ml Natriumbisulfit

100 mg Blattmaterial von A thaliana wurden geerntet und in flüs sigem Stickstoff eingefroren. Das Material wurde anschliessend im Mörser pulverisiert und in 750 µl Extraktionspuffer aufgenommen. Das Gemisch wurde 20 min bei 65°C erhitzt und anschliessend mit einem Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) ausgeschüttelt. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 10000 rpm in einer Heraeus pico-fuge wurde der Überstand mit einem Volumen Isopropanol versetzt und die so gefällte DNA erneut 5 Minuten bei 10000 rpm pelletiert. Das Pellet wurde in 70%igem Ethanol gewaschen, bei Raumtemperatur 10 min getrocknet und anschliessend in 100 µl TE- RNAse Puffer (10 mM Tris HCi pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 100 mg/l RNase) gelöst.

b) Klonierung des Gens für die MAAI aus Arabidopsis thaliana

Mittels der Protein-Sequenz der MAAI aus Maus (Mus musculus) mittels BLAST-Suche in der NCBI Datenbank (http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) das MAAI-Gen aus A.thaliana identifiziert (Genbank Acc.-No. AAC78520.1). Die Sequenz ist in der Genbank als putative Glutathione-S-Transferase annotiert. Mittels der ID-Nummern der Proteinsequenz konnten die korrspon dierende DNA-Sequenz ermittelt werden und Oligonukleotide abge leitet werden. Den Oligonukleotiden wurde jeweils am 5'Ende eine SalI und am 3'Ende eine BamHI Restriktionsschnittstelle angefügt. Das Oligonukleotid am 5'Ende umfasst die Sequenz
5'-atgtcgacATGTCTTATGTTACCGAT-3' (SEQ ID NO: 29)
beginnend mit Base 37 der cDNA, dem ersten Codon, das Oligo nukleotid am 3'Ende umfasst die Sequenz
5'-atggatccCTGGTTCATATGATACA-3' (SEQ ID NO: 30)
beginnend mit dem Basenpaär 803 der cDNA-Sequenz. Die PCR-Reak tion wurde mit der Taq Polymerase (Hersteller: TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt. Der Ansatz hatte folgende Zusammensetzung: 10 µl Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Tween20, 0,5% Nonidet P-40, 50% Glycerol), je weils 100 µmol der beiden Oligonukleotide, jeweils 20 nM an dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase, 1 µg genomische DNA, destilliertes Wasser add 100 µl. Das PCR-Programm lautete:

- 5 Zyklen mit: 94°C (4 sec), 52°C (30 sec), 72°C (1 min)
- 5 Zyklen mit: 94°C (4 sec), 50°C (30 sec), 72°C (1 min)
- 25 Zyklen mit: 94°C (4 sec), 48°C (30 sec), 72°C (1 min)

Das amplifizierte Fragment (SEQ ID NO: 41) wurde mittels Nucleo- Spin Extract (Machery-Nagel) gereinigt und nach Herstellerangaben in den Vektor pGEMTeasy von Promega kloniert (Fig. 6, Konstrukt VIII). Die Richtigkeit des Fragments wurde durch Sequenzierung überprüft. Mittels der durch die Primer an die Sequenz angefügten Restriktionsschnittstellen wurde das Gen als SalI/BamHI-Fragment in den entsprechend geschnittenen Vektor BinAR (Höfgen, R. und Willmitzer, L., (1990) Plant Sci. 66: 221-230) kloniert (Fig. 6, Konstrukt IX). Dieser enthält den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus und die OCS-Terminationssequenz. Das Konstrukt diente als Vorlage für eine PCR Reaktion mit dem Oligonukleotid
5'-ATGAATTCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA-3' (SEQ ID NO: 43)
spezifisch für die 35S-Promotor-Sequenz und dem Oligonukleotid
5'-ATGAATTCGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG-3' (SEQ ID NO: 44)
spezifisch für den OCS-Terminator. Beiden Oligonukleotiden wurde eine EcoRI-Erkennungssequenz angefügt. Die PCR wurde mit der Pfu- Polymerase durchgeführt (Hersteller: Stratagene). Der Ansatz hatte folgende Zusammensetzung: 10 µl Puffer (200 mM Tris HCl pH 8.8, 20 mM MgSO₄, 100 mM KCl, 100 mM Ammoniumsulfat, 1% Triton X-100, 1 g/l Nuclease freies BSA), jeweils 100 µmol der beiden Oligonukleotide, jeweils 20 nM an dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 2.5 Einheiten Pfu-Polymerase, 1 ng Plasmid DNA, destilliertes Wasser add 100 µl. Das PCR Programm lautete:

- 5 Zyklen mit: 94°C (4 sec), 52°C (30 sec), 72°C (2 min)
- 5 Zyklen mit: 94°C (4 sec), 50°C (30 sec), 72°C (2 min)
- 25 Zyklen mit: 94°C (4 sec), 48°C (30 sec), 72°C (2 min)

Das PCR-Fragment wurde mittels Nucleo-Spin Extract (Machery- Nagel) gereinigt und in den Vektor pCR-Script (Stratagene) kloniert (Fig. 7, Konstrukt X).

Beispiel 6 Herstellung des binären Vektors

Zur Erstellung eines binären Vektors zur Arabidopsis- und Raps- Transformation wurde das Konstrukt aus dem Vektor PCR-Script als EcoRI-Fragment in den Vektor pZPNBN einkloniert. pZPNBN ist ein pPZP200 Derivat (Hajdukiewicz, P., et al., (1994) PMB 25(6): 989-94), dem zuvor eine Phosphinotricinresistenz unter der Kontrolle des NOS-Promotors vor dem NOS-Terminator eingefügt worden war. (Fig. 7, Konstrukt XI)

Beispiel 7 Klonierung eines genomischen Fragments der Fumaryla cetoacetat Isomerase aus Arabidopsis thaliana

Mittels der Protein-Sequenz der FAAH aus Emericella nidulans wurde ein Blast-Search durchgeführt und aus A.thaliana eine Pro teinsequenz identifiziert, die zu 59% Homologie aufwies. FAAH aus A.thaliana hat die Accessionnummer AC002131. Mittels der ID- Nummer der Proteinsequenz konnte die DNA-Sequenz ermittelt werden und Oligonukleotide abgeleitet werden.

Dem 5'-Oligonukleotid wurde eine SalI und dem 3'-Oligonukleotid eine Asp718 Restriktionsschnittstelle angefügt. Das Oligo nukleotid am 5'-Ende von FAAH umfasst die Sequenz
5'-atgtcgacGGAAACTCTGAACCATAT-3' (SEQ ID NO: 31)
beginnend mit Base 40258 des BAC F12F1, das Oligonukleotid am 3'Ende umfasst die Sequenz:
5'-atggtaccGAATGTGATGCCTAAGT-3' (SEQ ID NO: 32)
beginnend mit dem Basenpaar 39653 des BACs. Die PCR-Reaktion wurde mit der Taq Polymerase (Hersteller: TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt. Der Ansatz hatte folgende Zusammensetzung: 10 µl Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Tween20, 0,5% Nonidet P-40, 50% Glycerol), jeweils 100 pmol der beiden Oligonukleotide, jeweils 20 nM an dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase, 1 µg genomische DNA, destilliertes Wasser add 100 µl. Das PCR-Programm lautete:

Das Fragment ((SEQ ID NO: 42) wurde mittels Nucleo-Spin Extract (Machery-Nagel) gereinigt und nach Herstellerangaben in den Vek tor pGEMTeasy von Promega kloniert (Fig. 8, Konstrukt XII).

Die Richtigkeit des Fragments wurde durch Sequenzierung über prüft. Mittels der durch die Primer an die Sequenz angefügten Restriktionsschnittstellen wurde das Gen als SalI/Asp718-Fragment in den entsprechend geschnittenen Vektor BinAR (Höfgen, R. und Willmitzer, L., Plant Sci. 66: 221-230, 1990) kloniert. Dieser enthält den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus und die OCS- Terminationssequenz (Fig. 9, Konstrukt XIII).

Zur Erstellung eines binären Vektors zur Arabidopsis- und Raps- Transformation wurde das Konstrukt aus dem Vektor pBinAR als EcoRI/HindIII-Fragment in den Vektor pZPNBN einkloniert. pZPNBN ist ein pPZP200 Derivat (Hajdukewicz, P. et al., Plant Molecular Biology, 25; 989-994, 1994), dem zuvor eine Phosphinotricin resistenz unter der Kontrolle des NOS-Promotors vor dem NOS- Terminator eingefügt worden war (Fig. 9, Konstrukt XIV).

Beispiel 8 Herstellung transgener Arabidopsis thaliana Pflanzen

Wildtyp Arabidopsis thaliana Pflanzen (cv. Columbia) wurden mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm (EHA105) auf Grundlage einer modifizierten Methode der Vacuum Infiltrationsmethode nach Clough und Bent (Clough, S. and Bent A., Plant J. 16(6): 735-43, 1998) und nach Bechtold, et al. (Bechtold, N., et al., CRAcad Sci Paris. 1144(2): 204-212, 1993) transformiert. Die verwendeten Agrobacte rium tumefaciens Zellen waren zuvor mit den Plasmiden pZPNBN- MAAIanti bzw pZPNBN-FAAHanti transformiert worden.

Samen der Primärtransformanden wurden auf Grundlage der Phosphi notricinresistenz gescreent, indem Saatgut ausgelegt wurde und die Keimlinge mit dem Herbizid Basta (Phosphinotricin) besprüht wurden. Basta resistente Keimlinge wurden vereinzelt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.

Beispiel 9 Herstellung transgener Raps (Brassica napus) Pflanzen

Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientierte sich an einem Protokoll von Bade, J. B. und Damm, B. (Bade, J. B. und Damm, B. (1995) in: Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangen berg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.

Die Transformation erfolgte mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA105. Zur Transformation wurde entweder das Plasmid pPTVHPPDopHGDanti (Fig. 4, Konstrukt VI) oder nach Anzucht ge mischte Kulturen von Agrobakterien mit den Plasmiden pPTVHGDanti (Fig. 4, Konstrukt V) und pPZP200HPPDop (Fig. 5, Konstrukt VII) verwendet. Samen von Brassica napus var. Westar wurden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Tee pol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen wur den drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm gross) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate wurden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktions medium wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.

Von den Agrobacterium Stämmen wurden Übernachtkulturen bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD₆₀₀ von 0,3 eingestellt. Zur Kotransformation wurde die Lösung der beiden Stämme zu gleichen Teilen vermischt.

Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit ste rilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien- Suspension wurde entfernt, die Raps-Explantate für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschliessend 100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co-Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktions mediums gestoppt und die Explantate zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explantaten wurde in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.

Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explantate in 90 mm Petri schalen überführt, welche 25 ml Spross-Induktionsmedium mit Phosphinotricin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Spross-Induktionsmedium umgesetzt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen wurde wie von Bade, J. B und Damm, B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrie ben durchgeführt.

Beispiel 10 Untersuchung der transgenen Pflanzen

Um zu bestätigen, dass durch die Inhibition der HGD-, MAAI,- und/ oder FAAH die Vitamin E Biosynthese in den transgenen Pflanzen beeinflusst wird, werden die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte in Blätter und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten trans formierten Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Brassica napus) analy siert. Dazu werden die transgenen Pflanzen im Gewächshaus kulti viert und Pflanzen, die die antisense RNA von der HGD-, MAAI,- und/oder FAAH exprimieren, mittels einer Northern-Blot Analyse untersucht. In Blättern und Samen dieser Pflanzen wird der Toco pherolgehalt und der Tocotrienolgehalt ermittelt. Der Aufschluß des Pflanzenmaterials erfolgte durch dreimalige Inkubation im Ep pendorfschüttler bei 30°C, 1000 rpm in 100% Methanol für 15 Minu ten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt wurden. Weitere Inkubationsschritte ergaben keine weitere Freisetzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen. Um Oxidation zu vermeiden, wur den die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer Waters Allience 2690 HPLC Anlage analysiert. Tocopherole und Tocotrienole wurden über eine reverse Phase Säule (ProntoSil 200-3-C30, Bischoff) mit einer mobilen Phase von 100% Methanol getrennt und anhand von Standards (Merck) identifiziert. Als De tektionssystem diente die Fluoreszens der Substanzen (Anregung 295 nm, Emmision 320 nm) die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszens detektors FP 920 nachgewiesen wurde.

In allen Fällen ist die Tocopherol- bzw. Tocotrienol-Konzentra tion in transgenen Pflanzen, die zusätzlich eine erfindungsge mässe Nukleinsäure exprimieren, im Vergleich zu nicht transfor mierten Pflanzen erhöht.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Bildung von Vitamin E durch Beeinflussung der Vitamin E-Biosynthese, dadurch gekennzeichnet, dass man den Homogentisatabbau durch Verminderung der Homogentisat-1,2- dioxygenase (HGD)-Aktivität, Maleylacetocacetatisomerase (MAAI)-Aktivität und/oder Fumarylacetoacetathydrolase (FAAH)-Aktivität reduziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die MAAI-Aktivität und/oder die FAAH-Aktivität reduziert und gleichzeitig

a) die Umsetzung von Homogentisat zu Vitamin E verbessert, oder
b) die Biosynthese von Homogentisat verbessert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die HGD-Aktivität reduziert und gleichzeitig

a) die Umsetzung von Homogentisat zu Vitamin E verbessert, oder
b) das TyrA-Gen überexprimiert.

4. Verfahren zur vermehrten Bildung von Vitamin E durch Beein flussung der Vitamin E-Biosynthese, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) die Umsetzung von Homogentisat zu Vitamin E, und gleich zeitig
b) die Biosynthese von Homogentisat verbessert.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultur eines pflanzlichen Organismus mit Inhibitoren der MAAI, HGD oder FAAH behandelt.

6. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz (anti-MAAI/FAAH), welche zu einer Reduktion der MAAI- Aktivität oder FAAH-Aktivität befähigt ist, oder ein funktio nales Äquivalent davon.

7. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 6, enthaltend zusätzlich

a) eine Nukleinsäuresequenz (pro-HG), welche zu einer Stei gerung der Homogentisat (HG) Biosynthese befähigt ist, oder ein funktionales Äquivalent davon; oder
b) eine Nukleinsäuresequenz (pro-Vitamin E), welche zu einer Steigerung der Vitamin E Biosynthese ausgehend vom Homo gentisat befähigt ist, oder ein funktionales Äquivalent davon; oder
c) eine Kombination von a) und b).

8. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz (anti-HGD), welche zu einer Inhibition der HGD befähigt ist, oder für ein funktionales Äquivalent davon.

9. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 8, enthaltend zusätzlich

a) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für bifunktionale Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase Enzyme (TyrA) oder ein funktionales Äquivalent davon; oder
b) eine Nukleinsäuresequenz (pro-Vitamin E), welche zu einer Steigerung der Vitamin E Biosynthese ausgehend vom Homo gentisat befähigt ist, oder ein funktionales Äquivalent davon; oder
c) eine Kombination von a) und b).

10. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz (pro-HG), welche zu einer Steigerung der Homogentisat (HG) Biosynthese befähigt ist, oder ein funktionales Äquivalent davon, und gleichzeitig eine Nukleinsäuresequenz (pro-Vita minE), welche zu einer Steigerung der Vitamin E Biosynthese ausgehend vom Homogentisat befähigt ist, oder ein funktiona les Äquivalent davon.

11. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 6 bis 10 enthaltend eine anti-MAAI/FAAH-Sequenz bzw. anti-HGD-Sequenz, die

a) zu einer antisense-Nukleinsäuresequenz transkribierbar ist, welche zur Inhibition der MAAI/FAAH-Aktivität bzw. der HGD-Aktivität befähigt ist, oder
b) eine Inaktivierung der MAAI/FAAH bzw. HGD durch eine homologe Rekombination bewirkt, oder
c) für einen Bindungsfaktor kodiert, der an die Gene der MAAI/FAAH bzw. HGD bindet und so die Transkription dieser Gene vermindert.

12. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7 und 10 enthaltend eine proHG-Sequenz ausgewählt aus den Genen kodierend für eine HPPD, TyrA.

13. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, 9 und 10 enthaltend eine proVitamin E-Sequenz ausgewählt aus den Genen kodierend für eine HPGT, Geranylgeranyloxidoreduktase, 2-Methyl-6-phy tylplastoquinol-methyltransferase, γ-Tocopherol-methyltrans ferase.

14. Rekombinanter Vektor, enthaltend

a) ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 6 bis 13; oder
b) eine Nukleinsäure, die für eine HGD, MAAH oder FAAH kodiert, sowie funktionelle Äquivalente davon, oder
c) eine Kombination der Möglichkeiten a) und b).

15. Rekombinanter Vektor nach den Anspruch 14, wobei die Nuklein säuren oder Nukleinsäurekonstrukte funktionell mit einer genetischen Kontrollsequenz verbunden sind und der die Fähig keit zur Transkription von sense oder antisense-RNA hat.

16. Transgener Organismus, transformiert mit einem Nukleinsäu rekonstrukt gemäss den Ansprüchen 6 bis 13 oder einem rekombinanten Vektor gemäss den Ansprüchen 14 oder 15.

17. Transgener Organismus nach Anspruch 16 ausgewählt aus Bakte rien, Hefen, Pilzen, Moosen, tierischen und pflanzlichen Organismen.

18. Zellkulturen, Teile, transgenes Vermehrungsgut, oder Früchte abgeleitet von einem transgenen Organismus nach den Ansprü chen 16 oder 17.

19. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der An sprüche 16 oder 17 oder von diesem abgeleitete Zellkulturen, Teile, transgenes Vermehrungsgut oder Früchte nach An spruch 18 als Nahrungs- oder Futtermittel oder zur Isolation von Vitamin E.

20. Antikörper, proteinbindende oder DNA-bindende Faktoren gegen Polypeptide mit HGD-, MAAI- oder FAAH-Aktivität, deren Gene oder cDNAs.

21. Verwendung von Polypeptiden mit HGD-, MAAI- oder FAAH-Akti vität, deren Gene oder cDNAs zum Auffinden von Inhibitoren der HGD, MAAI oder FAAH.

22. Verfahren zum Auffinden von Inhibitoren der MAAI, HGD oder FAAH, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Akti vität der MAAI, HGD oder FAAH in Gegenwart einer chemischen Verbindung misst und bei Erniedrigung der enzymatischen Akti vität im Vergleich zur nicht gehemmten Aktivität die chemi sche Verbindung einen Inhibitor darstellt.

23. Verwendung von Inhibitoren der HGD, MAAI oder FAAH, erhält lich gemäss einem Verfahren nach Anspruch 22, als Wachstums regulatoren.